Dal campione al risultato: valutazione delle performance

analitiche di Helios System nella determinazione di ANA e ANCA

Nicoletta Gallo UOC Medicina di Laboratorio Azienda Ospedaliera di Padova

Ricerca di ANA quale metodo? ACR ANA Task Force Reccomendations

(Meroni & Schur. Ann Rheum Dis 2010;69:1420-1422)

“The Task force has reviewed the

relevant literature published to date and

has concluded that solid phase

immunoassays may not be appropriate at

present for replacing IFA as a screening

test for the detection of ANA”

Il metodo IFA su cellule Hep2 è il gold standard per la ricerca di

ANA data la maggiore sensibilità vs i test in fase solida

Metodi di riferimento per la determinazione degli ANA

• Metodo di riferimento: immunofluorescenza indiretta

• Substrato consigliato: Cellule Hep-2 (ATCC-CCL-23) che consentono di evidenziare: titolo di positività

tipo di pattern fluoroscopico

• Titolo di screening consigliato: 1:80

• Lettura consigliata: a 400x

Cellule Hep-2: vantaggi • Substrato più sensibile:

identificazione di molti pattern

• Origine umana: miglior specificità rispetto ai tessuti animali

• Nuclei più grandi: si possono osservare anche dettagli nucleari complessi

• Il monostrato cellulare assicura la visualizzazione di tutte le strutture cellulari, nucleari e citoplasmatiche

• Elevato indice mitotico: gli antigeni associati alla divisione cellulare sono facilmente rilevabili (es. centromero, fuso mitotico)

• Le cellule non sono racchiuse in una matrice intercellulare: ridotta autofluorescenza

• La distribuzione degli antigeni è uniforme

• ini

ANA QUADRI FLUOROSCOPICI E PATOLOGIE ASSOCIATE

QUADRI

FLUOROSCOPICI

PATOLOGIA ANTIGENI

ASSOCIATI

QUADRI

NUCLEARI

CLASSICI

OMOGENEO LES dsDNA/ISTONI

FINEMENTE PUNTEGGIATO S SIOGREN, SSP SSA, SSB

GRANULARE MCTD Sm, U1-RNP

CENTROMERICO CREST, SCLERODERMIA

LIMITATA, RAYNAUD

CENP-B

NUCLEOLARE SS, SSP FIBRILLARINA, T0/Th,

RNA polimerasi I

GRANULIA DIFFUSA SCLERODERMIA

DIFFUSA

SCL-70

QUADRI

NUCLEARI

RARI

MULTIPLE NUCLEAR DOTS CBP Sp 100

FEW NUCLEAR DOTS S SJOGREN P 80 COILINA

LAMINA NUCLEARE CBP, LES LAMININA A,B,C

PCNA LES CICLINA

QUADRI

CITOPLASMATICI

RIBOSOMIALE LES PROTEINA P

RIBOSOMIALE

PUNTEGGIATO FINE POLIMIOSITE JO-1, PL7, PL12

MITOCONDRIALE CBP AMA-M2

CITOSCHELETRO-ACTINA EPATITE AUTOIMMUNE F-ACTINA

CITOSCHELETRO-

VIMENTINA

ARTRITE REUMATOIDE VIMENTINA

ANA in soggetti sani e in pazienti con LES: prevalenza

0

5

10

15

20

25

30

35

40 80 160 320

Healthy

SLE

Arthritis Rheum 1997;40:1601

QUANDO ESEGUIRE IL TEST ANA? • Non sorprende che il test ANA, come test di screening, non

abbia un forte PPV ed è spesso considerato un test over-utilizzato.

• Senza un forte razionale clinico il PPV è molto debole! Lo stesso dicasi per gli ANCA (Savige et al Am J Clin Pathol '99).

• Scoraggiare il test anche in casi limitati solo con forte sospetto clinico è pericoloso per il rischio di perdere alcuni pazienti potenziali (soprattutto per i non reumatologi).

• ANA può essere rilevato anche anni prima che la malattia conclamata (Arbuckle et al NEJM ‘03)

• Dato il costo di un singolo test ANA e l'eventuale costo diretto/indiretto di una mancata o ritardata diagnosi di una malattia autoimmune ANA-associata il rapporto costi/ benefici è a favore del test.

ANA 78%

Anti Ro/SSA 47%

Anti La/SSB 34%

Anti

fosfolipidi

18%

Anti ds/DNA 55%

Anti Sm 32%

Anti RNP 26%

Arbuckle MR, et al, N.Engl J Med 2003

115/130 pz con LES (88%) presentano almeno un autoanticorpo nel siero prima della diagnosi (in media 3,3 anni prima!)

ANA HEp-2 IFI: non tutto oro…

…. Ma anche zone d’ombra:

• Variabilità dell’analisi (isotipo del coniugato, microscopio, diluizione dei campioni, corretta preparazione dei vetrini)

• Soggettività interpretativa

• Automazione solo parziale

• Mancanza del consenso nella nomenclatura dei pattern

• Difficoltà di confronto inter-laboratorio

IFA DIGITALE

Standardizzazione dell’interpretazione dei vetrini ANA Hep-2 in IIF per migliorare l’affidabilità e la comparabilità dei risultati

Software d’immagine digitale per la lettura, la caratterizzazione e l’archiviazione

Inserimento in una piattaforma totalmente automatizzata per ridurre il tempo dell’esecuzione manuale

ANA Hep-2 IFA: standardizzazione meta raggiungibile Armonizzazione computerizzata della classificazione dei pattern

Hep-2 & creazione di un nomenclatore supportato da immagini digitali catalogate (Wiik AS et al. J Autoimmun 2010)

Possibile l’analisi della variabilità intra- ed inter –osservatore

Introduzione dell’automazione della lettura al microscopio dei vetrini Hep-2 (Aklides, EUROPattern, Helios, Image Navigator, NOVAView,

Zenit G-Sight)

Possibile l’analisi oggettiva

Valutare le prestazioni analitiche e il livello di accuratezza di Helios

system (Aesku Diagnostics, Wendelsheim, Germania) nella

preparazione, lettura (acquisizione delle immagini) ed elaborazione degli

anticorpi antinucleo (ANA) e degli anticorpi anti citoplasma dei

neutrofili (ANCA) .

HELIOS System (Aesku Diagnostics, Wendelsheim, Germania)

•IFA PROCESSING: esegue tutte le fasi del processo automaticamente

•SLIDE AND SAMPLE BARCODE READER: garantisce la tracciabilità del campione e del vetrino per tutto il processo

•BUILT-IN LED MICROSCOPE + IMAGE CAPTURE. Fotocamera esegue un autofocus high tech e le immagini sono salvate e archiviate automaticamente

724 sieri non selezionati

Processazione manuale

Preparazione vetrini (cellule Hep-2, Inova

Dianostics, USA)

Lettura con microscopio da parte di

due operatori

Refertazione su Lis

Processazione su piattaforma Helios

Refertazione Acquisizione immagini

Preparazione

Vetrini (Hep-2 Aesku,

Germany)

RISULTATI 1: ANA

IIF HELIOS

Neg Pos Failed

Neg

Basso titolo

Pos

84% ANA PPV 98% NPV con agreement totale del 94%.

174

168

382 372

58

27 143

105

8 2

5

4

Risultati discrepanti potrebbero dipendere da:

differenze del substrato e del coniugato utilizzato con le due metodiche;

differenze nel cut-off setting (Helios mostra però flessibilità nelle impostazioni di cut off, permettendo di dare preferenza alla sensibilità o alla specificità)

Valutazione dei campioni a basso titolo (aspetto raramente preso in considerazione)

ANCA

Il titolo ANCA CORRELA con l’attività di malattia

• In base ai diversi pattern ottenuti in immunofluorescenza possono essere distinti in

c-ANCA marker specifico di Granulomatosi di Wegener

p-ANCA riscontrati in alta percentuale in vasculiti sistemiche con glomerulonefrite idiopatica progresssiva (85-95%) si trovano anche nella poliarterite nodosa, snd di Churg Strauss, AR associata a vasculiti

p-ANCA atipici sono presenti soprattutto nelle MICI con una prevalenza variabile da 5-20% per il morbo di Crhon e dal 40- 70% nella rettocolite ulcerosa

• Esistono positività ANCA in alcune malattie non propriamente vasculitiche: malattie infettive (HIV, amebiasi, tubercolosi, epatiti, endocarditi), neoplasie (linfomi, mielodisplasie, ca colon e polmonari), silicosi, snd di Goodpasture, epatiti autoimmuni e CSP

RISULTATI 2: ANCA

IIF HELIOS

NEG POS

NEG 48 38 8

POS 93 10 85

TOT 141 141

European Vasculitis Group Recommendations (Villa Forte A., et al

European League Against Rheumatism/European Vasculitis Study Group

Recommendations for the management of vasculitis. Curr Opin rheumatol.

2010 Jan;22(1):49-53)

Sensibilità 90,3%, Specificità 81%

RISULTATI 3: ANCA

HELIOS

POS NEG

PR3 66 8 74

MPO 29 38 67

95 46 141

European Vasculitis Group Recommendations (Villa Forte A., et al

European League Against Rheumatism/European Vasculitis Study

Group Recommendations for the management of vasculitis. Curr

Opin rheumatol. 2010 Jan;22(1):49-53)

Sensibilità 69,5%, Specificità 82,6%

OSSERVAZIONI CONCLUSIVE

Helios è un processore automatico che include un sistema ottico

integrato per la lettura delle immagini, soprattutto dedicato

alla discriminazione positivo / negativo.

I risultati possono essere registrati, memorizzati e trasmessi

al sistema informativo di laboratorio.

La piattaforma Helios può ridurre la variabilità intra e inter-

laboratorio, migliorare efficienza di laboratorio e sostenere la

standardizzazione soprattutto nei laboratori caratterizzati da

elevati flussi di lavoro.

L'obiettivo primario della Medicina di Laboratorio è quello di fornire

informazioni utili alla formulazione della corretta decisione clinica, al fine di

contribuire significativamente alla qualità dell’assistenza sanitaria.

Tale obiettivo non può essere raggiunto che tramite la

produzione da parte del laboratorio clinico di risultati attendibili dal punto

di vista analitico e confrontabili indipendentemente dal laboratorio e/o dal

metodo utilizzato per produrli. Infatti, un’inadeguata prestazione da parte

del laboratorio può causare un’errata interpretazione e decisione da parte

del clinico, con gravi conseguenze per la pratica della medicina, per la

tutela della salute e, in definitiva, per il paziente stesso.

In altre parole, come recentemente ricordato, la standardizzazione dei

risultati degli esami di laboratorio racchiude in sé una dimensione etica

di grande importanza

«…quel vorticare di strumenti e di volti e di suoni che si trasfigurano nella

passione di creare, tutti insieme, quella che il protagonista chiama "l'armonia

suprema", è un'esperienza di profondo incanto, come capita di rado…»

IL CONCERTO