Developmental genetics in primitive chordates.

10
Developmental genetics in primitive chordates Paolo Sordino 1,2* , Lisa Belluzzi 3 , Rosaria De Santis 2 and William C. Smith 3 1 Department of Anatomy and Developmental Biology, University College London, Gower Street, LondonWC1E 6BT, UK 2 Laboratory of Cell Biology, Stazione Zoologica Anton Dohrn,Villa Comunale, 80121 Napoli, Italy 3 Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara, CA 93106, USA Recent advances in the study of the genetics and genomics of urochordates testify to a renewed interest in this chordate subphylum, believed to be the most primitive extant chordate relatives of the vertebrates. In addition to their primitive nature, many features of their reproduction and early development make the urochordates ideal model chordates for developmental genetics. Many urochordates spawn large numbers of transparent and externally developing embryos on a daily basis. Additionally, the embryos have a de¢ned and well-characterized cell lineage until the end of gastrulation. Furthermore, the genomes of the urochordates have been estimated to be only 5^10% of the size of the vertebrates and to have fewer genes and less genetic redundancy than vertebrates. Genetic screens, which are powerful tools for investigating developmental mechanisms, have recently become feasible due to new culturing techniques in ascidians. Because hermaphrodite ascidians are able to self-fertilize, recessive mutations can be detected in a single generation. Several recent studies have demonstrated the feasibility of applying modern genetic techni- ques to the study of ascidian biology. Keywords: ascidians; chordates; development; genetic screens; genomic tools 1. ASCIDIAN BIOLOGY AND DEVELOPMENT: AN OVERVIEW OF THE ASCIDIANS (a) Ascidians are among the oldest model animals of experimental embryology Adult ascidians, or sea squirts (subphylum Urochordata, class Ascidiacea), are sessile ¢lter-feeders that show no obvious evolutionary similarity to their vertebrate cousins. The phylogenetic position of the ascidians as chordates was not proposed until 1866 by Kovalewsky, and was only obvious upon observation of the larvae, which possess the de¢ning chordate characteristics of a dorsal, hollow nerve cord, notochord and tail muscles. By the turn of that century, ascidians were one of the primary model systems in the growing ¢eld of embry- ology. In one of the ¢rst studies of ascidian embryology, the teratologist L. Chabry (1887) showed that the disrup- tion of speci¢c blastomeres resulted in the loss of tissue types in the larva. In 1905, the seminal work of Conklin elegantly described the cell lineage of the ascidian embryo in a paper that remains a valuable reference to current researchers (Conklin 1905). Building on Conklin's pioneering work, researchers in the ensuing decades have greatly expanded our understanding of ascidian embry- ology at the cellular and molecular levels (Di Gregorio & Levine 1998; Nishida 1997). The ascidians have been used as model animals in the study of determinative development, and the ascidian egg also undergoes extensive cytoplasmic reorganization following fertilization, leading to the segregation of maternal determinants. A recent analysis of cytoplasmic reorganizations in the ascidian Phallusia mammillata between fertilization and ¢rst division hints at the complexity of this process, and demonstrates distinct micro¢lament and microtubule-driven phases to the movement of cytoplasm (Roegiers et al. 1999). Probably the most studied of the ascidian cytoplasmic determinants has been the myoplasm, which promotes the autonomous di¡erentiation of the primary muscle lineage (Satoh et al. 1996). In addition, maternal cytoplasmic determinants have been characterized in ascidians for endoderm (Marikawa & Satoh 1995) and epidermis speci¢cation (Ishida & Satoh 1998), as well as for gastrulation move- ments (Nishida 1996) and asymmetric cleavage (Nishida et al. 1999). A number of maternal mRNAs, including the posterior end mark (PEM) genes and wnt5, are actively localized to the posterior pole following fertilization and may provide clues to the molecular mechanisms of ooplasmic segregation (Sasakura et al. 1998; Satou & Satoh 1997; Yoshida et al. 1996). While the ascidians were thought to di¡er fundamentally from the vertebrates in their reliance on determinative mechanisms, the demon- stration of the importance of polarized maternal determi- nants in Xenopus development (King et al. 1999), and the characterization of inductive interactions required for the development of notochord, nervous system, trunk lateral cells and mesenchyme in ascidians (Nishida 1997), rein- forces the similarities between the chordate subphyla. (b) Urochordate genomes are unique among the chordates While the ¢eld of ascidian genomics is in its infancy, the urochordates are uniquely positioned to provide tremendous insight into chordate genome evolution and organization. Studies of the evolutionary history of chor- date genomes indicate that the vertebrate subphylum has Phil.Trans. R. Soc. Lond. B (2001) 356, 1573^1582 1573 & 2001 The Royal Society doi 10.1098/rstb.2001.0919 * Author for correspondence ([email protected]).

Transcript of Developmental genetics in primitive chordates.

����������� ����� � �� �������� ������

����� ���������� ���� �������� ������� �� ������ �� ������� �� ������

����������� ������ �� ������������ ������ ���������� ������ �� �� ���� ������� �� ����� ���� � ���!����� ���� ������ ���"��� #���$� ���� �%���&���� ��'����� ()�*� +����� ,����

����������� -��$'���� ���� �� ������������ ������ ���������� ��������� ����� ���!���� �� ./�)�� ���

���� �� ���� � �� ���� �� �� ������ �� ������� �� ����������� ����� � � ������ ����� ���� ������� ���������� ����� �� � �� �� ��� ������ � ��� ������� ����� �� �� �� ��������� ������� � ���� ������ � ����� ��� ������� �� ���� ���������� �� ����� �� ������ ���� ������������� ����� ����� �������� ��� �� �������� ������� �� ����������� ���� ����� �������� ������� �� �������� �� ������ ������� � � ����� ������ !���������� �� ������� �� � ���"�� �� ����#���������$�� ���� ������ ��� �� �� �� ���������� %���������� �� ������ �� ������������� �� � ��� ������� � �� ��� &'�() �� �� ��$� �� �� �������� �� � �� � ����� ������ ���� ����� �������� �� ��������� *���� ������� ����� ��� �������� ���� ��� � ��������� �������� ���������� �� � ������ ������ �������� ��� � �� ������� ����+��� � ���������,������ ������������ �������� ��� ���� � ����#������$�� ������� � ������ �� �� ������ � � ������������� -� ���� ���� ������ �� � ��������� �� ���������� �� ������� ����� ����� ����#+��� � �� ���� �� ������� ��������

�������� ��������. ��������. �� ������. ����� ������. ������ ����

�� �������� ��� ��� �����������

�� ������� � ��� ���������

�� ��������� �� ���� � ���� ��������� �� ����� �� ��������

!��� ��������� �� ��� �+���� /��������� 0��������������� !���������1� ��� ������� "���#������� �� ���� ��� ���� � �������� ��������� � ���� �������������� 2�� ���������� ������ �� �� �������� ���������� ��� � �������� ��� �344 �� 5� ���������� ��� ��� �� ���� ��� ����� ��� �� �� ��� �������� ������� �� ��"�� ������� ������������� �� �������� ������ �� � ����� ������� �� ��� �������� ,��� �� �� �� ������ �������� ���� �� �� ��������� ����� ������ � �� ������ "��� �� �����#������ � �� �� �� "�� ������ �� ������� ������������� ��������� 6� 7����� /�3381 ������ �� �� ������#�� �� �����"� ���������� ������� � �� ���� �� ��������� � �� ��� �� � �9(&� �� ������ ���� �� 7����������� ��������� �� ���� ������ �� �� ������������� � � ����� �� ������ � ������� �������� ������ ����������� /7���� �9(&1� ,������ � 7����:��������� ����� ����������� � �� ����� ������� �� ������� ������� ��� ��������� �� ������� �����#����� � �� �������� �� ��������� �� ��� /;� *������� <6� �� �993. =������ �9981�2�� �������� �� � ��� ���� �� ����� ������ � ��

���� �� �������� � �� ������� �� �� ������� ������� �������� ����� � ���������� �������$����������� ������$���� ������ � �� ��������� �������� ��������� ! ���� ������� �� �����������������$���� � �� ������� 0%���'��� ����������

����� ������$��� �� "�� �� ���� ��� � ����������� �� ��� �������� �� ��������� ����������"���� �� ����������#��� � ������ � ���� ��� �� �������� /�������� �� ��1 �9991� >��������� ��� ������ �� �� ������� ���������� ����������� ��� �� ��������� ����� ������� �� ����������?������� �� �� ������� ������ ������ /-��� �� ��1�9941� � ������� ������ ���������� ���������� � ��� ���������$�� � �������� ��� �������/ ������� < -��� �99&1 �� ��������� �����"����/������ < -��� �9931� �� ���� �� ��� ��������� �� �#��� /=������ �9941 �� ��������� ���� ��� /=�������� ��1 �9991� ! ����� �� ������ ��=!�� ������� ���������� �� ���� />@ 1 ���� �� ���2� ��� ��� ���������$�� � �� �������� ���� �������� ������$��� ����� ��� ��� ����� � �� ��������� ��������� ����������� ��������� /-������� �� ��1 �993. -��� <-��� �998. A������ �� ��1 �9941� B���� �� �������� ��������� � ��?�� ���������� ���� �� �������� ����� ������� � �������� � ���������� �� ����#����� �� �� �������� �� ������$�� ������ ������#�� � 3���'� �� ������ /5�� �� ��1 �9991� �� �����������$��� �� ����� � �������� ��+����� ��� ���� ������ �� �������� �� ��� ������ ��� ����������� �� ��������� � �������� /=������ �9981� ���#������ �� ����������� ����� �� ������� ���������

� ��������� ���� �� ��������� � ������ �

B���� �� "��� �� ������� ������� �� � �� �������� ����������� ��� ��+���� �������� � ��� ����������� ����� �� ������� ����� � ����� �������$���� -����� �� �� � �������� ������ �� ����#��� ������ ������ �� �� ������� ��������� ���

0%��1�����1 41 �$1 �� 1 , /�((�1 ���� �&8�'�&3� �&8� � �((� 2�� ����� -�����

� �(��(93C�����((��(9�9

�!���� ��� ������������ /������D�������$��1�

������� �� �����#���� ���������� ���� �� �� ��#���� ���� �� �� � ������� ������� ��������/ ���� < -���� �999. -���� �9941� 2�� ����+������� �� ���������� ��� � ��� � �� ����� ��� ���������� ��� ������������ �� �� ��������� 2�� ������������ �� ���� ������� � ��� ��� ��������� ���� �� ��� �������� 56 �������� ������� � �� �� ������� ���� ��� ����������� %������� �� �����#��������������� ��� �������� ������� �� ������ ������#�$��� ������ � �� � �������� � �� ������ ��������������� 2���� ������ ���� �� �� �� ���� �������������� �� ������ �� ����� ��C�� �������� �� �������������� �� �������� ���������� ��� �� ������������� ������ ��� �� ������� � �� � ������� ������ "���� �� ���� �������� �������� ������#���������������� ������� �����#����� 2�� �����#�������������� � �� �������� ��� ���� �������� ������������ ��� ����� ������� �� ������ � ���� �������� �� �������� ��������� �� �� ����� �� �� ���#������ B���� ������ ������ �� ��������� ���� �������� +������ ���� ����� � ���� ���� �������� ��� ���� ���� ������ ����� �� ��� �������� �������� ��

������ �� �������� ������ ��� ����� � �������� ������ !������� �?�� � ����"�� �� �#��� ��� ������ ������ �� ��� ��� � ������� � �� ���������� ����E��� �� �� ��� � ������ �� �� ������������ �����

�� �� ����� �� �������� ������ �� �� ���6����#����� ��������� ������ �� � ��� ��������

������ ��� �������� �� ���������� ������ ���� �����%��� /=F�����#G������ < B�������� �93(1 �������%�! ���� ������� /,���� �98H1� �� ���� ������ � �������� ���� �� $����"�� / ����� �� ��1 �99H. -�����#5��$�� �� ��1 �99H1� *���� ������ ��� ������ � ����������� � �������� �� ����� !��� �� ���� �������������� ��� ����� ��� ������ � �� ��������������� ����� ���� ������������� ���� �������� ��5��$���%�� ����"�� ��� �� ���� ���� ��� ���� ����� �������� ������� 6����#����� ����� ������ ��� ��������#���� � 51 ����"� ��� � �� ������ ������������ �������#��� ���� ������ ����� /I����� � %�������1� ����� ������� ���� I �� ���� ���� �1 �������������� �1 �������� �?�� ������� �� ����� ��� ���

�&8H >� -����� �� ����� ������������ ������$� �� ��������� $%� ����

0%��1�����1 41 �$1 �� 1 , /�((�1

%����� �� /�1 B���#���� /!1 !� �� /$1 ��! �1 ������������ ��� ��� ����� �� � ��� �������� ��� � ��#�������� ������������ �� / ' 1 ����������� ��� ����� ����������� ������ ������ �� ������ ������� 7������� ��� ����#��� ��� �/�1� !� �� ���������$�� �� � ������� ������ ������ /����� ������ � /!11 ��� � ������� ������� /���������� � /!1 ��/�11� ����� ��! ����� � ��� �� �������� � �� ������ ����� /���� ������ � /$1 �� / 11� ,��� � &( ���

�������� ������� � ����� ���������� �� � ������� ������� ���� � ���� ��� �� ����#������������ 6�� �� ���� �� ������� ������� ���� ������ � � ������ ������� ������ ����� ��� ��� �� ��#���� ���� ������ /������ � ����� ���������� ������� ����������� ������� �� �� ��� �����1 �� �������� ����� ������� /���������� ������� ��������������� �� �� ��������1� ���� ������� �� ����+������ �� ��� �������� ����� � ������ ��� ������������ � ������ � �� ��������� ������� �� �����#��� ����� ��� � /����� ������ ������ ����������� ���1��� ���� ������ ���� � ��������� ������J �1 �������������� �1 �������� ��� ������������� ��� �� ������ � ����#������$��B� �� � �������� ��� ������ � ������ ����#$����� ��� ������� � �� ��������� ������������ ����#������� ������� �� ���������� ������� ������� �� �������� �������� ��� ����������� ���� ������� ������� %������ �� ����� ��� �����

����� �� �������� /�3( ��1 �������� ��� �� �������������� ������ ������ ��� � �?��� � ��� �� ���������� ���������� ��� ��� ���������>������� ��� ��� ���� � �� ������ ����� ������

��� ��� �1 �������� �� �1 ������������� �� ���� ������� ����� ��+�� �� ������ >������ �������� � ��� �� ������������ ���� �� ���"����� ����������� ���� �?��� ������� ���� � ����� ������� �� ����� ������ � ����� ���� ������������ � ������� ���� �� ���� �����#�������� ����� ������ ������ �� ����#������� ������� �� �� � �� � �������� � ���������� �?��� � � ����� �������� %������ � ��� ��� ��������� �1 �������� �� �1 ������������ �� �����#������$� �������� �� �� �� ������� ������� � �� � ��� �� ��������� ��� ����� /,��� < 6����� �(((1� �� �� ��������� ��� � � �� ������ �� ������������� ������ � ��������� ���� �� ������� ����� �� ������� � ������?��� � ��� �������

������������ ������$� �� ��������� $%� ���� >� -����� �� ����� �&8&

0%��1�����1 41 �$1 �� 1 , /�((�1

%����� �� /�1 B���#���� /$1 ����� �� /!� 1 ������#��� �1 ������������ ��� ��� /�1 ! ���� ������� �� �� ������ ������/������ � /�1 �� /!11 �� ���� �� ����� ��� ����� �� � !�.��!� /!1 ! ������� ������� �� �������� ������ /$1 �%��7����/�%�1 �� � �������� ��� ������� ������ �� ����� �?���� ����������� �� ����� / 1 ! �%� ������� �������������� � �� ������ ������ �� �� ������ ����$���� �%�.��! ��� /� � ������ ��� ���1� ,��� � &( ���

�� ������ ������� �������

�� �� ������������6����� � �� ����� ���� �� �� *��� �� =������ �

������ ����� �� !� ;��� K��������� -��� �?����� ���� �� ����� ��� ������� ��������� �� �1 ��������������� ��� ������ ���� ��� ���� �� � ������ ! ������������ ������ ������� ���� ��� ������� �� ���������������� ���� ���� ������ ����� �� ������ �� �������������� !����� 2����� �� >���� 7����� B� �� ���������� �������� ������ ��� ������ ��������������� �� �� � ���� ��� ���������� ����������� ��������� ,�� ��� �� �� ��������� ��� ����� �� ��� ����� �� "����� �������� ����� ���������L��� � � ��� �� �� �� � ��� � ��B���#��� �� �����$���� ������� ������ �� ���

������ � �� ������� ������� �������� ����� �������� ����#����� ��� ������� =��������� ������� ��� ��� ����� ������� � �� ������� ������ �� ������� ���� ���� �� ����� ������ �� ����� �� ��������� �������� �� �� ������� �1 ������������ �� ����� �� �� ���� ���� ������� � ���� �� ������ ������� ��� ��������������� ��� �� ����� ������� �� ����������������� � �� ����� ��������� �� �1 ������������ � ��*��� �� =������ ����� ��� ����� �� ��� ������ � ������#����2� ������ ���� �� ����� �� �������� ����������

�� ��������� � �� �� �����#����� $����� ���������������� ��� �� ��� �� ������� ��� ���������!��� ����#����� ��� �+���� ���� ���M���� � ���� ���������� � � ������� ������ ������ ��?������������ �� +#����#+#��������� /@=01� ��� �� ��� ���� ��� ��� ����� ������� �������������� �� �� �������� ��� @=0 �������� ���������#���� ���������� � ����� � ������� ���#���������� ������$�� ������ ����� ������ ��#������� ������ ������� ����� ������ ���� �������� ���� ��������� ��� ���� ������ �� ������������� ��+����� ��� ����������� � ������ B���#������� ���� �� ������$�� ��� @=0#����� �������� �� �?����� ���� � �������@������� ���� ����� ������ � ����#������$�� %�

������������ ������ ��� ����#�������� �� �� �������%� ������ ������ ��� ��� �������� � �������� �������� ����� /-����� �� ��1 �(((1� 2� ���������� ������ �� ����#������$���� ����#������� ���������#������ �1 ������������ ����� ��� ��� �������� ���� ��� � ���� �� �� �� �� � ���� ���������� ���������� ����� ������ ������� ���������� ��� ��� ������ ����� ��$�� �� �� ���� ����������� ,����� �� �� ������ ����#������� ���������� � � ����� ���'��� ����� ��� � ���� �� �����%�� ���������� ������ ��� �������� �� �������� �������� �������� �� �� ��� �� ��� ������� � ������ ����������� � �& �� >��� ������� ����� ������������ ����� ��� �� ���� ���� ! ��� ���� ��>��� ������ ��� ��������� � ��� ����� ��� ����������� ������ ��� �� ��������� !�� �� ������������� ��� ��������� �������� � ������ �� ��������������� �� ��+��� ����� � ���� �������� ������� ����� �� ���� &(( �1 ������������ �� �� ������ � ������ ������ � ���� ���� � � �(( � ��/!� 2����� < >� 7����� ���������� ���1�

;���� � ���� ��������� ������ �� �� � �������4� ������ %� �������� ����� ���� ���� �� ���������� ��� ��8� ���& �� (��8� @=0� !� ���������� ���+���� �� ������ �� ������ �� � ����� � ���#�� �� @=0 ������� ������ �� �������� �� ���������� ������ ��� ������� ������ � @=0 �������������� �� ������� �� ������ ������� �� �����������������#�����"� �������� ��� ����� �� ���� �� �������������� 2�� @=0#������ �� �������� ����#���� ���� �� �� ���� ���������� ����� �?���������������� ���� ����� ������������ ������� ��� �������� ��� �� ����� �� ���������$�� �� �������$�#�� �� ����� �� �� ������� �� ��� � ������������ ��� ��������� -����"� �������� �� ���� ���� ���� ��� ����� �������� �?���� ����� ��?��������� ����������� ���������� ���������$�� ���� ����������� />� -������ ���������� ���1� 2�� ���������� ������� � ��� �� ������ ��� !�� $���'� /!�1 /"�����!��1 �� ��!�� /��!1 /"���� �$� 1� ,�� ���� ���� ���#�"�� ����� �� (��8� @=0 �������� 2��� ��������� � ������ ������ �� �� � �� ��� ������������� ��� ��������� � !� ��� ��� ��� �� ��������� ��� �� �� ����� �� ��� ������ �� �������� ������� �� ������ ������� /"���� �!��1� 2��� ����������� � ���� � ����� ���� � �������� ����������� ��������� �������� �� ������������� ����� /��� �����1� �� � ������� ��������������� � ��� � ��������� ����� 2�� �������� � ��� �� ������ ����� ��������� ��$�� ���� �� ������ ��� �� �� ������ ������� 2�� !���� ��� �� ������ �� ����� ���� �� ���������������� ��� ��������� �� ��� ������ ��������� 2�� ��!��� �� ���������$�� �� �� ������ �� ����� ���#���� ���� �� �������� ������� ��?������� ������������ ������� �� ����� /"���� �$� 1� %���� ������#��� ���� ������� �� ���� ������ �� ���� �������� ����� � �� @=0 ������� ���� ��� �� !� ������

�� ������� ���#���������� ������$�� ����� ��� !���� ����� N� ���+������ ���� �() ��� (�(�8� @=0 �� �() ��� (���& �� (��8� @=0� 2���������� ��� ����"���� ������ �� ���� ������ ���������� ������ � $����"�� �� ����� / ����� <=F�����#G������ �99�1� I� �������� ����� �� �������� � ���� ��������� ������� ����� ��� �������������� � �� ������ 7������� ��� �1 ������������� ��������� �1 �������� ����� � �� ���� ������� �� ������@=0 ��������� ��� ����� ��� �O��� ������������� / ���� �� ��1 �9991� N��� ��� ���� ������� � ���������� �� ������� � ����� � ������� �� ��������O����� �� @=0 � �� �� �1 ������������ ������*������ �� ��������� �� ������� �� ��������

�������� ����������� � ��������� �� �����#$������ �� ����$������ �������� � � ������������� �� �������� �������� ��� ��������� !����� � "���� �� ������� ������� ������� �������������� �� � ���� ������ ����$����� ����� ����#����� �� �� ����� �� �1 ������������ �� ����� ������ �� ������� � ������ />� -������ 7� >� N���������>� 7����� �� ���� �� �� ;� -���� �������������1����� ���� ����� �� �� ������� �������� �� ����#

������ �� ���"���� �� � ������ ��� ����� ������-����� �� ���$� ����� ������ �� � ������ � ���������� �� � �� � ������� ������ -���� ��� �������� ����

�&84 >� -����� �� ����� ������������ ������$� �� ��������� $%� ����

0%��1�����1 41 �$1 �� 1 , /�((�1

�� ����� ��� ��� � ��#L���� >����� ����� �� ���������� ��� � ���� 2��� ���������� �� ����� �������� � ��������#"����� ������� /�� ��1 �������() ������������������ 2�� ������ �� ���$� ��������� ��� � �� ��������� ����� ���������� ������ ����

� �� ��������! ������� "�� ��� � �� ������ ����� ������ �

�������� ��� ���������� ������� �� ����� ����� ����� ������� ������� �� ������ ������ ���������������� B� ���� � ����� �� ������� �������������� �1 ������������� ������ ���$��� �� ���������%'�������� �� ���� �� �1 �������� ��� ����� � ���� ����������� ���������� �� ���� �� �������� 2�� ���������������� �� �� �� � �� ������� ����� ��� ������������������ �� �������� ��� �� ���� ����� ��� ���� �#"����� ������� �� � ���� ������ ��� �� ������� 2��0� ����� �� 7�������� � -�� ,������ �� ������ � ��������� �� �� 7�������� ���� �� ��� ����� ������ ������� ���������� 0"����� ������� �� ���� ����� ����������� �� � �?#����� ���� ����� B� �� ����� �� �� ���� ������� ���� ����� ��O������������� /�� ������� ���� ������ ��� ��������1 ������� ����� �� ����#���� ������ !����� ������� ������ � �& �� >��� ������ �� ��� ��������� �4( � ��� /"���� �1� -������ �� ������ ������ ���� � $�1 3 ����� /�� �� �� ����� � ��� ��������1� 2��� ���� L�� ��� ��� ������� �� � �������1 �������� � ������� �� ���� �� 4(( ����� ��� ��� B��� � ������� �� � ���� L�� ��� ����� �� ���"������� ��� ������$�� ����� ��� �� ������ �� ������� � ������� �� ������ �� ��� ������� �� ������� �� ������ �� ������� L����� ����� �� ���������� ��������� � ���� ���� �� ������� ��� ������ ���

������ �� ������ ����"���� $��������� ����������� � ��������� � ������ ����� �������� ����@=0#����� ����� ���� ������� ��� ����#��� ���� ������� �����$����� %� ��� ������� ! ������� �� %������ ����#������$�� � ������ %� ������ �� ����������� ��� ������ ������ � �����#������ ���������� /$�1 �( � ���#������$���1� -���� ���� ���� %� ������ ���$�� �� �� �� ����������� %� ����� ������� ������ ����� �� ������ �� %� ����� ��� ���� �������$� ����#��� ���� � ������ � ��������� ����I�� @=0 ��������� ���� ����� ������� �� ����#

��� �� ����#������$�� ������ /%� ������1 ���� 3(�����$����� %�� ��� �� �������� ������� I� �� %�������� �� �������$�� �& �� �� �� ������ �������%��� ��� ����� �������� �� ��� ����� ���� ����������� ������ � ����� �������� �� ���� ������������������ � ��� 2�� �� ���� ����� 4�9 /���� ��� ��$%!� /$%!11 �� �H�& /���� ��� �� $%�����'� /$%�11 �� �������� ��� �������� ���������$�� �� ���� � �� ������� � ������� �� ������ /=����� �� ��1 �9991�2�� ���� ���� �8��� ��� ��� ���� � ����� ������ ���������� ������� � ��� � ��� ����� ������������$��� !������ ��� ���� ���� �� � ����������� ���� �������� ��� ������ �� ��� ���� ���� ����?��� ����������� ������� I� �� ���� �����$%� ������� � ������ ������� �� ������ ���������� 2�� �������� � ������� ����� ���� � ��� ��� ������������ �������� ����� �� �� � �� ����

������ �� ������ / ������ < 7������ �93&1� ����� �������� $%� ��������� �� $����"�� � ���� /���1������ ����� �� � �� !��$%�'��C� ��� /N����� �� ��1�99�1� =����� $%� �� ��� ������ � ����� ��� ����� �������� ������ ���� �� �� ��� � �� �������#�#������ ��� ����� � �� 8����� %�� ����� �� $����#"��� ������ �� ����� ������ ���������#���� � ���$%� �� ���� � ������� �� ������ � ��� $%� �� ������ �������� ������� � �� �������� �� ��� ��������� !��$%�'�� ���������� ������� �� �� ����������� � ������� ������ ��� � ��������� B� �� ���������� �� $%� ��� ����� ���� � ����� � ��!��$%�'�� ��� ������ �� ���� ���� ��� �� ��� ��������� ���� �� �� �������� �� !��$%�'��� I������������� ���� ������� �� �� $%� ����� �� ��������� �� ������ ������� ����� ������� !��$%�'���2�� ���� �1 �������� ������� ��� �� ��� ���

�������� ���������$�� �� $%!� �%! ������� ������ �#������������� ���� ����#��� ��� ���#������ �������� ����� ����� �� ������� �� ������ ���� �� ������� ������� !��$%�'�� ��������� �� ��������������� � ����� �������� N��� ��� �� ��� ������ ������� ���� �� $%! ������� ��� ���� ������ �� ����#����������� 2�� ��� ������� �� ��� $%�� ������� ������ ���� � ������� ��� ������� ������������� B��� � ������� ������� ������� � $%! ������� ����� �������� ��������� ���� � !��$%�'�� �������#���K������� �� �� �������� �����"� ������� ������� ��� 4H#���� ���� ��� �� ���������� ��� ;��� ,������������ ���� �� �� ������� �� $%! ������� ������� �� �� �� ����� ��� ��� ����� ������� ������� ������ � ������ B� �������� �� �� ����� �$%! ������� �?��� �� ������ �� �� ������� � ���� ������ ������ 2�� ���� �� ���� �� �� ������������� �� ������� ����� �� ������� �� ����������� ����� ! ����� �� �� ����� �� ������� ��� ������� ��������� �� �� ��M���� �� �� ����� �� ������� ��� ����� ������ ����� �� ������� �� �� ������������ �� �����#"���� �������� B� �������� �� � ����� ���� ���� � ������� ������������ �� ���������� � $%! �������� @���� �� ������� � ����� ������� ���� � ������ ��O��� ����� � ���#���� �� ����� ������� ������ �� ������ �� �� ��#����� ��� ������ ��O��� ������ �� � ����� ��������� �������� ! ����� � �� ��������� ������ ������������� �� ������� �� ������� �� �� ����������� ����� � �� ������� ����� �� ������������� �� ������ ��������� 2���� ���� ����� � ��#����� ������������ ��� ������ ��������� �� ��� ����� ����������� ������� � ��������� ���� ������ �� ��� ������

�� �������� ������ �������� ��������

���� ������ �� ������ ����������

-����� ��� ������#�?�� ���� � �� � ������������ ������ ����%��� �� �1 ������� �� � ����������� ��� ����� ������ �� ������ ������ � � ������ ������� �� �������� � �� ����� ���� ����#����������� �� ��������� ���� �� ����� � ���������� ���� ���� ��� �� �� �1 ������� P������ �����: /,�������993. - Q���� < =F�����#G������ �99�1� 2�� ���� �������� ������ � ������� �� ������ ��� ��� ���

������������ ������$� �� ��������� $%� ���� >� -����� �� ����� �&88

0%��1�����1 41 �$1 �� 1 , /�((�1

����� ��� ������ � 3���'�� ! ����� �� ��������=!� ��� ��� � �� ������$�� � ����� ������ ���� 3���'� ��� /5�� �� ��1 �9991� @?��� ��� ����� ������� �� ���������$� �� ���������� �������� ��������� ���� ����������� �� ��������� ����� ���#�+���� 2�� �� ������ �� ������� ����� ��������#���� �?��� �� ������������ ��� ���������$��� ��������#�?�� ���� � ��������� 2�� ��O������ ��������� �� ��������� ���� � �������� ��������"�� ��� ��������� ������#�?�� �����N��� ��� �� ���� �� �� ��+�� ��������� �� �������������������� ���� �������� � ������ ��� ���� ������� �� � ����#������$�� �������� ���������� ���������� �� ���� ���� ������#�?�� �����6����#����� ������ ��� ������#�?�� ������ ���

������� � $����"��� �� �� ������ �� � ���� ������� � ��� ������� />������ �� ��1 �999. >������ < -�����# ����� �9991� 2��� ����� ��� ���� ���"���� ���������� ������� ����$����� ������$�� �������� 2�� ������������� ��������� ���� � ����� ��������� ��?������� � ����� �� ����������� ������� ��� ������� ���� %��� �� ������� ������� �� ����$������� 2�� ������������� ������ ��������� � ������� ��� ������� � ������������� �� ��� �� ��� ��� ��� 0G#��������� ������,������ �� ������ �� � �������� ������� �� �������#��� ����� ���������� ����������� �������� �� ��������� � ����$������ ���� �� ���� �������� � ���������� ���� �� ������ ���������� �� ���� ����#$����� � �� ������� %�� /���������� &()1� ��������� ����� � �� �������� ���� �� ����� ����������/���������� ()1� 2���� �� ����� �� ������ ������ ������ ��� ��� ����� ����� � �� ��������� I��

������ ����� ������ ���� � ��?�� ���� ��� ����/R ��1 ��� ������������ ��� ���� ������ ���� �� �������������� /�&)1 �� ���� ����$����� � �� %� ������2�� ����� ��O���� ��� �� ��������� $����"��������� �� �� ��O���� � ���� ���� ������� ������ %� ������� ��� ������ � �� � ������ 2�� ����� ���#����� ��+���� ��� ���� ��� �� �� ����� ����������� ������ %� �������� �� %� ������� �� ��+����������� �� ����� ����� �� ������ �� ����� �������� � ���� �� �� ������ ,������ �1 �������� ����������������� �� ���� �� ���� � ���� �� �� ������� ��������� �� ����� ���� �� %� � ����#��� �����2�� ��� ������ ��O������ � ���� ��� ����� �� �������� � ����� ������� ����� ��� ������� ������ %�� ����� �� ������� � �� � ������ �� ������������� ����� ��� ������� � �� �������� �����

�� ���� ���� ��� � ������� � � ����! ���� ����� ��� ��� ������� �� �� ��������� ��

B�7�-� � ������ �� ���������� �� ������� ������#�?�� ������ � �1 ��������� I�� ���������� ��������� �� �� ������� ����$����� %� ������������� ����� ������� ��� ������#�?�� ������� �� �� ��� �������� ������� ��������� 2�� ������� ���� � �������� �� ���� ��������������� � "���� H� !� ��� ��$����� ����� � �1 ��������� @=0 ��� ���� � ������$������� -���� ���� @=0#����� ������ ���� ���������� ����#��� ����� � ������ �� ����� ���� �� ������ �� ��� �� �1 �������� ��� �� ������ � ����#������$� ������� ����$����� ����� � ��� �� ���������,������ �1 �������� �� ������������� �� ��� ���� ��� ������ ����� ��� � ����� ��� ������ �?��� ���� ��

�&83 >� -����� �� ����� ������������ ������$� �� ��������� $%� ����

0%��1�����1 41 �$1 �� 1 , /�((�1

%����� �� !��� �1 �������� ������� � �& �� >��� ������� �1 �������� ��� �� ��� ������ � >��� ������ �� ������� � ���� ��� ���� �� ������ 2�� ������ ��� �� �������� � �4( � ��� ��� ���� �������� 2�� ������ ����� ��������� � ��� ����� � � ������

��� �� � ���� �� �� �������� �� ������ ���������� �� ������ � �� ���� ������ �� �� � ��������� ������ ���� ������� ����� �� ���� ���� 8& @=0#������ ����#������$�� %�� �� ����#��� ������ 2�������� ������ ���� ������� � �� ���� � � ��� �+�� �#�� � �� �� �����#������ �������� � ����� ��� ������� ������� ��� �� ���� ������������ I� �� 8&������ �������� &H /8�)1 ��� � �� 9() �����#�������� ������� �� ���� ��������� 2�� ��������� ������ ��� ����� ��������� /�('�(()1 ��������� ������ ������������ %�� ����� ��������� ����� ����� �(() �� �� ������� � �� ����� ����� � ������� �������� -���� �� �� ������ ����������������� � ���� �� 9() �� �������� I� ������� ������ $��� ������$���� @�� � ������ ��� ��� ���������� � �� P����� �����: �� ������ � �� ���� ���� ����������� �� ������� �� ���� ������ ��� P�����

������: �� ������ ����� ������� �� ���� �����%������ ���� �� ������� " � ������ �� ����������������� � ����� ���������� � ������� �� ���������� ��� ����� ��� 2�� ��O���� ��� ����������� ������ �� �������� ����� ����������� ���� ���� ������ ������� ����� ���� �� ���#������ ���#���� �� ����� ��� �� �#�������� �� � ������������������� !� ��������� � R H�� �� ��� ��������� ������ ����� ���� �� �1 �������� �� �� � ��� ����� ��� �� ��������� ����������� ��� ��� � ����������� �� ����� ������ ������� ������� ����������� �� ����� �� ����� �� ������������2�� ��"�� � �� ������� ������ ���� ����#

���� ��� �� ������� �� ������#�?�� ������ �������� ��� �� ������� �� ���� �������� �� ������ ���� � �������� � ��������� 2�� ����� ���� ������ �� %�� ������� ������� ������ ������ ���

������������ ������$� �� ��������� $%� ���� >� -����� �� ����� �&89

0%��1�����1 41 �$1 �� 1 , /�((�1

F1 larvae

F1 adults

allow larvae tosettle on plates

4. dissect sperm and eggs from each F2 adult

1. treat with ENU

2. cross ENU sperm to untreated eggs

5. screen for phenotype6. allow larvae tosettle on plates

7. cross siblingsto regeneratehomozygotesfor maternal lesion

8. rescreen for phenotype

×3. self-fertilize

F1 adults

F2 self-fertilizedadults

F2 sperm × untreated F2 eggs × untreated

%����� H� -����� ��� ������� �� ������#�?�� �������

���� � ������$� ����#��� ���� � ������ � ���������������$����� ������ /"���� H1� ������ �� ��� ���������� �� ������� � �������� ����$������ ! �� ����� ������ ��� ������� ��� M�� ������� ������� ������ ��� ���� ���� ��� �� ���� ��� �� ������ ��������� � ����#��� ������ 2��� ��������� ��� ��+��������� �������� � ����� � �� ��� ���� ��� �� �� ����#��� ������� �� ��� ��� ������� ��� � �� �(����� � �� ������ � ����� �� �� �1 �������� ������ �� �� � ����"�� �� ��� ��� ��� ��������� �� ���� �� � ����� �� � � $����� ����� / ���� �� ��1 �9991���� �������� ��� � ����� ����

�� �������� �� ��������

������������ ��������

�� �� ������� �� ���������� �� ��� ���������$�������� �� ������� �� �������� � �� ��� ��� ������ ��� ����� � ������ �� � ���� ���� �� ������ ��������� �� ���� ������ � ��� ������ ���� ��� �� �������� ��������

�� ������� ����� ��� ���� �� �����!������ � ������� �� ����� ����� ��+����

���� � ������� ����� �� �������� ������� � ������ �� ������� ����� � ����� �� ��� ��������� ����� � ������ � �������� �� ��� ��� � ��������� � ���� �������� ��� ��� � ����� ��+������?��� � ��������� ������ �� �� ����� ������ �������� ��+����� �� �;=!� /���� @-2�1� %�� ����������� ������ ����� ���� �����#����� @-2 ���M��� �������������� ����� %���� ������� �� ������� ����� ��������� � ���� ������������ ��#+����� �� ������� �� ���� �� ������� ������� �� ����� ���;=!� �� ��� � �� ��+����� � ����� � ���� ����� ���������� �� ��������� ������ �� ������������ %���������� � �� ������� �� �� ������������ �� ���� � �������� ����� � � �� ������������ �� ��L���� ��������� � � ������� � �� ������� ������� ���� ��� ��������� �� � � ����� � �������� ��������� 2���� �� �� ����� ���� ����� ��+��#��� �� ������� �;=!� � �� � ������ ���+���� ����+�� ������� �� ����� �� ������� � �� ����� ������� ��������� %������ ��� ���� ������� @-2 ���M������� ��� ��� � ����� �� �������� � ������� ������ ������ 2�� �����#���� ���������� �� �� ��������� � �������� ��� ���� �� ����� ���������� � ����� �� �� � �������� �������� � �� �������� �������� �� ��������� !������ �������� �� � ������� � �� �� ���� ���� ���� ��� �� ��������� ����� �� ��� �� � � ������� �� �����#���� �����#����� �� ������ � �� � �� ��?��� ������ � �������� ����� ����� ���� �� ���� � ��������� ��� �� ����#���� ���� � ��������� 2���� ��� �� ��+���� ������� �� ������� ���� ��� ��� ��� ������ �� ��������� ����� �� ���� ���� � �� ����� ���������������������� ���� � �� ���� �� ��+���� ��������

��� ���� �� @-2� ���� ���� ���� ��� � �?��� � �������������� ������� � ��� ����� B���� �� ��� �� ����� ��+����� ������� ���� ������� �� ������������������ ������ �� ��?������ ��������� ����+������ ������� �� ��� ����� �� ���� � �� �������� ��

���� ������� �� ��� ���� ������� ����� ���������@-2 ���M��� ������� � ��� ��� � L��� �� ����+���� ��������� !� ���������� ����� �� @-2����� ��� ��� ������ � ���� ��������� �� ��� �� ���� ���� ����#��� �� ��� ������� ����� �� �� �#���� ����+���� �� �� ������� ��� ������ B�� ��@-2 ���M��� ��� ������� ��� �� ���' �������$���������� �� ��������� ������ ��� � ������� �������������� �� ��� ��������� �� �������� ����������� ���� ������ � �������� %������ �� @-2� ������ �� ���� ���� ��� ����� ������� >������������ ��������� ������ �� �� @-2� �� �� ������������ ������ ���������� � ��� ��� ��� ������������ �� ������� ���� � �� ��� ����� ���������-� ���� ������� @-2 ���M��� ��� �������

�������� ! ���M�� � 5��� 0� ����� ��� �� ;�5�$����� B� ����� �� ��+����� &� �� �� ��� �����������$�� ���� �� 51 ����"�� �� ���� �� ��������������#��� �� ���' �������$��� � ������ ��������������� -� ���� ������ ����� �� � ������� �����+������ �� ������� �������� �� � ������� � ������ /��JCC�������������M�C�����1� ! ����#����� ���� � �?�� ��� �1 ������������ �� ��� �� >��������=������� -��� � 5��� 0� ����� /��JCC�����$��������#�����M�C1� -��������� �� ���� �1 ������������ @-2���M��� ��� ������� � �� ��������� ����� �� ;� ��#������ ,������ /�;, � %����1� ��� �� ;� >�����6������� �� �� 0� ����� �� >��� � /����1� ��� ��>�������� *������ G���� � ����������� ��� ��;�-�2���� ���M��� ��� � ��+���� �;=!� ����� ������� ��������� �� ��� ��� ! ���������� � @-2 ���M�� ������� 0� ����� �� 7�������� � -�� ,������ /B�7�-�:����������1 �� -����� 0� ����� /!��� -����:����������1 �� ��+����� �;=!� ���� �������� ������� �1 ��������� ! �� ��� �� ������ ������������ �&((������#���� �1 �������� �;=!� �� � ��� ��+����� ��� ������ %���� �?��� ��� �� �1 �������� @-2 ���M������ ����� � �������� �������� ������ �������������� �� �������

� ���������� � ����� ��� �� �� ��� ������ ������ �� ��� �� � ��� ��������� �

����#����� ��������� 2�� ��� ������� ��� ��������� ��� ��������� ����� �� �������� �� �� � ���������������� /���� ���� ���� �� ���� ������� � ������� ���������� � ������� ���� ���+���� �� ����#������$���1� ������ �� �� ������ �� �� ���� ����� �� ��� ������������������ 2�� ������� �� ������ �?��� ���� ����� ���� ������ ������� �� ������������ ����� �� ������������ �� ��� �� ������ ���������� � ���� �� ������� ������� ��� ����� ���� �� ������� � �����#����%�� �� ���� �������� ���M��� ����� � �� ������

����������� ����� ���� �� �1 ������������ �� �1 ����������� ������� � �������� � -�� ,������� =����� ��5���� 2�� ������ �� ���� ���� � ����#������$� ����� ���������� �� ����� �� �������� ��+����� � ���� ������ �������� N��� ��� ��������� � ��� ���� ���M������ �� ����� ������� ������� ��� ��������� ����������#������$�� ���� �� � � ��� ���� ������� ��� ��M� ������ �� ���� ��� ������ �� ��� ����� ������������ ���� ���� ������ �� ������ /����1 �������

�&3( >� -����� �� ����� ������������ ������$� �� ��������� $%� ����

0%��1�����1 41 �$1 �� 1 , /�((�1

����� ���� ��� �� � �� ���������� ���� ������ �������� �������� �� ����#������$����� �� ���� �� �1 ��������� � �� �������� ���M�� ��

������� ���� �������� ������ ������ /���� ��4(1 ���� ��� ������ 7�������� �� >��� -���/B������ -��1� ����� �����"�� �����������;=! /�!>;1 ������� �� ���� ��� � ������ �� ��������� �������� �� � ������ �� ������ �� ����#�������� ���� ���� �1 �������� ���������� 2�� ������� ������������ ��� � ������ �� �� �������������������� �� � ��� ���������� ������ ����� � ����#�������� ����� ������ �������� � ������ �������� ������ 7�������� �� � � ������ ����������������� Q������ �� 7�������� �1 ��������� I�� ����#������� ����� ��� ����������� �� ���� �� � ������ ������� ��� �� �� �1 �������� ����� ��� �(('&(( �����#���� ��������� ������������ ������� /I��� �� ��1�9391 ������� ���� �� �������� ������ �� @-2��B������ �� ������ @-2� ���� �� ���� ���� ������ �������� ������� �������� ���� �� �����"�� ���������� ������������� /!%6>�1� �!>;� �� �����#��������� ��� ������ ������� 2�� ������ @-2� ������� ��� ��� ����� �� �� � ����� �� ������� �������� ����� � ������ �� ���� ����� �� � ��������� ������� ���������!���� � ���������� ���� ������������ ��������

����� ����� �� �1 ������������� �� ���M��� ��� � ��������� =����� �� 5���� %� � ����������� ��������������+����� �� � ��� ������� � �� ����� �� �1 ���������������� ���� ��������� � �� *��� �� =������ 2����������������� ���� ���� � ���� ���� �� ��� �� ������������������ �� ����� �3 ������� � 4( ��� ������� ����������� �� �!>; ������� ��� �� ���� ������� ��� � �� ���������� �� ����� ����� />���������� ��1 �(((1� ! �� 0� ����� �� 5���� ���������$����� ����� ������������ � �� � ����� ��������� �Q��� ��� ��������� �� ������� ��� �� ��������#�� �� � ����� ����� ����� �����$������ ����� ���� �� �!>; ������� /5�� �� ��� �(((1�

�� !��� ����� � ������ ��� �������� ��������

I�� ������ � ������ �� �������� ��� ���� ��������� ���� �� �� ���������� � ���� �� �����#����� �� ���������� �� ���� ������ � ���������N��� ��� ����� ������ �� �� �� ������ �� ����� �������� �� ����� ����� �� ��� ���� ��� �� ������ ����� ���� ���������� � $����"�� ������ ��� ��� ������ ��� ��� � ������� ��� ��� ��������� ���������� ������� ���� �� � ����� �������� �� ������������� ��� �������� >������ �� ��� ����� ��� �� ������������ � ������ �� �� �������� ��������������� ������ ��� �� ����� ����� �� L���� ������;=!� �� �� /�������1 ������������� ����"���� ���� �������� ���� � �������� ���������� ������� �� �������� ;=!� !������ ������ ;=! �� ����� �O��� ����� �� @=0� � ��� �� �� � ����������� � ��� � �� ������� �� �� ����� ��� �� ������#��� �� ��+����� �� �� ������$�� ���� %�� ����������� �������� ��������� ��� � =��� -���:���������� � 5��� 0� ����� ��� ��� ���� ���� �� ��#����� �� ��������� �� �������#����� ������� ����� /-� 7���� �� =� -���� ������� ����������1�

�������� ��������� �������� � �������� �� ���?���� ���� ��� ��������� ���� /!������� �� ��1�9991� ��+����� �� ��� ������ �� ������ �� ���������� ���� ��� ���� ����� 2���� �������� ��������������� �� ������ �� ������ ��� ������ � ���� ������ � � ���� ���+����� �� ��� ����� � ���������������� � $����"��� � ����� �� ���������� ��������� �� � ��� ����"�� �� ������� ������ ����������� /���� 5������� �� ��1 �998. -�����# ����� �� ��1�9981� ������� � ������ ��� �� ��� ���� ��� �������"�� �� ������ ����� ������� ���� �� �!>;��� !%6>� �������� �� ���������� ������ /����;�� � �� ��1 �(((. K��� �� ��1 �9931� � �� ��� �������� ���������� ������� �� �� ����������� ������#���� � �� ���#�������� 2�� �� ������ �� $����#"�� ������ ���� ���� �� ������ ���� �� ����� �����@-2� �� ������� ������� /���� �!>;� �� !%6>�1������ ���� ������ ���������� �� ������� ����������� ��� ������� ���� ��� ��� ������ /2���� <N����� �(((1� ! ����� ��+����� ����� ���� �� �������� �� ������ ���� � ������ ������� 2�� �1 �������7����� ����� ���M��� �� � ������ ��� ������ �Q��� �� �� 0��� -��� /=� -��� �� � 6� ���������� �����������1�7� ����� ������� ���������� �� � ��� �

�������� ����� ��� ��� ����������� �� �� ����#���� �� ��� ���������� !������ ����� ����������� ������������ ������� �� ������� �� �O�������������� � ��������� � ����� ������� ����� ���� ����� ��� L������� ������� �� �������� ������ �� ���� ������� ���2� ��� ���� �� �� � �������� � ��� �������� �� ���������� � ������ ������M���� �� ������#������ ������� � �1 ������������ �� �1 �������� ������1� ��� ����� �������� �� ��� � ��������� � ���������� ���� �� ���� /%�M����� < 2������� �(((1 ���������� ������ ��������� ������ �� ���� ����

�� ��������� �������

2�� �� ��� ����� ���� �� ������� � �� ������ ������ ����� ������ �� �������� ��� ������ �� ������������� �� ������� �� �������� ������� 2�� �����#�������� �� ����� ��������� �� �������� ��� �� ��� ������������ ������� ������� ������� �� ��� ��#���� ����� �� �� � ����� �� �� ��������� I� ���� ��� �������� �� �� ��� �� �������� ��������� �� ����+������ �� ����������� �� � ����� �������� � ������ � �� � ������ � ���� �������� !������ ���� ��� �������� ����� ��� ���� ����� � �� ������ ������� �+������ ���� � ����� ��� �� � �� �� ������ �� ������ �������� �� ����� �� ������ ���� �� =� ����#����� �� ���� ��������� �� ���� ��� �� ��� �� ����#������ �� ������� ������ ���� ������������������� �� ����� ��� ����� ����� ��� ����� � �������� � ������ 2�� ��� ����� � �� ���� � �� ������ � ������� �� �������� �������

B� ��� >� 7����� -� 7����� -� 5��� !� 2������ >� 6������� � 6� �� �� =� -��� ��� ����� ������ ���������� ����#����� >�-� ����� �� ������ ���� �� @������ 7����������� @������ �������� ,������ I����$���� 2�� �����-����� �� �� 7����� �� ,��������� B��� � �1 �������� ���������� �� ���� ���� �� 0- =����� ������ �� N������ �� =����� -����� %������ �B�7�-�

������������ ������$� �� ��������� $%� ���� >� -����� �� ����� �&3�

0%��1�����1 41 �$1 �� 1 , /�((�1

����������

!�������� !�� ,������� -�� *������ *�� 7��� B�� -�� K��2������ 5�� %������� -�� N����� � < N������ =� �999! �����#����� �������� ��������� ����� � $����"�������� ���1 ��� �8��'�8�H�

,������� ,��993 ����� ����� �� ���� ������� � ����������%�! ���� ������� �������� �'��1��1 ���� ���1 ��� 8�'��8�

,����� -� �98H 2�� ������ �� �����%�! ���� �������� ������$� ���8�'9H�

,���� Q� < 6������ 7� 7� �((( ������� �� ������� � ������#�$��� �� ���"� ����� �� �������� �������� ���������������� �� ���� ���������-�1 4��� 1 ���1 ��� �(9'��4�

7������ 6� �338 7������� � �:����������� ������ � �S ���#����+�� ��� !������ ������� 91 ����1 0%����1 :0����; ��� �48'��9�

7����� @� *� �9(& 2�� �����$��� �� ����#������ �� ��������� ���� 91 �$� 1 +��1 �$�1 :0%��� ���%��; ��� �'��9�

;� *�������� !� < 6� ��� � �993 !������ �������������� �� ������ �� �� ������� ���� ���� �'��1 <���1 �����1���1 �� H&8'H4��

;�� �� !� /�� �9 �����1 �((( >������� ����� �� $����"����������� � ����"�� � ����� �� ������� ��� ��������+��'�� � �� 884'83��

%�M������ � < 2�������� 5� �((( 7��������$��� �� �������� ;@!;#��� ���� ��7�����J �����"� ��������� ��� ���� ����� �� �� ��=! ������$��� � �� ��������#��� ���������� � ����� �������� ���1 ����� ���1 �� 4H'8��

N������ � @�� N�� �� 5�� B������ 7� < 5������ 7� ,� �99������� �� ������ ������� �� L��� ���� �� ������������� �� $����"�� � ���� ������ ���� ��� 99'����

������� 5� < -���� =� �993 T���� �� ���������$�� ����������� �� ��������� ��� �� ���� �� ������ �� ����������#�����"� ��� ��������� �� �� ������� ����������1 ����� ���1 � �� �&�'�&4�

5��� -�� 7����� -� < -���� =� �((( *���� ��������� �� ��������� � ����� �� ���� ��������� �� �� ������� ����#��� ���� ������������ �� ����� �� !>#>7�� -��1 ����$%��1-��1 ����$%��1 �� &3'48�

5��� � 6�� K���� A� < ,������� � �999 >�����$������� �������� � �� ��7����� -��J �=! ������$��� ��� ���� ������ �������� ��� &H4'&&8�

5�������� A�� 6��� 5� N�� K�� 6�� N������������ � <-�����# ������ -� �998 2�� ��������� ���� �� $����"�������J , >� ����� �� ������� ����� ����� ����� ����������� ���������� ���� HH&8'HH44�

5���� ����� !� �344 @������������������ ��� �������!�������-��1 �$� 1 �� 0�����!'��� ���1 = � � �'�9�

�������� A� < -���� =� �99& 0��� ����#����� � ��������������� ��� ���������� ��� �� �� ������ �� � �������#�����"� ������� ���������� � �� ������� �������� ���1����% ��>��1 ��� �48'�8��

����� !� < -����� � �999 *�� �� ����� ���������� � ��������J �� ��#�#���� /#�#���� � "��1 ���� �� ��� ����� �� � �� ��� ������� �'��1 <���1 ���� ���1 ���499'8(H�

������� ;� � < 7������� �� Q� �93& %������ �� ��������� � �� �� ������� �������� 91 ��!���1 �6�1-��%�1 ��� �'�8�

����� ��� ;� ��� -� B�� 7����� %� < -���� B� 7� �999������� �� �� �������� ���� �� �� ������� �������������-�1 ���1 �����1 ���� �99'�(4�

������ � 7� < =F�����#G������� 7� �99� ���������������� � ������ �������� ���� ������� � $����#"��� �'��1 <���1 �����1 ���1 �� 4H3'4&H�

������ � 7�� N������������ �� N�?��� >� < =F�����#G������� 7� �99H 6����#����� ��������� � �� $����"��J ������� �� ���� �������� �� ������ � � �������� �'��1���1 �� �39'�(��

=������ A�� ����� �� < -���� B� 7� �999 ������?���� ��� �� ������� �� ������ � �� ����������� ��������� ���������� ���� ��9�'��(��

=������� N� �994 G����� ��� �������� ������� ����������� �� ���������� ��� �����"���� �� ����� ���������� �������� �� �� ������� 5��$���%�� ����"�� ���������� ������8�'��89�

=������� N� �998 7��� ��� �����"���� �� ������$�� ������������������ �� ���� �������� � ������� �������� ,��14��1 ����1 ���� �H&'�(4�

=������� N�� �������� Q� < =�������� 2� �999 ����� ���#������� ������ ��� ������� �� ��+�� ���� ��� ����� ������ �������� �'��1��1 ���� ���1 ��� �'�8�

=F�����#G������� 7� < B��������� @� �93( ����� �?��������� ����� �� ������� � ����%���� +��'�� ����89&'3(��

I���� �� -�$����A�� -������ 2� < N������� 5� �939 ����� ������� � ������ �� ��� ������ �� ;=! ���������#���� ���� �� ���������� ���� ������� �����$� ��38H'389�

>������� %� < -�����# ������ -� �999 ! ���������#���������� ��� ������#�?�� ���� � �� $����"��� ���� �����-��%1 ���� ���1 � � �'�(�

>������� %�� 5��� N�� �������� N� �� -�����# ������ -� <=�U �����#G������� 7� �999 ! ����� � �� $����"��������#�?�� ��� ��!�� �?��� ������ ������� �� ����=! ������$���� �'��1 ���1 �� �H��'�HH(�

>��������� *�� >��������� � < ;� 6����� �� �((( >�������J ������� �� ���������$��� �� ������������ ���� ��� ������� ���� �������������-�1 �$�1 �� �9�H'�9�4�

��������� %�� ;M����� 7�� ;��������� ��� ��� ����� 7� <-����� 7� �999 >����� �� ���������� �� ������� �������#$���� �� �� ������� $���� ����� ������$��� �� "���� ����� ���������� ���� ��(�'���8�

-�������� A�� I��������� � < ������ 5� B� �993 5����72J� �������� ��������� ������� ��� ��� ��� ��������������$��� � ����� �������� ,��1 91 ���� ���1 ��� &8�'&89�

-���� =�� !����� �� < -���� A� �994 ! ������ ������������ ��� �������� ��?������� �� ������ ����� � ��������� ������� 0�$1 +��� �$� 1 �$�1 ��� ��� 9��&'9����

-���� A� < -���� =� �998 0������ �� ���? * /���7*1� ���7@����72� �� ���7�J ������ ���� ��� ������$�� ��=! ��� ������� ������� ���� ���1 ���� H48'H3��

-�����# ������ -�� 6��� 5� Q�� � ���� !� >� <N������������ � �998 2�� $����"�� �����$�� ��+�����$%� ��� +��'�� ���� 34�'34��

-����� !� �994 *�/��1� ���������� � �� � ����� �� ����� ��������� �'��1 <���1 �����1 ���1 �� 8�&'8���

-�����#5��$��� 6�� -������ !� %� < ;��� ��� B� �99H @O������� ��� �� @=0#������ ������ ���� �� $����"�� ����#���� ������$� ���� �H(�'�H�(�

-������ >�� N��������� 7� >�� 7����� >�� 2������ !��*������� >�� ����� ��� >��� � �� < ;� -���� �� �(((! ������� �������� � �� ���� �� �� ������ �� ������������� ���� ������������ /2������ 7������1� ��������� �8�'�84�

- Q����� ;� < =F�����#G������� 7� �99� 2�� ����� ������ �� ������� � �� ����%��� ������� ���� ��� �(�'��9�

2����� B� -� < N������ =� �((( K����"�� ������ ��������� ������� �� �� ������� ������ ����� ���1 ���8&&'84��

A������� -�� �������� A� < -���� =� �994 0������ �� ���?� �� �� ������ ��� ������ � ������$�� ����� � �� ����#��� ������� ���������� ���� �((&'�(�&�

K���� Q�� 2����� B� -� < -������ !� %� �993 >������� ���������"�� $����"�� ��#���� ������ �� � �������� � @*%#������ ����� ��+����� ����� ���������� ���� ��� �H�'�&��

�&3� >� -����� �� ����� ������������ ������$� �� ��������� $%� ����

0%��1�����1 41 �$1 �� 1 , /�((�1