ĆWICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ -...
Transcript of ĆWICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ -...
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
1
UNIWERSYTET MARII CURIE-SKŁODOWSKIEJ
WYDZIAŁ BIOLOGII I BIOTECHNOLOGII
ZAKŁAD BIOLOGII MOLEKULARNEJ
ĆWICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ
dla studentów III roku mikrobiologii
LUBLIN 2016
Wersja 1.2
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
2
Spis treści:
1. Izolacja jąder komórkowych i histonów
2. Analiza składu białkowego chromatyny
3. Trawienie DNA chromatyny nukleazą ze Staphylococcus aureus
4. Elektroforetyczna analiza DNA po trawieniu nukleazą
ze Staphylococcus aureus
5. Izolacja DNA z nabłonka jamy ustnej
6. Amplifikacja i analiza elektroforetyczna sekwencji minisatelitarnej z uzyskanego DNA
7. Otrzymywanie rybosomów i frakcji cytoplazmatycznej
drożdży Saccharomyces cerevisiae
8. Izolacja kwaśnych białek rybosomowych z drożdży
9. Analiza otrzymanych białek metodą SDS/PAGE i immunoblotingu
10. Badanie aktywności enzymatycznej w żelu poliakrylamidowym
na przykładzie inwertazy
11. Identyfikacja białek w komórkach ssaczych metodą immunocytochemiczną.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
3
Izolacja jąder komórkowych i histonów
U organizmów eukariotycznych, większość DNA znajduje się w wyspecjalizowanych
organellach – jądrach komórkowych. DNA jądrowy występuje w postaci kompleksu
nukleoproteinowego, zwanego chromatyną. Podstawową jednostką strukturalną chromatyny
jest nukleosom. W skład nukleosomu wchodzi tzw. cząstka rdzeniowa (ang. core particle),
cząsteczka histonu H1 i fragment DNA o długości ok. 190-220 pz. Cząstkę rdzeniową tworzy
kompleks ośmiu histonów (oktamer) zwanych histonami rdzeniowymi (po dwie cząsteczki
histonów H2A, H2B, H3 i H4). Wokół oktameru owinięty jest odcinek DNA o długości 140-
150 pz. Pozostałą część stanowi łącznikowy DNA (ang. linker DNA) o długości 50-70 pz
z którym oddziałuje pojedyncza cząsteczka histonu H1. Znanych jest wiele wariantów
sekwencyjnych histonu H1, występujących w określonych tkankach lub etapach rozwoju
danego organizmu. Na przykład w jądrzastych erytrocytach ptaków zamiast histonu H1
występuje histon H5.
Histony mogą podlegać szeregu modyfikacjom potranslacyjnym, np. acetylacji,
metylacji, fosforylacji czy ubikwitynacji. Modyfikacje te mają istotne znaczenie w regulacji
stopnia upakowania DNA i jego dostępności dla replikacji i transkrypcji np. acetylacja reszt
lizyny na N-końcu łańcucha polipeptydowego histonów rdzeniowych zmniejsza ich
powinowactwo do DNA, co powoduje rozluźnienie struktury chromatyny i zwiększenie
poziomu ekspresji genów. Warto zauważyć, że wpływ modyfikacji potranslacyjnych
histonów na stopień kondensacji chromatyny i ekspresję genów nie zależy tylko od rodzaju
modyfikacji ale także od miejsca wystąpienia takiej modyfikacji na białku histonowym,
np. metylacja reszty lizyny w pozycji 9 łańcucha polipeptydowego histonu H3 powoduje
zwiększenie stopnia upakowania chromatyny i wyciszenie ekspresji genów zaś metylacja
reszty lizyny w pozycji 4 wpływa na rozluźnienie struktury chromatyny. Wysunięto więc
hipotezę „kodu histonowego”, która zakłada, że istnieją pewne określone wzory modyfikacji
histonów odpowiedzialne za zachodzenie konkretnych procesów w komórce.
Materiał badawczy do ćwiczeń to linia komórkowa fibroblastów mysich NIH 3T3 lub
linia komórkowa wywodząca się z komórek raka szyjki macicy HeLa. Komórki hodowane są
na płytkach Petriego (10x14cm) odpowiednio w płynie hodowlanym DMEM
i RPMI, w temperaturze 370C i w atmosferze 5% CO2. Celem ćwiczenia jest otrzymanie
preparatów zawierających wszystkie białka jądrowe oraz izolacja histonów z jąder komórek
linii NIH 3T3 lub HeLa. Histony oczyszcza się z jąder komórkowych wykorzystując zdolność
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
4
tych białek do rozpuszczania się w kwasach nieorganicznych, np. 0,25M HCl lub 0,2M
H2SO4.
Materiały i odczynniki
1. Hodowla komórkowa fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa o gęstości
komórek ok. 90% (trzy płytki Petriego na jeden zespół studentów)
2. Bufor PBS
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4, pH 7,5
3. Bufor do izolacji jąder:
200 mM Tris-HCl, pH 7,5
100 mM NaCl
250 mM sacharoza
1 mM EDTA
0,5% Triton X-100
4. Bufor próbkowy do elektroforezy białek w żelu poliakrylamidowym
SDS-PAGE (4x stężony)
5. 0,25 M HCl
6. Aceton (oziębiony)
7. Zdrapywacz do komórek
8. Homogenizator szklano-teflonowy o pojemności 2 ml
9. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 i 2 ml oraz końcówki do pipet.
Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia przygotować blok grzejny o temp. 950C
oraz schłodzić wirówkę do temp. 40C
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
5
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Jeśli nie zaznaczono inaczej, poniższe czynności należy wykonywać
w temp. +40C
Otrzymywanie jąder z fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa
1. Trzy płytki Petriego z komórkami fibroblastów mysich o gęstości ok. 90% przenieść
na lód i ściągnąć pipetą płyn hodowlany.
2. Przepłukać komórki na każdej płytce 5 ml oziębionego buforu PBS.
3. Po ściągnięciu pipetą buforu PBS zeskrobać komórki fibroblastów z płytek za pomocą
specjalnego zdrapywacza do komórek. Zawiesinę komórek spłukać ze wszystkich
płytek 3 ml oziębionego PBS i przenieść do dwóch probówek Eppendorfa o poj. 2 ml.
4. Komórki odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 5 min. Supernatant odrzucić,
a osad z obu probówek zawiesić łącznie w 2 ml buforu do izolacji jąder i inkubować
20 min. w lodzie.
5. Przenieść zawiesinę komórek do homogenizatora szklano-teflonowego
i dezintegrować wykonując 40 ruchów teflonowym tłoczkiem (stopień dezintegracji
można zweryfikować przy użyciu mikroskopu świetlnego).
6. Uzyskany dezintegrat komórek przenieść do probówki Eppendorfa o poj. 2 ml
i odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
7. Supernatant (zawierający białka cytoplazmatyczne) przenieść do nowej probówki
Eppendorfa, oznaczyć w nim stężenie białka metodą Bradford (przepis w załączniku
do ćwiczeń), a następnie przygotować próbki do elektroforezy SDS-PAGE
zawierające po 15 μg i 30 μg białka (przepis w załączniku do ćwiczeń). Gotowe
próbki do analizy metodą SDS-PAGE przechowywać w temp. -200C do kolejnych
ćwiczeń.
8. Do osadu jąder dodać 1 ml buforu PBS, kilkukrotnie przepipetować zawartość
probówki w celu jej dokładnego wymieszania i odwirować przy 2000 rpm przez 10
min.
9. Po odwirowaniu usunąć z probówki supernatant przy pomocy pipety, a do osadu jąder
dodać 1 ml buforu PBS i dokładnie wymieszać ( za pomocą pipety).
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
6
Izolacja białek jądrowych
1. Do probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml przenieść 500 μl zawiesiny jąder i wirować
przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
2. Supernatant odrzucić a osad jąder zawiesić w 60 μl buforu próbkowego
do elektroforezy SDS-PAGE (1x stężony).
3. Próbki dokładnie wymieszać i inkubować w temp. 950C przez 5 min.
W wyniku uwolnienia DNA z jąder zawiesina przyjmuje galaretowatą konsystencję.
4. Po inkubacji próbki odwirować przy prędkości 10000 rpm przez 5 min. Supernatant
zawierający białka jądrowe przenieść do nowej probówki Eppendorfa i zamrozić.
Izolacja histonów z użyciem 0,25 M HCl
1. Do probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml przenieść 500 μl zawiesiny jąder i wirować
przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
2. Supernatant odrzucić, a do osadu jąder dodać 50 μl 0,25 M HCl i dokładnie
wymieszać.
3. Próbkę pozostawić w temp. pokojowej na 25 min. (ekstrakcja histonów),
a następnie odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
4. Supernatant zawierający histony przenieść do nowej probówki Eppendorfa o poj.
1,5 ml.
5. Do osadu dodać ponownie 50 μl 0,25 M HCl, dokładnie wymieszać i pozostawić
na 25 min. w temp. pokojowej (ponowna ekstrakcja w celu zwiększenia wydajności).
6. Próbkę odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
7. Uzyskane supernatanty, zawierające histony, połączyć.
8. Wytrącać histony z supernatantu przez dodanie 8 objętości (0,8 ml) oziębionego
acetonu. Całość pozostawić do kolejnych ćwiczeń (minimum na 24 godziny)
w temp. -20OC.
Analiza składu białkowego chromatyny
Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy białek jądrowych techniką elektroforezy
jednokierunkowej w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących SDS-PAGE
(metoda Laemmli’ego).
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
7
Materiały i odczynniki
1. Aceton (oziębiony)
2. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz załącznik do ćwiczeń)
3. Preparaty białek jądrowych, cytoplazmatycznych i histonów otrzymane w poprzednim
ćwiczeniu
Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia przygotować blok grzejny o temp. 900C
oraz schłodzić wirówkę do temp. 40C
Wykonanie ćwiczenia
1. rzygotować 13,8 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących według przepisu zamieszczonego w załączniku do ćwiczeń.
2. Próbki z wytrąconymi histonami odwirować przy prędkości 10000 rpm przez 15 min.
w 40C w celu otrzymania osadu białek histonowych. Następnie osad przemyć 1 ml
oziębionego acetonu i wysuszyć na powietrzu. Osad białek histonowych zawiesić
w 30 μl buforu próbkowego do elektroforezy SDS-PAGE (1x stężony).
3. Próbki zawierające wszystkie białka jądrowe, wyizolowane histony, białka
cytoplazmatyczne oraz wzorce białkowe zawieszone w buforze próbkowym do
elektroforezy SDS-PAGE ogrzewać przez 3 min. w temp. 90
0C. Bezpośrednio po
ogrzaniu nanosić na żel po 30 μl przygotowanych próbek. Rozdział prowadzić pod
napięciem 150V, tak długo, aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego. Po
rozdziale białka wybarwić błękitem Coomassie (patrz załącznik do ćwiczeń).
Interpretacja wyników
1. Porównać skład białkowy preparatów poddawanych elektroforezie.
2. Określić masy cząsteczkowe białek histonowych.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
8
Trawienie DNA chromatyny nukleazą ze Staphylococcus aureus
Nukleaza ze Staphylococcus aureus (MN-aza, nukleaza mikrokokowa) jest
stosunkowo niespecyficzną endonukleazą, gdyż tnie zarówno jedno- jak i dwuniciowe kwasy
nukleinowe, chociaż bardziej aktywna jest wobec substratów jednoniciowych. Cięcie DNA
lub RNA następuje preferencyjnie w regionach bogatych w AT lub AU. Zmieszana
z chromatyną MN-aza tnie fragmenty DNA, które nie są chronione przez związanie
z białkami. Dlatego też w wyniku działania MN-azy na chromatynę otrzymuje się szereg
fragmentów odpowiadających mono- i oligonukleosomom. Enzym ten wykazuje swoją
aktywność w obecności jonów Ca2+
. Reakcję trawienia chromatyny przez MN-azę można
zahamować stosując odpowiednie stężenie EGTA lub EDTA, które działają jako chelatory
jonów dwuwartościowych.
Ćwiczenie ma na celu otrzymanie mieszaniny oligonukleosomów w wyniku trawienia
chromatyny jąder fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa przez niespecyficzną
endonukleazę ze Staphylococcus aureus.
Materiały i odczynniki
1. Hodowla komórkowa fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa o gęstości
komórek ok. 90% (trzy płytki Petriego na jeden zespół studentów)
2. Bufor PBS
3. Bufor do izolacji jąder
4. Zdrapywacz do komórek
5. Homogenizator szklano-teflonowy o poj. 2 ml
6. Bufor do cięcia MN-azą:
20 mM Tris-HCl, pH 8,8
5 mM CaCl2
7. Roztwór MN-azy w H2O (300 U/µl). Bezpośrednio przed ćwiczeniami rozcieńczyć
MN-azę 240-krotnie (1 µl roztworu MN-azy dodać do 239 µl H2O). Uzyskuje się
końcowe stężenie 1,25 U/µl
8. 100 mM EDTA
9. 10% SDS
10. Pronaza E – roztwór w H2O o stężeniu 25 mg/ml
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
9
11. Fenol, pH 7,5- 8,0
12. Chloroform
13. 5 M NaCl
14. 96% etanol (oziębiony)
15. 70% etanol (oziębiony)
16. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 i 2 ml oraz końcówki do pipet.
Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia przygotować blok grzejny o temp. 370C
oraz schłodzić wirówkę do temp. 40C
Uwaga! Jeśli nie zaznaczono inaczej, poniższe czynności należy wykonywać
w temp. +40C
Otrzymywanie jąder z fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa
1. Trzy płytki Petriego z komórkami fibroblastów mysich o gęstości ok. 90% przenieść
na lód i ściągnąć pipetą płyn hodowlany.
2. Przepłukać komórki na każdej płytce 5 ml oziębionego PBS.
3. Po usunięciu PBSu, zeskrobać komórki fibroblastów z płytek za pomocą specjalnego
zdrapywacza do komórek. Zawiesinę komórek spłukać ze wszystkich płytek 3 ml
oziębionego PBS i przenieść do dwóch probówek Eppendorfa o poj. 2 ml.
4. Komórki odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 5 min. Supernatant odrzucić,
a osad z obu probówek zawiesić łącznie w 2 ml buforu do izolacji jąder i inkubować
20 min. w lodzie.
5. Przenieść zawiesinę komórek do homogenizatora szklano-teflonowego
i dezintegrować wykonując 40 ruchów teflonowym tłoczkiem (stopień dezintegracji
można zweryfikować przy użyciu mikroskopu świetlnego).
6. Uzyskany dezintegrat komórek przenieść do probówki Eppendorfa o poj. 2 ml
i odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
7. Po odwirowaniu usunąć z probówki supernatant przy pomocy pipety, a do osadu jąder
dodać 1 ml buforu do cięcia MN-azą i dokładnie wymieszać ( za pomocą pipety).
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
10
Trawienie DNA chromatyny MN-azą
Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków
jałowych. Pracę z fenolem wykonywać w rękawicach ochronnych
1. Zawiesinę jąder komórkowych odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.
Supernatant odrzucić, a osad jąder zawiesić ponownie w 1 ml buforu do cięcia
MN-azą
2. Dodać 5 µl przygotowanego roztworu MN-azy (6,25u) i wymieszać dokładnie
zawartość probówki.
3. Bezpośrednio po dodaniu enzymu przenieść 300 µl mieszaniny do nowej probówki
Eppendorfa o poj. 1,5 zawierającej 30 µl oziębionego 100 mM EDTA (czas
trawienia 0).
4. Pozostałą część mieszaniny inkubować w temp. 37oC. Po upływie 5 i 10 min. (licząc
od czasu 0) inkubacji, przenosić po 300 µl mieszaniny do nowych probówek
Eppendorfa zawierających po 30 µl oziębionego 100 mM EDTA.
5. Do tak otrzymanych próbek dodać po 5 µl 10% SDS i 3 µl roztworu pronazy.
6. Inkubować próbki przez 30 min. w temp. 37oC (trawienie białek jądrowych). Reakcję
zatrzymać przez dodanie 34 µl 10% SDS.
7. Do każdej probówki dodać po 400 µl fenolu i wytrząsać całość przez 10 min.
(ekstrakcja DNA) po czym odwirować przez 5 min. (jeśli nie zaznaczono inaczej
wszystkie wirowania wykonywać przy 10000 rpm w 40C) w celu rozdzielenia faz.
8. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa, dodać po 400 l
chloroformu i wytrząsać przez 5 min. (usuwanie resztek fenolu), a potem odwirować
przez 5 min.
9. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa i dodać po 6 l 5M
NaCl oraz 800 l oziębionego 96% etanolu. Próbki pozostawić w temp. -20oC, w celu
precypitacji DNA, do kolejnych ćwiczeń.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
11
Elektroforetyczna analiza DNA po trawieniu nukleazą
ze Staphylococcus aureus
Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy otrzymanych na poprzednich ćwiczeniach
preparatów DNA techniką elektroforezy w żelu agarozowym.
Materiały i odczynniki
1. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz załącznik do
ćwiczeń)
2. Preparaty DNA otrzymane w trakcie poprzednich ćwiczeń.
Wykonanie ćwiczenia
1. Wytrącony na poprzednich ćwiczeniach DNA odwirować przy prędkości 10000 rpm
przez 15 min. w 40C. Uzyskany osad DNA przemyć 1 ml oziębionego 70% etanolu,
po czym odwirować przy 10000 rpm przez 5 min. i wysuszyć na powietrzu.
2. Osad DNA rozpuścić w 20 l buforu próbkowego do elektroforezy DNA.
3. Przygotować 80 ml 1% roztworu agarozy w buforze TAE według przepisu
zamieszczonego w załączniku do ćwiczeń
4. Na żel agarozowy nanieść otrzymane próbki DNA. Rozdział fragmentów DNA
prowadzić przy napięciu 100V dopóki czoło barwnika nie dotrze do 3/4 długości żelu.
Po zakończonej elektroforezie obserwować rozdzielone fragmenty DNA pod lampą
UV. Obrazem trawienia powinna być „drabinka” prążków, które odpowiadają
fragmentom DNA stanowiącym wielokrotność około 200 par zasad.
Interpretacja wyników
1. Porównać obraz elektroforetyczny DNA przed i po trawieniu MN-azą.
2. Określić wielkość fragmentów DNA otrzymanych w wyniku działania MN-azy.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
12
Analiza zmienności osobniczej DNA w obrębie sekwencji
minisatelitarnej
Minisatelity to fragmenty DNA składające się z szeregu powtórzeń krótkiej sekwencji
o długości kilkudziesięciu nukleotydów. Ilość powtórzeń tej sekwencji jest zmienna
osobniczo, wobec czego może być wykorzystywana jako marker zmienności genetycznej.
Różnice między allelami bada się z wykorzystaniem w reakcji PCR starterów
komplementarnych do sekwencji flankujących region minisatelity. Produkty amplifikacji są
następnie nanoszone na żel agarozowy lub, jeśli chcemy precyzyjnie mierzyć długość
produktu, poliakrylamidowy i analizowane pod kątem długości. Są to markery kodominujące,
co oznacza, że dla heterozygoty w danym locus zobaczymy oba allele. Podczas ćwiczenia
zostanie przeanalizowany marker D1S80, którego sekwencja o długości 16 pz może być
powtórzona od 14 do 42 razy (najczęściej w populacji występującym allelem jest 24
powtórzeń). Ponadto, marker ten jest heterozygotyczny w 79%.
Celem ćwiczenia jest określenie profilu genetycznego charakterystycznego dla DNA
każdej osoby. W tym celu z komórek śluzówki policzka zostanie wyizolowane DNA
z wykorzystaniem specjalnego firmowego zestawu. Zestaw ten wyposażony jest
w kolumienki z membraną krzemionkową, wobec której kwasy nukleinowe wykazują
wysokie powinowactwo. Zastosowanie tej technologii pozwala na wygodne przepłukiwanie
membrany w celu usunięcia zanieczyszczeń, dzięki czemu uzyskane preparaty DNA
charakteryzują się wysoką czystością. Wyekstrahowane DNA wykorzystuje się następnie
w reakcji PCR, podczas której amplifikacji podlega tzw. fragment minisatelitarny.
Materiały i odczynniki
1. Zestaw do izolacji genomowego DNA z wymazów ( np. Genomic Micro AX Swab
Gravity Plus)
2. Startery reakcji PCR
3. Polimeraza Taq 0,5U/l
4. Bufor dla polimerazy Taq z siarczanem amonu (firmowy)
5. 2 mM mieszanina deoksynukleotydów (dNTP)
6. 25 mM MgCl2 (firmowy)
7. Jałowa dejonizowana woda
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
13
8. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz załącznik do
ćwiczeń)
9. Cienkościenne probówki do reakcji PCR o poj. 0,2 ml
10. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 i 2 ml oraz końcówki do pipet.
Izolacja DNA z nabłonka jamy ustnej
1. Do probówki o poj. 2 ml typu eppendorf dodać 700 µl buforu lizującego L.
2. Otworzyć opakowanie i wyjąć wymazówkę z probówki ochronnej.
Uwaga! Koniec wymazówki nie może dotknąć żadnej przypadkowej powierzchni
ani innej osoby poza osobą, od której pobierany jest wymaz.
3. Pobrać wymaz przy użyciu wymazówki dołączonej do zestawu. W tym celu pocierać
końcem wymazówki obie strony wewnętrznej części policzka przez 5 min.
Następnie szczoteczkę z pobraną próbką umieścić w probówce z buforem L, stosując
wyrzutnik wymazówki lub odciąć część patyczka wymazowego z pobraną próbką za
pomocą nożyczek (szczoteczka wymazówki z pobraną próbką powinna być
całkowicie zanurzona w buforze lizującym L).
4. Do próbki dodać 20 µl Proteinazy K i wymieszać przez worteksowanie. Następnie
próbkę inkubować 10 min. w temp. 50˚C z ciągłym mieszaniem bądź mieszać próbkę
podczas inkubacji przez worteksowanie co 2 min.
5. Podczas inkubacji umieścić kolumnę Micro AXD w probówce odbieralnikowej
i wstawić ją do statywu.
6. Nanieść na kolumnę 500 µl roztworu równoważącego K1. Odczekać aż do
całkowitego przejścia buforu przez kolumnę.
7. Po inkubacji w temp. 50˚C, próbkę wymieszać przez worteksowanie przez 2 min.
8. Krótko odwirować próbkę w celu osadzenia całości materiału na dnie probówki.
9. Nanieść próbkę na kolumnę Micro AXD. Poczekać aż roztwór przejdzie przez
kolumnę.
10. Dodać na kolumnę Micro AXD 600 µl pierwszego roztworu płuczącego W1.
Poczekać aż roztwór przejdzie przez kolumnę.
11. Dodać na kolumnę Micro AXD 500 µl drugiego roztworu płuczącego W2. Poczekać
aż roztwór przejdzie przez kolumnę.
12. Dodać do kolumny Micro AXD 60 µl roztworu elucyjnego E i poczekać 5 min.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
14
13. W tym czasie przygotować probówkę o poj. 1,5 ml typu eppendorf i dodać na jej dno
5 µl buforu zobojętniającego N.
14. Przenieść kolumnę Micro AXD do przygotowanej probówki.
15. Dodać na kolumnę 60 µl roztworu elucyjnego E. Odczekać aż roztwór całkowicie
wypłynie do probówki. Następnie krótko zwirować próbkę.
16. Kolumnę Micro AXD usunąć a DNA znajdujące się w probówce przetrzymywać
w lodówce do czasu dalszych analiz.
17. Sprawdzić wydajność izolacji oraz czystość preparatu DNA wykorzystując
spektrofotometr NanoDrop 2000c.
Amplifikacja i analiza elektroforetyczna sekwencji minisatelitarnej
z uzyskanego DNA
1. W probówkach do reakcji PCR o poj. 0,2 ml, przygotować 10 µl mieszaniny
reakcyjnej o następującym składzie:
Woda 4,3 µl
Bufor Taq z siarcz. am. 1 µl
dNTP (2mM) 1 µl
MgCl2 (25 mM) 0,4 µl
Starter F (20mM) 0,5 µl
Starter R (20mM) 0,5 µl
Polimeraza Taq 0,3 µl
DNA 2 µl
2. Przygotowaną mieszaninę reakcyjną wstawić do termocyklera i ustawić podany
program reakcji:
95°C – 2 min.
95°C - 15s
67°C - 30s x30
72°C - 30s
72°C – 2 min.
3. Po zakończeniu reakcji PCR, do probówki dodać 5 l buforu do elektroforezy DNA
i przeprowadzić rozdział elektroforetyczny powstałych produktów reakcji oraz
komercyjnego wzorca DNA w 1% żelu agarozowym (według przepisu
zamieszczonego w załączniku do ćwiczeń), ważne, aby przy wylewaniu żelu użyć
grzebyków o cienkich ząbkach – zwiększa to rozdzielczość rozdziału.
Interpretacja wyników - Przeanalizować zmienność genetyczną w grupie.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
15
Otrzymywanie rybosomów i frakcji cytoplazmatycznej drożdży
Saccharomyces cerevisiae
Frakcjonowanie komórek to metoda rozdzielania struktur subkomórkowych
polegająca na wstępnej dezintegracji oraz poddaniu homogenatu wirowaniu różnicowemu
(kilkukrotnemu wirowaniu ze stopniowo wzrastającą siłą odśrodkową) albo wirowaniu
w gradiencie sacharozy czy chlorku cezu (poszczególne struktury subkomórkowe osadzają się
w roztworze o różnej gęstości).
Celem ćwiczenia jest izolacja mikrosomów i frakcji cytoplazmatycznej oraz
oczyszczenie rybosomów z drożdży S. cerevisiae techniką wirowania różnicowego.
Mikrosomy są pęcherzykami, powstającymi z samozasklepiających się fragmentów gładkiego
lub szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. W celu uwolnienia rybosomów od błon
retikulum endoplazmatycznego stosuje się bufor z dodatkem 1% niejonowego detergentu
jakim jest Triton X-100. Tak traktowane rybosomy (tzw. rybosomy surowe) zawierają
zasocjowane z nimi białka cytoplazmatyczne, które można usunąć z powierzchni rybosomów
za pomocą zbuforowanych roztworów o wysokim stężeniu soli.
Materiały i odczynniki
1. Osad zamrożonych komórek drożdży S. cerevisiae
2. Piasek do dezintegracji
3. 2 M Tris
4. 10% roztwór Tritonu X-100 w buforze A
5. Bufor A (do dezintegracji)
50 mM Tris-HCl, pH 7,5
80 mM KCl
12,5 mM MgCl2
0,5 mM EDTA
1 mM PMSF
6 mM β- MET
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
16
6. Bufor B (do zawieszania rybosomów)
50% glicerol
50 mM Tris-HCl, pH 7,5
80 mM KCl
10 mM MgCl2
0,5 mM EDTA
5 mM DTT
7. Bufor A z dodatkiem 0,5 M KCl
8. 30% sacharoza w buforze A z dodatkiem 0,5 M KCl
9. Stały siarczan amonu
10. Bufor C (do preparatyki kinaz białkowych)
50 mM Tris – HCl, pH 7,5
0,5 mM EDTA
6 mM β- MET
0,5 mM PMSF
11. Odczynnik Bradford
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Poniższe czynności należy wykonywać w temp. 40C
Dezintegracja komórek drożdży i otrzymywanie ekstraktu bezkomórkowego
1. Osad zamrożonych komórek drożdżowych zważyć.
2. Komórki drożdżowe dezintegrować, ucierając je z piaskiem w moździerzu
porcelanowym przez około 15 min. Piasek dodawać stopniowo w ilości wagowej
3 -krotnie większej od masy komórek. Podczas dezintegracji utrzymywać wartość pH
w zakresie 7,2 – 7,5 poprzez dodawanie 2 M Trisu (niebuforowanego).
3. Uzyskany dezintegrat drożdży zawiesić w buforze A i wirować przy 3000 rpm przez
5 min. celem osadzenia piasku i resztek komórek.
4. Uzyskany supernatant wirować przy 30000 x g w ciągu 15 min. aby osadzić struktury
subkomórkowe (mitochondria, jądra, ściany komórkowe).
5. Tak otrzymany ekstrakt komórkowy (tzw. frakcja S30) podzielić na dwie części. Do
jednej części, przy stałym mieszaniu, dodać 10% Tritonu X-100 tak, aby jego
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
17
końcowe stężenie wynosiło 1%, po czym ekstrakt mieszać jeszcze przez 10 min.
Drugą część ekstraktu przechowywać w tym czasie w temp. 40C.
6. Obie części wirować przy 400000 x g przez 30 min. W wyniku wirowania otrzymuje
się frakcję cytoplazmatyczną, tzw. frakcję S100 i frakcję mikrosomalną
(z części nietraktowanej Tritonem X-100) oraz rybosomy surowe (z części
traktowanej Tritonem X-100).
7. Osady stanowiące frakcję mikrosomalną oraz rybosomy surowe zawiesić w buforze B
(za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego) i przechowywać do kolejnych
ćwiczeń w temp. –200 C.
8. W supernatancie stanowiącym frakcję cytoplazmatyczną oznaczyć białko metodą
Bradford. a następnie przygotować dwie próbki do elektroforezy SDS/PAGE
zawierające po 25 μg białka. Gotowe próbki białkowe przechowywać do kolejnych
ćwiczeń w temp. –200 C.
Oczyszczanie rybosomów
1. Osad rybosomów surowych zawiesić w buforze A z dodatkiem 0,5 M KCl i mieszać
w homogenizatorze szklanym przez 15 min. po czym osadzić przez wirowanie przy
100000 x g przez 1,5 godz. Czynność tę wykonać dwukrotnie.
2. Uzyskany preparat rybosomów ponownie zawiesić w buforze A z 0,5 M KCl
i wirować przez 1cm warstwę zbuforowanego roztworu sacharozy (30% sacharoza
w buforze A z dodatkiem 0,5 M KCl) przy 100000 x g przez 3 godz. Po osadzeniu,
rybosomy zawiesić w buforze B, oznaczyć ich stężenie (przepis – patrz załącznik do
ćwiczeń) i przechowywać do kolejnych ćwiczeń w temp. –200 C.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
18
Izolacja kwaśnych białek rybosomowych z drożdży
Większość białek rybosomowych stanowią małe białka o charakterze zasadowym,
których punkt izoelektryczny oscyluje w pobliżu pH 8,5 lub wyższym. Duża podjednostka
rybosomów zawiera jednak grupę powierzchniowych białek kwaśnych, tworzących
charakterystyczną strukturę zwaną „kciukiem”, który oddziałuje z czynnikami translacyjnymi
podczas syntezy białka. U bakterii kwaśne białka rybosomowe tworzą pentameryczny lub
heptameryczny kompleks, złożony, odpowiednio, z dwóch lub trzech dimerów białka L12
oraz pojedynczej cząsteczki białka L10. U Escherichia coli białko L12 nazywane jest L7/L12.
Różnica między L7 i L12 polega na potranslacyjnej acetylacji na N-końcu polipeptydu L7.
Białko L7/L12 E. coli złożone ze 120 aminokwasów i posiada masę cząsteczkową 12,2 kDa.
Eukariotyczne białka kwaśne noszą nazwę białek P, ze względu na ich fosforylacyjną
modyfikację. Białka te podzielono na dwie grupy. Jedną z nich stanowią dwa małe białka P1
i P2 o masie 11 kDa i pI równym 3,0-3,5, będące funkcjonalnymi odpowiednikami
bakteryjnego białka L12. U niższych eukariontów takich jak drożdże stwierdzono obecność
czterech białek P1/P2. Kwaśne białka drożdży S. cerevisiae nazwano P1A, P1B, P2A i P2B.
Ponadto u roślin zidentyfikowano dodatkowo białko P3. Drugą grupę białek P stanowi
pojedyncze białko P0 o masie ok. 34 kDa, będące odpowiednikiem bakteryjnego białka L10.
Na rybosomie białka P tworzą pentameryczny kompleks P0-(P1-P2)2, który wiąże się,
poprzez N-końcowy fragment białka P0, do wysoce konserwatywnego regionu 25S/28S
rRNA, zwanego centrum GTPazowym. U S. cerevisiae białka z grupy P1/P2 tworzą
preferencyjnie dwa heterodimery P1A-P2B i P1B-P2A w których N-końcowe fragmenty
białek są odpowiedzialne za dimeryzację i interakcje z białkiem P0, zaś karboksylowe końce
są wolne i oddziałują z czynnikami translacyjnymi takimi jak EF-2.
Białka z grupy P1/P2 nie są niezbędne dla aktywności translacyjnej rybosomu,
natomiast białko P0 jest stabilnym białkiem rdzenia rybosomowego i jest konieczne dla jego
funkcjonowania. Delecja genu dla P0 prowadzi do śmierci komórki. Wszystkie białka P
charakteryzują się niezwykle konserwatywną C-końcową domeną, zawierającą resztę seryny
ulegającą fosforylacyjnej modyfikacji oraz stanowiącą antygen, przeciwko któremu
skierowane są przeciwciała u ludzi cierpiących na niektóre choroby autoimmunologiczne
(układowy toczeń trzewny) i infekcyjne (choroba serca Chagasa, leiszmanioza).
W odróżnieniu od pozostałych składników rybosomu kwaśne białka rybosomowe,
zarówno bakteryjne jak i eukariotyczne, występują w postaci wolnej w cytoplazmie.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
19
U organizmów eukariotycznych, w przeciwieństwie do bakterii, odbywa się ponadto wymiana
tych białek między rybosomem a pulą cytoplazmatyczną.
Materiały i odczynniki
1. Oczyszczone rybosomy drożdżowe o stężeniu 20 mg/ml
2. Bufor do ekstrakcji kwaśnych białek rybosomowych
20 mM Tris-HCl, pH 7,5
40 mM MgCl2
6 mM β- MET
1 M NH4Cl
3. 96% etanol (oziębiony)
4. Aceton (oziębiony)
5. 25 mM Tris-HCl, pH 7,5
6. Odczynnik Bradford
Wykonanie ćwiczenia
1. Kwaśne białka rybosomowe ekstrahować z 2 mg rybosomów oczyszczonych
S. cerevisiae o stężeniu 20 mg/ml. Do zawiesiny rybosomów (1 objętość) dodać
1 objętość buforu do ekstrakcji białek kwaśnych i pozostawić na 5 min. w lodzie.
2. Dodać 1 objętość 96% etanolu (oziębionego) i pozostawić na 10 min. w lodzie.
3. Powtórzyć punkt 2.
4. Odwirować przy 10000 rpm przez 15 min. w celu osadzenia cząstek rdzeniowych
rybosomów ( tj. rybosomów zawierających białka, które nie zostały wyekstrahowane).
5. Supernatant zawierający kwaśne białka rybosomowe przenieść do nowej probówki
Eppendorfa, dodać trzykrotną objętość oziębionego acetonu (w celu wytrącenia białek
z supernatantu) i pozostawić w temp. –200 C przez co najmniej 24 godz.
6. Wytrącone białka osadzić drogą wirowania przy 10000 rpm przez 15 min., po czym
supernatant odrzucić, a osad kwaśnych białek rybosomowych wysuszyć na powietrzu
i zawiesić w 50 µl 25 mM Trisu – HCl, pH 7,5.
7. Oznaczyć stężenie białka metodą Bradford (przepis w załączniku do ćwiczeń)
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
20
Analiza otrzymanych białek metodą SDS/PAGE
i immunoblotingu
Technika immunoblotingu, zwana inaczej techniką western blot, składa się z kilku
etapów. Pierwszym etapem jest rozdzielenie mieszaniny białek w żelu poliakrylamidowym.
Następnie białka przenoszone są na membranę (w naszym przypadku jest to transfer pół-
suchy), która niespecyficznie wiąże wszystkie białka. Ostatnim etapem jest detekcja białek
przy udziale przeciwciał.
Po rozdziale elektroforetycznym w obecności SDS białka są zdenaturowane
i wszystkie posiadają ładunek ujemny proporcjonalny do ich masy. Transfer odbywa się
zatem w kierunku elektrody dodatniej. Wyróżniamy dwa typy transferu: transfer mokry
i półsuchy.
Transfer
Aby przeprowadzić transfer białek na membranę, należy przygotować „kanapkę”
złożoną z żelu, membrany i bibuły Whatman. W przypadku transferu mokrego, „kanapka”
ułożona jest pionowo pomiędzy dwiema elektrodami, a całość umieszczana jest w aparacie
wypełnionym buforem. Transfer mokry stosuje się zwłaszcza w przypadku białek dużych
(>100 kDa), hydrofoowych lub trudno rozpuszczalnych ze względu na możliwość
prowadzenia go nawet przez 24 godziny, bez ryzyka wyparowania buforu. Należy wówczas
zapewnić chłodzenie, aby utrzymać temperaturę w granicach 10 – 30°C. Transfer mokry
przeprowadza się przy stałym napięciu prądu, zwykle 20 – 30 V.
W przypadku transferu półsuchego „kanapka” ułożona jest poziomo między
elektrodami. Żel i membrana umieszczone są pomiędzy bibułami Whatman nasączonymi
buforem. Transfer ten prowadzi się przy stałym natężeniu prądu, wynoszącym zwykle 0,8 –
1,5 mA/cm2 membrany.
Transfer białek z żelu można przeprowadzić na membrany nitrocelulozowe lub
membrany z polifluorku winylidenu (PVDF). Wielkość porów w obu typach membranach
waha się od 0,1 μm do 0,45 μm. Membrany nitrocelulozowe są tańsze, wiążą 80-200 μg
białka na cm2. Membrany te od razu nasącza się buforem do transferu, bez uprzedniego
zanurzania ich w metanolu. Membrany PVDF wiążą 150-200 μg białka na cm2 i mają dużo
większą wytrzymałość mechaniczną niż membrany nitrocelulozowe. Należy pamiętać
o wcześniejszym zanurzeniu ich w metanolu i dopiero później w buforze do transferu.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
21
Blokowanie membran
Po transferze wolne miejsca wiązania białek na membranie są blokowane, aby
zapobiec niespecyficznemu wiązaniu się przeciwciał do membrany. Do blokowania membran
używa się odtłuszczonego mleka lub albuminy z surowicy bydlęcej.
Wiązanie przeciwciał
Badane białka identyfikuje się przy użyciu wyznakowanych przeciwciał
pierwszorzędowych (swoistych dla badanych białek), lub niewyznakowanych przeciwciał
pierwszorzędowych i wyznakowanych przeciwciał drugorzędowych (specyficznych dla
pierwszorzędowych). Następnie przeprowadza się detekcję przeciwciał związanych
z badanymi białkami, której sposób zależy od rodzaju znacznika, jaki dołączony jest do
przeciwciał.
Detekcja
Najczęściej dołączanymi do przeciwciał znacznikami są enzymy: alkaliczna fosfataza
i peroksydaza chrzanowa. Wizualizacja tych znaczników może być przeprowadzona
kolorymetrycznie (w miejscu związania przeciwciał do białka na membranie powstaje barwny
produkt) lub chemiluminescencyjnie (enzym przeprowadza reakcję z wytworzeniem światła,
odczytu ilości emitowanego światła można dokonać na dwa sposoby, stosując urządzenie do
detekcji chemiluminescencji lub za pomocą kliszy fotograficznej).
Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy białek rybosomowych
i cytoplazmatycznych techniką SDS-PAGE i immunoblotingu. Przeprowadzimy identyfikację
immunologiczną białek P drożdży. W tym celu wykorzystamy niewyznakowane przeciwciała
pierwszorzędowe rozpoznające drożdżowe, białka P i przeciwciała drugorzędowe sprzężone
z alkaliczną fosfatazą.
Materiały i odczynniki
1. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz załącznik do ćwiczeń).
2. Preparaty mikrosomów, rybosomów surowych, rybosomów oczyszczonych, frakcji
cytoplazmatycznej oraz białek P otrzymane na poprzednich ćwiczeniach.
3. Membrana PVDF.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
22
4. Metanol
5. Bibuła Whatman 3 MM.
6. Bufor Novablot.
7. Czerwień Ponceau.
8. PBS
9. Roztwór blokujący (10 % roztwór mleka odtłuszczonego w PBS).
10. Aparat do pół-suchego transferu białek.
11. Przeciwciała pierwszorzędowe (poliklonalna surowica skierowana przeciwko
drożdżowym białkom P)
12. Drugorzędowe przeciwciała sprzężone z alkaliczną fosfatazą
13. Bufor PBS
14. Bufor PBS-T (PBS z 0,1 % Tween 20)
15. Bufor AP
16. NBT (18 mg NBT rozpuścić w 1400 µl DMF i 600 µl wody). Przechowywać w -20oC.
17. BCiP (8 mg BCiP rozpuścić w 2 ml DMF). Przechowywać w -20oC.
18. Probówki Falcona o pojemności 15 ml i 50 ml.
19. Pęsety.
20. Rękawiczki nitrylowe.
Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotować dwa 12 % żele poliakrylamidowe do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących według przepisu w załączniku do ćwiczeń.
2. Oznaczyć stężenie mikrosomów, rybosomów surowych i oczyszczonych (przepis –
patrz załącznik do ćwiczeń)
3. Przygotować po dwie próbki białkowe do elektroforezy SDS/PAGE zawierające:
a) 25 μg mikrosomów, b) 25 μg rybosomów surowych, c) 25 μg rybosomów
oczyszczonych, d) 25 μg białek frakcji cytoplazmatycznej, e) 5μg białek P, e) wzorce
białkowe, według przepisu w załączniku do ćwiczeń.
4. Próbki białkowe zawieszone w buforze próbkowym SDS/PAGE nanieść na żele
poliakrylamidowe. Rozdział prowadzić pod napięciem 150V tak długo, aż barwnik
przesunie się do końca żelu separującego. Po rozdziale, jeden żel poliakrylamidowy
wybarwić błękitem Coomassie, (przepis w załączniku do ćwiczeń).
5. Drugi żel poliakrylamidowy przepłukać buforem Novablot a następnie przeprowadzić
transfer białek z żelu na membranę PVDF (wcześniej nawilżoną metanolem
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
23
a następnie buforem Novablot), umieszczoną pomiędzy dwiema potrójnymi
warstwami bibuły Whatman 3 MM nawilżonej buforem Novablot. Całość umieścić
w aparacie do elektrotransferu pomiędzy grafitowymi elektrodami. Transfer białka
prowadzić w kierunku anody przy natężeniu prądu 280 mA przez jedną godzinę.
6. Po zakończeniu transferu, membranę PVDF inkubować z 0,02% roztworem czerwieni
Ponceau (celem wybarwienia markerów białkowych). Po zaznaczeniu ołówkiem
pozycji markerów białkowych, odpłukać barwnik za pomocą buforu PBS. Następnie
inkubować membranę w roztworze blokującym, w temp. 4oC, do kolejnych ćwiczeń.
7. Wylać roztwór blokujący i dodać do membrany 20 ml przeciwciał
pierwszorzędowych rozcieńczonych 1:1000, w buforze PBS i pozostawić przez
40 min. na kołysce w temp. pokojowej.
8. Odpłukać przeciwciała roztworem PBST: 4 razy przez 1 min.
9. Na płytkę z membraną wlać 20 ml przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych
1:10000 w 20 ml PBST i pozostawić na kołysce w temperaturze pokojowej na
40 min. (w czasie inkubacji przygotować barwniki do detekcji).
10. Odpłukać przeciwciała roztworem PBST: 4 razy przez 1 min.
11. Przepłukać membranę buforem AP: 2 razy przez 1 min.
12. Przeprowadzić detekcję białek na membranie. W tym celu do probówki Falcona
dodać 10,5 ml buforu AP a następnie dodać jednocześnie dwa przygotowane
wcześniej barwniki (NBT i BCiP) . Wymieszać zawartość probówki Falcona i wylać
całość na płytkę z membraną. Pozostawić na kołysce do pojawienia się prążków.
Reakcje barwienia przerwać poprzez płukanie membrany wodą dejonizowaną, po
czym membranę wysuszyć na powietrzu.
Interpretacja wyników
1. Porównać skład białkowy preparatów poddawanych elektroforezie.
2. Określić masy cząsteczkowe białek P.
3. Określić w jakich frakcjach komórkowych występują białka P drożdży.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
24
Badanie aktywności enzymatycznej w żelu poliakrylamidowym
na przykładzie inwertazy
Badanie aktywności enzymów w żelu poliakrylamidowym jest często skuteczną
metodą identyfikacji enzymów w nieoczyszczonych preparatach białkowych. Badanie
aktywności enzymatycznej można przeprowadzać zarówno po rozdziale białek w żelu
poliakrylamidowym w warunkach denaturujących jak i po elektroforezie w warunkach
natywnych. Wybór metody zależy w dużej mierze od wrażliwości badanego enzymu na
obecność SDS. W przypadku niektórych białek, które nie zachowują aktywności
enzymatycznej w obecności SDS, można przeprowadzić ich renaturację poprzez usunięcie
SDS (np. płucząc żel w roztworze 2,5% tritonu X-100). Jednakże nie ma jednej
uniwersalnej, efektywnej metody renaturacji enzymów, toteż aktywność enzymatyczną
niektórych białek bada się po przeprowadzeniu elektroforezy w warunkach natywnych.
Inwertaza, albo sacharaza (EC 3.2.1.26) katalizuje hydrolizę sacharozy będącej
disacharydem złożonym z cząsteczki α-D-glukozy i cząsteczki β-D-fruktozy połączonych
wiązaniem α1-β2 glikozydowym. Po rozerwaniu wiązania powstaje równomolarna
mieszanina cząsteczek glukozy i fruktozy. Inwertaza jest syntetyzowana przez wiele
szczepów drożdży i bakterii. Ilość enzymu produkowana przez mikroorganizm waha się
znacznie w zależności od gatunku, szczepu, czy dostępnego źródła węgla. Drożdże
Saccharomyces cerevisiae wytwarzają zarówno wewnątrz- jak i zewnątrzkomórkową
inwertazę. Zewnątrzkomórkowa inwertaza występuje w formie wysoce glikozylowanego
homodimeru wydzielanego do przestrzeni periplazmatycznej. Wewnątrzkomórkowa
inwertaza również tworzy homodimer ale nie ulega glikozylacji. Inwertaza jest
powszechnie stosowana w przemyśle spożywczym do produkcji fruktozy czy
w biosensorach do stałego monitorowania poziomu sacharozy.
Celem ćwiczenia jest identyfikacja aktywności enzymatycznej inwertazy z drożdży
S. cerevisiae po rozdziale w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących.
Materiały i odczynniki
1. 20-godzinna hodowla drożdży S cerevisiae, szczep W303 (50 ml na zespół studentów)
2. (NH4)SO4 cz. d. a. w postaci stałej
3. 10 mM bufor fosforanowy pH 7,0
4. 10 mM bufor fosforanowy pH 7,0 z dodatkiem 30% glicerolu
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
25
5. 10 mM bufor fosforanowy pH 5,8
6. 0,1 M r-r sacharozy w 10 mM buforze fosforanowym pH 5,8 (przygotować
bezpośrednio przed użyciem)
7. Chlorek tetrazolu w postaci stałej (chronić przed światłem!!!)
8. 1M NaOH
9. Inwertaza - preparat handlowy (1 mg/ml w 10 mM buforze fosforanowym pH 5,8) –
przygotować w dniu poprzedzającym ćwiczenia, przechowywać w temp. 40C.
10. Celulozowe „węże” do dializy
11. Papierki wskaźnikowe pH 5,4 – 7,0
12. 10% roztwór kwasu octowego
13. Odczynniki i zestaw do elektroforezy białek SDS/PAGE
Wykonanie ćwiczenia
Wysalanie i dializa białek z płynu pohodowlanego
1. Po ok. 20 godzinach hodowli, gdy OD600 równa się ok. 9-10 (faza stacjonarna)
odwirować komórki przy 3000 rpm przez 10 min.
2. Płyn pohodowlany zlać do cylindra (źródło inwertazy) a osad komórek odrzucić.
3. Zmierzyć objętość płynu pohodowlanego, przelać go do zlewki i pozostawić w lodzie
na mieszadle magnetycznym.
4. Białka wytrącać stałym siarczanem amonu przy wysyceniu 0-90% (tabela
frakcjonowania siarczanem amonu – załącznik do ćwiczeń). Siarczan amonu dodawać
stopniowo mieszając przez 1 godz. w temp. 40 C. Następnie zawiesinę odwirować
przy 10000 rpm przez 20 min.
5. Osad wytrąconych białek rozpuścić w 200-300 µl 10 mM buforu fosforanowego, pH
7,0 i poddać dializie (przepis – załącznik do ćwiczeń) wobec 10 mM buforu
fosforanowego, pH 7,0 z dodatkiem 30% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór
białek przechowywać w temp. –200 C.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
26
Oznaczanie aktywności inwertazy w żelu
1. Oznaczyć stężenie białka metodą Bradford (przepis – załącznik do ćwiczeń).
2. Przygotować 10% żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących (SDS/PAGE) według przepisu w załączniku do ćwiczeń.
3. Przygotować trzy próbki zawierające: 100 µg, 150µg i 200 µg białka w objętości 30 µl
i dodać do nich po 10 µl buforu próbkowego do elektroforezy białek w warunkach
denaturujących (bezpośrednio przed naniesieniem na żel). Jako wzorzec przygotować
dwie próbki zawierające 10 µg i 20µg inwertazy handlowej w objętości 30 µl i dodać
do nich po 10 µl buforu próbkowego. Dokładnie wymieszać (uwaga! nie ogrzewać
próbek w temperaturze 900C) i nanieść do studzienek w żelu zagęszczającym.
4. Rozdział elektroforetyczny prowadzić pod napięciem 150 V tak długo, aż barwnik
przesunie się do końca żelu separującego.
5. Po zakończeniu elektroforezy żel przenieść do małego pojemnika, przepłukać 30 ml
wody destylowanej, a następnie 30 ml 10 mM buforu fosforanowego pH 5,8.
6. Następnie żel zalać 30 ml 0,1 M roztworu sacharozy w 10 mM buforze fosforanowym
pH 5,8 i inkubować w łaźni wodnej w temp. 450C przez 45 min. Uwaga! Podczas
inkubacji należy kontrolować, za pomocą papierków wskaźnikowych, pH r-ru
(pH r-ru wzrasta, zwłaszcza w ciągu pierwszych 15 min. inkubacji). W przypadku
zmiany pH, zlać roztwór sacharozy i zalać żel kolejną porcją.
7. Po zakończeniu inkubacji, zlać roztwór sacharozy, a żel przepłukać trzy razy wodą
destylowaną.
8. Ok. 10 min przed zakończeniem inkubacji przygotować wrzącą łaźnię wodną.
Naważyć 50 mg chlorku tetrazolu i rozpuścić w 50 ml 1M NaOH.
9. Gdy roztwór chlorku tetrazolu zaczyna zmieniać barwę (z bezbarwnej na różową),
wlać barwnik do naczynia z żelem i umieścić we wrzącej łaźni wodnej.
10. Żel barwić do pojawienia się czerwonych prążków białkowych.
11. Reakcję przerwać przez przeniesienie żelu do roztworu 10 % kwasu octowego.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
27
Identyfikacja białek w komórkach ssaczych metodą
immunocytochemiczną
Immunocytochemia (ICC, ang. immunocytochemistry) jest laboratoryjną techniką
mikroskopową powszechnie wykorzystywaną w badaniach podstawowych takich dziedzin
nauki jak np. biologia komórki czy biologia molekularna. Jednocześnie stanowi ona również
potężne narzędzie diagnostyczne stosowane szeroko w medycynie.
Zasada metody ICC polega na wykrywaniu in situ w komórce, tkance
(immunohistochemia, IHC) konkretnych antygenów (najczęściej są to białka, ale również
kwasy nukleinowe i polisacharydy) oraz definiowaniu ich subkomórkowej lokalizacji w
oparciu o zastosowanie przeciwciał specyficznie rozpoznających charakterystyczne dla
danego antygenu regiony określane jako epitopy. Wysoka specyficzność wiązania antygenu
przez przeciwciało jest determinowana unikalną strukturą epitopów danego antygenu
rozpoznawaną przez konkretne przeciwciało na zasadzie dopasowania przestrzennego.
Wizualizacja powstałych w komórce immunokompleksów (kompleksy przeciwciało-antygen)
jest możliwa dzięki znacznikom przyłączonym do przeciwciał. Generalnie wyróżnia się trzy
grupy znaczników:
1) enzymy (immunocytochemia właściwa), które przekształcają rozpuszczalny w
wodzie substrat w barwny i nierozpuszczalny w wodzie produkt np. peroksydaza chrzanowa
(HRP) czy alkaliczna fosfataza (AP) (Rys. 1),
Rys. 1 Analiza IHC chromograniny A pokazująca rekcję pozytywną w materiale pobranym z trzustki
(prawy panel) oraz reakcję negatywną w kontroli bez użycia przeciwciał anty-chromogranina A (lewy panel).
IHC pośrednia z wykorzystaniem pierwszorzędowych monoklonalnych przeciwciał anty-chromogranina A i
przeciwciał drugorzędowych wyznakowanych HRP (Fot. Thermo Scientific. Pierce Antibody Products).
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
28
2) fluorofory (immunocytofluorescencja IF) charakteryzujące się emisją światła o
innej długości fali niż światło wykorzystane do jego wzbudzenia np. FITC, barwniki z
rodziny Alexa Fluor, czy znaczniki nowej generacji tj. kropki kwantowe QDs (ang. qantum
dots) (Rys. 2) oraz
Rys. 2 Analiza ICC/IF białka HER2 pokazująca rekcję pozytywną w komórkach linii SK-BR-3 (prawy
panel) oraz reakcję negatywną w kontroli bez użycia przeciwciał anty-HER2 (lewy panel). ICC/IF pośrednia z
wykorzystaniem pierwszorzędowych monoklonalnych przeciwciał anty-HER2 i przeciwciał drugorzędowych
wyznakowanych fluoroforem DyLight 488. Jądra komórkowe wyznakowano barwnikiem DAPI. (Fot. Thermo
Scientific. Pierce Antibody Products).
3) białka zawierające metale ciężkie np. ferrytyna czy też same cząsteczki metali
ciężkich tj. np. koloidalne złoto w przypadku analiz ultrastrukturalnych w mikroskopii
elektronowej.
Detekcję antygenu w analizowanym materiale przeprowadza się stosując obserwacje
mikroskopowe w określonym typie mikroskopu (świetlny, fluorescencyjny, konfokalny,
elektronowy), co warunkowane jest rodzajem znacznika przyłączonego do przeciwciała
specyficznie wiążącego badany antygen.
Wśród metod immunocytochemicznych wyróżnia się metody bezpośrednie i
pośrednie. Immunocytochemia bezpośrednia polega na detekcji analizowanego antygenu w
komórce za pomocą wyznakowanego przeciwciała pierwszorzędowego specyficznie
wykrywającego dany antygen. Ze względu na zwiększoną czułość częściej stosuje się jednak
nieco bardziej skomplikowaną i czasochłonną immunocytochemię pośrednią. W tym
przepadku przeciwciało pierwszorzędowe skierowane przeciwko analizowanemu antygenowi
jest niewyznakowane i dopiero zastosowanie wyznakowanego przeciwciała drugorzędowego
specyficznie rozpoznającego przeciwciało pierwszorzędowe umożliwia wizualizację reakcji
(schemat poniżej).
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
29
Ze względu na szeroki wachlarz możliwości jakie stwarzają metody immunocyto- i
histochemiczne z powodzeniem stosuje się je w medycznych laboratoriach naukowych jak
również w diagnostyce klinicznej. Wykorzystuje się je m.in. do potwierdzenia infekcji
wirusowych (np. CMV, HBV, HCV), diagnostyki wrodzonych chorób genetycznych (tj. np.
dystrofie mięśniowe, choroby mitochondrialne) i chorób metabolicznych (np. miażdżyca).
Immunocytochemia odgrywa również bardzo ważną rolę w diagnostyce nowotworów.
Analizując obecność lub poziom ekspresji markerów nowotworowych możliwe jest wstępne
określenie typu nowotworu (np. antygen CA 125 - rak jajnika, PSA - rak gruczołu
krokowego, CEA - rak jelita grubego, ale również żołądka, płuc, S-100 – czerniak, ale i
diagnostyka nowotworów pochodzenia nerwowego) i różnicowanie nowotworów (np.
antygen LCA w różnicowaniu raków i chłoniaków w nowotworach płuc), zdefiniowanie czy
nowotwór jest złośliwy czy łagodny (np. ekspresja E-kadheryny, kalretyniny), określenie
stadium rozwoju nowotworu, identyfikacja typu komórek w przerzutach i odnalezienie źródła
przerzutowania czyli nowotworu pierwotnego (identyfikacja białek filamentów pośrednich FP
tj. np. cytokeratyna, wimentyna, nestyna), jak również przewidywanie odpowiedzi na
zastosowaną terapię czyli identyfikacja markerów predykcyjnych (np. lek trastuzumab, nazwa
handlowa: Herceptin, jest skuteczny w leczeniu raka piersi z przerzutami jedynie przy
nadekspresji białka HER2) jak również markerów prognostycznych. IHC wykorzystuje się
również przy opracowywaniu leków do testowania ich skuteczności poprzez wykrywanie
aktywności lub zmian w poziomie ekspresji molekularnego celu leku w chorobowo
zmienionej komórce.
Jakkolwiek pojęcie immunohistochemia jest często stosowane zamienne z
immunocytochemią warto zdawać sobie sprawę z istniejących między nimi różnic. Zasada
obu metod jest taka sama natomiast różnice dotyczą pochodzenia i histologiczno-
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
30
cytologicznej charakterystyki analizowanej próbki (w przypadku ICH mamy do czynienia z
materiałem biopsyjnym, pobraną od pacjenta tkanką, natomiast ICC umożliwia analizę
komórek pochodzących z płynów ustrojowych lub laboratoryjnych hodowli komórkowych)
oraz odpowiedniego przygotowania próbek przed zastosowaniem przeciwciał.
Celem ćwiczenia jest praktyczne zapoznanie się z techniką immunocytochemii
pośredniej oraz z metodami różnicowego barwienia fluorescencyjnego składników komórek.
Materiały i odczynniki
1. Hodowla komórek nowotworowych i prawidłowych na szkiełkach nakrywkowych w
oddzielnych małych szalkach Petriego 35 x 10 mm, o gęstości komórek ok. 80% (dwie
szalki z komórkami jednego typu na zespół studentów)
2. Bufor PBS:
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4, pH 7,5
3. 36,5-38% formaldehyd
4. Utrwalacz: 4% formaldehyd (przygotowywany na świeżo w buforze PBS)
5. Odczynnik do permeabilizacji: aceton schłodzony do temp. - 20° C
6. Bufor blokujący I:
2% BSA w buforze PBS
7. Bufor blokujący II:
6% BSA w buforze PBS
8. Surowica rozpoznająca ludzkie białko uL10
9. Roztwór króliczych przeciwciał pierwszorzędowych rozpoznających ludzkie białko
uL10, rozcieńczenie: 1:50 (przygotowywane na świeżo z surowicy w buforze
blokującym I)
10. Roztwór przeciwciał drugorzędowych skoniugowanych z fluoroforem Alexa fluor
488, rozpoznających przeciwciała pierwszorzędowe, stężenie 1 µg/ml w buforze
blokującym II
11. Barwnik fluorescencyjny Hoechst 33342, stężenie 2 µg/ml w H2O
12. Woda MiliQ
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
31
13. Roztwór do zatapiania komórek: komercyjny (Fluka), przed użyciem konieczne
ogrzanie w termobloku lub 20 % glicerol w H2O
14. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 i 2 ml i jałowe końcówki do pipet.
15. Jałowe probówki typu Falcon o poj. 15 ml
16. Pęsety
17. Małe szalki Petriego (35 x 10 mm) do hodowli komórkowych
18. Komory wilgotne (duże szalki Petriego 100 x 15 mm wyłożone bibułą filtracyjną
nasączoną w wodzie destylowanej)
19. Szkiełka podstawowe do obserwacji mikroskopowych
20. Termoblok
Wykonanie ćwiczenia
Wszystkie etapy wykonywać w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
Przy pracy z formaldehydem i barwnikiem Hoechst 33342 używać rękawiczek
ochronnych.
1. Usunąć pożywkę znad hodowli i przepłukać komórki 1 ml buforu PBS ogrzanym do
temp. 37° C.
2. Komórki w szalkach utrwalić na szkiełkach nakrywkowych za pomocą 1 ml 4%
roztworu formaldehydu, inkubować w utrwalaczu 10 min.
3. Po usunięciu 4% formaldehydu komórki przepłukać 3 x za pomocą 1 ml buforu PBS.
4. Usunąć bufor PBS i permeabilizować komórki przez 10 min. w 1 ml acetonu
schłodzonym do temp. -20° C (plastikowe szalki ulegną zmętnieniu).
5. Po usunięciu acetonu komórki przepłukać 3 x za pomocą 1 ml buforu PBS.
6. Szkiełka nakrywkowe z utrwalonymi i spermeabilizowanymi komórkami przenieść za
pomocą pęsety do nowych szalek Petriego.
7. Szalki z komórkami na szkiełkach umieścić w komorach wilgotnych.
8. Na komórki delikatnie nakroplić 50 - 100 µl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych
(anty uL10) i inkubować prze 30 min. w zamkniętych komorach wilgotnych (próba
badana). W przypadku preparatów kontrolnych zamiast roztworu przeciwciał
pierwszorzędowych użyć buforu blokującego I (kontrola negatywna).
9. Usunąć roztwór przeciwciał i przepłukać komórki 3 x za pomocą 1 ml buforu PBS.
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016
32
10. Na komórki delikatnie nakroplić 50 - 100 µl roztworu przeciwciał drugorzędowych
sprzęgniętych z markerem fluorescencyjnym Alexa fluor 488 i inkubować przez 30
min. w zamkniętych komorach wilgotnych.
11. Usunąć roztwór przeciwciał i przepłukać komórki 3 x za pomocą 1 ml buforu PBS.
12. Komórki przepłukać jednokrotnie wodą MiliQ (1 ml) i wybarwić jądra komórkowe
nanosząc na komórki 50-100 µl roztworu barwnika Hoechst 33342, inkubować 2 min.
13. Roztwór barwnika usunąć a komórki przepłukać buforem PBS.
14. Na szkiełko podstawowe nanieść 10 µl roztworu do zatapiania komórek. Na powstałej
kropli umieścić szkiełko nakrywkowe z wybarwionymi komórkami tak, aby strona z
komórkami była zwrócona do roztworu.
15. Przygotowane preparaty oglądać w mikroskopie konfokalnym przy określonej
długości fali:
Alexa-Fluor 488:
światło wzbudzające: niebieskie (max 488 nm), emisja – światło zielone.
Hoechst 33324:
światło wzbudzające: UV (max 352 nm), emisja – światło niebieskie
16. Zdefiniować obszary komórki wyznakowane fluorescencyjnie i porównać profil
intensywności fluorescencji komórek nowotworowych i prawidłowych.
Interpretacja wyników
Ocena subkomórkowej lokalizacji analizowanego antygenu na podstawie obserwacji
mikroskopowych fluorescencyjnie wyznakowanych immunokompleksów. Porównanie
intensywności sygnału fluorescencyjnego dla komórek nowotworowych i prawidłowych.
Literatura:
1. Immunocytochemia, Zabel A. Wydawnictwo Naukowe PWN