DESENVOLVIMENTO DE UM GEL CONTENDO O MONOTERPENO … · acima de tudo, sempre acreditou em mim e me...

10

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO CIÊNCIAS DA SAÚDE E

BIOLÓGICAS

Milla Gabriela Belarmino Dantas

DESENVOLVIMENTO DE UM GEL CONTENDO O

MONOTERPENO BORNEOL E DE UM MÉTODO

PARA PRODUÇÃO DE INFLAMAÇÃO

MUSCULOESQUELÉTICA EM RATOS

Petrolina-PE

2015

11

Trabalho apresentado à Universidade Federal do Vale do São Francisco – UNIVASF, Campus Petrolina, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências, com ênfase na linha de pesquisa: “Biodiversidade, Tecnologia e Recursos Naturais”. Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida Co-orientador: Prof. Dr. Ferdinando Oliveira Carvalho

MILLA GABRIELA BELARMINO DANTAS

DESENVOLVIMENTO DE UM GEL CONTENDO O

MONOTERPENO BORNEOL E DE UM MÉTODO PARA

PRODUÇÃO DE INFLAMAÇÃO MUSCULOESQUELÉTICA

EM RATOS

Petrolina-PE

2015

12

A Deus, por permitir a realização deste trabalho.

Aos meus Pais Zelia Belarmino Dantas e

Jachson Cardoso Dantas pela dedicação de uma

vida em prol dos meus estudos.

13

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por me permitir chegar até aqui com saúde,

preenchendo minha vida durante todos estes anos com sabedoria e discernimento

para trilhar da melhor forma este caminho, e por ser minha fortaleza nos momentos

difíceis.

Agradeço à Universidade Federal do Vale do São Francisco, pelo espaço e

material cedido para minha formação como profissional e mestre.

Ao Programa de Pós-Graduação Ciências da Saúde e Biológicas, e a todos

os Professores pelos conhecimentos compartilhados, contribuindo na minha

formação.

Ao meu orientador, professor Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida

por quem eu tenho uma imensa admiração e respeito pelo pesquisador e pessoa que

é, eu agradeço por ter aceitado me acompanhar e orientar nesta jornada, por toda

dedicação na orientação, conhecimento repassado e paciência nos momentos de

angústia e ansiedade, serei eternamente grata!

Ao meu co-orientador, professor Dr. Ferdinando Oliveira Carvalho, por todo

apoio e incentivo acadêmico, tanto como orientanda como enquanto professora

substituta e colegas de trabalho.

A todos do Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais (NEPLAME)

por todo apoio, em especial à Juliane Cabral, que antes mesmo da minha entrada no

mestrado já torcia por mim, e foi uma grande inspiração durante toda minha

caminhada.

Ao pessoal do biotério, Leonardo, Gabriela, Helenildo e Jean, que sempre me

receberam muito bem, e que cuidaram dos animais com toda dedicação.

A Silvio Alan, técnico do laboratório de farmacotécnica e colega de mestrado,

que mesmo sempre atarefado, colaborou em toda a parte farmacotécnica do

experimento, desde a produção até os testes com o gel.

À professora Dra. Maria Helena Tavares de Matos, que aceitou colaborar com

este estudo, permitindo-me realizar a preparação histológica em seu laboratório onde

sempre fui muito bem acolhida.

14

A todos do grupo de Biotecnologia Aplicada ao Desenvolvimento de Folículos

Ovarianos (BIOFOV) da UNIVASF, por me acolherem sempre de forma gentil em seu

laboratório, em especial a Msc. Vanessa Raquel Pinto de Barros, por toda paciência

e dedicação no preparo das lâminas e companhia nos longos dias de preparo

histológico.

A todos os colegas que de alguma forma contribuíram para a realização deste

estudo: Camila Mahara, Rayana Costa, Reginaldo Nascimento, Luiz Gabriel,

Eduardo Numata, Eveline Menezes, Júnior Benevides, Amanda Mira e Erica

Lavor, agradeço a parceria na realização dos experimentos.

Ao professor Dr. Ricardo Santana de Lima o qual me ensinou a realizar as

análises histológicas.

Ao professor Dr. Humberto de Sousa Fontoura da Universidade Estadual de

Goiás, o qual me acolheu gentilmente em seu laboratório na UEG onde fizemos o

treinamento para desenvolvimento do método de produção de lesão dos animais.

A todos os meus colegas do mestrado, em especial aqueles que durante estes

anos criaram acima de tudo um vínculo de amizade e tornaram essa caminhada ainda

mais agradável.

Aos meus amigos de longa data, pelo apoio e compreensão com minha

ausência nos momentos em que me dediquei inteiramente à pesquisa.

Ao meu amigo, mestre e eterno orientador, Dr. Paulo Adriano Schwingel, que

me acompanha desde o período de iniciação científica na Universidade de

Pernambuco durante minha graduação, e tornou-se além de tudo um amigo, que

acima de tudo, sempre acreditou em mim e me ensinou os primeiros passos da

carreira científica e docente.

Aos meus colegas do trabalho: Natália Soares, Luciano Soares, Ezer Lima e

João Paulo, os quais acompanharam minhas angústias e alegrias de perto.

Aos meus pais, Zelia Belarmino Dantas e Jachson Cardoso Dantas, que

sempre colocaram os estudos como prioridade na minha casa, cuidaram da minha

educação com dedicação e sempre me deixaram livre para que eu pudesse trilhar o

meu destino e ir atrás dos meus sonhos.

15

Ao meu irmão Pedro Henrique Belarmino Dantas e toda minha família que me

acompanharam de perto e sempre acreditaram nos meus sonhos e apoiando minhas

decisões.

E por fim, agradeço a cada um dos animais que doaram suas vidas para a

concretização deste estudo.

A todos, o meu muito obrigada!

16

Ó Mestre, Fazei que eu procure mais Consolar, que ser consolado;

compreender, que ser compreendido; amar, que ser amado.

Pois é dando que se recebe, é perdoando que se é perdoado,

e é morrendo que se vive para a vida eterna.

- São Francisco de Assis

17

RESUMO

O borneol é um monoterpeno que possui efeitos analgésico e anti-inflamatório comprovado em aplicações orais e intraperitoneais, entretanto seus efeitos em administrações tópica e transdérmica ainda são desconhecidos. Para análise de substâncias administradas por tais vias, diferentes métodos de produção de inflamação musculoesquelética são comumente empregados na literatura. Entretanto, a disparidade entre tais métodos podem resultar em lesões com severidade e resposta inflamatória variadas. O presente estudo teve como objetivos: desenvolver um gel na concentração de 5% do monoterpeno borneol (GB5), e avaliar sua estabilidade a partir de testes físico-químicos e análises macroscópicas após oito meses de formulação; e avaliar o efeito de um método para produção de contusão no gastrocnêmio de ratos, a partir de análise morfológica do tecido musculoesquelético, comparando a resposta inflamatória produzida por diferentes impactos. Para a formulação do gel, a proporção de 5% de borneol foi incorporado em gel carbopol. O GB5 desenvolvido foi armazenado em temperatura ambiente por oito meses, após esse período foi submetido a avaliações macroscópicas e testes físico-químicos. O GB5 teve sua estabilidade testada quanto ao seu aspecto, pH, condutividade e viscosidade imediatamente antes e após um teste de congelamento e descongelamento de duração de 12 dias. Os dados obtidos antes e após o teste foram comparados por teste t pareado com p <0,05. Para análise do método de produção de lesão, doze ratas Wistar foram divididas em quatro grupos. A lesão foi gerada por 324 g de ferro liberado de alturas pré-determinadas para cada grupo (30, 45, 60 e 70 cm). Nas análises do GB5, o mesmo permaneceu com características macroscópicas estáveis após oito meses de sua formulação, o pH variou entre 3,95 ± 0,01 e 3,83 ±0,03 e a condutividade entre 186,15 ± 0,35 e 171,3 ± 1,27 mV antes e após 12 dias de ciclo, não apresentando diferença estatística. Da mesma forma, a viscosidade do GB5 manteve-se semelhante, diminuindo de acordo com o aumento da força de cisalhamento empregada. Na análise do tecido musculoesquelético, a resposta à lesão variou conforme a altura da queda da massa sobre o músculo, de forma que apenas o grupo que sofreu impacto a partir de 70 cm respondeu com processo inflamatório uniforme e severo, enquanto que os grupos de 30, 45 e 60 cm apresentaram processo inflamatório em apenas algumas regiões do tecido, com infiltrado entre leve e moderado. Desta forma, pode-se concluir que o GB5 desenvolvido é estável quanto aos aspectos físico-químicos e macroscópicos mesmo após oito meses de preparo, e submetido a variações extremas de temperatura, apresentando valores considerados adequados para o uso sobre a pele, e podendo ser futuramente avaliado quanto aos efeitos analgésico e anti-inflamatório por via tópica ou transdérmica. O método de liberação de 324 g de massa a partir 70 cm de altura sobre o músculo gastrocnêmio de ratos parece ser o mais adequado para a produção de contusão muscular nestes animais, por apresentar após 72 h de lesão um infiltrado inflamatório importante.

Palavras-chave: Géis. Inflamação. Músculo Esquelético. Terpenos.

18

ABSTRACT

The borneol is a monoterpene which has analgesic and anti-inflammatory effects demonstrated in oral and intraperitoneal applications. However, its effects on topical and transdermal administration is still unknown. For analyzing substances administered by such routes, different methods for production of inflammation are commonly used in the literature. However, the disparity between these methods may show different severities of injury and levels of inflammatory response. This study aimed to develop a gel with 5% concentration of borneol monoterpene (BG5), and assess its stability from physical-chemical tests and macroscopic analysis after eight months of formulation; and from morphological examination of the musculoskeletal tissue, assessing the effect of a contusion method for production in rat gastrocnemius, comparing inflammatory response produced by different impacts. For the formulation of the gel, 5% borneol was incorporated in carbopol gel. The BG5 developed was stored at room temperature for eight months, after this period underwent macroscopic evaluations and physical-chemical testing. The BG5 had been tested for stability as for their appearance, pH, conductivity and viscosity before and after the 12 days of freezing and thawing test, the data obtained before and after the test were compared by paired t-test with p <0.05 . For analysis of injury production method twelve female Wistar rats were divided into four groups. The lesion was generated by 324 g of was dropped from a different predetermined heights for each group (30, 45, 60 and 70 cm). The findings of BG5, it remained stable with macroscopic characteristics after eight months of its formulation, the pH ranged from 3.95 ± 0.01 and 3.83 ± 0.03 and a conductivity between 186.15 ± 0.35 and 171.3 ± 1.27 mV before and after 12-day cycle, with no significant statistical difference. Similarly, the viscosity of BG5 remained similar, decreasing according to the increase in the shear force employed. In the analysis of musculoskeletal tissue in response to injury varied according to the mass of the drop height on the muscle, so that only the group which was affected from 70 cm responded with uniform and severe inflammation, whereas the groups 30, 45 and 60 cm showed inflammation in a few regions of the tissue infiltrated with mild and moderate. Thus, it can be concluded that the BG5 developed is stable as the physico-chemical and macroscopic aspects even after eight months of preparation, and subjected to extreme temperature variations, with values considered appropriate for use on the skin, and may be further tested for its analgesic and anti-inflammatory effect by topical or transdermal delivery. Furthermore, the method with mass of 324 g that dropped from 70 cm height on the gastrocnemius muscle of rats seems to be the most suitable for the production of muscle injury in these animals for 72 hours after, showing an important inflammatory infiltrate. Key-words: Gels. Inflammation. Skeletal Muscle. Terpenes.

19

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura química do borneol. .................................................................... 35

Figura 2. Material utilizado para a preparação do gel carbopol. ................................ 47

Figura 3. Borneol (A) e gel carbol (B). ....................................................................... 48

Figura 4. Preparação do gel com concentração de 5% de borneol. .......................... 48

Figura 5. Demonstração dos animais em seus recintos durante período de adaptação.

.................................................................................................................................. 53

Figura 6. Administração de quetamina e xilazina pela via Intraperitoneal. ................ 54

Figura 7. Mensuração do diâmetro da pata do rato pós-lesão. ................................. 55

Figura 8. Avaliação da circunferência do membro posterior esquerdo com fita métrica

antes da lesão. .......................................................................................................... 55

Figura 9. Distribuição dos animais por grupo para produção de contusão muscular.

.................................................................................................................................. 56

Figura 10. Equipamento para produção de contusão com aberturas a 30,45, 60 e 70

cm de altura. .............................................................................................................. 57

Figura 11. Haste de metal com massa de 324g, utilizada para produção do impacto.

.................................................................................................................................. 58

Figura 12. Animal anestesiado e posicionado para realização do trauma contuso no

MID. ........................................................................................................................... 59

Figura 13. Músculos gastrocnêmio direito e esquerdo dissecados para análise

histológica após 72h de lesão. .................................................................................. 60

Figura 14. Aspecto do GB5 após oito meses de desenvolvimento e testes de

estabilidade. .............................................................................................................. 63

Figura 15. Efeito da velocidade de corte na viscosidade do gel carbopol e do gel

borneol 5% antes e após o ciclo de congelamento e descongelamento. .................. 65

Figura 16. Tecido musculoesquelético do músculo posterior controle, com fibras e

núcleos íntegros, evidenciando aspecto normal do músculo gastrocnêmio; objetiva de

10 X (A e B), coloração: HE. ..................................................................................... 66

Figura 17. Aspecto histológico do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio

lesionado do grupo de 30 cm, com ausência de sinais de processo inflamatório (A) e

discreto aumento do número de células inflamatórias no meio intersticial, denotando

pequenos focos de infiltrado inflamatório (setas) e edema entre as fibras (B), objetiva

10 X. E= edema, coloração: HE. ............................................................................... 67

20


lesionado dos animais do grupo de 45 cm, com focos de infiltração discretos no local

indicado pela seta (A) e um aumento claro da celularidade intersticial com infiltração,

células inflamatórias aderidas as fibras musculares (indicado pelas setas em

diferentes regiões do tecido), e edema entre as fibras (B), objetiva de 10 X. E = Edema,

coloração: HE. ........................................................................................................... 68


lesionado do grupo de 60 cm. Observa-se neste grupo uma lesão variável com regiões

sem resposta inflamatória aparente (A), e regiões com infiltrados perivasculares de

tamanho variado dispersos pelo interstício, podendo ser notado também um aumento

da celularidade intersticial em algumas regiões indicadas por setas (A, B, C, D),

objetiva de 4 X(A) e 10 X(B, C, D, coloração: HE. .................................................... 69


lesionado dos animais do grupo de 70 cm. Neste grupo pode-se observar lesão severa

com distribuição mais ampla e uniforme. Aumento de 4 X (A) evidenciando a presença

do infiltrado em toda região analisada. Intenso infiltrado inflamatório disperso pelo

interstício (seta figura B) e edema indicado pela letra E, (nas figuras B, C e D),

aderência das células inflamatórias às fibras lesadas indicadas por seta na figura D, e

áreas de necrose tecidual (C), coloração: HE. .......................................................... 70

21

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Resultados da avaliação da estabilidade preliminar do gel de borneol 5%

antes e após o teste de congelamento e descongelamento........................................64

22

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

® Marca registrada

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

FGF Fator de crescimento fibroblástico

g Gramas

GC Gel de carbopol

GCB5 Gel de carbopol com borneol a 5%

HE Hematoxilina eosina

HGF Fator de crescimento de hepatócitos

IGF-1 Fator de crescimento semelhante à insulina 1

M Molar

mL Mililitro

NaOH Hidróxido de sódio

ºC Grau Celsius

pH Potencial hidrogênio

rpm Rotações por minuto

TNFα Fator de necrose tumoral alfa

VEGF Fator de crescimento endotélio vascular

μg Micrograma

23

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 25

2.OBJETIVOS ........................................................................................................... 29

2.1 Objetivo geral ............................................................................................... 30

2.2 Objetivos específicos: .................................................................................. 30

3.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .............................................................................. 31

3.1 Desenvolvimento de formulações para tratamentos tópicos e transdérmicos . 32

3.2 Géis .................................................................................................................. 33

3.3 Carbopol® ........................................................................................................ 34

3.4 Monoterpeno borneol ....................................................................................... 34

3.5 Tecido muscular estriado esquelético .............................................................. 36

3.6 Lesões no tecido muscular estriado esquelético .............................................. 38

3.7 Resposta inflamatória do tecido muscular estriado esquelético à contusão ... 38

3.8 Métodos de produção de lesão muscular em modelos animais ....................... 41

4.PARTE ................................................................................................................... 45

EXPERIMENTAL – I .................................................................................................. 45

4.1 Materiais........................................................................................................... 46

4.2 Preparação da formulação em gel do borneol ................................................. 46

4.3 Estudo de estabilidade do gel de borneol 5% .................................................. 49

4.3.1 Análise macroscópica da formulação ............................................................ 49

4.3.2 Ciclo congelamento e descongelamento....................................................... 49

4.3.3 Teste da centrifugação .................................................................................. 50

4.3.4 Determinação do pH ..................................................................................... 50

4.3.5 Análise de condutividade .............................................................................. 50

4.3.6 Teste de viscosidade .................................................................................... 50

4.4 Análise estatística ............................................................................................ 51

5. PARTE EXPERIMENTAL – II ................................................................................ 52

24

5.1 Animais ............................................................................................................ 53

5.2 Preparo dos animais ........................................................................................ 54

5.3 Divisão dos grupos para produção de lesão .................................................... 56

5.4 Equipamento para lesão muscular ................................................................... 56

5.5 Obtenção da lesão muscular............................................................................ 58

5.6 Análise histológica ........................................................................................... 59

5.7 Análise estatística ........................................................................................ 61

6. RESULTADOS ...................................................................................................... 62

6.1 Características macroscópicas do gel do borneol 5% ...................................... 63

6.2 Avaliação de pH e condutividade ..................................................................... 64

6.3 Medidas da viscosidade ................................................................................... 65

6.4 Análise macroscópica do músculo gastrocnêmio pós contusão ...................... 65

6.5 Análises microscópicas dos músculos gastrocnêmios submetidos à lesão ..... 66

7.DISCUSSÃO .......................................................................................................... 72

8. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 78

9. PERSCPECTIVAS FUTURAS .............................................................................. 80

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 82

APÊNDICE ................................................................................................................ 96

ANEXOS ................................................................................................................ 110

25

1. INTRODUÇÃO

26

1 INTRODUÇÃO

O borneol (C10H18O) é um monoterpeno bicíclico oxigenado presente nos óleos

essenciais de várias plantas e comumente utilizado na medicina tradicional chinesa e

indiana (LU et al., 2011). Este metabólito secundário está presente em mais de 63

produtos à base de plantas medicinais (CHEN et al., 2011), sendo amplamente

utilizado para tratar febre, aftas, acidente vascular encefálico e patologias nos olhos e

ouvidos (HATTORI, 2000; FARMACOPÉIA CHINESA, 2010). Algumas doenças

cerebrovasculares têm seu tratamento baseado no uso do borneol, que além de efeito

sedativo e anticonvulsivo, apresenta efeitos neuroprotetores (LIU et al., 2011).

Quando administrado com outros fármacos, o borneol acelera a distribuição dos

medicamentos no tecido cerebral (CHAI; PAN; LI, 2009), melhora a biodisponibilidade

de drogas, e acelera a passagem dos fármacos na barreira hematoencefálica (CAI et

al., 2008; LU et al., 2012; YUA et al., 2013; ZHANG et al., 2015). A ação do borneol

na potencialização da ação dos compostos no cérebro é superior quando este

composto é administrado por via intravenosa, bem como intranasal (ZHAO et al.,

2012). Do mesmo modo, a administração por via oral e intraperitoneal do borneol em

ratos e camundongos tem comprovado seu efeito como agente antibacteriano,

analgésico e anti-inflamatório, podendo ser utilizado também no tratamento de dor

crônica (CANDAN et al., 2003; ALMEIDA et al., 2013; JIANG et al., 2015), todavia, os

efeitos deste monoterpeno através de administrações tópicas e transdérmicas ainda

não são relatados.

A utilização de medicamentos em formulações para administração tópica como

géis e pomadas, são muitas vezes requeridas para tratamento de diversas lesões

cutâneas e musculares, como queimaduras e eritemas, processos de cicatrização,

além de efeitos analgésico e anti-inflamatório em lesões musculoesqueléticas

(SCHÄFER-KORTING; MEHNERT; KORTING, 2007; SILVA et al., 2010; KUEHL,

2010; LIONBERGER; BRENNAN, 2010). O uso de fármacos que possibilitam a

administração por via cutânea, seja com aplicação direta ou com auxílio de técnicas

que aceleram a permeação dos mesmos, como a fonoforese e a iontoforese (MARRO

et al., 2002), e que atuem no processo álgico e inflamatório, especialmente na lesão

musculoesquelética, tem crescido consideravelmente, e diversos estudos avaliam o

efeito de géis, pomadas e extratos de plantas no tratamento agudo destas lesões

(YANG et al., 2005; ALFREDO et al., 2008; ABREU et al., 2013; PARK et al., 2014).

27

Isto se dá porque dentre as lesões sofridas por atletas profissionais, as lesões

musculares apresentam ampla incidência, representando aproximadamente 30% das

lesões sofridas nos desportos (JUNGE et al., 2006; EKSTRAND, HÄGGLUND,

WALDÉN, 2011). Tais lesões são, na sua maioria, decorrentes de traumas mecânicos

(JARVINEN et al., 2007) e podem ocorrer por ruptura, onde a fibra muscular e a fáscia

são afetadas, ou lesões onde apenas as fibras musculares e miofibrilas são

danificadas, não afetando os tecidos conjuntivos basais de forma significativa. As

lesões geradas por cargas em cisalhamento são as mais frequentes, sendo elas as

contusões, distensões ou lacerações, e vão variar de acordo com o mecanismo de

lesão, ocorrendo com mais frequência nos membros inferiores (ASTUR et al., 2014;

BRATLAND-SANDA; SUNDGOT-BORGEN; MYKLEBUST, 2015).

A contusão representa aproximadamente 90% das lesões musculares nos

esportes (JARVINEN et al., 2000), e ocorre quando um músculo é ferido por uma força

de compressão significativa gerando impacto de alta energia, que rapidamente

comprime tecidos locais, como um golpe direto, sendo este um mecanismo comum

em esportes de contato (JARVIEN et al., 2007; SMITH et al., 2008; KHATTAK et al.,

2010). A fim de replicar as lesões musculoesqueléticas resultantes de trauma,

principalmente para em seguida testar o efeito de algum fármaco, alguns modelos de

produção de lesão em animais são propostos na literatura, entretanto, a severidade

da lesão gerada por estes dispositivos pode variar em cada estudo devido aos

mecanismos utilizados para a produção do trauma (SOUZA; GOTTFRIED, 2013).

Os modelos de produção de lesão buscam simular o mecanismo que ocorre na

prática, principalmente nos esportes de contato (MCBRIER et al., 2009). Alguns

modelos utilizando a queda de uma massa sobre o músculo de animais já têm sido

relatados na literatura, nos quais uma massa específica desliza até contatar

diretamente o músculo do animal, sendo normalmente o gastrocnêmio o músculo mais

utilizado para estas avaliações (CRISCO et al., 1994, 1996; AMBROSIO et al., 2010;

PUNTEL et al., 2011; ABREU et al., 2013).

Esta técnica replica o mecanismo de lesão original, comumente observada na

prática clínica, e tem sido utilizada em estudos que avaliam a lesão inflamatória aguda

e em ensaios que testam medicamentos e tratamentos neste tipo de lesão (WILKIN et

al., 2004; MCBRIER et al., 2007; SILVEIRA et al., 2010; SHU et al., 2012), entretanto,

não há ainda na literatura um consenso sobre o mecanismo de lesão, fazendo com

que os estudos apresentem uma relativa discrepância em relação às cargas utilizadas

28

e às alturas de queda da massa sobre o membro, consequentemente, a resposta

inflamatória desenvolvida nos animais varia de acordo com a força do impacto gerada

sobre a musculatura (SOUZA; GOTTFRIED, 2013).

Desta forma, considerando a importância da aplicação de métodos fidedignos

que garantam a avaliação do efeito de tratamentos anti-inflamatórios à base de gel, o

presente estudo buscou, por meio de uma abordagem interdisciplinar, desenvolver a

formulação de gel do borneol, avaliando sua estabilidade e propriedades físico-

químicas, para em estudos futuros testá-lo pela via tópica ou transdérmica em lesão

musculoesquelética aqui também estudadas. E avaliar através de análise morfológica

do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio de ratos, um modelo experimental de

produção de contusão muscular que seja adequado para o desencadeamento do

processo de inflamação musculoesquelética em ratos.

29

2.OBJETIVOS

30

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Desenvolver um gel contendo o monoterpeno oxigenado (borneol) e avaliar sua

estabilidade, propriedades macroscópicas e físico-químicas; e estudar métodos de

produção de lesão musculoesquelética em ratos a partir de análise morfológica do

músculo gastrocnêmio após 72 h de lesão instalada.

2.2 Objetivos específicos:

- Desenvolver um gel com concentração de 5% do monoterpeno borneol (GB5).

- Descrever as características do GB5 através de análise macroscópica.

- Avaliar as propriedades físico-químicas do GB5: pH, condutividade e viscosidade

antes e após ciclo de congelamento e descongelamento de 12 dias.

- Avaliar macroscopicamente o processo inflamatório agudo no membro posterior

direito após trauma contuso.

- Comparar e descrever as variáveis histopatológicas do músculo gastrocnêmio

72 h após a produção de contusão muscular, produzida por diferentes alturas de

queda de massa (30, 45, 60 e 70 cm).

- Contribuir com o estudo do borneol na literatura.

- Desenvolver método para produção de contusão muscular em ratos, baseado na

resposta inflamatória aguda.

- Contribuir para os estudos de contusão muscular e tratamento muscular na

farmacologia e fisioterapia.

31

3.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

32

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 Desenvolvimento de formulações para tratamentos tópicos e transdérmicos

A administração de fármacos por via tópica e transdérmica são métodos atrativos

para tratamentos locais e sistêmicos comumente utilizada de forma eficaz no

tratamento de doenças dermatológicas e em processos inflamatórios que afetam o

tecido musculoesquelético (GLAVAS-DODOV et al., 2003; MITKARIA et al., 2010;

KAUR; GULERI, 2013). Quando administradas sobre a pele, as drogas podem

apresentar uma melhor absorção local, sendo essa uma vantagem em comparação a

tratamentos convencionais por via oral (GLAVAS-DODOV et al., 2003; RUPAL et al.,

2010).

A administração tópica contorna o metabolismo de primeira passagem, evita a

irritação do trato gastrointestinal, os riscos da terapia intravenosa e os riscos

associados às condições variadas de absorção, como mudanças de pH, presença de

enzimas e tempo de esvaziamento gástrico. Além disso, a biodisponibilidade do

fármaco é aumentada, facilitando sua atuação diretamente no local de ação

(SHARMA; PAWAR; JAIN, 2012; BHASHA et al., 2013).

Uma grande variedade de formas de dosagem farmacêutica pode ser utilizada

no sistema de entrega das drogas tópicas, dentre elas, os géis, cremes e pomadas

são os mais utilizados, seguidos de sprays e preparações líquidas (GISBY; BRYANT,

2000; VERMA et al., 2013). A utilização de gel como meio de entrega na administração

tópica pode aumentar o tempo de resistência da droga na pele, melhorar o

fornecimento e liberação da substância e aumentar o tempo de permanência no local

da aplicação (KARADZOVSKA et al., 2013). Entretanto, vários fatores do fármaco e

da pele podem afetar a absorção, como a espessura, temperatura, grau de hidratação

e limpeza da pele, concentração de lipídios, número de folículos pilosos, função das

glândulas sudoríparas, raça, pH na superfície da pele e integridade do estrato córneo

(WOKOVICH et al., 2006).

Com isso, além da busca por formulações de uso tópico, as formulações

transdérmicas são desenvolvidas como estratégia para o transporte de diversas

classes de fármacos, tanto hidrofílicos quanto lipofílicos, representando uma

33

alternativa para superar aspectos relacionados às características farmacocinéticas e

farmacodinâmicas de diversos medicamentos quando utilizados por outras vias, e

estimulando a penetração do fármaco sobre o tecido (TEICHMANN et al., 2007;

BADRAN et al., 2009).

3.2 Géis

Os géis são sistemas em estado intermediário de matéria possuindo

propriedades sólidas e líquidas, sendo portanto, semissólidos compostos por

partículas inorgânicas ou macromoléculas orgânicas, principalmente polímeros,

naturais ou sintéticos, que formam uma matriz tridimensional ao longo de um meio de

dispersão líquido ou hidrofílico (ALVAREZ-LORENZO; CONCHEIRO, 2001;

ROYCHOWDHURY et al., 2012). A rigidez do gel é dada pela rede formada pelo

entrelaçamento das partículas do agente de gelificação, e a natureza destas partículas

determina a estrutura e propriedades do gel (UCHE, 2013).

Para a formulação de um gel alguns polímeros podem ser utilizados, entre eles

as gomas naturais, materiais sintéticos e semissintéticos, e os carpobol®, sendo

preparados por fusão ou por procedimento especial que pode ser requerido pelas

características de geleificação do gelante (LACHMAN et al., 2001). A viscosidade da

formulação é dada por essas substâncias, sendo o carbopol o polímero mais utilizado.

Os géis são considerados veículos adequados para a administração tópica de

fármacos por não serem pegajosos, não demandar muita energia durante a

formulação, serem estáveis e apresentar valor estético (NORRIS, 2005).

Os géis podem ser classificados em hidrofóbicos ou hidrofílicos. Os géis

hidrofóbicos normalmente possuem bases constituídas de parafina líquida como

polietileno e são também chamados de oleogéis. Já os géis hidrofílicos,

(hidrossolúveis ou hidrogéis) são constituídos em sua base de água, propilenoglicol

ou glicerol. Estes, por sua vez, são mais utilizados em produtos cosméticos e

dermatológicos por não serem gordurosos, apresentarem um bom espalhamento e

veicularem ativos hidrossolúveis (GENNARO, 2004).

34

3.3 Carbopol®

O Carbopol® é formado por ácido acrílico de alto peso molecular (variação de 2

a 30 x 106) com ligação cruzada e fornecido como ácido livre. É comumente utilizado

em formulações farmacêuticas líquidas ou semissólidas como géis, suspensões e

emulsões, sendo empregado na fase aquosa dos géis (BONACUINA; MARTELLI;

PALMIERI, 2004; CORREA et. al., 2005). O Carbopol® 940 apresenta o maior efeito

espessante dentre as resinas de Carbopol®, sendo o mais utilizado para produzir géis

cristalinos e brilhantes. Também vantajoso em comparação com os demais géis, por

apresentar um bom comportamento reológico, e permanecem por um período de

tempo maior no local administrado (MERCLIN et al., 2004).

O Carbopol® é normalmente estável quando exposto a variações extremas de

temperatura, e apresenta máxima transparência e viscosidade com o pH 7, embora a

faixa de pH 4 a 5,5 também seja considerada adequada para tais características

(ISLAM et al., 2004; FERREIRA, 2008). Além disso, os géis de carbômeros possuem

bom comportamento de fluidez, compatibilidade com muitos excipientes e ativos,

características organolépticas consideradas excelentes e alta viscosidade com baixa

concentração, por isso, tais géis apresentam uma ampla aplicação na área

dermatológica e farmacêutica (ISLAM et al., 2004; BONACUINA; MARTELLI;

PALMIERI, 2004).

3.4 Monoterpeno borneol

Os terpenos ou terpenoides são metabólitos secundários e formam uma

diversificada classe de produtos naturais, podendo ser isolados a partir de uma

variedade de organismos. Algumas aplicações médicas e atividades biológicas são

atribuídas a muitos destes produtos (CHERNEVA et al., 2012). Dentre a diversificada

classe de metabólitos secundários, os monoterpenos são componentes primários de

óleos essenciais e representam um grupo de terpenos e compostos orgânicos cuja

estrutura básica consiste em duas unidades de ligações de isopreno que são

formados por uma base 5-carbono (C5) cada (BAKKALI et al., 2008).

Muitas ervas medicinais têm seus efeitos associados à presença dos

monoterpenos (ABU-DARWISH et al., 2015; CALDAS et al., 2015, THAN et al., 2015),

35

e algumas propriedades farmacológicas destes produtos, como efeito antioxidante,

analgésico e cardiovascular, já são relatadas na literatura (SANTOS et al., 2011;

GUIMARÃES; QUINTANS; QUINTANS JÚNIOR, 2013).

O borneol (C10H18O) (Figura 1) é um álcool monoterpenoide bicíclico presente

nos óleos essenciais de numerosas plantas medicinais e tem sido utilizado na

medicina tradicional chinesa e indiana (LU et al., 2011), além de ser utilizado na

indústria de alimentos, especiarias aromáticas e preparo de materiais químicos.

Segundo a farmacopeia da China (2010), o borneol é um componente importante

presente em mais de 63 produtos à base de plantas medicinais (CHEN et al., 2011),

além disso, é aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) como um seguro

aromatizador de alimentos (SHEN et al., 2011).

Figura 1. Estrutura química do borneol.

Fonte: CHERNEVA et al., 2012.

O borneol é caracterizado por possui sabor amargo, propriedade de

arrefecimento e ser pungente, e está presente nos óleos essenciais de muitas plantas

medicinais sendo comumente prescrito pela medicina tradicional chinesa para

doenças do coração, baço e pulmão. Também é amplamente utilizado para tratar

doenças febris, aftas, acidente vascular encefálico, doenças dos olhos, dores de

garganta e problemas de ouvido (FARMACOPÉIA CHINESA, 2010), além de ser

utilizado na anestesia e analgesia na medicina tradicional chinesa e japonesa (LIN et

al., 2006; JIANG et al., 2015).

É estimado que de 10 a 100 toneladas métricas de borneol são utilizadas por

ano, além do uso na medicina, o borneol também tem sido utilizado em cosméticos

36

decorativos, perfumes finos, xampus, sabonetes, e outros produtos de higiene

pessoal, devido à sua fragrância, bem como em produtos não-cosméticos como

detergentes e produtos de limpeza (BHATIA; LETIZIA; API, 2008).

Até meados da década de 50 o borneol natural era comumente importado na

China para utilização na medicina tradicional chinesa. Depois de 1949, devido a uma

escassez de recursos e o alto preço do borneol natural, o mesmo começou a ser

gradualmente substituído pelo borneol sintético (XIAO-FEI et al., 2008).

Com isso, duas formas de borneol podem ser encontradas: o borneol sintético e

o borneol natural. O borneol sintético (BS) consiste em d-borneol e isoborneol,

enquanto o borneol natural apenas d-borneol. O borneol natural é considerado seguro

para consumo, pois não inibe a medula óssea nem induz micronúcleos de glóbulos

vermelhos. Desta forma, em preparações da medicina chinesa é recomendada a

utilização do borneol natural como fonte segura (HU; JIANG; LING, 2006).

O isoborneol, presente no borneol sintético estimula atividade mucosa e

hepatotoxicidade (LU et al.,2011), enquanto estudos provam que o borneol natural (d-

borneol) pode melhorar a biodisponibilidade oral de algumas drogas por modular a

permeabilidade da mucosa intestinal e acelera a distribuição de medicamentos no

tecido cerebral pelo aumento da permeabilidade da barreira hematoencefálica e

melhorar a biodisponibilidade de drogas neste tecido (ZHOU et al., 2010; LU et al.,

2012; YUA et al., 2013 ZHANG et al., 2015).

O borneol tanto natural quanto sintético também tem ação antibacteriana,

analgésica e anti-inflamatória comprovada em aplicações orais e intraperitoneais em

ratos e camundongos, podendo ser utilizado também no tratamento de dor crônica

(CANDAN et al., 2003; ALMEIDA et al., 2013; JIANG et al., 2015), entretanto, ainda

não há relatos na literatura do efeito anti-inflamatório do borneol sobre tecido

musculoesquelético, assim como seu efeito em aplicações tópicas.

3.5 Tecido muscular estriado esquelético

O tecido musculoesquelético é versátil, heterogêneo e complexo, formado por

células multinucleadas que se originam da fusão de mioblastos e organizam-se em

feixes de aspecto cilíndrico e alongado com até 30 cm, e estriações transversais. As

células deste tecido são as chamadas fibras musculares, as quais apresentam

37

características específicas, de modo que os componentes destas células recebem

nomes diferentes das demais células do corpo. Desta forma, o citoplasma é chamado

de sarcoplasma, o retículo endoplasmático de retículo sarcoplasmático e a membrana

citoplasmática de sarcolema. Tais células apresentam mionúcleos localizados na

região periférica da fibra em contato com o sarcolema (JUNQUEIRA; CARNEIRO,

2013).

As fibras musculares são constituídas morfologicamente pelo conjunto de

sarcômeros, que são as unidades contráteis do músculo (KAWIAK et al., 2006). Cada

sarcômero é formado por várias proteínas, das quais se destacam as proteínas

contráteis miosina e actina. O conjunto de sarcômeros forma uma fibra muscular, a

qual é revestida por uma camada de tecido conjuntivo chamado endomísio. O

conjunto de fibras forma o feixe muscular, ou fascículo, o qual é agrupado e revestido

por uma outra camada de tecido conjuntivo chamada perimísio e o grupo de fascículos

são mantidos unidos com seus vasos sanguíneos e tecido nervoso por uma terceira

camada de tecido conjuntivo denominada epimísio. Finalmente, o conjunto de

fascículos forma o músculo que é então revestido pela fáscia muscular (BERNE et al.,

2004).

A fáscia é um tecido conjuntivo denso e resistente que recobre todo o músculo

e estende-se até o osso, formando o tendão, cuja função é fixar o músculo ao osso,

de forma que a força exercida pela contração da fibra muscular e seus sarcômeros

seja transmitida para a articulação e o movimento seja gerado. Esta disposição dos

tecidos conjuntivos que revestem desde a fibra muscular até o conjunto de músculos,

mantêm a organização estrutural do músculo e permite que as forças produzidas por

ele sejam transmitidas para outras estruturas, como os tendões e ligamentos, além de

influenciar na distribuição de vasos sanguíneos e linfáticos (JUNQUEIRA;

CARNEIRO, 2013).

As fibras musculares que compõem o tecido musculoesquelético são

consideradas células estáveis, por serem resistentes à morte. Tal fato normalmente

está associado à presença de lesões musculares, as quais podem ocorrer a partir do

exercício físico, estímulos tóxicos, doenças degenerativas e/ou genéticas ou lesões

mecânicas (FRANCO et al., 2015). Por ser um dos tecidos mais abundantes no corpo

humano, o tecido musculoesquelético é constantemente exposto a vários tipos de

lesão (ASTUR et al., 2014).

38

3.6 Lesões no tecido muscular estriado esquelético

Os atletas de desporto, principalmente aqueles envolvidos em esportes de

contato como nas artes marciais, futebol, handebol, entre outros, estão comumente

expostos ao risco de lesões. As lesões musculares representam aproximadamente

30% das lesões sofridas nos desportos (JUNGE et al., 2006; EKSTRAND,

HÄGGLUND, WALDÉN, 2011). Normalmente tais lesões são ocasionadas por

traumas mecânicos, os quais podem ser classificados como contusão, distensão ou

laceração (JARVINEN et al., 2007). Destas, as contusões musculares são

responsáveis por aproximadamente 90% das lesões musculares nos esportes,

(JARVINEN et al., 2000), sendo o tipo de lesão mais comum em atletas de artes

marciais mistas (MMA) (RAINEY, 2009). Tais lesões muitas vezes impossibilitam que

o sujeito lesado participe de treinos ou competições, podendo desta forma

comprometer o desempenho do atleta (JUNGE et al., 2006).

As lesões mecânicas envolvem normalmente a interrupção do tecido conjuntivo,

podendo levar à necrose da fibra muscular, presença de hematomas e inflamação

(JARVINEN et al., 2007; QUINTERO et al., 2009). Após uma lesão mecânica, o

processo de reparação do tecido lesionado é semelhante na maioria dos casos, de

forma que o tecido musculoesquelético se recupera em um processo sequencial,

exibindo eventos celulares e moleculares característicos e já bem descritos na

literatura (MEHALLO et al., 2006; QUINTERO et al., 2009; FILIPPIN et al., 2011;

CAROSIO et al., 2011). Tais eventos são conhecidos no processo inflamatório típico

e o tratamento para estas lesões está mais associado à gravidade da lesão do que ao

tipo de lesão sofrida (JARVINEN et al., 2005).

3.7 Resposta inflamatória do tecido muscular estriado esquelético à contusão

O músculo esquelético quando lesionado apresenta uma série de processos

que estão interligados e são considerados tempo-dependentes, tais processos são

divididos em três fases: degeneração, reparação e remodelação (MEHALLO et al.,

2006; JARVINEN et al., 2007; FILIPPIN et al., 2009). A inflamação do músculo

acompanha o processo de recuperação do tecido lesado evoluindo até garantir uma

regeneração ideal para o retorno da função (JARVINEN et al., 2000). Entretanto,

quando esta resposta ocorre de forma exacerbada, a regeneração muscular pode ser

39

prejudicada, dificultando a recuperação funcional do músculo (TIDBALL; VILLALTA,

2010).

A fase degenerativa inicia-se com a ruptura do sarcolema, quando alguma força

excessiva provoca a ruptura muscular e necrose das miofibrilas. O rompimento

provoca o aumento nos níveis séricos de proteínas musculares dependentes de

cálcio, o influxo de cálcio extracelular e ativação de fosfolipases (KAWIAK et al., 2006;

GREFTE et al., 2007; QUINTERO et al., 2009). A proteína creatina quinase (CK), que

normalmente é restrita ao citosol da fibra muscular, sinaliza a presença de inflamação

por ser normalmente encontrada após estresse mecânico ou doenças degenerativas

em amostras de sangue de humanos e modelos animais (BRANCACCIO; MAFFULI;

LIMONGELLI, 2007; SARI et al., 2008).

A lesão no tecido musculoesquelético inicia-se com a destruição da ferida do

músculo, através do rompimento do sarcolema, influxo de cálcio extracelular e

ativação das proteases e fosfolipases dependentes de cálcio, que em última análise

induz a necrose cálcio-dependente, sua degeneração e danos às miofibrilas. Também

leva à ruptura dos vasos sanguíneos, e células inflamatórias simultaneamente

acessam o sítio da lesão. Nas fibras lesionadas, a resposta inflamatória é ampliada

pela liberação hormonal de células satélites e miofibrilas necrosadas (BUTTERFIELD;

HERZOG, 2006; GREFTE et al., 2007).

As primeiras células imunológicas a chegar são os neutrófilos, seguidos dos

macrófagos, sendo ambos os responsáveis pela resposta inflamatória no local da

lesão muscular (BRICKSON et al., 2001; CHARGE; RUDNICKI, 2004; TIDBALL,

2005). Do mesmo modo, os linfócitos T e as citocinas são responsáveis por regular a

reparação e fibrose muscular (DUMKE; LEES, 2011; MANN et al., 2011). As células

inflamatórias circulares são atraídas pelos sinais quimiotáticos produzidos e liberados

pelos macrófagos, como as citocinas, fator de crescimento e outros (JARVINEN et al.,

2005)

Um grande número de fatores de crescimento e citocinas são expressos na lesão

musculoesquelética, como o fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de

crescimento fibroblástico (FGF), fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1)

e o fator de crescimento endotélio vascular (VEGF). O fator de necrose tumoral alfa

(TNFα) também participa da reparação do músculo esquelético lesionado, e sua

inativação pode resultar em perda de força do músculo que está em recuperação

(TURNER; BADYLAK, 2011).

40

Na fase aguda da lesão musculoesquelética, os neutrófilos são os

polimoformonucleares mais abundantes no local da lesão, os quais são

posteriormente substituídos por monócitos que se transformam em macrófagos

engajados na proteólise e fagocitose do material. Os neutrófilos, através da liberação

de citocinas pró-inflamatórias, destroem o tecido danificado por fagocitose (SMITH et

al., 2008), liberando células citotóxicas que geram substâncias reativas de oxigênio,

as quais destroem o tecido necrótico. Entretanto, tais substâncias podem exacerbar o

processo inflamatório e gerar danos às miofibrilas saudáveis (BRICKSON et al., 2001;

TOUMI; BEST, 2003; BUTTERFIELD et al., 2006; TOUMI;GUYER; BEST, 2006).

Os macrófagos aparecem normalmente dois dias após a lesão, sendo

provenientes dos capilares localizados no tecido muscular em torno da lesão e do

epimísio e perimísio. Este período coincide com a diminuição do número de

neutrófilos, a qual ocorre rapidamente até cinco dias após a lesão (SHEN et al., 2008;

CHAZAUD et al., 2009).

A fase de reparo e remodelamento inicia-se alguns dias após a lesão, com a

diminuição da fase degenerativa. Esta nova etapa envolve o processo de regeneração

das fibras musculares lesadas, angiogênese e a formação de uma cicatriz do tecido

fibroso que são um pré-requisito ideal para a recuperação da função contrátil do

músculo (JARVINEN et al., 2005; WANG et al., 2009; CAROSIO et al., 2011).

As células satélites ativadas em resposta ao trauma são encontradas sob a

lâmina basal de cada fibra muscular e garantem às miofibrilas a capacidade

regenerativa. Essas células quando ativadas, proliferam-se e diferenciam-se em

fibroblastos que se fundem às células satélites vizinhas ou às fibras musculares

remanescentes da lesão para gerar novas fibras musculares (CICILIOT;

SCHIAFFINO, 2010; JARVINEN et al., 2005). Os fibroblastos secretam proteínas

importantes para a reparação do tecido musculoesquelético, incluindo os colágenos

de tipo I e II, fibronectina, elastina, proteoglicanos, lamina e fatores de crescimento

(MANN et al., 2011; LI et al., 2013).

No entanto, a proliferação excessiva de matriz extracelular e a ativação dos

fibroblastos podem levar ao desenvolvimento de fibrose muscular, acarretando em

recuperação incompleta das células e alterando as características mecânicas do

músculo, como elasticidade e força (KAARIAINEN et al., 2000; WANG et al., 2009). A

fibrose é caracterizada pelo acúmulo de matrizes extracelulares e colágeno e embora

41

sua origem não seja bem compreendida, é normalmente induzida por lesões crônicas

dos tecidos conjuntivos que envolvem os músculos (UEZUMI et al., 2011).

As fases degenerativa e regenerativa são semelhantes em diferentes tipos de

músculos lesados, entretanto, a amplitude cinética de cada uma pode variar de acordo

com o músculo lesionado ou do modelo animal utilizado. Para compreender melhor

cada etapa do processo inflamatório e criar mecanismos de intervenção na ação

inflamatória, sejam farmacológicos ou fisioterapêuticos, modelos animais com

produção de inflamação no tecido musculoesquelético têm sidos propostos na

literatura (CHARGE; RUDNICK, 2004).

3.8 Métodos de produção de lesão muscular em modelos animais

Considerando a elevada prevalência de lesões musculoesqueléticas entre

atletas e população em geral, alguns pesquisadores da área médica, buscam meios

de facilitar o tratamento dos indivíduos, reduzir o período do processo inflamatório, e

evitar as possíveis complicações decorrentes de um processo inflamatório

demasiadamente prolongado.

As contusões musculares ocorrem quando o tecido é exposto a uma força de

compressão rápida e forte (JARVINEN et al., 2007) e são os tipos mais comuns de

lesões que acometem o tecido musculoesquelético (SMITH et al., 2008; KHATTAK et

al., 2010), levando à formação de hematoma dentro do músculo (KARY, 2010),

gerando dor ao repouso, dor ao movimento, e restrição da amplitude de movimento,

podendo estes sintomas se apresentarem de forma isolada ou concomitante

(JARVINEN et al., 2005).

Visando o breve retorno funcional da musculatura lesionada, métodos como

massagem de ar comprimido, aplicação de medicamentos anti-inflamatórios por via

oral ou tópica e aplicação de ultrassom terapêutico para acelerar a entrada dos

fármacos no local de ação a partir do método da fonoforese têm sido investigados na

literatura (DEANE; GREGORY; MARS, 2013; ABREU et al., 2013, GARG;

CORONAAN; WALTERS, 2015). Entretanto, para que a resposta dos métodos seja

avaliada de forma fidedigna, é necessária uma análise morfológica do tecido lesionado

e a resposta deste ao método testado. Para isso, seria preciso a realização de biópsia

muscular nos sujeitos, todavia, este método não é muito aceitável entre os atletas já

42

lesionados, e seria contra o princípios éticos gerar lesão em sujeitos saudáveis a fim

de comprovar o efeito de tais técnicas.

Com isso, diversos modelos experimentais de produção de lesão

musculoesquelética mecânica têm sido propostos na literatura, entre eles, os modelos

com aplicação de contusão muscular são os mais relatados, onde uma determinada

massa é solta sobre determinada altura no músculo que se pretende avaliar (CRISCO

et al., 1996; MINAMOTO; GRAZZIANO; SALVINI, 1999; MCBRIER et al., 2009;

PUNTEL et al., 2011). Para isso, alguns estudos utilizam coelhos, cobaias, macacos

e ratos, entre outros modelos experimentais. Os experimentos com os ratos são os

mais relatados na literatura, e o músculo mais avaliado tem sido o músculo

gastrocnêmio (CRISCO et al., 1996; KAMI; SENBA, 2002; WILKIN et al., 2004;

MARKERT et al., 2005; MCBRIER et al., 2007, 2009; SILVEIRA et al., 2010; PUNTEL

et al., 2011; FILIPPIN et al., 2011), pois a maioria das contusões em humanos ocorrem

na parte posterior da perna (JARVINEN et al., 2005; KARY, 2010). Além disso, a

predileção por este músculo pode ser justificada por se tratar de um músculo

superficial e que contêm dois tipos de fibras musculares (WANG; KERNELL, 2000),

uma vantagem em relação a outros modelos utilizados que apresentam uma

predominância de apenas um tipo de fibra muscular, como os músculos sóleo, tibial

anterior e extensor longo dos dedos (WANG; KERNELL, 2000; OTA et al., 2011;).

Os estudos que realizam modelos de contusão muscular em animais buscam

compreender as respostas histológicas deste tecido quando exposto a lesões em

humanos. A avaliação qualitativa ou quantitativa do efeito de medicamentos anti-

inflamatórios ou modalidades de intervenções da fisioterapia, necessita de estudos

comparativos que forneçam um modelo de lesão que seja reprodutível, estabeleça as

mudanças que ocorrem na morfologia associada à lesão, em um determinado

momento durante a recuperação do tecido, e quantifique tais alterações de maneira

que seja possível uma comparação entre diferentes tratamentos.

A avaliação de possíveis métodos de tratamento para lesões, ou métodos

facilitadores do processo de regeneração muscular são as principais causas para a

aplicação dos modelos de produção de lesão musculoesquelética, entre essas

causas, a avaliação do efeito do ultrassom (WILKIN et al., 2004; MCBRIER et al.,

2007; SILVEIRA et al., 2010; SHU et al., 2012), exercício (AMBROSIO et al., 2010;

KHATTAK et al., 2010), frio (PUNTEL et al., 2011; TAKAGI et al., 2011), laser terapia

(RIZZI et al., 2006; LUO et al., 2012) e medicamentos anti-inflamatórios seja por via

43

oral ou com associação ao ultrassom. Estes modelos também são aplicados para

avaliação do processo de regeneração e influência de fatores de crescimento sobre o

músculo lesado (ZIMOWSKA et al., 2009; FAN et al., 2013; LI et al., 2013;).

Na maioria dos estudos, a análise microscópica do tecido lesionado revela a

destruição das miofibrilas e necrose com ruptura da membrana basal, além disso há

hemorragia e presença de células inflamatórias como os neutrófilos e macrófagos,

caracterizando um processo inflamatório típico de fibra muscular (MINAMOTO;

GRAZZIANO; SALVINI, 1999; MINAMOTO; BRUNHO; SALVINI, 2001, WILKIN et al.,

2004; NOZAKI et al., 2008).

Para chegar a essas análises, a maioria dos estudos utiliza um modelo de

contusão por impacto direto, sem penetração na pele. A lesão nestes casos é

provocada pela queda de uma massa metálica através de um tubo guia, e a massa é

liberada de uma altura previamente estabelecida sobre a região do ventre muscular a

ser ferido (CRISCO et al., 1994; 1996; MINAMOTO; GRAZZIANO; SALVINI, 1999;

AMBROSIO et al., 2010; PUNTEL et al., 2011). Outros estudos porém utilizam o

esmagamento do músculo como modelo, entretanto este método é mais invasivo, pois

o ventre muscular é exposto através de técnica cirúrgica e posteriormente lesionado

com esmagamento de suas fibras (GHALY; MARSH, 2010; TAKAGI et al., 2011;

WINKLER et al., 2011). Entretanto, esse modelo não é compatível com a contusão

que ocorre entre os seres humanos, pois na maioria das vezes a contusão é gerada

por uma força compressiva súbita, sem que haja penetração no ventre muscular

(JARVINEN et al., 2005).

Alguns estudos a fim de definir um protocolo para produção de contusão

muscular que seja aplicável e permita a comparação entre diferentes tratamentos já

têm sido relatados na literatura, entre eles, um dos fatores analisados é a frequência

em que o músculo é exposto à lesão (MINAMOTO;GRAZZIANO; SALVINI, 1999), bem

como outros fatores relacionados ao modelo de lesão, como a intensidade da lesão,

a qual pode variar com mudanças no peso da massa derrubada sobre o músculo, bem

como a altura em que esta é liberada (MCBRIER et al., 2009).

No entanto, esses estudos ainda usam diferentes massas e diferentes alturas de

queda, gerando consequentemente impactos de energia cinética variada, de forma

que os tecidos analisados nestes estudos oferecem respostas distintas por se

tratarem de lesões de diferentes gravidades (RIZZI et al., 2006; FILIPPIN et al., 2011).

Mesmo em estudos que analisam a mesma espécie de animal e o mesmo músculo,

44

as variações metodológicas encontradas quanto ao alcance e impacto produzido

sobre a musculatura são consideráveis, podendo chegar até ao dobro (SOUZA;

GOTTFRIED, 2013).

45

4.PARTE EXPERIMENTAL – I

46

4 PARTE EXPERIMENTAL I

4.1 Materiais

O borneol foi adquirido pela de Sigma-Aldrich®, enquanto que os demais materiais,

Carbopol 940, EDTA, metilparabeno e trietanolamina, foram adquiridos a partir da Via

Farma®.

4.2 Preparação da formulação em gel do borneol

O gel de base e o gel borneol foram desenvolvidos no laboratório de

farmacotécnica da UNIVASF, no qual foram utilizados 10 g de carbopol® 940 na

proporção de 1%, 70 g de propilenoglicol na proporção de 7%, 1 g de

metilparabeno/nipagin na porção de 0,1%, 1 g de EDTA (0,1%) e 918 mL de água

deionizada qsp para 1 g na proporção de 91,8% (Figura 2).

O propilenoglicol (PPG) (umectante) é um álcool diol de fluido viscoso, incolor,

higroscópico e inodoro, presente em uma grande quantidade de produtos que entram

em contato com a pele humana, tais como medicamentos de aplicação tópica,

dermatológica, cosméticos e material de limpeza e apresenta atividade

antimicrobiana, atuando na prevenção contra contaminações microbiológicas de

formulações cosméticas. Além disso, atua na solubilização e dispersão de diversos

ingredientes tais como ativos, extratos vegetais, proteínas, vitaminas, aminoácidos,

colágenos, conservantes, filtros solares, essências, corantes, pigmentos, entre outros

(GOTTSCHALCK; MCEWEN, 2004).

O metilparabeno é um agente antimicrobiano utilizado como conservante em

cosméticos e também conhecido pela marca Nipagin®. É um éster derivado do ácido

p-hidroxibenzoico pertencendo à classe dos parabenos e apresenta um amplo

espectro de ação antimicrobiana, sendo efetivo contra bactérias gram-positivas, gram-

negativas, leveduras e fungos. Além disso, apresenta baixa toxidez. O metilparabeno

possui uma boa solubilidade em etanol e propilenoglicol, entretanto é pouco solúvel

em água, tendo sua solubilidade aumentada com o aumento da temperatura

(GOTTSCHALCK; MCEWEN, 2004).

Inicialmente foi feita a pesagem dos componentes com auxílio de uma balança

analítica. Em seguida foi realizada a mistura do carbopol na água, adicionando nipagin

e o propilenoglicol. Essa mistura permaneceu em repouso por 24 horas, tendo em

47

seguida seus componentes mixados até a obtenção do aspecto de gel. Para isso, foi

utilizada a agitação das partículas por meio do ultrassom e aquecimento com chapa

quente.

No segundo dia após a mixagem e obtenção do aspecto de gel, a correção do

pH do gel foi conduzida adicionando 3 mL de trietanolamina até alcançar um pH entre

5 e 5,5. Em seguida, o gel foi embalado em um pote de plástico e mantido em

temperatura ambiente por uma semana.

Após uma semana de repouso do gel base, as partículas de borneol

correspondentes à concentração de 5% para o gel foram diluídas e acrescentadas à

base (Figuras 3 e 4). Em seguida, o gel com o borneol foi armazenado em pote de

vidro e conservado em temperatura ambiente, obtendo uma coloração transparente e

odor característico do borneol. O GB5 permaneceu sob temperatura ambiente por um

período de oito meses.

Fonte: Autoria própria.

Figura 2. Material utilizado para a preparação do gel carbopol.

48



A

B

Figura 3. Borneol (A) e gel carbol (B).

Figura 4. Preparação do gel com concentração de 5% de borneol.

49

4.3 Estudo de estabilidade do gel de borneol 5%

Antes de iniciar o estudo de estabilidade, o GB5 foi submetido ao teste de

centrifugação. A centrifugação foi realizada utilizando-se 10 g da amostra, a qual foi

centrifugada (Centribio, modelo 80-2B) a 3.000 rpm durante 30 minutos a fim de

detectar qualquer sinal de instabilidade, como separação espontânea em duas fases

(gel e líquido). Em seguida, foi realizado o teste de estabilidade preliminar analisando

parâmetros organolépticos (aspecto, cor e odor) e físico-químicos (pH, condutividade

e viscosidade).

4.3.1 Análise macroscópica da formulação

Após manipulação do gel a amostra foi analisada quanto às características

organolépticas, a fim de identificar qualquer instabilidade, alteração da cor ou

separação de fases. A comparação visual da amostra com o gel base permite a

análise da cor, aspecto e odor, e foi realizada em cerca de 10 g da amostra

acondicionados em frascos iguais. A fonte de luz empregada foi a luz branca, natural,

de modo que a amostra pudesse ser avaliada criteriosamente com iluminação

adequada comparada antes e após a centrifugação.

4.3.2 Ciclo congelamento e descongelamento

A amostra do GB5 foi submetida ao teste do ciclo congelamento e

descongelamento, mediante variações extremas de temperatura. O teste foi realizado

no período de 12 dias com 6 ciclos alternados de 24 h a 40 ± 2 ºC e 24 h a 5 ± 2 ºC

em estufa e refrigerador, respectivamente (LIMA et al., 2008; ANVISA, 2014). As

análises dos parâmetros organolépticos (aspecto, cor e odor), valor de pH,

condutividade e viscosidade foram realizadas antes e após os ciclos. Depois deste

período, as amostras foram submetidas também ao teste de centrifugação (Centrífuga

– Centribio® ) com 3.000 rpm durante 30 min, a fim de identificar sinal de instabilidade.

50

4.3.3 Teste da centrifugação

Para a realização do teste de centrifugação, 5 g da formulação foi adicionada em

tubo de ensaio cônico, sendo em seguida levada à centrífuga para realização do teste.

Na centrifugação, a amostra do gel foi submetida a um ciclo de 3000 rpm durante 30

minutos à temperatura ambiente. A centrifugação foi realizada com a centrífuga

Centribio® (Modelo 80-2B) e a amostra avaliada considerando a separação de fases.

4.3.4 Determinação do pH

A análise de pH do gel foi realizada em pHmetro de bancada digital

(MSTecnopon equip. Especiais LTDA) calibrado previamente com as soluções

determinadas pelo próprio equipamento (tampão de pH 7 e 4). A verificação do pH foi

realizada em triplicata com o eletrodo inserido diretamente no GB5.

4.3.5 Análise de condutividade

Para avaliação da condutividade do gel, o mesmo equipamento que verificou o

pH foi utilizado (MSTecnopon equip. Especiais LTDA). As medidas de condutividade

foram dadas em milivolt (mV), e a mensuração da condutividade foi realizada em

triplicata.

4.3.6 Teste de viscosidade

Para avaliação da viscosidade foi empregado o viscosímetro rotativo micro

processado (Quimis, modelo Q-860M21). Aproximadamente 30 g de GB5 foi utilizada

de forma suficiente para manter a haste do sistema imerso na amostra e padronizou

o “spindle 2”, em seis velocidades (10, 20, 30, 40, 50 e 60 rpm) o que permite medir

eletronicamente a força de torção já convertida em viscosidade. Todas as análises

foram realizadas em triplicata.

51

4.4 Análise estatística

A formulação do GB5 foi testada em triplicata, e a análise estatística foi realizada

em duplicata. A fim de verificar o efeito do teste de estabilidade acelerada com o ciclo

de congelamento e descongelamento, foi utilizado o teste t de Student com o software

Graph Pad Prism versão 5 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA), com nível

de significância de p <0,05.

52

5. PARTE EXPERIMENTAL – II

53

5 PARTE EXPERIMENTAL II

5.1 Animais

Foram utilizados nesta pesquisa 12 ratas Wistar, albinas, com idade aproximada

de 90 dias, com peso de 223,58 ± 9,19 gramas, todas provenientes do biotério setorial

da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) (Figura 5). Os animais

foram colocados dois dias antes no ambiente onde o experimento seria realizado, para

adaptação ao meio. Foram mantidos em gaiolas coletivas de plástico, permanecendo

com temperatura média de 21 ± 2 °C, em ciclo claro/escuro de 12 horas, entre às 6 h

e 18 h, em ambiente higienizado e com livre acesso à ração específica para espécie,

e água. Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com os princípios éticos

de experimentação animal, sendo aprovados pela Comissão de Ética no Uso de

Animais (CEUA) da Universidade Federal do Vale do São Francisco - UNIVASF sob

o número 0006/110414.


Figura 5. Demonstração dos animais em seus recintos durante período de adaptação.

54

5.2 Preparo dos animais

Os experimentos com os animais foram realizados no laboratório de cirurgia e

experimentação da UNIVASF. Após o período de adaptação os animais foram

distribuídos em quatro grupos, (Grupo 1 = 30 cm; Grupo 2 = 45 cm; Grupo 3 = 60 cm;

Grupo 4 = 70 cm). Cada animal foi inicialmente pesado, e em seguida foi feita a

administração de ketamina e xilazina (80 e 10 mg/kg de peso corporal,

respectivamente) diluída em 1 mL de solução salina e aplicada por via intraperitoneal

(Figura 6).

Figura 6. Administração de quetamina e xilazina pela via Intraperitoneal.

Após a administração do anestésico, os membros posteriores dos animais foram

tricotomizados bilateralmente e em seguida foi feita a mensuração dos seus diâmetros

com o auxílio de um paquímetro digital (Figura 7) e a circunferência da região medial

do ventre muscular foi avaliada por perimetria com o auxílio de fita métrica (Cescorf®)


55

(Figura 8). Todas as medidas foram realizadas anteriormente à lesão e 72 h após a

lesão, antes da eutanásia.



Figura 7. Mensuração do diâmetro da pata do rato pós-lesão.

Figura 8. Avaliação da circunferência do membro posterior esquerdo com fita métrica antes da lesão.

56

5.3 Divisão dos grupos para produção de lesão

Os animais foram distribuídos em quatro grupos de três animais cada, o grupo 1

recebeu o impacto com queda da massa a 30 cm de altura, o grupo 2 com 45 cm, o

grupo 3 com 60 cm e o grupo 4 teve o membro lesionado com altura de queda de 70

cm. Cada animal recebeu o impacto apenas no membro posterior direito, o qual foi

realizado uma única vez com o animal anestesiado.

Figura 9. Distribuição dos animais por grupo para produção de contusão muscular.


5.4 Equipamento para lesão muscular

Para obtenção da lesão muscular foi utilizado um equipamento adaptado,

baseado no estudo de Abreu e colaboradores (2013), o qual continha uma base de

suporte de ferro nas dimensões de 20 x 12 cm, com uma haste de metal fixa de 60

cm, dando suporte a um tubo eletroduto de PVC 3/4 de 135 cm de altura e 8 mm de

diâmetro, o qual foi preso à haste de metal por fitas adesivas. No tubo, foram

marcadas quatro alturas diferentes, 30, 45, 60 e 70 cm, e em cada altura foi feita uma

pequena abertura para facilitar o controle do deslizamento de uma haste de ferro de

324 g que ficava solta dentro do tubo (Figura 9).

Animais (N=12)

Grupo 1 (n=3)

Lesão 30 cm

Grupo 2 (n=3)

Lesão 45 cm

Grupo 3 (n=3)

Lesão 60 cm

Grupo 4 (n=3)

Lesão 70 cm

57

A haste de ferro no interior do tubo (Figura 10) ficava fixa na altura determinada

presa por uma chave, e imediatamente após a retirada da chave, deslizava até atingir

o membro posterior direito. Desta forma, pode-se obter quatro quedas com a mesma

massa, com a energia cinética das quedas variadas. O cálculo da energia cinética foi

realizado pela fórmula Ec = m.g.h, onde m é a massa da haste, g é a ação da

gravidade, e h corresponde à altura de queda da massa. Desta forma, foram obtidas

A = Base de suporte de ferro; seta amarela = haste de metal fixa dando suporte ao cano de PVC; seta preta = cano com aberturas demarcadas para passagem da haste móvel no seu interior.

A


Figura 10. Equipamento para produção de contusão com aberturas a 30,45, 60 e 70 cm de altura.

58

as energias cinéticas de 0,970 J; 1,455 J; 1,940 J; 2,2634 J, para as alturas de 30, 45,

60 e 70 cm, respectivamente.

5.5 Obtenção da lesão muscular

Após a administração da anestesia e tricotomia digital dos membros posteriores,

os animais foram posicionados em decúbito ventral sobre a mesa. Uma extensão da

pata com o movimento de dorsiflexão foi realizado de forma passiva pelo pesquisador

no MPD do animal, a fim de posicionar o gastrocnêmio em posição de alongamento.

Desta forma, o músculo gastrocnêmio era atingido por uma massa de 324 g que foi

liberada nas alturas de 30, 45, 60 e 70 cm, conforme o grupo testado. Todos os

animais receberam apenas um impacto, o qual foi realizado somente sobre o MPD,

tendo o MPE como controle interno.


Figura 11. Haste de metal com massa de 324g, utilizada para produção do

impacto.

59


5.6 Análise histológica

Após 72 horas de lesão, os animais foram anestesiados e eutanasiados. A

eutanásia foi realizada com uma dose letal de 20 mg/ 100 g de pentobarbital sódico

por via intraperitoneal. Após a eutanásia, os MP dos animais foram dissecados, sendo

feita a retirada do músculo gastrocnêmio medial e lateral bilateralmente em todo seu

comprimento. O músculo retirado foi em seguida depositado em recipiente com

formalina a 10% em PBS onde permaneceu por 24 horas, sendo sem seguida

depositado em álcool 70%.


Figura 12. Animal anestesiado e posicionado para realização do trauma

contuso no MID.

60

A fim de preparar o tecido na parafina para realização dos cortes histológicos,

as peças passaram por um processo que consistiu em: álcool 80%, 90%, 95% cada

um por uma hora, seguidos de mais uma hora em três álcoois a 100%. Além disso, as

peças permaneceram por mais 1 hora e 30 minutos no xilol, de forma que a cada meia

hora este xilol era trocado. Em seguida, o tecido foi embebido por três tipos de parafina

permanecendo 30 minutos em cada, estando desta forma prontos para a realização

dos cortes.

Os cortes do tecido na parafina foram realizados no laboratório de histologia do

campus de ciências agrárias da UNIVASF, onde foram realizados cortes com 4 μm,

os quais foram corados com hematoxilina-eosina para análise histológica. A área

representativa foi selecionada para análise histológica qualitativa da resposta

inflamatória celular com objetivas de 4x e 10x, a área representativa foi fotografada e

posteriormente foi feita a análise das imagens obtidas. Todas as análises foram feitas

por um único examinador.

A= músculo gastrocnêmio esquerdo do animal 2 do grupo 1; B= músculo gastrocnêmio direito do animal 2 do grupo 1.

A B


Figura 13. Músculos gastrocnêmio direito e esquerdo dissecados para análise

histológica após 72h de lesão.

61

5.7 Análise estatística

Os valores da circunferência e diâmetro da região medial do ventre muscular do

gastrocnêmio foram analisadas através teste t de Student com o software Graph Pad

Prism versão 5 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA), adotando-se um nível

de significância estatística de p <0,05.

62

6. RESULTADOS

63

6 RESULTADOS

6.1 Características macroscópicas do gel do borneol 5%

A formulação do GB5 foi avaliada quanto às suas características e qualidades

macroscópicas, como cor, aspecto e aroma. A formulação desenvolvida apresentou

uma textura lisa, transparente, aspecto homogêneo e aroma característico do borneol.

As características macroscópicas do GB5 mantiveram-se semelhantes mesmo após

oito meses do desenvolvimento, e não houve diferença no aspecto da GB5 após o

ciclo de congelamento-descongelamento. A figura 14 apresenta o aspecto do gel após

os testes.


Figura 14. Aspecto do GB5 após oito meses de desenvolvimento e testes de estabilidade.

64

6.2 Avaliação de pH e condutividade

Os valores de pH, condutividade, aspecto macroscópico e resposta à

centrifugação do GB5 antes e após o teste de congelamento e descongelamento

estão apresentados na tabela 1. Não foi verificada diferença estatística nos valores de

pH e condutividade analisados antes e após o teste.

Tabela 1 - Resultados da avaliação da estabilidade preliminar do gel de borneol 5%

antes e após o teste de congelamento e descongelamento.

Amostra Aspecto pH Condutividade Centrifugação

GB 5 Pré

Homogêneo,

Translúcido,

Incolor

3,95 ± 0,01 186,15 ± 0,35 mV Sem separação

de fases.

GB 5 Pós

Homogêneo,

Translúcido,

Incolor

3,83 ± 0,03 171,3 ± 1,27 mV Sem separação

de fases.


65

6.3 Medidas da viscosidade

A figura 15 apresenta o comportamento do gel base de carbopol e do GB5 os

quais tiveram sua viscosidade testada em seis momentos com 10, 20, 30, 40, 50 e 60

rpm.

Figura 15. Efeito da velocidade de corte na viscosidade do gel carbopol e do gel borneol 5% antes e após o ciclo de congelamento e descongelamento.

A viscosidade destes géis diminuiu com o aumento da taxa de cisalhamento,

apresentando-se com fluxo não-Newtoniano. Não houve diferença estatística entre os

valores de viscosidade dos géis de borneol com o gel carbopol, e entre as formulações

de GB5 após o teste de congelamento e descongelamento.

6.4 Análise macroscópica do músculo gastrocnêmio pós contusão

Na avaliação macroscópica do aspecto dos músculos gastrocnêmios, foi

identificada uma discreta alteração na coloração do músculo lesionado dos animais

apenas nos grupos de 60 e 70 cm, caracterizando aumento de circulação local. As

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

0 10 20 30 40 50 60 70

GB5 Antes GB5 depois CG


66

medidas de circunferência e diâmetro da pata, realizadas a fim de identificar

quantitativamente a presença de edema, não apresentaram diferença significativa

entre as mensurações realizadas antes da lesão e após 72 h de lesão, bem como não

houve diferença entre as medidas da pata lesionada com a pata controle.

6.5 Análises microscópicas dos músculos gastrocnêmios submetidos à lesão

Nas análises microscópicas dos músculos lesados, foi realizada uma análise

histológica qualitativa comparando ao aspecto do tecido da musculatura contralateral,

a qual foi utilizada como controle. Na análise microscópica dos músculos controle, não

foram observados sinais de inflamação, a fibra muscular apresentou-se de forma

íntegra, com características morfológicas normais (Figura 16).

O impacto da massa de 324 g deslizando a 30 cm de altura no membro posterior

direito não apresentou uniformidade em sua análise histológica, de forma que em

algumas regiões a análise com aumento de 10 X não permitiu identificar sinais de

processo inflamatório, enquanto que outras áreas do mesmo tecido apresentaram


50µ

m

A

50µm

B

Figura 16. Tecido musculoesquelético do músculo posterior controle, com fibras e núcleos íntegros, evidenciando aspecto normal do músculo gastrocnêmio; objetiva de 10 X (A e B), coloração: HE.

67

sinais leves de inflamação com presença de edema e discreto infiltrado inflamatório

(Figura 17).

Do mesmo modo, os animais dos grupos de 45 cm e 60 cm também

responderam à lesão de forma variada, com presença de infiltrado inflamatório não

uniforme, com regiões do tecido sem lesão aparente, e outras com resposta

inflamatória moderada, sinalizada por aumento da celularidade intersticial e células

inflamatórias aderidas às fibras musculares (figuras 18 e 19).

50µm 50µm

E

E


B A

Figura 17. Aspecto histológico do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio lesionado

do grupo de 30 cm, com ausência de sinais de processo inflamatório (A) e discreto aumento do número de células inflamatórias no meio intersticial, denotando pequenos focos de infiltrado inflamatório (setas) e edema entre as fibras (B), objetiva 10 X. E= edema, coloração: HE.

68

50µm 50µm

E

E

B A


Figura 18. Aspecto histológico do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio lesionado

dos animais do grupo de 45 cm, com focos de infiltração discretos no local indicado pela seta (A) e um aumento claro da celularidade intersticial com infiltração, células inflamatórias aderidas as fibras musculares (indicado pelas setas em diferentes regiões do tecido), e edema entre as fibras (B), objetiva de 10 X. E = Edema, coloração: HE.

69

A figura 20 apresenta a resposta do tecido 72 horas após a lesão provocada no

grupo de 70 cm. Neste grupo, diferente dos demais, a resposta inflamatória

apresentou-se com aspecto uniforme, com sinais de infiltrado inflamatório em todas

as regiões do tecido, onde pode-se observar uma lesão mais intensa, com células

inflamatórias em quase todas as regiões do tecido, além de edema e necrose de fibras

musculares.

50µm 50µm

50µm 50µm

A B


D C

Figura 19. Aspecto histológico do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio lesionado do grupo de 60 cm. Observa-se neste grupo uma lesão variável com regiões sem resposta inflamatória aparente (A), e regiões com infiltrados perivasculares de tamanho variado dispersos pelo interstício, podendo ser notado também um aumento da celularidade intersticial em algumas regiões indicadas por setas (A, B, C, D), objetiva de 4 X(A) e 10 X(B, C, D, coloração: HE.

70

A comparação qualitativa por inspeção microscópica e análise de fotos do

tecido musculoesquelético dos animais de cada grupo demonstra que quanto maior a

altura da queda da massa sobre o músculo maior a resposta inflamatória, embora nos

grupos de 30, 45 e 60 cm a resposta à lesão foi variada, com regiões do tecido sem

sinais aparentes de lesão e regiões com lesão de leve a moderada. Apenas o impacto

D

50µm 50µm

50µm 50µm


A B

C

E

E

E

D

Figura 20. Aspecto histológico do tecido musculoesquelético do gastrocnêmio lesionado dos animais do grupo de 70 cm. Neste grupo pode-se observar lesão severa com distribuição mais ampla e uniforme. Aumento de 4 X (A) evidenciando a presença do infiltrado em toda região analisada. Intenso infiltrado inflamatório disperso pelo interstício (seta figura B) e edema indicado pela letra E, (nas figuras B, C e D), aderência das células inflamatórias às fibras lesadas indicadas por seta na figura D, e áreas de necrose tecidual (C), coloração: HE.

71

provocado no grupo de 70 cm gerou uma lesão uniforme e com resposta inflamatória

mais acentuada, podendo ser classificada como uma lesão severa, quando

comparada com aquelas com demais combinação de altura.

72

7.DISCUSSÃO

73

7 DISCUSSÃO

A ação anti-inflamatória de alguns fármacos vem sendo estudada desde muito

tempo, a fim de atribuir a produtos naturais ou sintéticos a redução do período da

resposta inflamatória e seus efeitos indesejados (TIDBALL, 2005; ABREU et al.,

2013). Entretanto, quando esta intervenção se volta para as lesões

musculoesqueléticas, é necessária uma abordagem interdisciplinar com cooperação

de profissionais de diferentes áreas. O método empregado para a produção de lesão

muscular em modelos animais pode ser utilizado tanto para testes farmacológicos,

como para avaliar o efeito de procedimentos fisioterápicos, como a crioterapia,

massagem, fonoforese e outros (DEANE; GREGORY; MARS, 2013; ABREU et al.,

2013, GARG; CORONAAN; WALTERS, 2015).

O presente estudo, na busca de uma abordagem interdisciplinar que embase

uma avaliação futura de um gel produzido à base do borneol, objetivou desenvolver o

gel e avaliar suas características físico-químicas, as quais avaliam se a fórmula

desenvolvida apresenta boas condições para uso, também analisando sua resistência

a fatores externos observando possíveis alterações em sua composição, as quais, se

presentes, colocariam em risco a garantia dos efeitos farmacológicos do produto.

Além disso, considerando a extensa variação na literatura na determinação de

um método adequado para a produção de contusão muscular em modelo animal de

ratos, foi realizada uma análise histológica das fibras musculares do músculo

submetido à lesão, a fim de identificar de que forma o tecido responderia a diferentes

lesões geradas por diferentes alturas de compressão de massa sobre o músculo.

Desta forma, pode-se realizar o teste da substância desenvolvida, seja com aplicação

tópica, com auxílio de massagem ou ainda aplicação de fonoforese, sem risco de

submeter animais a procedimentos desconfortáveis que gerem resposta inflamatória

insuficiente para atribuir ação anti-inflamatória a qualquer método testado, ou lesões

exacerbadas que gerem respostas indesejadas como possíveis fraturas.

O gel do borneol foi avaliado macroscopicamente logo após a sua formulação,

oito meses após a formulação e novamente após a realização dos testes de

estabilidade acelerada, podendo-se a partir desta análise, classificar o gel quanto às

suas características e qualidades considerando a cor, aspecto e aroma.

O GB5 desenvolvido apresentou uma textura lisa e de cor transparente, aspecto

homogêneo e odor característico do borneol. Tais características do GB5 foram

74

observadas logo após a conclusão da sua formulação e as mesmas mantiveram-se

semelhantes após oito meses de armazenamento do gel em temperatura ambiente e

luz natural. Da mesma forma, após a realização dos testes de estabilidade acelerada,

nenhuma mudança macroscópica foi observada. Desta forma, observa-se que os

aspectos macroscópicos do gel desenvolvido apresentam grande capacidade de se

manterem estáveis mesmo após considerável período após sua formulação.

Nas análises físico-químicas, nenhum dos parâmetros avaliados do GB5

apresentou-se diferente estatisticamente após o teste de estabilidade acelerada, com

o ciclo de 12 dias de congelamento e descongelamento da fórmula, onde a mesma foi

exposta a temperaturas extremas, alterando entre estufa e refrigerador por 12 dias,

onde permanecia em cada temperatura por 24 horas. Os valores de pH do GB5

variaram entre 3,95 ± 0,01 e 3,83 ± 0,03. Tais valores com pH ácido já eram

esperados, já que o gel base de carbopol® foi formulado com um pH entre 5 e 5,5, por

serem estes, valores ideais para a obtenção de uma boa viscosidade e clareza do gel

(ISLAM et al., 2004). Além disso, o borneol também é considerado uma substância de

pH ácido (XIAO-FEI et al., 2008).

Este valor de pH apresentado pela formulação do GB5 não é considerável como

irritante para a pele, podendo ser utilizado em aplicações tópicas. Nas análises de

condutividade da formulação do GB5 também não houve alteração com os testes, não

sendo constatada diferença estatística nos seus valores entre as mensurações

realizadas antes e após ciclo de congelamento e descongelamento.

Para as formulações tópicas analgésicas e anti-inflamatórias, uma das

características mais importantes é a consistência da substância, por ser em grande

escala aplicada às camadas finas da pele, de modo que a viscosidade do gel

desempenha um papel importante no controle de permeação do fármaco. Geralmente

a viscosidade das formulações de gel reflete a coerência da fórmula (SHINDE;

POKHARKAR; MODANI, 2012).

Nos géis analisados, a viscosidade apresentou relação inversa ao aumento da

taxa de cisalhamento, apresentando desta forma um fluxo não newtoniano, este

comportamento esteve presente nestes géis devido à sua baixa resistência ao fluxo

quando aplicado em condições de cisalhamento elevadas (BOUSMINA, 1999). O

comportamento pseudoplástico da formulação do GB5 está ligado à diminuição da

viscosidade e associado à característica de alta espalhabilidade de formulações,

devido à diminuição da viscosidade quando se aplica força determinada, e ao mesmo

75

tempo tem a propriedade de permanecer no local de aplicação, sem escorrer

(CARVALHO et al., 2010).

Desta forma, a formulação de um gel à base de carpobol, com concentração de

5% do monoterpeno borneol, mostrou-se homogênea e estável, sendo resistente a

longo período de armazenamento e testes de estabilidade acelerada, apresentando

pH, condutividade e viscosidade adequadas para aplicações sobre a pele.

O GB5 formulado no presente estudo pode apresentar efeitos cutâneos ou

resultados sobre o tecido musculoesquelético, visto que o monoterpeno borneol

apresenta efeito anti-inflamatório comprovado na musculatura lisa de animais, e

através de outras vias de administração (ALMEIDA et al., 2013; JIANG et al., 2015).

Entretanto, para que este efeito seja comprovado, se faz necessária a aplicação de

um modelo que possa garantir que o tecido analisado produzirá uma resposta

inflamatória considerável, e servir de suporte para a comprovação da ação da

substância. Por isso, um modelo para produção de contusão muscular já utilizado na

literatura, com a queda de determinada massa sobre a musculatura, foi utilizado neste

estudo, de forma que a variável avaliada foi a altura da queda da massa.

McBrier e colaboradores (2009) em seu estudo também avaliaram as variações

da resposta muscular à lesão produzida por diferentes alturas, entretanto os autores

optaram por determinar o nível da lesão produzida por avaliação de ressonância

magnética. Quando a carga (267 g) foi aplicada a 40 cm e 50 cm, a lesão foi

considerada leve a moderada, quando a altura foi de 60 cm, a resposta passou de

moderada a grave, e apenas a altura de 70 cm apresentou um prejuízo severo,

entretanto, nesta altura os pesquisadores relataram a presença de fratura de tíbia e

fíbula, o que no presente estudo, mesmo utilizando alturas semelhantes e uma massa

maior, não foi identificada nenhum tipo de fratura.

Apesar deste estudo ter mostrado a importância da altura na determinação do

nível da lesão, os autores não avaliaram a resposta microscópica do infiltrado

inflamatório presente no tecido musculoesquelético, sendo toda análise realizada por

ressonância magnética. Embora tal análise seja válida para classificação da lesão, a

maioria dos estudos que utilizam métodos semelhantes para comprovar a eficácia de

fármacos com potencial anti-inflamatório, se baseiam em comparações qualitativas ou

quantitativas do tecido, através de inspeção microscópica da área lesada (FACIO;

MINAMOTO, 2006; ABREU, 2013; DEANE; GREGORY; MARS, 2013).

76

O modelo de contusão não penetrante deve considerar também o formato da

massa empregada para induzir o trauma, pois a área de contato da massa sobre o

músculo pode influenciar na resposta desencadeada (SOUZA; GOTTFRIED, 2013).

Alguns autores utilizaram de massa em forma de bola (NOZAKI et al., 2008;

AMBROSIO et al., 2010; KHATTAK et al., 2010; OTA et al., 2011; LI et al., 2013),

enquanto outros utilizam em forma de cilindro (CRISCO et al., 1996; KAMI; SENBA,

2002), ou não descrevem a forma da massa (WILKIN et al., 2004; MCBRIER et al.,

2007; SILVEIRA et al., 2010; FILIPPIN et al., 2011; LUO et al., 2012; SHU et al., 2012).

A massa utilizada no presente estudo, embora de formato cilíndrico, apresentava

uma base plana que recobria toda região do ventre do músculo gastrocnêmio das

ratas, e embora alguns estudos relatem que a aplicação de uma massa plana gere

uma lesão mais uniforme que a massa em forma esférica, por esta segunda gerar uma

menor área de contato (SMITH et al., 2008), apenas a altura de 70 cm respondeu à

lesão com infiltrado uniforme, sendo que nas demais alturas testadas, a resposta

apresentou-se variada entre leve e moderada, foi desuniforme, com o tecido

apresentando áreas sem lesão aparente e ausência de infiltrado inflamatório.

Abreu e colaboradores (2013), provocaram uma lesão muscular e comprovaram

o efeito anti-inflamatório do gel de Lychnophora pinaster após lesão aguda provocada

no musculo gastrocnêmio de ratos. A lesão desencadeada foi produzida por massa

de 300 g a 30 cm de altura do MPD dos ratos, entretanto, no presente estudo, a

aplicação de metodologia semelhante apresentou um infiltrado discreto, com áreas do

tecido sem sinais de inflamação.

Minamoto e colaboradores (1999) analisaram o músculo sóleo de rato após

contusões simples e recorrentes, utilizando uma massa de 204 g solta a 16 cm na

região posterior do MP de 32 ratos, e através de análise histológica foi verificado sinais

abundantes de danos agudos no músculo lesionado, e mudanças importantes na

morfologia do tecido. Em outro estudo, Minamoto e Salvini (2002) analisaram e

compararam a morfologia do tibial anterior submetidos à lesão gerada por um único

impacto ou por contusões periódicas. Neste estudo entretanto, o método empregado

foi composto por outras variáveis para a produção da lesão, sendo utilizada uma

massa de 200 g soltas a 36 cm.

Em um estudo buscando verificar os efeitos do ultrassom terapêutico nas

propriedades mecânicas do músculo de ratos após contusão, os autores induziram o

trauma mecânico com a aplicação de 200 g de massa a 30 cm. Contudo os autores

77

não analisaram a resposta histológica do tecido (MATHEUS et al., 2008). Esta

discrepância entre o método empregado para produção de lesão por contusão em

ratos, com variação de carga, altura e energia cinética empregada é constatada na

literatura (SOUZA; GOTTFRIED, 2013). Outros estudos também buscam o

desenvolvimento e validação de métodos para produção de contusão muscular em

coelhos (DEANE et al., 2013).

A partir destas análises deve-se atentar para o método de escolha no momento

da produção da lesão no teste de uma nova substância, visto que a resposta da

musculatura mesmo utilizando o mesmo modelo animal, com as mesmas

características, idade e ausência de treinamento, apresenta-se de forma variável, pois

embora todos os estudos utilizem modelos de controle, a atribuição do efeito de

qualquer tipo de tratamento pode estar atrelada a não-resposta do tecido, e não ao

efeito do tratamento testado.

No presente estudo, apenas a lesão de 70 cm apresentou um processo

inflamatório severo e uniforme. Nas demais alturas de queda testadas, a resposta

inflamatória pode ser classificada entre leve e moderada, e apresenta regiões do

tecido com ausência de sinais inflamatórios, por outro lado, diferente do estudo de

McBrier (2009), no presente estudo não houve casos de fratura óssea.

O trauma mecânico induzido na musculatura a fim de produzir contusão

muscular em ratos é aplicado em diversos estudos, os quais utilizam-se destes

métodos para testar ações farmacológicas anti-inflamatórias. Entretanto, como foi

possível observar, mesmo na musculatura em que o impacto foi causado, a lesão

provocada por 30, 45 e 60 cm apresentou na análise histológica regiões sem sinais

consistentes de resposta inflamatória. Com isso, os estudos que analisam a ação de

fármacos no processo inflamatório causado por trauma mecânico devem se voltar com

mais cuidado para o método de escolha para produção da lesão, de modo que a

associação entre o estado aparente do tecido e o efeito obtido a partir da substância

testada, seja realizada de forma fidedigna.

78

8. CONCLUSÃO

79

8 CONCLUSÃO

De acordo com os resultados obtidos a partir deste estudo, concluiu-se que

borneol pode ser incorporado com sucesso na formulação do gel de carbopol. O gel

do borneol na concentração de 5% analisado após oito meses de sua produção e

armazenamento em temperatura ambiente, apresentou valores consideravelmente

bons para pH, condutividade, viscosidade e estabilidade, quando analisado antes e

após 12 dias no ciclo de congelamento e descongelamento. Na análise do método

para produção de contusão muscular em ratos, todos os protocolos adotados

estimularam a resposta inflamatória muscular, entretanto, o método da queda de uma

massa de 324 g a partir de 70 cm de altura parece ser o mais adequado para estudos

que buscam avaliar efeito de substâncias que atuem no processo inflamatório, devido

a este protocolo o tecido musculoesquelético ter apresentado uma lesão uniforme com

intenso infiltrado inflamatório.

80

9. PERSPECTIVAS FUTURAS

81

9 PERSPECTIVAS FUTURAS

O presente estudo teve como objetivo desenvolver a avaliar um gel à base do

borneol, e testar um método de produção de lesão musculoesquelética em ratos, com

a finalidade de embasar uma futura investigação, permitindo que a mesma produza

resultados fidedignos sobre o efeito anti-inflamatório do gel do borneol no tecido

musculoesquelético de rato, visto que os testes realizados com o gel garantem a

segurança de sua aplicação em testes in vivo. Pôde-se sugerir que o gel desenvolvido

pode ser uma alternativa promissora para o tratamento tópico ou transdérmico, pois

apresentou-se como uma formulação estável e com características físico-químicas

adequadas para sua aplicação sobre a pele. Com isso, espera-se que ao aplicar o

método de produção de contusão testado, os efeitos do gel sobre a tecido

musculoesquelético de ratos possam ser analisado em estudos futuros.

82

REFERÊNCIAS

83

ABREU, V. G. C. et al. Anti-inflammatory effects in muscle injury by transdermal application of gel with Lychnophora pinaster aerial parts using phonophoresis in rats. BMC Complementary and Alternative Medicine. v. 13, n. 270, p. 1-8, 2013.

ABU-DARWISH M. S. et al. Artemisia herba-alba essential oil from Buseirah (south Jordan): Chemical characterization and assessment of safe antifungal and anti-inflammatory doses. Journal of Ethnopharmacology. p. 1-17, 2015. ALFREDO, P. P. et al. Análise qualitativa dos efeitos da sonoforese com Arnica montana sobre o processo inflamatório agudo do músculo esquelético de ratos. Fisioterapia e Pesquisa, São Paulo, v.15, n.3, p.273-9, 2008

ALMEIDA, J. R. G. S. et al. Borneol, a Bicyclic Monoterpene Alcohol, Reduces Nociceptive Behavior and Inflammatory Response in Mice. The Scientific World Journal. v. 2013, p. 1-5, 2013. ALVAREZ-LORENZO C, CONCHEIRO A. Effects of surfactants on gel behavior: Design implications for drug delivery systems. American Journal of Drug Delivery. v. 1, n. 2, p. 77-101, 2001. AMBROSIO, F. et al. Synergistic effect of treadmill running on stem-cell transplantation to heal injured skeletal muscle. Tissue Engineering Part A. v. 16, p.

839–849, 2010. ASTUR, D. C. et al. Muscle injury: current perspectives and trends in Brazil. Revista Brasileira de Ortopedia, v. 49, n. 6, p. 573-580, 2014. BADRAN, M. M.; KUNTSCHE, J.; FAHR, A. Skin penetration enhancement by a microneedle device (Dermaroller®) in vitro: Dependency on needle size and applied formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. v. 36, n. 4-5, p. 511-

23, 2009. BAKKALI, F. et al. Biological effects of essential oils: a review. Food and Chemical Toxicology, v. 46, n. 2, p. 446–475, 2008. BERNE, R. M. et al. Fisiologia. ed. 5,. Mosby Elsevier Editora Lda, 2004.

BHASHA, S. A. et al. Recent Trends in Usage of Polymers in the Formulation of Dermatological Gels, Indian Journal of Research in Pharmacy and Biotechnology. v.1, p. 161-168, 2013.

84

BHATIA, S. P.; LETIZIA, C. S.; API, A. M. Fragrance material review on borneol. Food and Chemical Toxicology, v. 46, p. S77–S80, 2008. BONACUCINA, G.; MARTELLI, S.; PALMIERI, G. F. Rheological, mucoadhesive and release properties of carbopols gels in hydrophilic cosolvents. International Journal of Pharmaceutics, v. 282, p. 115-130, 2004.

BOUSMINA, M. Rheology of polymer blends: linear model for viscoelastic emulsions. Rheologica Acta, v. 38, n. 1, p. 73– 83, 1999.

BRANCACCIO, P.; MAFFULI, M; LIMONGELLI, F.M. Creatine kinase monitoring in sport medicine. British Medical Bulletin; v. 81 e 82, p. 209-230, 2007.

BRASIL. Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Guia de estabilidade de produtos cosméticos. Brasília: ANVISA, 2014.

BRATLAND-SANDA, S.; SUNDGOT-BORGEN, J.; MYKLEBUST, G. Injuries and musculoskeletal pain among Norwegian group fitness instructors. European Journal of Sport Science, v.9, p.1-9, 2015. BRICKSON S. et al. Oxidant production and immune response after stretch injury in skeletal muscle. Medicine & Science in Sports & Exercise, v. 33, p. 2010–5, 2001. BUTTERFIELD, T. A; HERZOG, W. Effect of altering starting length and activation timing of muscle on fiber strain and muscle damage. Journal of Applied Physiology. v. 100, p.1489–98, 2006.

CAI, Z. et al. Effect of borneol on the distribution of gastrodin to the brain in mice via oral administration. Journal of Drug Targeting. v. 16, n. 2, p. 178–184, 2008.

CALDAS, G. F. R. et al. Gastroprotective Mechanisms of the Monoterpene 1,8-Cineole (Eucalyptol). PLoS ONE. v. 10, n. 8, 2015.

CANDAN, F. et al. Antioxidant and antimicrobial activity of the essential oil and methanol extracts of Achillea millefolium subsp. millefolium Afan. (Asteraceae). Journal of Ethnopharmacology. Journal of Ethnopharmacology. v. 87 n. 2-3 p. 215-20, 2003.

85

CAROSIO, S. et al. Impact of ageing on muscle cell regeneration. Ageing Research Reviews. v. 10, p. 35–42, 2011. CARVALHO, F. C. et al. Surfactant systems for nasal zidovudine delivery: structural, rheological and mucoadhesive properties. Journal Pharmacy and Pharmacology, v. 62, p.430-439, 2010. CHAI, G.; PAN, Y.; LI, F. Effect of borneol/mentholum eutectic mixture on nasal-brain delivery of neurotoxin loaded nanoparticles. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. v.

34p.698–701, 2009. CHARGE, S. B; RUDNICKI, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiological Reviews;v. 84 p.209–38, 2004. CHAZAUD, B. et al. Dual and beneficial roles of macrophages during skeletal muscle regeneration. Exercise and Sport Sciences Reviewsv. 37, p.18–22, 2009. CHEN, L. et al. A new source of natural D-borneol and its characteristic. Journal of Medicinal Plants Research, vol. 5, no. 15, pp. 3440–3447, 2011. CHERNEVA, E. et al. The Effect of Camphor and Borneol on Rat Thymocyte Viability and Oxidative Stress. Molecules, v. 17, p. 10258-10266, 2012. CICILIOT, S.; SCHIAFFINO, S. Regeneration of mammalian skeletal muscle: basic mechanisms and clinical implications. Current Pharmaceutical Design, v. 16, p. 906-14, 2010. CORREA, N. M. et al. Avaliação do comportamento reológico de deferentes géis hidrofílicos. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. v. 41, n. 1 p. 1-8. 2005.

CRISCO, J. J. et al. A muscle contusion injury model. Biomechanics, physiology, and histology. The American Journal of Sports Medicine v. 22, p.702–710, 1994.

CRISCO, J. J. et al. Maximal contraction lessens impact response in a muscle contusion model. Journal of Biomechanics. v. 29, p.1291–1296, 1996.

DEANE, M. N. et al. Creation of a contusion injury in rabbit skeletal muscle using a drop-mass technique. Journal of the South African Veterinary Association, v. 84,

n.1, p. 1-6, 2013.

86

DEANE, M.; GREGORY, M.; MARS, M. The Effect of A Contusion Injury on Rabbit Skeletal Muscle: A Morphological Study. The Open Access Journal of Science and Technology, v.1, p, 1-8, 2013.

DUMKE BR, LEES SJ. Age-related impairment of T cell-induced skeletal muscle precursor cell function. American Journal of Physiology – Cell Physiology, v. 300,

p. 1226–33, 2011. EKSTRAND, J.; HÄGGLUND, M.; WALDÉN, M. Epidemiology of muscle injuries in professional football (soccer). The American Journal of Sports Medicine. v. 39,n. 6,p. 1226-32, 2011. FAN Y. Y. et al. Time-dependent expression and distribution of Egr-1 during skeletal muscle wound healing in rats. Journal of Molecular Histology, v. 44, p.75–81,

2013. FERREIRA, A. O. Guia Prático da Farmácia Magistral. Juiz de Fora, v. 1, 2008.

FILIPPIN L. I. et al. Nitric oxide and repair of skeletal muscle injury. Nitric Oxide. v. 21, p.157–63, 2009. FILIPPIN, L. I. et al. Nitric oxide regulates the repair of injured skeletal muscle. Nitric Oxide v. 24, p. 43–9, 2011.

FRANCO, M. et al. Patologia: Processos Gerais. ed.6, 2015. GARG, K.; CORONA, B. T.; WALTERS, T. J.Therapeutic strategies for preventing skeletal muscle fibrosis after injury. Frontiers in Pharmacology, v. 6, n. 87, p. 1-9, 2015. GENNARO, A R. Remington: A Ciência e a Pratica da Farmácia. ed. 20. Editora Guanabara Koogan. 2004. GHALY, A.; MARSH, D. R. Aging-associated oxidative stress modulates the acute inflammatory response in skeletal muscle after contusion injury. Experimental Gerontology, v.45, p. 381–8, 2010.

87

GISBY, J.; BRYANT, J. Efficacy of a new cream formulation of mupirocin: Comparison with oral and topical agents in Experimental skin infections. Antimicrobial agents and chemotherapy. v. 44, n. 2, p. 255-260, 2000.

GLAVAS-DODOV, M. et al. 5-Fluorouracil in topical liposome gels for anticancer treatment--formulation and evaluation. Acta Pharmaceutica. v. 53, n. 4 p. 241-250,

2003. GOTTSCHALCK, T. E.; MCEWEN, Jr, G. N. International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook. ed. 10, v. 2, Washington: Pharmabooks, 2004. GREFTE, S. Et al. Skeletal muscle development and regeneration. Stem cells and development. V. 16, p. 857–68, 2007. GUIMARAES, A. G.; QUINTANS, J. S. S.; QUINTANS JUNIOR, L. J. Monoterpenes with analgesic activity: a systematic review. Phytotherapy Research, v. 27, n. 1, p. 1–15, 2013. HATTORI, A. Camphor in the Edo era—camphor and borneol for medicines. Yakushigaku Zasshi, v. 35, p.49–54, 2000.

HU, L. M.; JIANG, M.; LING, S. General reproductive toxicit study of natural borneol and synthetic borneol on mouse. Journal of Toxicology, v. 4, p. 275–276, 2006.

ISLAM, M. T. et al. Rheological Characterization of Topical Carbomer Gels Neutralized to Different ph. Pharmaceutical Research. v. 21, n. 7, p. 1192-9, 2004.

JARVINEN, T. A. et al. Muscle injuries: biology and treatment. The American Journal of Sports Medicine v. 33, p.745–64, 2005.

JARVINEN, T. A. et al. Muscle injuries: optimising recovery. Best Practice & Research Clinical Rheumatology, v.21, p.317–31, 2007.

JARVINEN, T. A. et al. Muscle strain injuries. Current Opinion in Rheumatology v.12, p.155–61, 2000. JIANG, J. et al. (þ)-Borneol alleviates mechanical hyperalgesia in models of chronic inflammatory and neuropathic pain in mice. European Journal of Pharmacology. v.

757, p. 53–58, 2015.

88

JUNGE, A. et al. Injuries in team sport tournaments during the 2004 Olympic Games. The American Journal of Sports Medicine, v.34, n. 4, p. 565 – 576, 2006. JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia Básica. ed. 12, Guanabara Koogan,

2013. KAARIAINEN, M. et al. Relation between myofibers and connective tissue during muscle injury repair. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports,v.10, p.332–7, 2000. KAMI, K.; SENBA, E. In vivo activation of STAT3 signaling in satellite cells and topical patch 1.3% in patients with acute pain due to soft tissue injuries. Clinical Therapeutics. v. 32, n.6, p.1001-14, 2010. KARADZOVSKA, D.; RIVIERE, J. Assessing vehicle effects on skin absorption of non-volatile compounds using membrane-coated fiber arrays. Cutaneous and Ocular Toxicology. v. 32, n. 4, p. 283-289, 2013.

KARY, J. M. Diagnosis and management of quadriceps strains and contusions. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine, v.3, p.26–31, 2010.

KAUR, L. P.; GULERI, T. K. Topical Gel: A Recent Approach for Novel Drug delivery. Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences. v. 3, n. 17, p. 1-5,

2013. KAWIAK, J. et al. Contribution of stem cells to skeletal muscle regeneration. Folia Histochemica et Cytobiologica. v. 44, p.75–9, 2006. KHATTAK, M. J. et al. Muscle healing and nerve regeneration in a muscle contusion model in the rat. The Journal of Bone & Joint Surgery, v.92, p.894–899, 2010. KUEHL, K. S. Review of the efficacy and tolerability of the diclofenac epolamine topical patch 1.3% in patients with acute pain due to soft tissue injuries. Clinical Therapeutics. v. 32, n.6, p.1001-14, 2010.

LACHMAN, L.; LIEBERMAN, H. A.; KANING, J. L. Teoria e prática na indústria farmacêutica. Lisboa: Fundação Calouse Gulbenkian, v. 2, 2001.

89

LI, H. Y. et al. The fibrotic role of phosphatidylinositol-3-kinase/Akt pathway in injured skeletal muscle after acute contusion. International Journal of Sports Medicine, v. 34, n. 9, p. 789-94, 2013. LIMA, G. C. et al. Desenvolvimento e avaliação da estabilidade física de emulsões O/A contendo óleo de babaçu (Orbignya olrifera). Revista Brasileira de Farmácia,

v.89, n.3, p.239-245, 2008. LIN, A. L. et al. Herbal monoterpene alcohols inhibit propofol metabolism and prolong anesthesia time. Life Sciences, v. 79, n. 1 p. 21-29, 2006. LIONBERGER, D. R.; BRENNAN, M. J. Topical nonsteroidal anti-inflammatory drugs for the treatment of pain due to soft tissue injury: diclofenac epolamine topical patch. Journal of Pain Research, v. 3, p.223–233, 2010.

LIU, R. et al. Protection by borneol on cortical neurons against oxygen-glucose deprivation/reperfusion: Involvement of anti-oxidation and anti-inflammation through nuclear transcription factor 𝜅appaB signaling pathway. Neuroscience, v. 176, p. 408–419, 2011. LU, Y. et al. Bioavailability and Brain-Targeting of Geniposide in Gardenia Borneol Co-Compound by Different Administration Routes in Mice. International Journal of Molecular Sciences. v. 13, n. 11, p. 14127–14135, 2012. LU, Y. et al. Enhancing effect of natural borneol on the absorption of geniposide in rat via intranasal administration. Journal of Zhejiang University SCIENCE B. v.12, p.143–148, 2011. LUO L, et al. Effects of low-level laser therapy on ROS homeostasis and expression of IGF-1 and TGF-beta1 in skeletal muscle during the repair process. Lasers in Medical Science, v.28, n. 3, p.725-34, 2012. MANN C. J. et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skeletal Muscle p.1-21, 2011. MARKERT, C. D. et al. Nonthermal ultrasound and exercise in skeletal muscle regeneration. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation v. 86, p. 1304–10, 2005.

90

MARRO, D. et al. Optimizing iontophoretic drug delivery: identification and distribution of the charge-carrying species. Pharmaceutical Research, v. 18, n. 12, p. 1709-1713, 2002. MATHEUS, J. P. C. et al. Efeitos do ultrassom terapêutico nas propriedades mecânicas do músculo esquelético após contusão. Revista Brasileira de Fisioterapia, v.12, n.3, p. 241-247, 2008. MCBRIER N. M. et al. Reliability and validity of a novel muscle contusion device. Journal of Athletic Training. v. 44, p. 275–278, 2009. MCBRIER, N. M., et al. Therapeutic ultrasound decreases mechano-growth factor messenger ribonucleic acid expression after muscle contusion injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. v.88, p. 936–940, 2007.

MEHALLO, C. J.; DREZNER, J. A.; BYTOMSKI, J. R. Practical management: nonsteroidal antiinflammatory drug (NSAID) use in athletic injuries. Clinical Journal of Sport Medicine. v. 16, p. 170–174, 2006. MERCLIN, N.; BRAMER, T.; EDSMAN, K. Iontophoretic delivery of 5-aminolevulinic acid and its methyl Ester using a carbopol gel as vehicle. Journal of Controlled Release, v. 98, p. 57-65, 2004.

MINAMOTO V. B.; BUNHO, S. R.; SALVINI, T. F. Regenerated rat skeletal muscle after periodic contusions. Brazilian Journal Of Medical and Biological Research,

v. 34, p. 1447–52, 2001. MINAMOTO, V. B; GRAZZIANO, C. R.; SALVINI, T. F. Effect of single and periodic contusion on the rat soleus muscle at different stages of regeneration. The Anatomical Record. v. 254, n. 2, p. 81–87, 1999.

MITKARI, B.; KORDE, S.; MAHADIK, K. R. Formulation and Evaluation of Topical Liposomal Gel for Fluconazole. Indian Journal of Pharmaceutical Education and Research. v. 44, n. 4, p.324-333, 2010. NORRIS, D. A. Mechanisms of action of topical therapies and the rationale for combination Therapy. Journal of the American Academy of Dermatology. v. 53, n. 1, p.17-25, 2005.

91

NOZAKI M. et al. Improved muscle healing after contusion injury by the inhibitory effect of suramin on myostatin, a negative regulator of muscle growth. The American Journal of Sports Medicine, v. 36, p. 2354–62, 2008.

OTA S. et al. Intramuscular transplantation of muscle-derived stem cells accelerates skeletal muscle healing after contusion injury via enhancement of angiogenesis. The American Journal of Sports Medicine, v. 39, p. 1912–22, 2011. PARK, D. et al. Sonophoresis in transdermal drug deliverys Ultrasonics v. 54, p. 56–

65, 2014. PHARMACOPOEIA COMMITTEE OF PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA, Chinese Pharmacopoeia. The Medicine Science and Technology Press of China, Beijing, China, 2010 (English edition). PUNTEL G. O. et al. Therapeutic cold: an effective kind to modulate the oxidative damage resulting of a skeletal muscle contusion. Free Radical Research v. 45, p.

125–38, 2011. QUINTERO, A. J. et al. Stem cells for the treatment of skeletal muscle injury. Clinics in Sports Medicine, v. 28, p. 1–11, 2009. RAINEY, C. E. et al Determining the prevalence and assessing the severity of injuries in mixed martial arts athletes. North American journal of sports physical therapy. v. 4, n. 4, 2009

RIZZI C. F. et al. Effects of low-level laser therapy (LLLT) on the nuclear factor (NF)-kappaB signaling pathway in traumatized muscle. Lasers in Surgery and Medicine

v. 38, p. 704–13, 2006. ROYCHOWDHURY, S. et al. A review on pharmaceutical gel. International Journal of Pharma and Bio Sciences. v. 1, n. 5, p.21-36, 2012. RUPAL, J. et al. Preparation and Evaluation of Topical Gel of Valdecoxib. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Drug Research. v. 2, n. 1, p. 51-54, 2010. SANTOS, M. R. V et al. Cardiovascular effects of monoterpenes: a review. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 21, n. 4, p. 764–771, 2011.

92

SARI, Y. et al. Changes in serum and exudates creatine phosphokinase concentrations as an indicador of deep tissue injury: a piloty study. Internationa Wound Journal, v. 5, p. 674-680, 2008.

SCHÄFER-KORTING, M.; MEHNERT, W.; KORTING H-C. Lipid nanoparticles for improved topical application of drugs for skin diseases. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 59, p.427–443, 2007. SHARMA, S., PAWAR, S.; JAIN, U. K. Development and Evaluation of Topical Gel of Curcumin from Different Combination of Polymers Formulation and Evaluation of Herbal Gel. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. v.

4, n. 4, p. 452-456, 2012. SHEN, Q. et al. Enhanced intestinal absorption of daidzein by borneol/menthol eutectic mixture and microemulsion. AAPS PharmSciTech, v. 12, p. 1044–1049, 2011. SHEN, W. et al. Interaction between macrophages, TGF-beta1, and the COX-2 pathway during the inflammatory phase of skeletal muscle healing after injury. Journal of Cellular Physiology, v. 214, p. 405–12, 2008. SHU, B. et al.Effect of different intensity pulsed ultrasound on the restoration of rat skeletal muscle contusion. Cell Biochemistry and Biophysics. v. 62, p.329–336, 2012. SILVA, J.A. et al. Administração cutânea de fármacos: desafios e estratégias para o desenvolvimento de formulações transdérmicas. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada. v. 31n. 3, p.125-131, 2010. SILVEIRA, P. C., et al. Effects of therapeutic pulsed ultrasound and dimethylsulfoxide (DMSO) phonophoresis on parameters of oxidative stress in traumatized muscle. Ultrasound in Medicine & Biology. v. 36, p.44–50, 2010.

SMITH, C. et al. The inflammatory response to skeletal muscle injury: illuminating complexities. Sports Medicine, v.38, p.947–69, 2008.

SOUZA, J.; GOTTFRIED, C. Muscle injury: Review of experimental models. Journal of Electromyography and Kinesiology. v. 23, p.1253–1260, 2013.

93

TAKAGI, R. et al. Influence of icing on muscle regeneration after crush injury to skeletal muscles in rats. Journal of Applied Physiology, v. 110, p.382–8, 2011. TAN, L. T., et al. Traditional Uses, Phytochemistry, and Bioactivities of Cananga odorata (Ylang-Ylang). Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. v. 2015, p. 1-30, 2015.

TEICHMANN, A. et al. Comparison of stratum corneum penetration and localization of a lipophilic model drug applied in an o/w microemulsion and an amphiphilic cream. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. v. 67, n. 3, p. 699-706, 2007. TIDBALL, J. G. Inflammatory processes in muscle injury and repair. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, v.

288, p.345–53, 2005. TIDBALL, J. G.; VILLALTA, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology v. 298, p.1173–87, 2010.

TOUMI, H.; BEST, T. M. The inflammatory response: friend or enemy for muscle injury? British Journal of Sports Medicine v. 37, p. 284–6, 2003.

TOUMI, H.; F’GUYER, S.; BEST, T. M. The role of neutrophils in injury and repair following muscle stretch. Journal of Anatomy, v. 208, p.459–70, 2006.

TURNER, N. J. et al. Biologic Scaffold remodeling in a dog model of complex musculoskeletal injury. Journal of Surgical Research, v. 176, p. 490–502, 2012.

UCHE, D. O. V. Sol-gel technique: A veritable tool for crystal growth. Advances in Science and Research v. 4, n. 1, p. 506-510, 2013.

UEZUMI, A. et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science, v. 124, p. 3654–64, 2011.

VERMA, A. et al. Formulation, Optimization And Evaluation Of Clobetasol Propionate Gel. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. v. 5, n. 4,

p. 666-674, 2013.

94

WANG L. C. KERNELL, D. Proximo-distal organization and fibre type regionalization in rat hindlimb muscles. Journal of Muscle Research and Cell Motility, v. 21, p. 587–98, 2000. WANG, W et al. Matrix metalloproteinase-1 promotes muscle cell migration and differentiation. American Journal of Pathology, v. 174 p. 541–9, 2009.

WILKIN, L. D. et al. Influence of therapeutic ultrasound on skeletal muscle regeneration following blunt contusion. International Journal of Sports Medicine v.

25, p. 73–7, 2004. WINKLER, T. et al. Time course of skeletal muscle regeneration after severe trauma. Acta Orthopaedica, v. 82, p.102–11, 2011. WOKOVICH, A.M.; et al. Transdermal drug delivery system (TDDS) adhesion as a critical safety, efficacy and quality attribute. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 64 p.1-8, 2006.

XIAO-FEI, J. et al. Preliminary study: biotransformation of borneol to camphor in mice, rats, and rabbits. Mode Tradit Chin Med Mater Med, v. 10, n. 3. p. 27-36,

2008. YANG, J-H. et al. Anti-inflammatory effects by transdermal application of triamcinolone acetonide gel using phonophoresis in rat. International Journal of Pharmaceutics, v.302, p. 39–46, 2005. YUA, B. et al. Improved blood–brain barrier distribution: Effect of borneol on the brain pharmacokinetics of kaempferol in rats by in vivo microdialysis sampling. Journal of Ethnopharmacology. v. 150, n. 3, 1 p.1096–1108, 2013. ZHANG, Q. et al. Improved blood–brain barrier distribution: Effect of borneol on the brain pharmaco kinetics of kaempferol in rats by in vivo micro dialysis sampling. Journal of Ethnopharmacology, v. 162, p. 270–277, 2015.

ZHAO, J-Y. et al. Comparative pharmacokinetic studies of borneol in mouse plasma and brain by different administrations. Journal of Zhejiang University SCIENCE B.

v.13, n.12, p. 990–996, 2012.

95

ZHOU, Y. et al. Enhancement of intestinal absorption of akebia saponin D by borneol and probenecid in situ and in vitro. Environ. Regulatory Toxicology and Pharmacology, v.29, p.229–234, 2010.

ZIMOWSKA, M. et al. Immunoneutralization of TGFb1 improves skeletal muscle regeneration: effects on myoblast differentiation and glycosaminoglycan content. International Journal of Cell Biology, v. 2009, 2009.

96

APÊNDICE

97

APÊNDICE A – ARTIGO

ARTIGO:

Development and evaluation of stability of a formulation containing

the monoterpene borneol

98

Artigo submetido à:

Revista: The Scientific World Journal - ISSN 1537-744X

Título: Development and evaluation of stability of a formulation containing the

monoterpene borneol

Autores: Milla Gabriela Belarmino Dantas, Silvio Alan Gonçalves Bomfim Reis,

Camila Mahara Dias Damasceno, Larissa Araújo Rolim, Pedro José Rolim Neto,

Ferdinando Oliveira Carvalho e Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida.

99

Development and evaluation of stability of a formulation

containing the monoterpene borneol

Milla Gabriela Belarmino Dantas,1 Silvio Alan Gonçalves Bomfim Reis,1 Camila

Mahara Dias Damasceno,1 Larissa Araújo Rolim,1 Pedro José Rolim Neto,2

Ferdinando Oliveira Carvalho,3 Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida1,*

1Center for Studies and Research of Medicinal Plants, Federal University of Vale do São

Francisco, 56.304-205 Petrolina, Pernambuco, Brazil.

2Federal University of Pernambuco, 50.670-901, Recife, Pernambuco, Brazil.

3Federal University of Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil.

*Correspondence should be addressed to Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida;

[email protected]

The current study was designed to develop a topical gel formulation containing the

monoterpene borneol using carbopol as gel base and to evaluate its stability. The

prepared formulation was subjected to physical characterization and physical-

chemistry assessment. The gel was prepared from carbopol gel and 5% of borneol.

The prepared gel was subjected to pharmacotechnical test evaluated for its pH,

viscosity, conductivity, spreadability, centrifugation test and accelerated stability with

freezing-thaw cycle. The borneol was successfully incorporated into the carbopol gel

formulation. Borneol gel (BG5) showed good stability after eight months of its

development and after 12 days in the freeze-thaw cycle, not show statistics differences

in pH value, conductivity, and viscosity before and after test. Furthermore, the

formulation showed a good spreadability. Therefore, it was concluded that the

formulation could be very promising alternative for the topical or transdermal treatment

of skin diseases.

100

1. Introduction

The topical delivery of drugs is an attractive method for local and systemic treatments

and is commonly used in the treatment of inflammatory conditions like dermatological

diseases and musculoskeletal injuries [1, 2, 3]. Topical application has many

advantages over the conventional dosage forms, especially to avoid some serious

systemic adverse effects [4].

When the drug is delivered topically it can penetrate deeper into skin and hence

give better absorption [2, 5]. Topical preparation prevent the metabolism of drug in the

liver, avoid gastrointestinal disorders and the risks and inconveniences of intravenous

therapy and avoid the risks associated to the varied conditions of absorption, like pH

changes, presence of enzymes and gastric emptying time. Furthermore, the

bioavailability of the drug is increased and its action occurs directly at the action site

[6, 7].

A wide variety of pharmaceutical dosage forms can be used in the delivery system

for topical drugs. The most used are gels, creams and ointments, followed by sprays

and liquid preparations [8, 9]. The delivery topical with gels can increase the resistance

time of the drug on the skin and improve the delivery and release of the substance by

increasing the residence time at the injection site [10]. Furthermore, transdermal

delivery of some drugs such as nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) using

gel is proven effective for a variety of clinical conditions [11].

Borneol (C10H18O) is a bicyclic monoterpenoid alcohol commonly used in traditional

Chinese and Indian medicine and is found in more than 60 products based on

medicinal plants [12, 13, 14]. The borneol is extracted from the essential oil of various

medicinal plants and has the ability to accelerate the opening of the blood-brain barrier

and increase the bioavailability of drugs in the brain tissue [15, 16]. It has antibacterial,

101

analgesic and anti-inflammatory action proven in studies that used oral and

intraperitoneal applications of this monoterpene in mice [17, 18].

Although the easy borneol penetration into the nervous tissue is reported, and it is

a potent analgesic and anti-inflammatory, there are no reports in the literature about

borneol penetration of the skin and your topical or transdermal effect. Therefore, the

aim of this study was to develop an effective, stable topical gel containing borneol 5%

(BG5).

2. Materials and methods

2.1 Materials. The borneol was purchased from Sigma-Aldrich®, carbopol 940,

E.D.T.A, methylparaben and triethanolamine were purchased from Via Farma®.

2.2 Preparation of Borneol Gel. The exact amount of carbopol 940 (1%), propylene

glycol (7%) and methylparaben (0.1%) was dispersed in distilled water. The carbopol

dispersion was kept in rest for 24 hours to allow for the complete swelling. Then the

blended carbopol was mixed with continuous stirring, ultrassom and hot plate to form

gel aspect. Dispersion obtained was neutralized with required quantity of

triethanolamine for obtain pH 5.0 to 5.5. The carbopol gel was remained in a plastic jar

for a week at room temperature. Then, a concentration corresponding to 5% of borneol

was diluted with propylene glycol and added to the carbopol gel. The BG5 was stored

in a glass jar and kept at room temperature for 8 months for physical and chemistry

analysis.

2.3 Macroscopic Analysis of Formulation. The prepared BG5 formulation was

inspected visually for your color, homogeneity, consistency and spreadability. The

102

clarity was determined by using the natural light and all the macroscopic analysis were

realized comparing with carbopol gel.

2.4 Accelerated Stability and Physico-Chemical Analysis of Borneol Gel. The BG5 was

submitted to accelerated stability tests. The gel was kept at room temperature (20-25

°C) for evaluation to color, odor, pH, viscosity and conductivity. For analysis the

resistance to freeze-thaw cycle, the BG5 was kept at a temperature of 4 °C and 40 °C

for 12 days. The tests were performed eight months after the production of the

formulation. Each test was done in triplicate with samples of 30 grams each.

2.5 Freeze-thaw Cycle. The BG5 sample was subjected to freeze and thaw cycle, the

test was performed in 12 days with six cycles. In each cycle, the substance remained

in a particular temperature for a period of 24 hours. The temperature in the refrigerator

was 5 ± 2 °C and 40 °C in the greenhouse.

2.6 Centrifugation Test. To perform the centrifugation test, 10 g of formulation was

added in a tapered test tube. In centrifugation, the sample gel was subjected to a cycle

of 3000 rpm for 30 minutes at room temperature. Centrifugation was performed with

Model Centribio® 80-2B equipment.

2.7 Spreadability. The spreadability of the BG5 was measured by spreading of 0.5 g

of the gel on a circle of 2 cm diameter premarked on a glass plate and then a second

glass plate was employed. Half kilogram of weight was permitted to rest on the upper

glass plate for 5 min [19, 20].The diameter of the circle after spreading of the gel was

determined.

103

2.8 Conductivity and pH Analysis. The pH and conductivity of BG5 formulation were

determined by using digital pH meter (MSTecnopon equip. Special LTDA). The glass

electrode was calibrated with the solutions determined for the equipment (pH of 4.00

and 7.00), and the conductivity measurement was done in millivolts (mV). The

preparation was left for about 15 min for attaining equilibrium while measuring. The

analysis of pH and conductivity of formulation were done in triplicate and average

values were calculated.

2.9 Viscosity Study. The viscosity measurement of the borneol gel was performed with

a Viscometer (Quimis® MOD 0860M21). The gel was rotated at 10, 20, 30, 40, 50 and

60 rotations per minute. At each speed, the corresponding dial reading was noted.

2.10 Statistical Analysis. The BG5 formulation was tested in triplicate, and each

analysis were duplicated. Effect of formulation variables after freeze-thaw cycle were

tested for significance by using Student’s t‐test using Graph Pad Prism software‐5

version (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA) and were considered the p

values < 0.05.

3. Results and Discussion

The borneol gel formulation was assessed for its macroscopic characteristics and

qualities such as color, aspect, and aroma. The borneol gel formulation have a smooth

texture and white color transparent and homogeneous, and characteristic odor of

borneol extract. The BG5 characteristics were remained similar eight months after

104

development and there was no difference in aspect of BG5 between before and after

freeze–thaw cycle.

The pH values of the BG5 were found to be in the range from 3.95 ± 0.01 to

3.83 ± 0.03, which was expected since the carbopol gel was formulated with a pH

between 5 and 5.5 because these are values sufficient to obtain a good viscosity and

clarity of the gel [21]. Furthermore, the borneol is also considered acidic [22]. This pH

value showed that the BG5 probably would not produce skin irritation. The conductivity

values of BG5 also remained stable, it was not verified statistical difference in pH

values and conductivity before and after freezing thaw cycle. Hence, the prepared

borneol gel is suitable for topical application. The table 1 shows the physical and

chemical values of BG5 before and after twelve days of the freeze and thaw cycle.

TABLE 1: Results of evaluation of the preliminary stability of borneol gel 5% before

and after the freeze–thaw cycle.

Sample Appearance pH Conductivity Centrifugation

BG 5% Before

Homogeneous,

Transparent,

Incolor

3.95 ± 0.01 186.15 ± 0.35

mV

No noticeable

instability in the

formulation.

BG5 %

After

Homogeneous,

Transparent,

Incolor

3.83 ± 0.03 171.3 ± 1.27

mV

No noticeable

instability in the

formulation.

Values are mean ± standard deviation.

The spreadability of BG5 was considered high by having a low spread of time.

The therapeutic efficacy of gels depends on their spread. The gel spreading helps in

the uniform application of the gel to the skin, so the prepared gels must have a good

spreadability and satisfy the ideal quality in topical application. Furthermore, this is

considered an important factor in patient compliance to treatment.

105

The consistency of the substance is one of the most important features to

analgesic and anti-inflammatory topical formulations due to being applied to the thin

layers of the skin, so that the gel viscosity plays an important role in controlling of drug

permeation. The figure 1 shows the behavior of carbopol gels and BG5 that had a

viscosity tested at six times with 10, 20, 30, 40, 50 and 60 rpm.

FIGURE 1: Effect of shear rate on the viscosity of borneol gel 5% (BG5 %) before

and after the freeze-thaw cycle and carbopol® (CG) gel formulation.

Generally, the viscosity gel formulations reflects consistency [19]. The viscosity

of these gels decreases with increasing rate of shear, showing with non-Newtonian

flow (shear thinning), this behavior is preferred due to its low flow resistance when

applied at high shear conditions [23]. This viscosity decreases with possible

pseudoplastic behavior observed in the formulation of BG5, confirms the characteristic

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

0 10 20 30 40 50 60 70

BG5% Before BG5% Afther CG

106

of high spreadability due to the decrease in viscosity when applying certain force, and

at the same time has the property of remaining at the application site without drain [24].

4. Conclusions

According to the results obtained from this study, it was concluded that borneol was

successfully incorporated into the carbopol gel formulation. Borneol gel showed good

pH value, conductivity, viscosity, spreadability and stability before and after the 12 days

in the freeze-thaw cycle. Therefore, it was concluded that the formulation could be very

promising alternative for the topical or transdermal treatment. However, further

preclinical, clinical and long-term stability studies should be required.

5. References

[1] B. V. Mitkaria, S. A Kordea, K. R. Mahadika and C. R. Kokarea, “Formulation and

Evaluation of Topical Liposomal Gel for Fluconazole,” Indian Journal of

Pharmaceutical Education and Research, vol. 44, no. 4, pp. 324-333, 2010.

[2] M. Glavas-Dodov, E. Fredro-Kumbaradzi, K. Goracinova, S. Calis, M. Simonoska

and A. A. Hincal, “5-Fluorouracil in topical liposome gels for anticancer treatment-

formulation and evaluation,” Acta Pharmaceutica, vol. 53, no. 4, pp. 241-50, 2003.

[3] L. P. Kaur and T. K. Guleri, “Topical gel: Recent approach for novel drug delivery,”

Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, vol. 3, no. 17, pp. 1-5,

2013.

[4] M. W. Whitehouse, “Anti-inflammatory glucocorticoid drugs: reflections after 60

years,” Inflammopharmacology, vol. 19, no. 1, pp. 1-19, 2011.

[5] J. Rupal, J. Kaushal, C. Setty, S. C. Mallikarjuna and P. Dipti, “Preparation and

Evaluation of Topical Gel of Valdecoxib,” International Journal of Pharmaceutical

Sciences and Drug Research, vol.2, no. 1, pp. 51-54, 2010.

107

[6] S. A. Bhasha, S. A. Khalid, S. Duraivel, D. Bhowmik and K. S. Kumar, “Recent

Trends in Usage of Polymers in the Formulation of Dermatological Gels,” Indian

Journal Research Pharmacy Biotechnology, vol. 01, no. 2, pp. 161-168, 2013.

[7] S. Sharma, S. Pawar and U. K Jain, “Development and Evaluation of Topical Gel

of Curcumin from Different Combination of Polymers Formulation and Evaluation of

Herbal Gel,” International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, vol. 44,

no. 4, pp. 452-456, 2012.

[8] J. Gisby and J. Bryant, “Efficacy of a new cream formulation of mupirocin:

comparison with oral and topical agents in experimental skin infections,” Antimicrobial

Agents and Chemotherapy, vol. 44, no. 2, pp.255-60, 2000.

[9] A. Verma, S. Singh, R. Kaur, A. Kumar and U. K. Jain, “Formulation, Optimization

and Evaluation of Clobetasol Propionate Gel,” International Journal of Pharmacy and

Pharmaceutical Sciences, vol. 5, no. 4, pp. 666-674, 2013.

[10] D. Karadzovska, J. D. Brooks, N. A. Monteiro-Riviere and J. E. Riviere, “Predicting

skin permeability from complex vehicles,” Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 65,

no. 2, pp. 265–277, 2013.

[11] G. Cevc and G. Blume, “New, highly efficient formulation of diclofenac for the

topical, transdermal administration in ultradeformable drug carriers, Transfersomes,”

Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1514, no. 2, pp. 191-205, 2001.

[12] Y. Lu, S. Y Du, X. L. Chen et al., “Enhancing effect of natural borneol on the

absorption of geniposide in rat via intranasal administration,” Journal of Zhejiang

University SCIENCE B, vol. 12, no. 2, pp. 143-148, 2011.

[13] L. Chen, J. Su, L. Li, B. Li and W. Li, “A new source of natural D-borneol and its

characteristic,” Journal of Medicinal Plants Research, vol. 5, no. 15, pp. 3440–3447,

2011.

108

[14] E. Horváthová, D. Slamenová, L. Marsálková, M. Sramková and L. Wsólová,

“Effects of borneol on the level of DNA damage induced in primary rat hepatocytes and

testicular cells by hydrogen peroxide,” Food and Chemical Toxicology, vol. 47, no. 6,

pp. 1318–1323, 2009.

[15] Q. Zhang, D. Wu, J Wu, Y Ou, C Mu, B Han and Q Zhang, “Improved blood–brain

barrier distribution: Effect of borneol on the brain pharmacokinetics of kaempferol in

rats by in vivo microdialysis sampling,” Journal of Ethnopharmacology, vol. 162, pp.

270–277, 2015.

[16] B. Yua, M. Ruanb, X. Dongc, Y. Yua and H. Chenga, “Improved blood–brain

barrier distribution: Effect of borneol on the brain pharmacokinetics of kaempferol in

rats by in vivo microdialysis sampling,” Journal of Ethnopharmacology, vol. 150, no. 3,

pp. 1096-1108, 2013.

[17] J. R. G. S. Almeida, G. R. Souza, J. C. Silva et al., “Borneol, a Bicyclic

Monoterpene Alcohol, Reduces Nociceptive Behavior and Inflammatory Response in

Mice,” The Scientific World Journal, vol. 2013, pp. 1-5, 2013.

[18] D. Slamenová, E. Horváthová, L. Wsólová, M. Sramková and J. Navarová,

“Investigation of anti-oxidative, cytotoxic, DNA-damaging and DNA-protective effects

of plant volatiles eugenol and borneol in human-derived HepG2, Caco-2 and VH10 cell

lines,” Mutation Research, vol. 677, pp. 46–52, 2009.

[19] U. Shinde, S. Pokharkar, and S.Modani, “Design and evaluation of microemulsion

gel system of nadifloxacin,” Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 74, no. 3,

pp. 237–247, 2012.

[20] S. A. Al-Suwayeh, E. I. Taha, F. M. Al-Qahtani, M. O. Ahmed, and M. M. Badran,

“Evaluation of Skin Permeation and Analgesic Activity Effects of Carbopol Lornoxicam

109

Topical Gels Containing Penetration Enhancer,” The Scientific World Journal, vol.

2014, pp. 1-9, 2014.

[21] M. T. Islam, N. Rodríguez-Hornedo, S. Ciotti and C. Ackermann, “Rheological

characterization of topical carbomer gels neutralized to different pH,” Pharmaceutical

Research, vol. 21, no. 7, pp.1192-9, 2004.

[22] J. Xiao-feia, Z. Jia-lia, Y. Yue-meia, F. C. P. Lawb, Q. Yan-jiangc and Y Mei-cuna,

“Preliminary study: biotransformation of borneol to camphor in mice, rats, and rabbits,”

World Science and Technology, vol.10, no.3, pp.27–36, 2008.

[23] M. Bousmina, “Rheology of polymer blends: linear model for viscoelastic

emulsions,” Rheologica Acta, vol. 38, no. 1, pp. 73– 83, 1999.

[24] F. C. Carvalho, M. S. Barbi, V. H. V. Sarmento, L. A. Chiavacci, F. M. Netto and

M. P. D. Gremiao, “Surfactant systems for nasal zidovudine delivery: structural,

rheological and mucoadhesive properties,” Journal Pharmacy and Pharmacology, v.

62, pp.430-439, 2010.

110

ANEXOS

111

ANEXO A – Aprovação do Comitê de Ética e Deontologia em Estudos e

Pesquisas – CEDEP, Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA / UNIVASF

112

ANEXO B – Carta de Submissão do Artigo

DESENVOLVIMENTO DE UM GEL CONTENDO O MONOTERPENO … · acima de tudo, sempre acreditou em mim e me...

Documents

Transcript of DESENVOLVIMENTO DE UM GEL CONTENDO O MONOTERPENO … · acima de tudo, sempre acreditou em mim e me...