Determinacion de Cocos Pirogenos
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DETERMINACION DE COCOS PIROGENOS
1. INTRODUCCIÓN.- Los cocos gram positivos excluyendo las
enterobacterias, son los microorganismos más frecuentemente
aislados de muestras de pacientes y se han involucrado como
agentes importantes en procesos de enfermedades infecciosas
desde el año 1836. e encuentran ampliamente distribuidos en la
naturale!a y forman parte de la "ora microbiana normal de la piel
y las mucosas del hombre y de animales. Las infecciones en el
hombre se producen por contacto directo con individuos infectados
o portadores sanos, o por penetraci#n a trav$s de piel y mucosas
mediante ob%etos corto pun!antes por heridas, trauma o
procedimientos &uir'rgicos o por la acci#n de toxinas producidas
por cepas de algunas especies.
taphylococcus Los esta(lococos son c$lulas esf$ricas gram
positivas dispuestas en grupos seme%antes a racimos de uvas en
medios s#lidos o en pares, cadenas o t$tradas, en medios l)&uidos.
*recen bien en medios simples y de acuerdo a la especie producen
diferentes pigmentos+ blanco, amarillo y dorado y algunas de ellas
producen beta hem#lisis. on catalasa positiva, inm#viles, no
esporulados, con raras excepciones, no encapsulados y son
aerobios o anaerobios facultativos.
treptococcus Los estreptococos son c$lulas esf$ricas u ovaladas
gram positivas dispuestas en pares o cadenas cortas o largas. on
más exigentes &ue los esta(lococos, no crecen en medios simples,
por el contrario re&uieren de factores de crecimiento como la
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sangre y sus derivados. roducen diferentes tipos de hem#lisis,
caracter)stica &ue permite clasi(carlos en beta hemol)ticos, alfa
hemol)ticos o no hemol)ticos. -o forman pigmentos, son catalasa
negativa, inm#viles, no esporulados, con formaci#n de cápsula
variable. on aerobios y anaerobios facultativos.
nterococcus Los enterococos clasi(cados anteriormente como
una especie de estreptococos, son c$lulas esf$ricas gram positivas
dispuestas en pares o cadenas cortas. /l igual &ue los
estreptococos, re&uieren de factores de crecimiento como la
sangre y sus derivados. on capaces de desarrollarse en medios
&ue contienen altas concentraciones de -a*l 06.2 y de bilis0452. ueden producir hem#lisis de tipo alfa, beta o ser no
hemol)ticos. -o forman pigmentos, son catalasa negativa,
inm#viles, no esporulados, con formaci#n de cápsula variable. on
aerobios y anaerobios facultativos.
2. OBJETIVOS
Objetivo Gener!.
• roporcionar al estudiante el conocimiento cient)(co y las
habilidades prácticas de los m$todos y t$cnicas utili!ados en
7icrobiolog)a *linica para el aislamiento e identi(caci#n de las
principales especies de cocos pirogenos &ue afectan al hombre..
Objetivo" e"#e$%&$o".
• stablecer la diferencia entre g$neros de cocos gram positivos
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• studiar las caracter)sticas macrosc#picas, microsc#picas y
cambios producidos en el medio de diferentes especies de cocos
gram positivos
• *onocer algunas de las pruebas bio&u)micas de laboratorio
utili!adas para la identi(caci#n de especies de cocos gram
positivos
• denti(car especies de taphylococcus, treptococcus y
nterococcus
• studiar el caso cl)nico y aislar e identi(car el agente etiol#gico, a
partir de la muestra asignada de cada paciente.
3. MARCO TEORICO
. *atalasa+ la catalasa es una en!ima &ue descompone el per#xido de
hidr#geno 09:;: en ox)geno y agua. l per#xido de hidr#geno se forma
como uno de los productos (nales del metabolismo oxidativo o aer#bico
de los hidratos de carbono. i se de%a acumular, el per#xido de
hidr#geno es letal para las c$lulas bacterianas.
:9:;: :9:; < ;: 0burbu%as de gas
La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaob%etos o en
tubos, es muy com'nmente utili!ada para diferenciar estreptococos
0negativos de esta(lococos 0positivos.
*oagulasa+ la coagulasa es una en!ima prote)ca de composici#n
&u)mica desconocida, con actividad seme%ante a la protrombina, capa!
de transformar el (brin#geno en (brina, provocando la formaci#n de un
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coagulo visible en un sistema anal)tico adecuado. n el laboratorio, la
prueba de la coagulasa se utili!a más com'nmente para diferenciar al .
aureus 0coagulasa positivo de otros esta(lococos y micrococos.
La coagulasa se halla en : formas, =libre> y =(%a>, cada una de
las cuales posee diferentes propiedades &ue re&uieren el uso de t$cnicas
separadas+
*oagulasa libre 0prueba en tubos+ la coagulasa libre es una
sustancia seme%ante a la trombina, &ue se haya presente en los (ltrados
de cultivos. *uando una suspensi#n de bacterias productoras de
coagulasa se me!clan en partes iguales con una pe&ueña cantidad de
plasma en un tubo de ensayo, se forma un coagulo visible como
consecuencia de la utili!aci#n de los factores de la coagulaci#n del
plasma de manera similar a cuando se añade trombina.
?acitracina+ Las pruebas presuntivas en la identi(caci#n delb9@/ 0streptococo beta hemol)tico del grupo / se basan en la
susceptibilidad e inhibici#n del crecimiento en una placa de agar sangre,
y &ue tienen la mayor parte 0A2 de las cepas al ponerlas en contacto
con discos &ue contienen dosis ba%as 05.54B de bacitracina.
;pto&uina+ se usa el disco de opto&uina para diferenciar entre
. pneumoniae 0sensibles y otras especies de estreptococos a
hemol)ticos 0resistentes. La sensibilidad a la opto&uina es una medida
de la fragilidad de la membrana celular bacteriana. La opto&uina, &ue es
el clorhidrato de etilhidrocupre)na.
'. MATERIA(ES ) METODOS.-
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'.* MATERIA(ES
@uardapolvo
@uantes
@orro
?arbi%o
/sas de siembra desechables =;;>
ortaob%etos
*a%as etri
7echero
*ubreob%etos
apel madera
7atra!
7icroscopio
Cubos de ensayo
@radilla
Deringa
/gua destilada
'.2 METODOS
thaphylococcus. Eiagn#stico de Laboratorio
Las colonias de esta(lococo son fáciles de reconocer, relativamente
son grandes
Cienen de : a 3 mm o más, dependiendo de la edad del cultivo. Las
colonias son
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*irculares, convexas, de super(cie lisa, bordes enteros, cremosas,
blancas o
/marillas o doradas. ara iniciar la identi(caci#n además de las
caracter)sticas de
crecimiento tanto en medio l)&uido como s#lido y la coloraci#n de
@ram, se utili!a la
prueba de la catalasa &ue permite diferenciarlos del g$nero
estreptococo, el cual
carece de esta en!ima. ara identi(car especies se utili!an diferentes
pruebas dentro
de las cuales están las siguientes.
PRUEBAS BIO+U,MICAS
*/C/L//
rincipio
La catalasa es una en!ima &ue descompone el per#xido de hidr#geno
09:;: en
agua y ox)geno seg'n la siguiente reacci#n+
:9:;: :9:; < ;: 0burbu%as de gas
La prueba catalasa se usa con frecuencia, para diferenciar miembros
de la familia
7icrococcaceae de miembros de la familia treptococcaceae.
7ateriales
F *olonia aislada 07edio de cultivo sembrado e incubado
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F er#xido de hidr#geno al 32
rocedimiento
1. *on un palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia
a la
super(cie de un portaob%etos.
:. /gregar una gota de per#xido de hidr#geno al 32 y observar la
formaci#n de
efervescencia o burbu%as.
Gesultados
F ositiva+ Bna prueba positiva esta dada por la aparici#n rápida y
sostenida de
burbu%as o efervescencia.
F -egativa+ Bnas pocas burbu%as pe&ueñas despu$s de :5 a 35
segundos se
considera un resultado negativo.
F Halsas ositivas+ Los eritrocitos poseen catalasa, por lo cual debe
tenerse
cuidado de no tomar eritrocitos del agar sangre %unto con el material
de la
colonia.
*;/@BL//
rincipio
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La coagulasa es una prote)na de composici#n &u)mica desconocida,
&ue tiene
actividad similar a la protombina, capa! de convertir el (brin#geno en
(brina, lo &ue
da como resultado la formaci#n de un coágulo visible en los sistemas
apropiados. e
utili!a para identi(car taphylococcus aureus de otras especies. La
coagulasa se
presenta en dos formas, ligada y libre y para determinarlas se utili!a
dos
procedimientos+ en lámina y en tuboI si la prueba en lámina da
positiva, no hay
necesidad de hacer la prueba en tubo.
rueba en lámina 0*oagulasa ligada
7ateriales
F *epa en estudio
F Lámina
F lasma de cone%o
rocedimiento
F *olocar 1 gota de plasma sobre la lámina
F /gregar la colonia en estudio
F 7e!clar
Gesultados
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F ositivo+ La presencia de aglutinaci#n o formaci#n de grumos
F -egativo+ -o se observa aglutinaci#n, permanece emulsionada la
colonia
rueba en tubo 0*oagulasa libre
7ateriales
F *epa en estudio
F Cubo de ensayo con 5. ml de plasma de sangre de carnero
rocedimiento
F /gregar la colonia en estudio al tubo de ensayo
F ncubar a 3J* por 4 horasI si no se ha formado el coágulo,
reincubar por :4
horas a temperatura ambiente
Gesultados
F ositivo+ La formaci#n de un coágulo
F -egativo+ -o se observa formaci#n de coagulo, permanece l)&uido el
plasma
treptococcus
Las colonias de estreptococos son variables, dependiendo de la
especieI ara iniciar la identi(caci#n además de las caracter)sticas de
crecimiento
tanto en medio l)&uido como s#lido y la coloraci#n de @ram, se utili!a
la prueba de la
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catalasa &ue permite diferenciarlos del g$nero esta(lococo, el cual
produce esta
en!ima. ara identi(car especies se utili!an diferentes pruebas dentro
de las cuales
están las siguientes.
ruebas ?io&u)micas
?/*CG/*-/
rincipio
treptococcus pyogenes es sensible a ba%as concentraciones 05.54B
de
?acitracina.
7ateriales
F *epa en estudio
F /gar sangre
F Eiscos de ?acitracina
rocedimiento+
F embrar la colonia masivamente en cuadr)cula sobre una placa de
agar sangre
F *olocar un disco de ?acitracina y presionar suavemente
F ncubar a 3J* por :4 horas
Gesultados
F ensible+ La aparici#n de cual&uier halo de inhibici#n alrededor del
disco
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F Gesistente+ *recimiento alrededor del disco
*/7
rincipio
e basa en &ue treptococcus agalactiae produce un factor llamado
*/7 0factor
de monofosfato de adenina c)clica &ue aumenta la !ona de hem#lisis
producida por
algunas cepas de taphylococcus aureus productoras de K lisina.
7ateriales
F *epa en estudio
F /gar sangre
F *epa de taphylococcus aureus K lisina positivo
rocedimiento+
F embrar sobre la palca de agar una estr)a de esta(lococo K lisina
positivo
F erpendicular al esta(lococo, hacer una estr)a con la colonia en
estudio
F ncubar a 3J* por :4 horas
Gesultados
F ositivo+ resencia de una !ona de hem#lisis en forma de "echa
F -egativo+ /usencia de la hem#lisis en "echa
. PROCEDIMIENTO
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-ota+ e utili!an tres medios de cultivo para el esputo &ue son+ agar
7acconey, agar sangre y caldo de tioglicolato. n la práctica haremos
con agar sangre y caldo de tioglicolato
a. iembra en agar sangre 0para identi(caci#n de bacterias gramFnegativas y gramFpositivas+
acamos el agar sangre de la refrigeradora y esperamos a &ue
ad&uiera la temperatura ambiente
ncendemos el mechero de bunsen, colocamos las asas y las
muestras de esputo cerca del mismo
Comamos un cotonete de algod#n est$ril y tomamos un poco de
muestra de esputo en una lado del agar, luego tomamos el asa lo
estereli!amos en el mechero y luego de enfriar lo pasamos por el agar,
%usto en el sitio por donde paso el cotonete, estriamos en tres
direcciones alrededor de la ca%a
Capamos el agar y colocamos en la incubadora alrededor de 3JF
3MJ* y de%amos por :4 a 48 horas en la misma
Bna ve! transcurrido el tiempo de incubaci#n se reali!a la lectura
de la siembra y la interpretaci#n de la misma
b.iembra en caldo de tioglicolato
*on el cotonete de algod#n &ue se tom# la muestra de esputo y se
sembr# en agar sangre, introducir un poco de la misma en el caldo e
incubar de 3N a 3MN* durante 48 horas.
ste medio se usa para determinar el efecto del ox)geno sobre el
crecimiento microbiano. Bn tubo con medio semis#lido contiene
tioglicolato para reducir el potencial redox del medio. /s) s#lo hay
ox)geno en la super(cie y no en el resto del tubo.
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i el microorganismo es aerobio estricto crecerá en la parte de arriba del
tubo, si es anaerobio estricto no crecerá en la parte más alta del tubo y
si es anaerobio facultativo crecerá por todo el medio.
c. ;bservaci#n de placas coloreadascon coloraci#n gram de muestra de
esputo
7irar al microscopio con el lente de gran aumento 0155 x y con aceite
de inmersi#n, las colonias de ta(lococcus, de treptecoccus, de otras
bacterias y otros elementos pat#genos presentes anotar el color y las
formas &ue presentan.
C$cnica o procedimiento+ denti(caci#n de cocos gram positivos
*atalasa
n una placa portaob%etos añadir 1 o : gotas de per#xido de hidr#geno
al 32 0diluir la soluci#n al 352 con agua destilada, transferir c$lulas
del centro de una colonia bien aislada y me!clar. La rápida aparici#n y
producci#n sostenida de burbu%as de gas o efervescencia indica unareacci#n positiva.
*oagulasa
rueba en tubos 0coagulasa libre+
1.F colocar as$pticamente 5. ml de plasma de cone%o reconstituido en
el fondo de un tubo est$ril.
3.F me!clar por rotaci#n suave del tubo, evitando remover o agitar el
contenido.
4.F colocar el tubo en la incubadora de 4 a :4 horas. ;bservar la
formaci#n de un coagulo visible.
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La reacci#n se considera positiva ante cual&uier grado de coagulaci#n
visible dentro del tubo.
rueba de la ?acitracina
e toma un agar sangre y en un lado de la placa se estria con el asa en
forma continua la cepa de estreptococo beta hemol)tico, con una pin!a
est$ril se coloca el disco de bacitracina en el centro del estriado
reali!ado. La placa de agar sangre es incubada a 3F3MN * durante toda
la noche. Los resultados son cualitativos y es positiva para estreptococo
beta hemol)tico del grupo / si se encuentra cual&uier halo de inhibici#n
alrededor del disco.
rueba de la opto&uina
7$todo+ se toma una suspensi#n de colonias puras en caldo
7ueller 9inton o tioglicolato y con un hisopo se estr)a una placa de agar
sangre de carnero al 2. obre la estr)a se coloca el disco de opto&uina.
e incuba con atm#sfera de *;: al 2 0 %arra con vela . durante :4 hs.
a 3N *.
nterpretaci#n+ ensible, cuando hay inhibici#n alrededor del disco. e
considera como punto de corte 16 mm. 0discos de 15 mm o 14 mm
0discos de 6 mm. Gesistente, cuando el crecimiento no es inhibido
alrededor del disco. Los casos de halos intermedios deben resolverse por
acumulaci#n de pruebas a favor o en contra.
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.ANE/OS
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@G/7 ;CO; @G/7 -@/CO;;xacilina 0ox /mpicilina 0amritromicina 0 *efuroxima 0cxm*lindamicina 0cc /mpicilina < sulbactam 0sam*efoxitin 0fox @entamicina 0gm
ulfas 0sxt -or"oxacina 0nor*ipro"oxacina 0cip -itrofuranto)na 0fmOancomicina 0va ulfas 0sxt
0. BIB(IOGRA1IA.-
http+PPQQQ.higiene.edu.uyPcefaPLibro:55:P*ap2:51A
http+PPQQQ.medicina.unal.edu.coPEepartamentosPmicrobiologia
http+PPQQQ.infomed.sld.cuPcocosPpirogenos