Introduction 1I. INTRODUCTION GENERALE I.1.CYCLE DE VIE DUNE METHODE ANALYTIQUE Une mthode analytique est un moyen visant exprimer concrtement un besoin bien exprim,ouencorecestlarponsematrialiseunproblmedonn,commeparexemple dans le cadre de notre travail la prsence dimpurets (chirales) dans un mdicament, nfastes pour la sant et dont il faudra dterminer la teneur. Dans le domaine analytique, deux types de mthodessontmentionns,lesmthodesqualitativesetlesmthodesquantitatives.Par rapport cette dernire, lobjectif dune mthode analytique peut se rsumer en sa capacit quantifierchacunedesquantitsinconnuesprsentesdansunchantillon.Lamiseenuvre dunemthodededosagepeutsedcomposerenquatregrandesphasesgnralement successives telles quillustres dans la figure I.1. [1] : -une phase de Slection o des objectifs et des conditions opratoires initiales sont dfinis ; -unephasedeDveloppement,avecousansoptimisationaumoyendeplans dexpriences ; -une phase de Validation (Validation Interne/Externe) prcde, selon les cas, dune phase de prvalidation ; -une phase dapplication en routine (Usage en routine), incluant le plus souvent une validation en routine et parfois une validation partielle ou une revalidation. Introduction 2 Figure I.1. Cycle de vie dune mthode analytique Lgendes : Les tapes sont reprises dans un rectangle vert (gras), les tests associs dans un rectangle bleu et les critres pour lvaluation dans un rectangle non colori (italique). I.1.1. SELECTION DUNE METHODE Ltape de la slection est critique pour un analyste. En effet, tant le point de dpart dunemthode,cestdellequedpendentlesautrestapesetplusparticulirementles dcisions qui seront prises. De ce fait, elle ncessite de bien cerner la problmatique en vue de dfinirclairementlesobjectifspourproposerdessolutionsappropries,matrialisesen termesdeconditionsopratoires(output).Unproblmemalcernconduitdesdcisions inappropries,aveccommeconsquencelapertedetemps,deractifsetdargent,dola Optimisation des paramtres instrumentaux, des conditions opratoires, tablissement des procdures opratoires standardises SELECTIONDEVELOPPEMENTVALIDATION EXTERNEUSAGE EN ROUTINESpcificit - Slectivit, Justesse, Linarit, Prcision, Exactitude, Fonction de rponse, Limites de dtection et de quantificationReproductibilit / RptabilitChoix des analytes, Type de technique, SignalPlanification des contrles, Plan dchantillonnage, Capacit de mesureExpertise de lanalysteOptimisationTest de robustessePlan exprimentalProcdures de validationEtudes inter-laboratoiresTests daptitudesCarte de contrleTest de robustesseOptionnelleREVALIDATIONVrification des aptitudesVALIDATION INTERNEOptimisation des paramtres instrumentaux, des conditions opratoires, tablissement des procdures opratoires standardises SELECTIONDEVELOPPEMENTVALIDATION EXTERNEUSAGE EN ROUTINESpcificit - Slectivit, Justesse, Linarit, Prcision, Exactitude, Fonction de rponse, Limites de dtection et de quantificationReproductibilit / RptabilitChoix des analytes, Type de technique, SignalPlanification des contrles, Plan dchantillonnage, Capacit de mesureExpertise de lanalysteOptimisationTest de robustessePlan exprimentalProcdures de validationEtudes inter-laboratoiresTests daptitudesCarte de contrleTest de robustesseOptionnelleREVALIDATIONVrification des aptitudesVALIDATION INTERNEIntroduction 3ncessit dune bonne expertise de lanalyste qui devra sappuyer sur un maximum da priori, dinformations pertinentes (input). La slection de la mthode tant faite, il est indispensable deffectuer des expriences complmentaires en vue de sassurer du bien fond de la mthode et de la capacit de sa mise en uvre par le laboratoire par rapport lusage requis [1]. I.1.2. DEVELOPPEMENT DUNE METHODE Laralisationdecettephasepeutsefaireaumoyenounondunplandexpriences selonlaproblmatiquedfinielorsdeltapedelaslection.Toutefois,ilsavrequedans certainessituations,bienquelesconditionsopratoiresanalytiquessoientoptimises, lapplicationenroutinedemthodesanalytiquesnaboutitpasforcmentunrsultat satisfaisant. En effet, dautres objectifs sont parfois ajouts en phase de routine, par exemple ladaptationdunemthodepourledosagedunemolculesimilaireoudimpurets dcouvertesenphasederoutinequilfaudraquantifierimprativement,utilisationdela mthode dans une autre application (bioanalyse). Dans ce cas, il est indispensable doptimiser nouveau la mthode et recourir un plan dexpriences. I.1.2.1. MTHODOLOGIE DES PLANS DEXPRIENCES Les plans dexpriences font partie de la chimiomtrie [2]. Lobjectif poursuivi est de fournirlanalyste,moyennantunnombredexpriencesrestreint,unmaximum dinformationspertinentespouvantexpliquercertainseffets,informationssusceptiblesdene pastreobtenuesparlamthodologieclassiqueunivarie.Cettedernirenefournitdes informations que pour un seul facteur tudi, les autres facteurs tant maintenus un niveau constant. Puisquedanslamthodologiedesplansdexpriences,touslesfacteurssonttudis simultanment,lastratgieconsisteraliserlesexpriencesdemanireprogrammeet raisonne en faisant varier les niveaux de tous les facteurs la fois [3-5]. Le meilleur moyen pouryparvenir,toutenexpliquantlesphnomnesobservsetenexploitantlesrsultats obtenus,estlutilisationdesoutilsmathmatiquescombinsauxoutilsstatistiquescequi, Introduction 4paradoxalement, rend complexe leur mise en uvre. Cependant, grce lapport fondamental de linformatique, au dveloppement et la disponibilit de nombreux logiciels dvelopps cet effet, leur utilisation est maintenant rendue plus accessible et surtout plus rapide. Plusieurs types de plans sont dfinis pour raliser les expriences et sont dcrits dans lalittrature[6-9].Retenonsque les plans dexpriences sont gnralement rpartis en plans factorielscompletsetfractionnaires.Cependant,pourlechoixdunplanadquat,ilyaun certain nombre de prrequis tels que lobjectif poursuivi par lanalyste, le type et le nombre de facteurs tudier, les informations recueillir, et mme les exigences de lexprimentateur. I.1.2.2. MODLISATION Sansunemodlisation,lesplansdexpriencesnontaucunevaleurinformativeni exploitable.Lamodlisationpermetdexprimerlarelationentre,dunepart,larponse(Y) quileplussouvent,estunparamtredeperformancedelamthodeanalytique,et,dautre part, les facteurs tudier (X1,X2, X3Xp). Le choix du modle (premier ou second degr) dpendradesobjectifs poursuivis, du nombre de facteurs considrs ainsi que dunombre de niveaux tester par facteurs. Lquation I.1. reprsente un modle appliqu sur la base dune rgression linaire multiple pour p facteurs : = = =+ + + =pjpkk j jkpii iX X X Y1 1 10 (I.1.) Dans cette quation, le terme quadratique apparat dans la double somme lorsque j est gal k, et lorsque j nest pas gal k, le terme correspond une interaction entre le facteur j etlefacteurk ;tantquantellelerreurrsiduelle.Signalonsencorequunterme quadratiquenepeuttreobtenuquavecunplandexpriencesdanslequelplusdedeux niveaux sont envisags. I.1.2.3. OPTIMISATION Lunedesapplicationsdesplansdexpriencescorrespondaucriblagedansun domaine exprimental fix, de tous les facteurs potentiellement influents, y compris ceux qui Introduction 5ne semblent ne jouer quun rle mineur. Les plans exprimentaux appropris dans ce cas sont desplansfactorielscompletsoufractionnairesdeuxniveaux.Lesfacteursayantune influencerellementsignificativetantidentifis,leuroptimisationpeutensuitetre envisage.Elleconsisteenlaslectionparmilamultiplicitdesolutionspotentielles,dela meilleuresolutionparrapportdescritresbiendfinisetce,toujoursaumoyendesplans dexpriences.Cependant,lesplansfactorielsdeuxniveauxneconviennentpaspour lexamendessituationsspcifiquesloptimisation,parexempleleseffetsquadratiquesqui doiventpouvoirtrevalusaummetitrequeleseffetsprincipauxetlesinteractions ponctuellesentrelesdiffrentsfacteurs.Ainsi,ilestncessairederecourirunmodledu second degr. Lquation I.2. illustre un exemple de modle pour lequel trois facteurs (X1, X2 et X3) sont considrs : Y = 0 + 1X1 + 2X2 + 3X3 + 11X12 + 22X22 + 33X32

+ 12X1X2 + 13X1X 3 + 23X2X3 + (I.2.) Y tant la rponse, 1, 2 et 3 les effets principaux de ces facteurs, 11, 22 et 33, leurs effets quadratiques, 12, 13 et 23 les effets dinteraction entre deux facteurs et lerreur rsiduelle. Lamiseenpratiquedetelsmodlesncessitelapplicationdeplansdexpriencesadquats, parmi lesquels peuvent tre cits le rseau de Doehlert, le plan factoriel complet 3 niveaux, le plan algorithmique D-optimaux, le plan central composite et le plan de Box-Behnken [10-12]. Cependant,ilarriveparfoisque,lorsdeloptimisation,larelationentrelarponse slectionneetlesfacteurstudisnesoitpasmodlisableparlesoutilsmathmatiques usuels.Cecasdefigureestgnralementobservlorsquelesrponsessontdesparamtres intermdiaires,commeparexemplelarsolution,frquemmentutilisecommecritrepour qualifierloptimalitdesconditionsopratoiresdunemthodesparative[13-17].Eneffet, on peut constater que la relation entre la rsolution et un facteur donn X dcrot jusqu un minimum voire mme zro, puis ensuite crot [18]. Dans ce cas, il est recommand deffectuer unemodlisationindirectequipeutsefaireendeuxtapes[19]:lapremireconsiste modliserlesdiffrentesrponsesdirectementissuesdelexcutiondesexprienceset aisment modlisables, telles que le temps de rtention, le temps de migration ou les largeurs mi-hauteur des pics des analytes. Ensuite, les rponses obtenues lors de cette premire tape permettentdestimerlesdiffrentesrponsesnonmodlisablestellesquelarsolution,le facteurdesymtrie,lenombredeplateauxthoriques.Celles-cisontsouventdesrponses Introduction 6dintrtpuisquellesvontpermettredejugerlaqualitdelaperformancedunemthode sparative obtenue pour chaque condition exprimentale relevant des facteurs concerns. Les rponses dintrt doivent tre fonction des rponses obtenues la premire tape. I.1.2.4. OPTIMISATION SIMULTANE DE PLUSIEURS RPONSES Loptimisation des valeurs des facteurs peut devenir une situation difficile rsoudre, enparticulierlorsquilyaplusieursrponsesrendreoptimales.Ilestdslorsindiqude recourirdesapprochesmultirponses,parexemplecelleproposeparLantrietLongeray [2],quiconsidrelindiceglobaldunesparationcommefacteurderponsepermettant dapprcierlaqualitglobaledunesparationouencorecellequiutiliselecritre doptimalitdePareto[20,21].Cettedernireapprochequiatintroduitedansla chromatographie par Smilde et coll. [21], permet de dcider de loptimalit dune exprience enconsidrantlefaitquilnyaaucuneautreexpriencequiaitunmeilleurrsultatsurun critre sans pour autant avoir un rsultat dfavorable sur un autre. Citons dautres approches tellesquecellesutilisantlesfonctionsdobjectifsbasssurlesrapportsdesrponsesousur lesfonctionsdutilitdesrponses.Cependant,cesapprochessonttrsvitelimiteslorsque limportance des rponses doit tre prise en considration de manire individuelle. Une autre limitation non moins importante apparat lorsque, par exemple, les rponses impliquent aussi des pics non adjacents et plus particulirement lorsque celles-ci sont des rponses dintrt. Il estalorsrecommanddesorienterversdesapprochesquiconsidrentlaprisededcision base sur des critres multiples Multicriteria decision making et pondrables [20, 22, 23]. LafonctiondedsirabilitdfinieparHarrington[24]etparDerringeretSuich[25] estlunedesapprocheslesplusutilises.Initialementintroduiteenchromatographieliquide parBourguignonetMassart[26],lafonctiondedsirabilitdeDerringerafinipartre largementadopteparlesanalystespourrsoudredessituationscomplexeslorsde loptimisation de mthodes analytiques [19, 27, 28-37]. Elle est base sur la transformation de touteslesrponsesobtenuespartirdediffrenteschellesdemesureenunechelle identique de dsirabilit et sans dimension. Les valeurs des fonctions de dsirabilit (di) sont comprises entre 0 et 1. Comme le montre la figure I.3. la valeur de 0 est attribue lorsque les facteurs conduisent une rponse inacceptable (non dsirable) et celle de 1 lorsque la rponse reprsente la performance maximale dsire pour les facteurs considrs [17, 26]. Introduction 7 Figure I.3. Dsirabilit (di) dune rponse Yi pour un facteur considr ri Lquationpermettantdecalculerlesvaleursdedsirabilitindividuellespeuttreainsi prsente : | | < < =max ,max , min ,min ,10min , max ,min ,i ii i ii irY YY YiY YY Y YY Ydii ii i(I.3.) avec : Yi,min, la valeur en dessous de laquelle la rponse Yi ne convient pas (di = 0) ; Yi,max, la valeur cible au dessus de laquelle la rponse Yi est trs satisfaisante (di = 1) ; ri,lefacteurmodifiantlimportanceduneaugmentationdelarponseYipourla dsirabilitindividuelleconsidre.Celacorrespondlapondrationdufacteur dpendant de lutilisateur en fonction du degr de dsirabilit que lon voudrait avoir pour une rponse donne entre Yi,min et Yi,max. Ensuite,lensembledesdsirabilitsindividuellesestrassemblenuneseuledsirabilit globale D qui est leur moyenne gomtrique. La valeur de D la plus leve est obtenue dans les conditions o la combinaison des diffrentes rponses est globalement optimale. di01Yi,maxYi,minYiri1Introduction 8 I.1.3. VALIDATION Lavalidationestlensembledesoprationseffectuesenvuedeprouverquune procdureestsuffisammentexacteetfiablepouravoirconfiancedanslesrsultatsfournis pour lusage prvu (de la mthode de dosage) [38-43]. Plusieurs procdures ont t labores cet effet [38, 44-49]. Dun point de vue statistique, elles prsentent certaines insuffisances, notammentlemanquedeconsidrationdelaprisededcisionenfonctiondelimites dacceptation dfinies a priori et du risque relatif lusage futur de la mthode. Rcemment, une nouvelle stratgie de validation base sur le profil dexactitude a t introduite[50,51].Elleestenparfaitaccordaveclobjectifdunemthodeanalytique, savoir sa capacit de quantifier le plus exactement possible chacune des quantits inconnues quun laboratoire aura dterminer [43]. A ce stade, il est important de dfinir certains termes frquemment rencontrs en validation. Lajustesseexprimeltroitessedelaccordentrelavaleurmoyenneobtenuepartir dunesriehomognedersultatsdessaisetunevaleurquiestacceptesoitcommeune valeur conventionnellement vraie, soit comme une valeur de rfrence accepte. La mesure de la justesse est gnralement exprime en termes de recouvrement et de biais absolu ou relatif (erreursystmatique)[50,52].Unevaleurconventionnellementvraiepeuttreparexemple un talon international, un talon dune pharmacope. Lafidlitexprimeltroitessedelaccordentreunesriedemesuresprovenantde multiples prises dun mme chantillon homogne dans des conditions prescrites. La fidlit fournituneindicationsurleserreursliesauhasard[50].Ellepeuttrevaluetrois niveaux,savoirlarptabilit,lafidlitintermdiaireetlareproductibilit.La reproductibilit nest envisage que dans le cas dtude inter-laboratoires. Lexactitudeexprimeltroitessedelaccordentrelersultatdessaietlavaleurde rfrence accepte, aussi appele valeur conventionnellement vraie . Ltroitesse daccord ainsiobserveestlarsultantedelasommedeserreurssystmatiquesetalatoires,en dautres termes lerreur totale lie au rsultat [50, 52]. La nouvelle stratgie de validation permet dassocier les deux lments fondamentaux delavalidationquesontlajustesseetlafidlitaursultatfinaldunemesure,etpar consquentdetenircomptedelerreurtotaledemesure(erreursystmatique+erreur Introduction 9alatoire) [50]. Le principe de cette stratgie de validation peut tre traduite par lquation I.4. qui stipule que la diffrence entre une mesure (x) et sa vraie valeur () doit tre infrieure la limite dacceptation () dfinie a priori. < < < x x (I.4.) La notion de limite dacceptation introduit donc un premier critre permettant lanalyste de prendredesdcisionsbassurlobjectifdelamthodeanalytique.Communment,lalimite dacceptation est de 1% ou 2 % pour le dosage de principes actifs dans une matire premire, de5%pourlesformespharmaceutiquesetde15%pourlesanalysesdanslesmatrices biologiquesouenvironnementales[50,51].Pourladterminationdesimpurets,unelimite dacceptation minimale de 10 % est communment admise [53, 54]. Leprofildexactitudeestconstruitpartirdesestimsdelintervalledetolrance desprance de mesures attendues chaque niveau de concentration. Uneautrenotionimportantedfinieestcellede bonneprocdureanalytique avec un risque connu qui peut se traduire par la relation suivante : | | > x Pr (I.5.) avec la proportion de mesures dans les limites dacceptation, et la grandeur dfinissant les limitesdacceptationfixesapriorienfonctiondescontraintesdusecteurdactivit.Le risque associ dune procdure svalue par la proportion attendue de mesures en dehors des limites dacceptation [50, 55]. Le risque associ dpend des estims du biais et de la prcision delaprocdureanalytiqueobtenusenphasedevalidationcommelemontrelafigureI.4. Prcisonsdsprsentquedanslecadredenotretravailnousavonsconsidrquune estimation est un moyen par lequel on obtient une valeur qui est l estim . La formule qui est applique pour obtenir cet estim est quant elle l estimateur . Introduction 10 Figure I.4. Profil dexactitude comme outil de dcision pour quatre mthodes M1 (fidle et juste), M2 (fidle mais non juste), M3 (non fidle et non juste) et M4 (non fidle mais juste) Ainsi, le profil dexactitude est un outil de dcision base sur le risque associ la mthode. Lanotionderisqueestlielagarantieconcernantlafutureanalysedeschantillons inconnustoutenappliquantlamthodevalide.Parconsquent,leprofildexactitudepeut serviraccepterourejeterunemthodeanalytiquesuivantlusageattendu.Parailleurs,le profil peut galement tre utilis comme outil de diagnostique. Par exemple, il peut tre utilis pourslectionnerlemodledergressionleplusappropripourlacalibrationetpour dterminerleslimitesdequantificationsuprieureetinfrieureetslectionnerainsique lintervalle de dosage [54]. Unetroisimenotionrelativecettenouvellestratgiedevalidationimportantedans lecadredenotretravailestsapossibilitdestimerlincertitudedemesuresurlabasedes donnes de validation [1]. Cette notion sera explicite ultrieurement dans ce travail. 0% = M1M3M2| | > x Pr+ M40% = M1M3M2| | > x Pr+ M4Introduction 11I.1.4. ROBUSTESSE Selon la figure I.1., la robustesse est considre comme une tude qui se ralise dans lestapesdedveloppementetdevalidation.SelonICH,larobustessefaitpartiedela validation [56] et est ralise en complment des expriences de validation. Cependant, dans la pratique courante, les analystes la considrent trs souvent comme tant une tape distincte delavalidation.Acausedurisquelilobtentiondunemthodenonrobuste(pertede temps,dargentetparfoisfrustrationdesoprateurs),certainsanalystesprfrenttesterla robustesse dune mthode en phase de dveloppement et doptimisation [56, 57]. Larobustesseduneprocdureanalytiqueestlamesuredesacapacitnepastre affectepardeschangementsfaiblesmaisdlibrsdesparamtresdelaprocdure[56,58-61]. Elle fournit une indication sur la fiabilit dune procdure lors de son usage normal [56-61].Suitelvaluationdelarobustesse,unesriedeparamtrespermettantdevrifierles performancesdusystmepeuventtretablisenvuedesassurerquelavaliditdela procdure est maintenue chaque application [62]. La robustesse peut donc servir fixer les valeurspourlestestsdeconformitdusystme(SystemSuitabilityTest)ainsiqueleurs limites[59,62,63].Elleestgalementimportantepourlidentificationdesfacteurs exprimentauxnayantpasncessairementtvalusenphasedoptimisationmaisqui cependant, pourraient avoir une influence sur les rsultats. Il est en effet important de pouvoir anticiperlesproblmessusceptiblesdesurvenirlorsdelapplicationdelamthode,par exemple lors de lanalyse en routine ou au cours dune tude collaborative [59, 63, 64]. Si les mesuressontsensiblesauxvariationsdesconditionsanalytiques,ilestalorsexigde maintenirlesconditionsopratoiresaussiconstantquepossibleoudintroduireune prcaution particulire dans la description de la mthode [62]. Cesontgnralementlesrponsesqualitativesquisontleplussouventexamines pour valuer la robustesse dune mthode. Cependant, les rponses quantitatives doivent tre considrestantdonnlobjectifdunemthodequiestladterminationquantitativedune substance dans un chantillon. Il est ds lors envisageable de se servir de la robustesse comme unoutildeprdictionducomportementdunemthodelorsdesonusage.Particulirement pourlesrponsesquantitatives,letestderobustessepeutservirprdirelexactitudeetla reproductibilit [59, 62, 65-67]. Parfoislexamendesgraphiquesdessurfacesderponseobtenusenphase doptimisation peut servir de point de dpart pour une valuation prliminaire de la robustesse Introduction 12des facteurs tudis. Cependant, le meilleur moyen reste lapplication des plans dexpriences qui,commenoncprcdemment,offrentlavantagedtudiersimultanmentplusieurs facteursetdentirerlesconclusionspertinentes.Bienquilexistequelquesapplicationsdes plans exprimentaux utilisant plusieurs niveaux [64, 65], ce sont surtout ceux deux niveaux, notammentlesplansfactorielsfractionnaires[68-70]oulesplansdePlackett-Burman[70, 71]quisontlesplusutiliss.Ilsconviennentpourlvaluationdunnombrerelativement important de facteurs avec un nombre relativement restreint dexpriences. De plus, seuls les effets principaux des facteurs sont valus, ce qui simplifie lexploitation des rsultats. Du fait deleurmiseenuvrefacileparrapportauxplansfractionnaires,lesplansdePlackett-Burman sont conseills pour les analystes peu expriments dans ce domaine. Quelques plans recommands sont prsents dans le tableau I.1. Tableau I.1. Plans de Plackett-Burman CommeindiqudansletableauI.1.,ilestpossibledetesterlarobustessedune mthodeavec7facteursopratoiresetce,enappliquantunplandePlackett-Burmanavec8 expriences.AinsiquelaproposHundetcoll.[115],ilestenvisageabledesimulerune tudeinter-laboratoirespourlaquellelesnormesISO[52]exigentunminimumde8 laboratoires. Nombre de facteurs Plan de Plackett-Burman slectionn Nombre de variables fictives (dummy) Nombre dexpriences 3 7Plan pour 7 facteurs4 08 8 11Plan pour 11 facteurs3 012 12 15Plan pour 15 facteurs3 016 16 19Plan pour 19 facteurs3 020 20 23Plan pour 23 facteurs3 024 Introduction 13 I.1.5. ETUDE COLLABORATIVE Une tude collaborative (ou inter-laboratoires) ne constitue pas au sens strict une tape du cycle de vie dune mthode. Cependant, elle est reprise au niveau des tests daptitude lors delutilisationenroutinedelamthode(figureI.1.)dontelleestconsidrecomme prcurseur. Selon Lowthian et coll. [72], une mthode est dclare entirement valide lorsque ses performances ont t prouves au moyen dune tude inter-laboratoires. Une tude inter-laboratoirespeutdonctredfiniecommeunensembledessaiseffectusmomentanment dansdiffrentslaboratoiresreprsentatifsdelapopulationdelaboratoiressusceptibles dutiliser la mthode en routine. Unetudeinter-laboratoiresfaitintervenirnotammenttroisentits : laboratoire , mthode et substance (Figure I.5.). Figure I.5. Principaux objectifs (rectangles gris) poursuivis lors dune tude inter-laboratoires pour les trois entits impliques (cercle gris en caractres gras) en se servant des critres dfinis (rectangle avec caractres italiques). BiaisReproductibilitRptabilitPerformancesBiaisPerformancesPrcisionExactitudeIntercomparaisonSubstitutionTransfertValidationTests de comptenceEstimation de lincertitude Dclaration dincertitude Certification dune SCRComposition qualitativeComposition quantitativeMthodeLaboratoireEchantillonBiaisReproductibilitRptabilitPerformancesBiaisPerformancesPrcisionExactitudeIntercomparaisonSubstitutionTransfertValidationTests de comptenceEstimation de lincertitude Dclaration dincertitude Certification dune SCRComposition qualitativeComposition quantitativeMthodeLaboratoireEchantillonIntroduction 14 Ds lors, les diffrents objectifs poursuivis [73] se rapporteront ces entits dune manire ou duneautre,cequiconcordeavecladfinitiondonneparHorwitzdansle4merapportde lUnion Internationale de Chimie Pure et Applique [74] et par Maier et coll. [75]. Au niveau de lentit mthode , ltude inter-laboratoires permettra den valuer les performances en termes dexactitude, de biais et de prcision (rptabilit et reproductibilit) [52,73,75-79]dansunbutdintercomparaisonoudesubstitutiondemthodes.Dautres objectifs consistent dmontrer la capacit de transfert dune mthode selon des critres bien dfinis [73, 78], de valider une nouvelle mthode ou une mthode amliore en la comparant avec une autre dont la validit est avre ou une mthode de rfrence [75]. Parrapportlentit laboratoire ,unetudepermettradvaluersesperformances (biaisdulaboratoire)[73,77].Danscecas,ilseraimpliqudansdestestsdaptitude (ProficiencyTestingSchemes)[80-82]dontlesrsultatsserontvrifislorsdaccrditation (ISO 17025). Enfin, une tude inter-laboratoires pourrait servir lidentification des composs [73, 80],ladterminationdelacompositionquantitativedunchantillon[79]oula certificationdunesubstancechimiquederfrence(SCR)[73,78,81,83].Deplus,la reproductibilitdesrsultatspeuttredtermine,cequipermettradecalculerlincertitude des rsultats et de pouvoir estimer lincertitude associe aux futurs rsultats [84]. Ltudeinter-laboratoiresconstituecertainementunetapepertinentepourune mthode avant son application une large chelle. Par consquent, il est important quelle soit bienprpareetmeneconvenablementselonunprotocolebiendfini,judicieusement laborpourpermettredatteindrelaplupartdesobjectifsfixs.Leprotocoledoittrebien comprisparlesdiffrentespartiesimpliquesetconvenuentreelles.Ltudecollaborative doitreflterlepluspossiblelusageenroutinedelamthodedanslesconditionsdu laboratoire daccueil. Au niveau de la prparation de ltude, il est indispensable de veiller diffrentsaspectsnotammentlacomptencedesdiffrentsoprateurs,lecaractreappropri des quipements utiliss, la pertinence des tests statistiques appliqus pour les traitements des donnes, linterprtation des rsultats et ltablissement des conclusions [52, 73, 78, 85]. Les aspectsadministratifsdoiventaussitreconsidrs.Unprotocoletropcharg,incomprisou mallaborpeutconduiredesrsultatsinutiles,scientifiquementinexploitables,etparfois pouvant tre la cause des abandons dtudes. Ds lors, pour circonscrire ces situations, il est utiledeffectuerpralablementuntestprliminairepourvaluerlamiseenuvreparles laboratoires de la mthode concerne et leur permettre de se familiariser au protocole dtude. Introduction 15Ilsepourraitquunetudeinter-laboratoiresnepuissepasaboutirdesrsultats attendusouexploitablespourltablissementdelareproductibilit.Danscecas,ellese limiteralatranscriptiondesrsultatsobtenusetunreportdesproblmessurvenuset ventuellementdessolutionsproposes[86-89].Uner-valuationdelamthodeserads lors envisage dans les phases prcdentes. Introduction 16 I.2.INCERTITUDE I.2.1. GENERALITES Alheureactuelle,dansnotresocit,lecontrledequalitdevientdeplusenplus frquent et les exigences sur les rsultats rendus sont de plus en plus importantes. Il suffit de considrerlesdomainesointerviennentlesrsultatsdesmthodesdedosagepoursen rendrecompte:dveloppementetcontrledequalitdesmdicaments,dterminationde paramtresdebiologieclinique,analysestoxicologiquesetmdico-lgales,contrles antidopage,analysesdedioxinesetdepolychlorobiphnyles(PCB),dadditifsdansles aliments, etc. Etant donn limportance des dcisions prendre, par exemple en conformit avec les rglementations gouvernementales ou les limites fixer dans les commerces internationaux, il est important de pouvoir dmontrer la qualit de ces rsultats. Pour ce faire, lapplication des mthodesdanalysevalides,desprocduresdfiniesdecontrledequalitinterneetla participationauxtestsdaptitudeconformmentlanormeISO/CEI17025[82]sontdes moyensutilissenvuedesatisfairecesexigences.Parexemple,enindustrie pharmaceutique,commelemontrelafigureI.6.lesdiffrentestapespourlobtentiondun rsultat sont vrifies par lassurance qualit.Afinquelesrsultatsfournissoientvalablementinterprtsetdoncutilissbon escient, il faut quils soient fiables cest--dire que leur incertitude soit connue. De plus, il est impossible de dterminer ladquation par rapport lobjectif dune mthode analytique sans encomparerlesestimsdelincertitudedemesureaveclaconfianceexige[91].Sansla connaissancedelincertitudedemesure,ladclarationdunrsultatanalytiquenepeuttre considrecomplte[92].Cestpourquoi,lanormeISO17025imposedepuis2001aux laboratoiresdessaietnotammenttouslesprestatairesdeservicesdansledomainedela santhumainedappliquerdesprocdurespourlestimationdelincertitudedemesurepour leurs rsultats dessais et de mesure et le cas chant, de rapporter cette incertitude [82, 93]. Introduction 17 Figure I.6. - Diagramme dIshakawa prsentant les diffrentes interventions vrifies par lassurance de qualit en vue de fournir au client de rsultats de qualit. Cependant,bienqueleconceptdincertitudesoitclairementtablidepuisuncertain temps (approches GUM et EURACHEM) [91, 93], il nen existe pas moins un foss entre ces exigencesnormativesetlapratiquequotidiennedeslaboratoires.Eneffet,lesapproches mtrologiquesprcitessontcomplexes,coteusesetsouventfastidieusesdanslecadre danalysesimpliquantdemultiplessourcesderreurs.Ellesposentdoncunproblme conomiquequasiinsolublepourcesprestatairesdeservicestantetsibienqulheure actuelle, la plupart dentre eux sont incapables de rpondre valablement cette exigence. Sans information sur lincertitude, linterprtation des rsultats est malaise et la prise dedcisiondlicatepouvant,parexemple,conduireladclarationdeconformitdun produitquinelestpasetinversementlanon-conformitdunproduitquiestconforme. Cettesituationpeutavoirdesconsquencesdfavorablestantpourlasocit(santdes consommateurs)quepourlesindustries(dpensesinutilesetpoursuitesjudiciaires inappropries). Rponse (Prestataire)Protocole dtudeArchivage Rapport dtude Documentation Mthode analytique Oprateur Matriels Equipements VrificationRglementations Publications Normes et critres dacceptation Lignes directrices ApprobationVrification Approbation Slection Qualification Verrerie volumtrique Echantillons analyser Substances de rfrence QualificationComptence Demande (Client) Calcul Calcul Vrification Rdaction Rdaction Certificat danalyseRdaction Expdition Version lectronique Version papier Appropriation Qualification Conservation Certificat danalyseDveloppement Validation (interne) Application Assurance qualit Introduction 18 I.2.2. DEFINITION DE LINCERTITUDE Lincertitudeestdfiniecommetantunparamtreassociaursultatdunemesure, quicaractriseladispersiondesvaleursquipourraientraisonnablementtreattribuesau mesurande [91, 94, 95]. De nos jours, lexpression de lincertitude associe aux rsultats de mesure devient un paramtre important de performance dune mthode analytique considrer ct des critres devalidation[93].Pourserendrecompte,ilsuffitderegarderpendantcescinqdernires anneslaquantitdedirectives,normes,recommandationsmisesetlenombredarticles publis en rapport avec lincertitude.Enfait,lorsquunesriedersultatsdemesuresestgnrelorsdelapplicationdune mthode analytique, par exemple lors de la validationdunemthodededosage,lorsdeson tude de robustesse ou lors de son application large chelle par plusieurs laboratoires, et du fait que ces rsultats ne sont jamais identiques, une variabilit de ces rsultats est logiquement observe.Celle-citraduitladispersiondesdonnesduescesmesuresetestconsidre comme une incertitude [94]. Le terme mesurande est dfini comme tant une quantit particulire sujette une mesure[94,96].Unmesurandepeuttrelaconcentrationdunanalyte.Cetermenestpas trsfrquentdansledomaineanalytique.Toutefois,ilatreprisdanslevocabulaire international de mtrologie [95] et adopt dans le domaine de lincertitude pour le diffrencier du terme analyse chimique employ pour mesurer dautres grandeurs telles que la couleur, lepH.Ilconvientgalementdelediffrencierduterme analyte prfrenchimie analytiquepourdfinirunlment(ouunesubstance)recherchoudtermindansun chantillon [96]. Parlerdincertituderevientparlerdelaqualitdersultats.Celle-cisous-entendla performancedesmoyensparlesquelscesrsultatssontobtenus,cest--direunemthode. Lincertitudetraduitdonclaperformancedunemthodedemesureassocieaursultat rendu.Elleestfondamentalepourlacomparaisondecesrsultatsentreeux,etsurtoutde ceux-ciparrapportdesseuilsdetoxicitoudepathologie.Lacomparaisonpeutaussise rapporterdeslimitesrglementaires(ex:leretraitdunmdicamentdumarchoule dclenchement dune crise alimentaire). Introduction 19Lincertitudesignifieaussiledoute.Dansnotrecas,lincertitudedemesure nimplique pas le doute concernant la validit de la mesure, mais au contraire la connaissance de lincertitude implique laugmentation de la confiance sur la validit des rsultats de mesure [97]. Bienquelatchepuissenepastrefacileentermedetemps,lvaluationde lincertitudedemesuredanslesessaisprsenteplusieursavantagespourles laboratoires dessai [98] : Lincertitudedemesurecontribuedefaonquantitativedespointsimportantstels que le contrle de risques et la crdibilit des rsultats dessai. Unedclarationdelincertitudedemesurepeutprsenterunavantageconcurrentiel direct en ajoutant de la valeur et de la signification au rsultat rendu. Lvaluationdelincertitudedemesureapportedeslmentspouroptimiserune procdure dessai au travers de sa meilleure comprhension. Laconnaissancedeseffetsquantitatifsdegrandeurssurlesrsultatsdelessai amliorelafiabilitdelaprocduredelessai.Desmesurescorrectivespeuventtre mises en uvre de faon plus efficace. Les organismes de certification de produits ont besoin dinformations sur lincertitude associe aux rsultats lorsquils attestent de la conformit aux spcifications. Lescotsdtalonnagepeuventtrerduitssilpeuttredmontrpartirde lvaluationquedesfacteursdinfluenceparticuliersnecontribuentpasdefaon substantielle lincertitude. I.2.3. COMPOSANTES DE LINCERTITUDE I.2.3.1. INCERTITUDE TYPE Lincertitude type xuest lincertitude dun rsultat x dune mesure exprime laide duncart-type.Danslestimationdelincertitudeglobale,ilpeuttrencessairede considrer chaque source dincertitude et de la traiter sparment pour obtenir la contribution decettesource.Chacunedescontributionslincertitudeprisesparmentestappele composantedelincertitude.Lorsquelescomposantesdelincertitudesontconcernes,elles Introduction 20doiventaussitreexprimessouslaformeduncart-type[91,97].Pourunedistribution donne, lcart-type reprsente la mesure de la dispersion des donnes autour de la moyenne. Lorsquecettedistributionconcernelensembledelapopulationteste,lexpressioncorrecte de lcart-type de la moyenne est celle de la population et se calcule comme suit : NxiN = = 2) ((I.6.) o xi est un rsultat individuel, la moyenne de la population et N la taille de la population. Par contre lorsque cette distribution concerne un chantillon prlev au sein dune population, lexpression correcte de lcart-type de la moyenne est : 1) (21= =nx xsin (I.7.) ox est la moyenne de lchantillon, n la taille de lchantillon et 2) ( x xi la somme des carrs des diffrences entre chaque valeur xi et la moyennex . Lestimation de lincertitude de rsultat bas sur lchantillon prlev au sein de la population de mesure est : ux = s(I.8.) Lcart-type de la moyenne est la mesure de la variabilit de la moyenne : nssx = (I.9.) o s est lcart-type de lchantillon et n la taille de lchantillon. Lcart-type de la moyenne est aussi connu comme tant lerreur type de la moyenne. Introduction 21 I.2.3.2. INCERTITUDE TYPE COMPOSE Lincertitudetypecomposeouincertitudetotaleestlarsultantedetoutesles incertitudestypesissuesdescomposantesindividuellesdelincertitude.Cestlcart-type estimgallaracinecarredelavariancetotaleobtenueencombinanttoutesles composantesdelincertitude.Lacombinaisonsefaitdedeuxmaniresselonquelasource dincertitudeestproportionnelleounonlaconcentrationdelanalyte[91,99].Danslecas otouteslessourcesdincertitudesontproportionnelleslaconcentrationdelanalyte,les composantesdincertitudesontdabordconvertiesencart-typerelatifpuisensuite combines.Pourunrsultatx(parexemplelaconcentrationdunesolutionstockdune substancequelconque),affectparlesparamtresp,qetr(parexempleplamassedela substance, q sa puret et r le volume de la solution finale) et les incertitudes correspondantes u(p), u(q) etu(r), lincertitude type compose ux devient : ...) ( ) ( ) (22 2+|.|

\|+||.|

\|+||.|

\|=rr uqq upp uxux(I.10.) Par contre dans le cas o les sources dincertitude sont indpendantes de la concentration de lanalyte, les composantes dincertitude doivent tre combines sous forme dcart-type. Pour un rsultat donn x, lincertitude type compose ux sera calcule comme suit : ... ) ( ) ( ) (2 2 2+ + + = r u q u p u ux(I.11.) I.2.3.3. INCERTITUDE LARGIE Appele aussi incertitude globale, lincertitude largie Ux est une grandeur dfinissant un intervalle autour du rsultat dune mesure, dont on puisse sattendre ce quil comprenne unefractionlevedeladistributiondesvaleursquipourraienttreattribues raisonnablementaumesurande[91,99].Lincertitudelargieestobtenueenmultipliant lincertitudetype(compose)parunfacteurdlargissementk.Lechoixdelavaleurdece Introduction 22facteurdpendduniveaudeconfianceexig,delaconnaissancedeladistributionainsique dunombrededegrsdelibertcorrespondant.Danslaplupartdescasilestrecommand dutiliserlavaleurde1,962correspondantauquantile95%bilatraldeladistribution gaussienne(normale).Danschaquecas,leniveaudeconfianceestde95%.Ainsi, lincertitude largie est calcule comme tant Ux = kux = 2ux, et le rsultat final crit comme suitxUx.Cependant,lavaleurdekpourraittreinsuffisante,parexemplelorsque lincertitude compose est base sur les observations statistiques avec un nombre de degrs de libertrelativementfaible.Lechoixdekdpendraalorsdunombrededegrsdelibert effectif.Dautrepart,lorsquelincertitudetypecomposeestdomineparuneseule contributionavecunnombrededegrsdelibertinfrieur6,ilestalorsrecommandde prendre la valeur de k gale au t de Student bilatral associ au nombre de degrs de libert de cettecontribution,etunniveaudeconfianceexig,souvent95%[99].LetableauI.2. prsente une liste des valeurs de t de Student bilatral au niveau de confiance de 95% [99]. Table I.2. Quelques valeurs de t de Student bilatral 95 % Degrs de libertt 112,7 24,3 33,2 42,8 52,6 62,5 I.2.4. SOURCES DINCERTITUDE Enpratiquelincertitudeaffectantunrsultatpeutprovenirdeplusieurssources possibles,cequipourraitexpliquerladifficultrelativelestimationdelincertitudede mesure, tant donn que toutes les composantes de lincertitude contribuent la dispersion de la distribution de lincertitude [100, 101]. Lors de lvaluation de lincertitude, il faut dabord Introduction 23identifierlessourcesmajeuresdincertitudeavantdelesquantifier.Acestade,lobjectif seraitdoncdtablirunelistereprenanttoutes lessourcespossiblesdincertitudedanslebut deconnatrelebesoinconsidrerlorsdelestimationdelincertitude[99].Quelquescas sontprsentsci-aprsnotammentenrapportavecletypedvaluationdelincertitude, lchelle derreur et lanalyse pharmaceutique. I.2.4.1.SOURCESDINCERTITUDESELONLETYPEDVALUATIONDE LINCERTITUDE Ilexistedeuxmaniresdiffrentesdeclassifierlvaluationdescomposantesde lincertitude savoir lvaluation du Type A et lvaluation du Type B. Cette classification ne signifie toutefois pas quil existe une diffrence quelconque de nature entre les composantes rsultant des deux types dvaluation. I.2.4.1.1. Evaluation du Type A LamthodedvaluationduTypeAconcernelvaluationdelincertitudepar lanalysestatistiquedesriesdobservations.Lvaluationsefaitpartirdunefonctionde densit de probabilit dduite dune distribution de leffectif observ. La variance estime u2 qui caractrise une composante de lincertitude obtenue par ce type dvaluation est calcule partirdesriesdobservationsrptes.Lavariancehabituelleestimestatistiquementest alors s2 et lcart-type estim u est donc u = s. Par commodit u2(xi) et u(xi) valus de cette faon sont parfois appels respectivement variance de Type A et incertitude-type de Type A. PourquelvaluationduTypeAsoitfiable,ilfaudraquellesoitfondesurunnombre relativement lev dobservations statistiquement indpendantes [91, 97]. Cependant,lesconditionspourlestimationdelaprcisionnesontpasdfinies. Certainessourcesdincertitudenepeuventpastrestatistiquementvaluesouleur valuation statistique nest pratiquement pas possible ou nest pas ncessaire. Rpondant ce cas de figure, nous pouvons citer comme exemples lincertitude en rapport avec ltalonnage dunquipementetlincertitudesurlematrielvolumtriqueoulquipementutilis.Dans cescas,lesestimationsdincertitudesontfaitessurlabasedexpriencesouselon lvaluation du Type B. Introduction 24 I.2.4.1.2. Evaluation du Type B LvaluationduTypeBestunemthodedvaluationdelincertitudequisefaitpar des moyens autres que lanalyse statistique de sries dobservations. Elle se fait partir dune densitdeprobabilitsuppose,fondesurledegrdecroyanceencequunvnementse produise,souventappelprobabilitsubjective.Pouruneestimationxidunegrandeur dentreXiquinapastobtenuepartirdobservationsrptes,lavarianceestime associe u2(xi) ou lincertitude type est value par un jugement scientifique fond sur toutes lesinformationsdisponiblesausujetdelavariabilitpossibledexi.Lensemble dinformationsaccumulespeutcomprendredesrsultatsdemesuresantrieures, lexprience ou la connaissance gnrale du comportement et des proprits des matriaux et instrumentsutiliss,lesspcificationsdufabricant,lesdonnesfourniespardescertificats dtalonnage ou autres certificats, lincertitude assigne des valeurs de rfrence provenant douvragesetdemanuels.Parcommodit,u2(xi)etu(xi)valusdecettefaonsontparfois appels respectivement variance de Type B et incertitude-type de Type B [91, 97]. LvaluationduTypeBconstitueunealternativepourpallierlinsuffisance dinformations telle quobserve dans lvaluation du type A. Ces estimations de lincertitude sont obtenues au moyen des informations autres que statistiques telles que la littrature ou les spcifications du fabricant [90, 97]. I.2.4.2 SOURCES DINCERTITUDE SELON LERREUR I.2.4.2.1. Erreur et incertitude Lerreur est dfinie comme tant la diffrence entre un rsultat individuel et la valeur exacteouvraievaleurdumesurande.Entantquetelle,lerreurestunevaleuruniqueetla connaissancedecettevaleurpeuttreappliquepourcorrigerlersultat.Cependant,en pratique la correction nest pas faisable car la valeur des erreurs nest pas exactement connue. Lincertitudequantelle,prendlaformedunintervalleet,sielleestestimepourune procdureanalytiqueetuntypeparticulierdchantillon,ellepeutsappliquertoutesles Introduction 25dterminationsdcritesdecettefaon.Lavaleurdelincertitudenepeutparfoispastre utilisepourcorrigerlersultatdunemesureetlincertitudedursultatdunemesurene devraitjamaistreinterprtecommereprsentantlerreurelle-mme,nilerreursubsistant aprs correction [91, 99]. Lerreuradeuxcomposantes.Lapremire,lerreuralatoire,rsultetypiquementdes variations imprvisibles des grandeurs ayant une influence sur le rsultat. Ces effets donnent lieudesvariationsdanslesobservationsrptesdumesurande.Lerreuralatoiredun rsultat analytique ne peut tre compense, mais il est possible de la rduire en augmentant le nombredobservations.Laseconde,unecomposantesystmatiqueappeleaussibiais systmatique,estdfiniecommeunecomposantedelerreurqui,aucoursdunensemble danalysesdummemesurande,resteconstanteouvariedefaonprvisible.Elleest indpendante du nombre de mesures ralises et ne peut donc tre rduite par laugmentation dunombredanalysesdansdesconditionsdemesureconstantes[91].Lebiaisestla diffrenceentreunevaleurobserveetlavraievaleuralorsquelerreuralatoireestla diffrence entre la valeur observe et celle attendue [96]. Le biais peut avoir aussi deux composantes, le biais de la mthode qui est une erreur inhrente la mthode et le biais du laboratoire qui peut tre considr comme tant le biais introduitspcifiquementparunlaboratoirelorsdelapplicationdunemthodenonbiaise [94]. Finalement,pourlersultatdunemesurex,lerreur(quationI.12.)doittre distingue de lincertitude (quation I.13.). Les quations suivantes le montrent clairement: (I.12.) o reprsente la vraie valeur, e lerreur associe qui est compose du biais et de lerreur alatoire , et la valeur attendue obtenue suite une sries dobservations infinies, x Ux(I.13.) o Ux reprsente lincertitude largie du rsultat de la mesure x. Lincertitude, reprsente ici par lincertitude largie, est donc un intervalle. x = + e = + + = + ex = + e = + + = + eIntroduction 26 I.2.4.2.2. Lchelle derreur Laclassificationdelerreurpeutaussitreraliseenconsidrantlchellederreur [102, 103]. Comme lindique lquation I.12., un rsultat dvie de la vraie valeur cause de lexistence dun certain nombre derreurs, systmatiques ou alatoires, associes ce rsultat. Lerreur associe un rsultat x peut donc tre dcompose comme suit [104] : x = vraie valeur+biais de la mthode +biais du laboratoire +effet de lanalyse+erreur de la mesure Commeilatprcdemmentsoulign,lebiaisdelamthodeestuneerreursystmatique inhrentelamthode.Lebiaisdulaboratoirepeutdonctreconsidrsoitcommeune erreur systmatique pour un laboratoire individuel, ou soit comme une erreur alatoire lorsque le laboratoire est considr comme faisant partie dune population de laboratoires par exemple dans une tude inter-laboratoires. Dans ce cas, cest une composante de la reproductibilit de la mthode utilise. Lerreur due lanalyse comprend lestim de la fidlit intermdiaire qui estuneerreuralatoirersultantdesconditionsdanslesquelleslanalyseatfaite.Celle-ci peuttrefaitedestempsdiffrents,pardesoprateursdiffrentsou/etaumoyen dquipementsdiffrents.Lerreurduelarptabilitestuneerreuralatoirequiapparat lors de lanalyse de plusieurs rptitions dun chantillon, chaque analyse tant effectue dans les conditions de rptabilit [104, 105]. I.2.4.3 SOURCES DINCERTITUDE DANS LANALYSE PHARMACEUTIQUE Les contrles de qualit dans le domaine pharmaceutique sont de plus en plus souvent raliss par des techniques de sparation, en loccurrence la chromatographie liquide haute performance (CLHP), dont le domaine dapplication stend aussi bien au dosage du principe actifqulasparationetdterminationdesimpuretschiralesounon,enpassantparla Introduction 27quantificationdestracesdionsmtalliquesetdanionsinorganiques.Cependant,dautres techniquesdesparationsontaussiappliquespourlesanalysesdanslesdomainesprcits, tellesquellectrophorsecapillaire(EC)[106].Bienqueprsentantencorequelques insuffisancesauniveaudelaprcisiondesrsultats,cettetechniqueseprtebienla sparation chirale. La rapidit dobtention des rsultats lors du dveloppement des mthodes et surtout lefficacit de la sparation observe(entermedenombredeplateauxthoriques) enfontunetechniquetrsrecherche.Unautreavantagenonmoinsimportantdecette techniqueestlecotrduitparanalyse.Commeautretechniquedesparation,la chromatographie en phase gazeuse est aussi utilise mais son usage est beaucoup plus limit.Legrandavantagedestechniquesdesparationestlapossibilitquellesoffrent deffectueruneanalysesimultanedeplusieurssubstances,apportantungaindetemps considrableetunerductiondescotspourlesindustrielsdusecteurpharmaceutique. Nanmoins,uncertainnombredtapespralablessontncessairesenvuedegarantir lobtentiondersultatsfiables,notammentlavrificationdeschantillonsetdesmatriels danalyse, la prparation des solutions dchantillons et des solutions tampons, la vrification delaperformancedesquipements.Pourtant,laccroissementdunombredtapesapour consquence daccrotre aussi les sources dincertitude ce qui du reste, demande une matrise parfaite de la succession des tapes en vue dassurer la qualit du rsultat final [107]. Dune maniregnrale,quelquessourcessontcitesdansleguideEurachem[91]etsontreprises dans le diagramme de cause effet ci-aprs (Figure I.7.):Introduction 28 Figure I.7. - Diagramme dIshakawa prsentant les causes et les effets y compris les sources dincertitudes pour un processus analytique. Acessourcesdincertitudeillustresci-avant,ilfautencoreajouterleseffetsalatoiresqui contribuentlincertitudedanstoutleprocessusanalytiqueetquidoiventfigurerdansle diagramme de cause effet. Le diagramme peut varier selon la technique analytique utilise, compte tenu de la complexit et de la diversit des oprations effectues [107, 108]. Dautres sourcespropresauxtechniquesanalytiquesdeCLHPetdECsontreprises,respectivement dans les figures I.8. et I.9. [105, 106, 109, 110]. Rsultats et incertitude Echantillonnage Conservation (stockage)StoechiomtriePuret des ractifs Appareils (quipements)Conditions de mesure Effets dus loprateur Blanc Effets dus aux calculsEffets dus lchantillon Biais ventuel Variations entre chantillons Dure Conditions Effets de contamination Effets mmoires Limites dexactitude de ltalonnage Diffrence de valeurs indiqueset rgles Manque dinformations Suppositions Raction incomplte Ractions secondaires Temprature ambiante diffrente de celle de ltalonnage Verrerie volumtrique Complexit de la matrice Ajouts doss Troncature Arrondissements Slectiondu modle dtalonnageCorrection Interprtation lgrement diffrente Lecture incorrecte dchelle Introduction 29 Figure I.8. - Diagramme dIshakawa prsentant les causes et les effets y compris les sources dincertitude pour une procdure gnrale danalyse en chromatographie liquide (CL). Figure I.9. - Diagramme dIshakawa prsentant les causes et les effets y compris les sources dincertitudes pour une procdure gnrale danalyse en lectrophorse capillaire (EC). Echantillonnage Puret des ractifs Equipement de CLHPConditions de mesure Effets dus aux calculs Effets dus lchantillonVariations auniveau de solvant dextraction Volume dchantillon Prcision de linjection Exactitude de la longueur donde Standard pour la calibrage Substances de rfrence Temprature de thermostatisation ColonneInfluence de la matrice Htrognit de lchantillonCalculs Paramtres dintgrationInjecteur Volume de la boucle dinjection Age Composition Dbit Phase mobile Rsultats et incertitude en EC Echantillonnage Puret des ractifs Equipement de EC Conditions de mesure Effets dus aux calculs Effets dus lchantillon Variations auniveau de solvant dextraction Volume dchantillon Prcision de linjection Exactitude de la longueur donde Standard pourcalibrage Substances de rfrence Diamtre Capillaire Influence de la matrice Htrognit de lchantillon Calculs Paramtres dintgrationVolume dinjectionTemps dinjection Effet joule Renouvellement durant lanalyse Tampon de sparation Extrmits Thermostatisation Normalisation des surfaces des pics Rsultats et incertitude en CL Introduction 30 Lorsquelessourcesdincertitudesontidentifies,ilestimportantdelesmatriser,deles contrleretsipossibledvaluerleurcontributionlincertitudedursultat.Cependant,les moyenspermettantdyarrivernesontpastoujoursbiendcritsoubienassimilsparles analystes.Deplus,lesestimsdincertitudenepeuventtrevalusquepourunnombre limit de sources dincertitude. I.2.5. APPROCHES POUR LESTIMATION DE LINCERTITUDE Lexamendelasituationexistantemontrequautraversdesnombreusesstratgies dveloppes et publies, un effort considrable a t fourni par les analystes pour parvenir la dterminationdelincertitudedemesure.Selonlasituationenprsence,cesstratgies peuventtreclassifiesentroisgrandesapproches:lesapprochesintra-laboratoires nimpliquantquunseullaboratoire,lapprocheinter-laboratoiresimpliquantdiffrents laboratoiresetlesapprochesmixtesquicombinentdunemanireouduneautrelesdeux premiresapproches.Laquantificationdelincertitudepartirdecesapprochesestaborde dans la partie I.2.6. I.2.5.1. APPROCHES INTRA-LABORATOIRES I.2.5.1.1. Approche ISO Dveloppe par plusieurs organisations internationales oeuvrant dans le domaine de la physiqueetdelamtrologie,lapprochedelOrganisationInternationaledeNormalisation (ISO)connueaussisouslenomdapproche bottom-up ,approche error-budget ou encoreapprochedepropagationderreursatoriginalementproposepourquantifier lincertitude des mesures physiques [97]. Elle peut tre considre comme une approche intra-laboratoiretraditionnelledestineauxmesuresphysiquesetmtrologiquesdoelletireson nom dapproche physico-mtrologique. ISO la publie dans le GUM [97]. En 1990, elle a t adapteenvuedestimerlincertitudedesmesureschimiques.Aceteffet,elleatreprise Introduction 31dansleguidedEURACHEM[91].Paralllement,dautreslignesdirectricescomparables pourvalueretexprimerlincertitudedemesureonttpubliesparleNationalInstituteof Standards and Technology (NIST) [111]. Du fait que la stratgie de lapproche ISO semble tre en parfait accord avec tous les domainesdemesure,ellepeuttreappliquepourlestimationdelincertitudedenimporte quellemesureeffectue.LautreavantagedelapprocheISOestquellepermetdestimer lincertitudeenlabsencedtudesinter-laboratoires,celles-cintantpassouventfaciles raliser.Plusparticulirement,dufaitdelimplicationdetouteslessourcespotentielles dincertitude(identificationdessourcesetvaluationdeleurincertitudeetleurampleur). Cetteapprocheaidemieuxcomprendrelestechniquesanalytiquesquionttappliques poureffectuerlamesureainsiqueleurprincipe[112,113].Lesdeuxtypesdvaluation dincertitudeAetB,peuventtreutiliss.Cependant,pourlesmesureschimiques, ladaptation de cette approche telle que faite par EURACHEM ne retrouve pas des situations similaires.Eneffet,latendancedeserreursdanslesmesureschimiquesdiffredecelle rencontresdanslesmesuresphysiques.Lorsdelestimationdelincertitudedesmesures physiques,cesontleserreursalatoiresquiprdominentalorsquelestimationde lincertitudedesmesureschimiquesestinfluencenonseulementparleserreursalatoires maisaussiparlerreursystmatiqueoubiais.Acecivientsajouterlaprsencedeplusieurs sourcesdincertitudedanslesprocessusdesmesureschimiquescomparativementaux processusdesmesuresphysiques[100,114].Enfin,cetteapprocheestdifficilement applicablepourlesmthodesanalytiquescomplexescomprenantplusieurscomposantes dincertitudes.Samiseenuvreestdslorsmalaise,cequirduitsonapplicationdes mthodesanalytiquesprimairespourlesquelleselleconvientparfaitement[115-117].Un exempledemthodeprimaireestprsentdanslafigureI.10.aveclessourcespotentielles dincertitude inhrentes [99]. Introduction 32 Figure I.10. Diagramme dIshakawa prsentant les sources dincertitude pour la standardisation dune solution dhydroxyde de sodium par titrage laide du phtalate acide de potassium I.2.5.1.2. Approche par la Validation Enintra-laboratoire,lincertitudepeutgalementtrevalueparuneseconde approche base sur lutilisation des rsultats issus de la phase de validation [1, 84, 115-119]. Acettefin,ilatncessairedeclarifierlarelationexistanteentrelavalidationet lincertitudeetplusparticulirementdemontrerdunpointdevuepratiquecommentles donnes de validation peuvent tre utilises en pratique pour estimer lincertitude de mesure. LapprocheintroduiteparFeinbergetcoll.[1]envuedestimerlincertitudedemesureen utilisantlesdonnesdevalidationestconsidrecommeuneavancepertinentepourles analystescarellepermetderpondreauxdifficultslieslestimationpratiquede lincertitude partir des donnes de validation. De plus, cest une approche intra-laboratoire, cequipermetdoncunlaboratoiredvaluerlesperformancesdesespropresmthodeset ventuellementdelescomparerentreelles.Signalonsquilestimportantquelechoixdu protocoledevalidationpuissetrefaitavecunmaximumdesourcesdevariationenvue Rsultats et incertitude RptabilitFacteur de correction du Phtalate-K Volume de titrage de la solution de NaOHMasse de la tare Masse brute Calibration Puret du Phtalate-K Masse du Phtalate-KCalibration Linarit CalibrationLinarit Sensibilit Sensibilit Temprature Terme de titrage Biais Volume du titrage de NaOH Terme de titrageMasse de phtalate-K Introduction 33dobtenirunebonneestimationdelincertitude.Danslecasinverse(protocoleavecpeude sources de variation), lestimation de lincertitude nest pas bonne. I.2.5.1.3. Approche par la Robustesse Laparticularitdecetteapprocheestquelleestraliseselonlapprocheclassique inter-laboratoirestoutentanteffectuedansunseullaboratoire.Enfait,lastratgie appliquepourestimerlincertitudedelareproductibilitdansunetudeinter-laboratoires (partieI.2.5.2)estappliquepourestimerlincertitudedelareproductibilitpartirdes rsultats provenant dun test de robustesse. Partant de sa dfinition et de ses objectifs [56, 59-62],larobustessepeuttreconsidrecommeunesimulationintra-laboratoiredunetude inter-laboratoires pour autant que les facteurs opratoires soient convenablement slectionns etqueleplanexprimentalpourlexcutiondutestcomprenneaumoins8expriences,de maniresimulerlepluspossiblecequipourraitarriverlorsdunetudeinter-laboratoires. Ainsi,cesexpriencespeuventtreassimiles8laboratoires,conditionrequiseparISO 5725-2 pour mener une tude inter-laboratoires [52].Cetteapprocheesttrsavantageusedautantplusquellenerequiertpasdtudeinter-laboratoiressouventdifficilesraliser.Cependant,trspeudapplicationssontnotesce jour.Commeenvalidation,ilestimportantquelechoixduprotocolederobustessepuisse tre fait avec un maximum de sources de variation en vue dobtenir une bonne estimation de lincertitude. I.2.5.2. APPROCHE INTER-LABORATOIRES I.2.5.2.1 Approche CMA InitialementproposeparWernimont[120]etensuiterepriseparleComitde Mthodes Analytiques (CMA) de la Socit Royale de Chimie, lapproche CMA aussi connue souslappellationapproche Top-down permetdedterminerlincertitudedemesure partirdunetudeinter-laboratoires[121].Lappellation Top-down serfrela dmarche descendante suivie par cette approche loppos de la dmarche ascendante utilise Introduction 34danslapproche Bottom-up oleseffetsdechaquegrandeurdentresontdcomposs pourestimerlincertitude.Eneffet,danslapprocheCMA,lafidlitdunemthodeest dcompose en une somme de composantes conformment au modle de dcomposition de la variance, permettant ainsi dappliquer une analyse de variance. Les estims dincertitude sont calculs partir des estims de prcision obtenus lissue dune tude de performances inter-laboratoires.Onutilisedonclesrsultatsdessaisinter-laboratoires.Ainsi,lelaboratoireest vupartirdunniveaulevcommefaisantpartiedelapopulationdelaboratoiresetpar consquent,leserreurssystmatiquesetalatoiresdunlaboratoiredeviennentdeserreurs alatoires lorsquelles sont considres partir de ce niveau lev. Lapproche CMA est plus ralistedufaitquelleinclutlessourcesmajeuresdincertitudedesmesureschimiquesnon reprises au niveau de lapproche ISO comme les facteurs laboratoire, oprateur, quipement et temps. Comme autre avantage, les estims dincertitude obtenus au moyen de cette approche sontissusdesmesuresrellesdeslaboratoiresetque,touteoupartie,decesdonnessont souvent directement disponibles partir des donnes de validation. I.2.5.3. APPROCHES MIXTES La combinaison dune part, des informations issues des approches intra-laboratoire et inter-laboratoires ou dautre part, des stratgies appliques dans les dmarches ascendante et descendante pour lestimation de lincertitude, peut donner lieu des approches mixtes. I.2.5.3.1. Approche de Barwick et Ellison Danscetteapproche,troislmentsdiffrentsdevalidationsontcombinsenvue dvaluerlincertitudedemesuredesrsultatssavoirlaprcision,lexactitudeetla robustesse [99, 115]. La validation est prise ici au sens large telle que dfinie par ICH cest--direquellecomprendletestderobustesse[56].Laprcisionestvalueauniveaudela fidlitintermdiaireconsidrantdiffrentstemps.Ensuitelorsdutestderobustesse diffrentes conditions exprimentales sont appliques pour prouver la mthode, on considre dslorsquelesvariationsobservesquivalentcellessusceptiblesdtreobtenuespar diffrents laboratoires, par consquent par diffrents oprateurs afin que la robustesse simule ltude inter-laboratoires. De ce fait, la prcision peut tre aussi value un second niveau de Introduction 35lafidlitintermdiairecest--direentreoprateurs.Concernantlebiaisdelamthode, plusieurspossibilitssontdcritesenvuedestimerlincertitude,savoirlanalysede substancesderfrencecertifies,lanalysedematricesdopesetlacomparaisonavecune mthode de rfrence [99, 115]. I.2.5.3.2. Approche ISO/TS Leguidepourlincertitudedemesure GUM publiparISO[97]constitueune approchenormaliselargementadopte.Nanmoins,sonapplicationestlimitedes situationsounmodlecompletduprocessusdemesureestdisponible.Pourtant,pourtre normalise[82]etdclarevalide[72],unemthodedessaidoitfairelobjetdunetude collaborative qui, en appliquant les normes ISO 5725-2 [52], permet de fournir les donnes de performances,savoirlesestimationsdelacomposantedelavarianceintra-laboratoireet inter-laboratoires accompagnes dune estimation de lincertitude associe la justesse de la mthode.Cest ainsi que lquipe du Comit Technique ISO/TS 69 [122] a rcemment labor deslignesdirectricespourlvaluationdelincertitudeassocieauxrsultatsdesmthodes dessaisnormalisesenconsidrantdunepart,leursdonnesdeperformanceobtenuesau moyen dune tude collaborative et dautre part, les principes correspondants du GUM cest--dire en combinant les estimations pertinentes de la variance. Trois pralables sont requis pour mener correctement cette approche [122] :-ladisponibilitdesestimationsobtenuesaumoyendtudescollaborativesselon ISO5725-2[52].Cesestimationssontcellesdelarptabilit,dela reproductibilit et de la justesse de la mthode dessai utilise. -Laconfirmationparlelaboratoiredelacohrencedelamiseenuvredela mthodedessaiaveclesperformancesdfiniesdelamthode.Cecisefait notamment en vrifiant le biais et la fidlit de la mthode. -Lidentification de toutes les influences sur les rsultats de mesure qui ne sont pas correctementcouvertesparltudecollaborative,etparconsquentla quantification de la variance associe aux rsultats qui peut dcouler de ces effets. Introduction 36 I.2.6. QUANTIFICATION DE LINCERTITUDE I.2.6.1. APPROCHE INTRA-LABORATOIRE I.2.6.1.1. Approche ISO Laprocdurepourquantifierlincertitudedemesureproposeparcetteapproche repose sur quatre tapes fondamentales telles quillustres dans la figure I.11. [91, 99]. Figure I.11. Illustration schmatique du processus destimation de lincertitude de la mesure analytique selon lapproche ISO Lapremiretapeapourobjectifdeposerclairementcequivatremesur (mesurande), y compris la relation entre le mesurande et les grandeurs introduites, tandis qu ladeuximetape,chaquesourcepotentielledincertitudeestidentifie.Parlasuite,la troisime tape a pour objectif destimer la valeur de la composante de lincertitude associe DEPARTFINtape 1tape 2tape 3tape 4Spcifier le mesurandeIdentifier les sources dincertitudesSimplifier en groupant les sources couvertes par les donnes existantes Quantifier les composantes groupesQuantifier les composantes restantesConvertir les composantes en carts-typesCalculer lincertitude type combinePasser en revue et si ncessaire r-valuer les composantes majeuresCalculer lincertitude largieIntroduction 37chaque source potentielle dincertitude telle quidentifie lors de la deuxime tape. Enfin, sur labasedesinformationsobtenuescettetroisimetape,laquatrimetapeconcernera lestimationdelincertitudetypecomposequiestlacombinaisondetouteslesincertitudes exprimessousformedcart-type.Lacombinaisonsefaitselondesrglesappropries,par exempleladditiondesvariancesselonlesalgorithmesdepropagationderreurbasesurles expansions de Taylor [91]. Finalement, le facteur dlargissement sera appliqu pour donner lincertitude largie. I.2.6.1.2. Approche base sur lvaluation de la prcision Lvaluation de la prcision en intra-laboratoire se fait habituellement au niveau de la rptabilit et/ou au niveau de la fidlit intermdiaire [103]. - Evaluation de la rptabilit Larptabilitestdfiniecommetantlafidlitdanslesconditionsderptabilit cest--diredanslesconditionsodesrsultatsdessaisindpendantssontobtenusparla mmemthodesurdesindividusdessaiidentiquesdanslemmelaboratoire,parlemme oprateur,utilisantlemmequipementetpendantuncourtintervalledetemps[103,122]. Larptabilitpeutdonctrevalueenestimantlcart-typedesrsultatsdessais(sr) obtenus sous des conditions de rptabilit et calcul comme suit : ( )112= =nx xsniir(I.13.) avec xi le rsultat dune mesure individuelle etxle rsultat moyen de n dterminations. Une indpendancedemesuresignifiequechaquersultatdessaiestobtenudemanirenepas tre influenc par nimporte quel autre essai prcdemment effectu sur le mme mesurande [103]. Introduction 38- Evaluation de la fidlit intermdiaire Contrairementlarptabilit,lvaluationdelaprcisionauniveaudelafidlit intermdiaire est correctement estime lorsquun plan exprimental est tabli cet effet. Il en estdemmedelvaluationdelareproductibilit.Lapplicationdunplanexprimentala pour avantage dobtenir en mme temps les estims de la rptabilit [103]. Usuellement un plan hirarchis appel nested design est appliqu. Ce genre de plan est complet do leur prfrence au plan hirarchis incomplet appel en anglais staggered-nested design [123]. En principe, la prcision intermdiaire peut tre value partir des tudes intra-laboratoire et inter-laboratoires. Dans cette dernire situation, la similarit des variances des laboratoires est pralablementvrifiedemanirepouvoirlesrassembler[124],situationquinestpas souventfacilerencontrerenpratiquedanslecasdestudesinter-laboratoires.Par consquent,ilestprfrabledallerverslapprocheintra-laboratoirequincessitemoinsde dpenses en termes dexpriences. Pourestimerlafidlitintermdiairejour-dpendant,ilestindiquderecourirun planhirarchiscompletdeuxniveaux(FigureI.12.).Danscecas,unseuloprateur effectuekrptitionsdessaisdanschacundespjours.Moyennantlatabledanalysedes variances (ANOVA) [5, 52, 103], les carrs moyens sont calculs, ce qui permet destimer la variancedelarptabilit,lescomposantesdelavarianceinter-joursetparconsquentla variance de la fidlit intermdiaire jour-dpendant [103]. Figure I.12. Plan exprimental pour lvaluation de la fidlit intermdiaire dans lequel un seul oprateur effectue n rptitions dessais en p jours danalyse. Lorsquune situation plus complexe se prsente, par exemple la fidlit intermdiaire impliquant deux facteurs tels que le facteur jour (j = 1p) et le facteur oprateur (i = 1m), un plan hirarchis complet trois niveaux (Figure I.13.) convient. Jours (j=1p)Rptitions (k=1n) Introduction 39 Figure I.13. Plan exprimental pour lvaluation de la fidlit intermdiaire dans lequel m oprateurs effectuent chacun n rptitions dessais dans chacun des p jours danalyse. Danscettederniresituation,lescarrsmoyensinter-oprateur(CMOprateur),inter-jour (CMJour) et inter-rptition (CMRptition) sont estims au moyen de la table dANOVA [5, 52, 103]. A partir de ces carrs moyens, les estims suivants de la prcision sont ainsi calculs : -la variance de la rptabilit : s Rptition rCM s =2(I.14.) -les composantes de la variance inter-jour : nCM CMss Rptition JoursJours=2(I.15.) -la variance de la fidlit intermdiaire inter-jour : 2 2 2) ( r Jours Jours Is s s + =(I.16.) -les composantes de la variance inter-oprateur : npCM CMss Rptition OprateursO=2(I.17.) -la variance de la fidlit intermdiaire inter-oprateur : Oprateurs (n=1m)Jours (j=1p)Rptitions (k=1n)Introduction 40 2 2 2) ( r Oprateurs O Is s s + =(I.18.) -la variance de la fidlit intermdiaire inter-(oprateur + jour) (O + J) : 2 2 2 2) ( r Jours Oprateurs J O Is s s s + + =+ (I.19.) Ilsepourraitquelorsdescalculs,desvaleursngativesdescomposantesdelavariance puissent tre obtenues. En pratique, elles sont fixes 0. Danslemmeordredide,dautresfacteurstelsquelesfacteursquipementspeuventtre ajouts au modle en vue dobtenir dautres estims de la fidlit intermdiaire. Trssouventilarrivequelenombredoprateurssoitinsuffisant,cequipourrait entranerunevaleurfaibledes0.Dansdetellessituations,ilseraitavantageuxdvaluerla composantedelavariancecombine(temps+oprateur)pluttquelescomposantes individuelles.Quelquesexemplesdecettevaluationpeuventtretrouvsdanslalittrature [125]. I.2.6.1.3. Approche base sur les donnes de validation Enconsidrantlanouvellestratgiedelavalidationbasesurleprofildexactitude, les donnes issues de la validation peuvent servir pour lestimation de lincertitude de mesure [1].Lincertitudeestdrivepartirdelavarianceutilisepourconstruireleslimitesde lintervalle de tolrance des mesures attendues et est calcule comme suit : 22211((

+ = M TolpnB(I.20.) avec 11++=nAAB , 22WBA= .Introduction 41Le terme 2Mest la variance totale estime ou la fidlit intermdiaire, 2Bla variance inter-srieet 2W lavarianceintra-srie,nlenombrederptitionsetplenombredesries. Feinberg et coll. [1] ont dmontr que 2Tolest gal lincertitude des mesures. Unesriereprsentelesconditionsdanslesquelleslesrptitionsdesessaissont effectues.Dansunsenslarge,les conditions sontdfiniespourindiquerlesconditions exprimentalesstandardisesouleplandexcutionpourraliserlesessaisenrptitions. Ellesdpendentduplanexprimentaletdelintentiondeltudeenvisageou,siune validationestconcerne,destapesdecelle-ci.Danscettederniresituation,lesconditions (sries)peuventtredesjours,parconsquentlanalysedescomposantesdesvariances permettradestimerlesvariancesinter-jouretintra-jour,etplusparticulirementlavariance de la fidlit intermdiaire. Par contre, dans le cas o les conditions sont des laboratoires, la variancedelareproductibilitseraaussiestime.Danscemmecontexte,lesconditions peuvent stendre vers les lots dchantillon, les quipements. Il est important de mentionner quecesvariancesnepeuventtreobtenuesquelorsquelesconditionssontvaries,cest--direquelesmesuresdesessaissontfaitesenvariantaumoinsunedesconditions(par exemple plusieurs laboratoires, plusieurs jours, ou plusieurs oprateurs). I.2.6.1.4. Approche base sur les donnes de robustesse Puisqueletestderobustessepeuttreutilispoursimulerdemanireexagreles modificationssusceptiblesdesurvenirlorsduntransfertdunemthodeversdautres laboratoires, dautres instruments et/ou dautres oprateurs, et que chaque exprience du plan peut tre considre comme tant un laboratoire individuel, il est ds lors possible dvaluer lincertitudeenseservantdesdonnesdutestderobustesse[64,65]etenutilisantunplan exprimental similaire celui utilis pour ltude inter-laboratoires. Le guide ISO 5725-2 [52] destins aux tudes inter-laboratoires peut tre adapt pour estimer lincertitude dans le test de robustesse. En assimilant chaque exprience du plan des laboratoires et au moyen de latabledANOVA[5,52,103],lescarrsmoyensinter-exprience(CMExprience)etinter-rptition(CMRptition)peuventtrecalculs,cequipermetparlasuitedobtenirdiffrents estimsdelavariance,notammentlavarianceintra-expriencecalculepartirdela rptabilitetlavarianceinter-expriencesquivalentlavarianceinter-laboratoires.Ainsi Introduction 42lincertitudedelareproductibilitestcalculedelammefaonquedanslapprocheinter-laboratoires. I.2.6.2. APPROCHE INTER-LABORATOIRES Ltudeinter-laboratoiresdemeurelemoyenclassiquepourexaminerla reproductibilit des rsultats. Les essais sont effectus selon un plan exprimental similaire celui appliqu pour valuer la fidlit intermdiaire (Figure I.14.) : Figure I.14. Plan exprimental pour une tude inter-laboratoires classique en vue de lvaluation de la reproductibilit et de lincertitude dun chantillon ( un niveau de concentration). Les essais sont effectus en deux rptitions dans les conditions de rptabilit par p laboratoires diffrents EnutilisantlatabledANOVA,lesestimsdelavariancedelarptabilit(sr)etdelade varianceinter-laboratoires(sL),quisontrespectivementretL,sontcalculs.La combinaison des deux variances donne la variance de la reproductibilit (sR) : sR = sr + sL(I.21.) Lincertitude dun rsultat individuel peut donc tre calcule comme suit : 2 2L r xs s u + =(I.22.) Rptition 1 Rptition 2 sr Laboratoire p Rptition 1 Rptition 2 sr Laboratoire 2 Rptition 1 Rptition 2 sr sL Laboratoire 1 Introduction 43Lorsquenmesuresderptitionssonteffectues,lincertitudedelamoyenneestcalcule comme suit : 22Lrxsnsu + = (I.23.) Et si p laboratoires effectuent n mesures de rptitions, lincertitude standard de la moyenne est calcule comme suit : pspnsuL rx2 2+ = (I.24.) Leplanexprimentalpourraitaussitreadaptselonltudeenvisage,parexemple lorsquon voudrait valuer leffet du facteur jour dans une tude inter-laboratoires. I.2.6.3. APPROCHES MIXTES I.2.6.3.1. Approche propose par Barwick et Ellison Cetteapprochetientcomptedetroislmentsdiffrentsdelavalidation,savoirla prcision, la justesse et la robustesse. Lexemple illustr par Hund et coll., [115] montre que lincertitude u(x) dun rsultat x est la combinaison de ces trois lments selon une approche comparable du budget derreur exprime par lquation suivante : ...) ( ) ( ) ( ) ( ) (22 2 2) (2+|.|

\|+||.|

\|+||.|

\|+||.|

\|+||.|

\|=rr uqq upp uxsRR uxx uT Imm (I.25.) o 2) (||.|

\|mmRR u est la contribution de la composante justesse lincertitude de la mesure et quidanslecasprsentestvalueentermedincertitudedurendementmoyendela mthode, Introduction 44 2) (||.|

\|xsT Ilacontributiondelacomposantedeprcisionlincertitudedelamesure, value en terme de fidlit intermdiaire dpendant du temps, 2) (||.|

\|pp u, 2) (||.|

\|qq uet 2) (|.|

\|rr ulacontributiondelarobustessevalueentermes destims dincertitude des diffrents facteurs p, q et r de la robustesse. I.2.6.3.2. Approche propose par ISO/TS [122] La procdure propose comporte 5 tapes (cf. partie 1.2.5.3.2.), savoir : a)obtenir des estimations de la rptabilit, de la reproductibilit et de la justesse de la mthode utilise, partir des informations publies sur cette mthode ; b)dterminer si le biais de laboratoire relatif aux mesures se situe dans les limites de celui attendu selon les informations obtenues au point a ; c)dterminer si la fidlit obtenue par des mesures actuelles se situe dans les limites decelleattendueselonlesestimationsderptabilitetdereproductibilit obtenues au point a ; d)identifiertouteinfluencesurlamesurequinapastcouvertedemanire adquatedanslestudesdontilestfaitrfrenceaupointaetquantifierla variancequipourraitdcoulerdeceseffets,entenantcomptedescoefficientsde sensibilit et des incertitudes dans les grandeurs dinfluence ; e)lorsquelebiaisetlafidlitsontsouscontrlecommedmontrauxtapesdu pointbetc,combinerlestimationdelareproductibilitaupointaavec lincertitudeassocielajustessedonneauxpointsaetb,etleseffets dinfluencessupplmentairesdupointdpourformeruneestimationde lincertitude compose. Lquation fondamentale qui prsente le modle statistique se rapportant cette valuation de lincertitude u(y) associe une observation peut tre crite comme suit : + + + =2 2 2 2 2 2) ( )( ) (r i i Ls x u c s u y u (I.26.) Introduction 45o 2Lsest la variance estime de la composante laboratoire du biais ; 2rsest la variance estime de la rptabilit ou lerreur rsiduelle ; )( uest lincertitude associe , due lincertitude de lestimation de en mesurant untalondemesurederfrenceouunmatriauderfrencedevaleurcertifie ,tantletermereprsentantlebiaisintrinsquedelamthodedemesureutilise ;u(xi) est lincertitude associe xi qui est lcart par rapport la valeur nominale de xi ; ci le coefficient de sensibilit, gale y/xi. Puisquedansunetudeinter-laboratoires,lcart-typedelareproductibilit(sR)estexprim par 2 2 2r L Rs s s + = , 2Rspeut remplacer 2 2r Ls s + . Ainsi lquation I.26. devient : + + = ) ( )( ) (2 2 2 2 2i i Rx u c s u y u (I.27.)