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Università degli Studi di Torino / ASL TO2
Dipartimento di Scienze Mediche, Malattie Infettive Laboratorio di Farmacologia Clinica e Farmacogenetica
Padiglione Q, Ospedale Amedeo di Savoia, C.so Svizzera 164 10149 TORINO (Italy)
Web Site: www.tdm-torino.org e-mail: [email protected] UNI EN ISO 9001:2008 CERTIFIED LABORATORY
Development and validation of an UPLC-MS/MS
method for Sildenafil and N-desmethysildenafil
plasma determination and quantification
Debora Pensi, Marco Simiele, Daniela Pasero, Francesca Ivaldi, Mauro
Rinaldi, Giovanni Di Perri, Vito Marco Ranieri, Antonio D'Avolio
1986 : sintetizzato dalla Pfizer in Inghilterra come inibitore della
fosfodiesterasi 5 (PDE5)
1996 : viagra brevettato dalla Pfizer
1998 : approvato dall’FDA per la cura della disfunzione erettile
2005 : approvato da FDA e EMA per il trattamento ipertensione
polmonare arteriosa di classe II e III
Sildenafil
2013 : termine del brevetto della Pfizer possibile commercializzazione di farmaci generici contenenti il sildenafil
inibisce Non inibisce
PDE 1
PDE 3 PDE 5 PDE 6
PDE 9
PDE 2 PDE 7
PDE 8
PDE 5 A1 875 aa
PDE 5 A2 833 aa
vescica, colon, prostata, corpo cavernoso, piccolo intestino,
stomaco, condrociti, muscolatura liscia dei vasi
Sildenafil e N-desmetilsildenafil sono inibitori selettivi delle fosfodiesterasi
Guanilato ciclasi
5’-GMP
cGMP
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+
NO
Ca2+
PDE
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Meccanismo d’azione del sildenafil
Muscolo vascolare liscio
Piastrine
Intestino
Corpo cavernoso
Vescica, Colon, Prostata, Placenta
riduzione transitoria della pressione sanguigna sistemica
azione antitrombotica aumento rischio emorragico
riduzione traffico intestinale reflusso gastrico rilassamento sfintere gastro-esofageo
solo in seguito a stimolo sessuale rilascio di Ach NO ↑[cGMP]
Retina (PDE-6) incapacità temporanea di distinguere blu-verde
Farmacodinamica
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Assorbimento
Distribuzione
Eliminazione
Metabolismo
somministrazione orale a digiuno a livello del tratto gastrointestinale 30-120 min raggiungimento Cmax
volume di distribuzione SIL circa 105 L SIL e N-desmetil legati a proteine del plasma legano sostanza nera, pelle, retina
SIL metabolizzato a livello epatico a N-desmetil metabolita secondario UK150,564 CYP3A4 e CYP2C9 anche l’N-desmetil viene metabolizzato
eliminato principalmente nelle feci eliminazione in misura minore nelle urine tasso di eliminazione è 41L/h
Farmacocinetica
Infusione endovena
TEMPO INFUSIONE = 15 min C max = 15 min T max = 15 min
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Bosentan
Cimetidina
Eritromicina
Indinavir
Ritonavir
Saquinavir
Beta-bloccanti
Succo di pompelmo
Induttore del CYP3A4, co-somministrazione aumenta metabolismo sildenafil
Inibitore CYP3A4, co-somministrazione induce aumento del 56% delle concentrazioni plasmatiche di sildenafil
Inibitore CYP3A4, co-somministrazione induce aumento del 182% delle concentrazioni plasmatiche di sildenafil
Antiretrovitrale, co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil
Antiretrovitrale, co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil
Antiretrovitrale, co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil
Co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil
Co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil
Farmaci che possono interferire sulla farmacocinetica del sildenafil
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PAH: ipertensione polmonare arteriosa
Malattia rara (2/1000000 abitanti) Associata a malattie del connettivo, del fegato, HIV, cardiopatie congenite, trombo-embolia polmonare Aumento pressione polmonare Malattie del sistema vascolare (casi gravi)
Stanchezza Sensazione di affanno Ritenzione liquidi
Vita quotidiana compromessa
Il cuore destro si dilata e non risulta più in grado di pompare sangue nel
circolo polmonare
Trattamento sildenafil di pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca per :PATOLOGIA DELLA
VALVOLA MITRALE PRESENTANTI IPERTENSIONE POLMONARE SEVERA
Studio clinico 2013 (ancora in corso) presso La Città della Salute (presidio
Molinette) di Torino
Scopo del lavoro
Messa a punto e validazione di un metodo bioanalitico per la
quantificazione plasmatica (con finalità cliniche) di sildenafil e N-
desmetilsildenafil
rapido e preciso
adattabile alla pratica clinica
sensibile e specifico
Assenza di metodi QUANTITATIVI dedicati Indagini antidoping
2013 termine del brevetto della Pfizer
farmaci generici contenenti il sildenafil
UPLC vs HPLC
Fasi stazionarie con particelle < a 2µm
Velocità delle analisi aumentata di 2-3 volte rispetto all’HPLC
Efficienza separativa e alta risoluzione
Sensibilità e produttività
Riduzione lunghezza colonna
Riduzione dimensioni particelle
Aumento delle pressioni da 6000 psi a 15000 psi
15000 psi
QC H QC M QC L
750 ng/mL 100 ng/mL 10 ng/mL
Cal 9 Cal 1
1000 ng/mL 3,9 ng/mL
Controlli di Qualità e Curva di Calibrazione
Concentrazioni uguali per sildenafil e N-desmetilsildenafil
Pensi et al.,2014 Submited
5,06 min
6,06 min
5,11 min
Cromatogramma di un mix chimico (sildenafil, N-desmetilsildenafil e quinaxolina alla concentrazione di 10µg/mL)
Run Time 10 minuti
Pensi et al.,2014 Submited
Validazione del metodo secondo linee guida FDA (2013)
PRECISIONE
ACCURATEZZA
Misura la distanza tra i vari valori misurati, espressa in CV%
Misura la distanza dei valori misurati dal valore vero
STABILITA’
SPECIFICITA’
Calibratori, controlli di qualità, campioni devono essere stabili fino al momento delle analisi
Capacità di riconoscere l’analita d’interesse senza interferenze da parte di altri farmaci
LLOD
LLOQ
Limite minimo di rilevazione (3 volte rumore di fondo)
Limite minimo di quantificazione (RSD<20%; 5 volte rumore di fondo)
Recupero Efficienza della procedura estrattiva
Effetto matrice Rumore di fondo causato da analiti che competono con l’analita d’interesse
ULOQ Limite massimo di quantificazione
FDA RISULTATI
PRECISIONE CV % < 15% 5 prove intra-day :(8,26-2,58%) e 5 inter-day(1,02-3,25%)
ACCURATEZZA < 15% -7,16% - 9,01%
Curva di
calibrazione
deviazione % dalla conc nominale
<15%, per Cal 1 <20%;
Coefficiente di regressione >0,995
r2 = 0,995-0,999
Deviazione % dalla concentrazione nominale <15%, per tutti
i calibratori
STABILITA’ _ Vos et al., 2008 : stabili per 6 mesi a -20°C
SPECIFICITA’ No interferenze 6 campioni di plasma bianco, senza interferenze
LLOQ RSD%<20% ; almeno 5
volte rumore di fondo
3,9 ng/mL (= CAL1)
LLOD almeno 3 volte rumore
di fondo
1,95 ng/mL (diluizione 1:1 CAL 1)
RECUPERO Costante per ogni
campione (>70%)
Recupero medio per sildenafil 83,2%
Recupero medio per N-desmetilsildenafil 84,5%
Effetto Matrice Assente (<20%) 6 campioni di plasma bianco ricostituiti, deviazione
percentuale 3-4 % effetto matrice <15%
Risultati della validazione
LLOD
LLOQ
sildenafil sildenafil
QC M
PLASMA BIANCO RICOSTITUITO
MIX CHIMICO
QC H 1,2µg/mL QC M 160 ng/mL QC L 16 ng/mL
Pensi et al.,2014 Submited
Applicazione del metodo
20 pazienti dell’ospedale La Città della Salute presidio Molinette (studio clinico di Fase III)
somministrati 10 mg di sildenafil per via endovenosa
(ogni 8 h per un massimo di 72h)
Prelievi ematici
T0 -15 min (Ctrough) T1 20 min (Cmax) T2 1 h T3 4 h T4 8 h
steady state 1° infusione
Tutti i campioni dei pazienti sono stati analizzati in doppio I valori delle concentrazioni plasmatiche dei
pazienti rientrano nei range di curva
Pensi et al.,2014 Submited
Parametri farmacocinetici allo steady-state dei pazienti analizzati
Cmin
Cmax
AUC
emivita
Volume distribuzione
Concentrazione più bassa di farmaco nel plasma tra una somministrazione e l’altra
Concentrazione più alta di farmaco nel plasma tra una somministrazione e l’altra
Area sottesa alla curva nella concentrazione plasmatica nel tempo
(t1/2) tempo di dimezzamento necessario affinchè la concentrazione plasmatica di farmaco si dimezzi
Valore correlato alla concentrazione plasmatica rispetto alla concentrazione totale di farmaco
sildenafil N-desmetil
38.0 ng/mL
[31.7-93,0]
52,50 ng/mL
[38,75-85,75]
328,50 ng/mL
[177,0-475,2]
74.0 ng/mL
[55,7-101,5]
655,7 h*ng/mL
[535,9-1249,9]
493,5 h*ng/mL
[352,83-717,8]
5,1 h
[4,0-5,5]
15.4 h
[14,7-15,7]
75,2 L
[57-128]
403,3L
[385-615]
Pensi et al.,2014 Submited
primo metodo sviluppato su sistema UPLC-MS/MS
seguite le norme UNI EN ISO 9001: 2008 (progettazione e sviluppo metodi)
validazione del metodo seguendo le linee guida FDA 2013 separazione efficace del sildenafil da N-desmetilsidenafil (metodo molto specifico) alta sensibilità (nonostante il piccolo volume di plasma) assenza di effetto matrice e buon recupero
rapidità e affidabilità: analisi adatta alla pratica clinica
Conclusioni
Conclusioni
tutte queste caratteristiche rendono
questo metodo utilizzabile nella routine di laboratorio e, in base alle
necessità dei clinici, per un futuro TDM plasmatico del sildenafil
Sviluppi futuri di questo lavoro
Ricerca dei polimorfismi genetici che correlino con le concentrazioni plasmatiche degli analiti in oggetto:
per prevedere a priori le concentrazioni del sildenafil e del suo metabolita
per spiegare le eventuali differenze inter-paziente
applicazione di tale metodo anche ad indagini anti-doping