Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia

Pedro Bosch Mendoza13 Feb. 2014

Introducción

Quimioteca de compuestos catiónicos

Ensayos de intercalación

Intercalantes deADN

Ensayos de selectividad de secuencia

Ensayos de fluorescencia

Compuestos fluorescentes

Bases estructurales

de selectividad

Sondas de ADN

RT-PCR

Tinción celular

Ensayos de actividad

antiproliferativa

Potencial antitumoral

Introducción

N+

X-N+

X-

N

N+N-MSTS

N+N

Br-

N+

TfO-

NH

N+Br-

N+

NN

I-

N

N+N-MSTS

N+

TfO-

N+TfO-

N+

TfO-

N

N+N-MSTS

N

N+

-MSTS

N

Quinolizinio

Sistemas tri , tetra y pentacíclicos

Variación de forma y tamaño N

N+N

MSTS-

Síntesis

• Condensación de Westphal

NX

R

R1

R1

CH2R

NXH

O

O

R1

R1

CH2R

NAr

++

R =H, EWG

N-Alkylation or

N-Amination Base

X=NH, CHCO2Et

Westphal, O.; Jahn, K.; Heffe, W. Arch. Pharm. 1961, 294, 37-45.J. J. Vaquero, J. Alvarez-Builla, Adv. Nitrogen Heterocycles, 2000, 159-245

N

Me

OH

N

Me

OO

N

Me

CO2H

RR

O

O

OO

N

R

R

O OH

N

R

RN

R

R

OH

Br_

Br_

Br_

Br_

Br_

2. HBr, 100 oC, 1 h

1.Ethyl bromoacetatenBu4NI, Toluene, reflux

HOBt, DIC

Wang resin

DCM/DMF

++Het Het Het

Base, Solvent, rt

+

-CO2

+

Het

+

Het

+

Het

F. Delgado, L. Linares, R. Alajarín, J. Alvarez-Builla, J.J. Vaquero, Org. Lettt. 2006, 4057-4060

Síntesis

• Metátesis de cierre de anillo

N N

RuCl

Cl

PhPCY3

N N

RuCl

ClO

Grubbs 2º generaciónHoveyda-Grubbs

Núñez; B. Abarca; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. J. Org. Chem. 74, 4166 – 4176, 2009A. Nuñez, A. M. Cuadro, J. Alvarez-Builla, J. J. Vaquero. Org. Lett. 2007, 9, 2977-2980 A. Núñez; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. Chem. Comm. 3, 2690 – 2692, 2006

N+

X-

N+

X- N+

X-

1. GII ó HG2. Oxidación HG

N+

1. GII ó HG2. Oxidación

Ensayos

• Intercalación / selectividad de secuencia de ADN• Curvas de fusión• Oligonucleótidos de secuencia definida• Ligando unido: aumento de temperatura de fusión

Intercalantesde ADN

Ensayo de selectividadde secuencia ADN

(preferencia AT vs GC)

Ensayo deIntercalacióncon el ADN

Selectividadvs estructura

V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling EnviadoA. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES 210000264, 2010

Quimioteca de compuestos catiónicos

Ensayos

• Intercalación / selectividad de secuencia de ADN• Curvas de fusión• Oligonucleótidos de secuencia definida• Ligando unido: aumento de temperatura de fusión

V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling EnviadoA. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES 210000264, 2010

Ensayos

• Intercalación / selectividad de secuencia de ADN

N

N+N-MSTS

N

N+

-MSTS

N

N

N+N-MSTS

N+N

Br-

N+

TfO-

NH

N+Br-

Unión ADN

Selectividad GC ó AT

1 No ---

2 Sí AT

3 Muy débil No existe

4 No ---

5 No ---

6 Sí AT

N+

NN

I-

N

N+N-MSTS

N+

TfO-

N+TfO-

N+

TfO-

N

N+N

MSTS-

Unión ADN

Selectividad GC ó AT

7 No ---

8 No ---

9 Débil AT

10 Débil AT

11 Muy débil AT

12 Sí AT

Máx. emisión

Eficiencia cuántica

1 442 0,33

2 544 < 0,05

3 464 < 0,05

4 461 0,14

5 361 0,23

6 467 0,15

Ensayos

• Fluorescencia:

N

N+N-MSTS

N

N+

-MSTS

N

N

N+N-MSTS

N+N

Br-

N+

TfO-

NH

N+Br-

Máx. emisión

Eficiencia cuántica

7 353 0,18

8 437 < 0,05

9 419 0,15

10 400 0,35

11 398 0,31

12 450 0,25

N+

NN

I-

N

N+N-MSTS

N+

TfO-

N+TfO-

N+

TfO-

N

N+N

MSTS-

Ensayos

NH

N+Br-

N

N+N

MSTS-

N

N+N

MSTS-12

1

6

Valoración Fluorescencia

• Materiales– Cromóforos (5% DMSO, 3,9·10-5M) – DNA Timo bovino (10 µl, 4,1·10-3M)

• Procedimiento– Adición de alicuotas de DNA sobre disolución de cromóforo– Tiempo de intercalación: 10 min– Error correspondiente a dilución menor del 5%– Ratio 1:12 cromóforo/DNA

Valoración Fluorescencia

• Gráficas

N

N+N

MSTS-

N

N+N

MSTS-

1

12

Valoración Fluorescencia

• Gráficas– Área bajo la curva– Anisotropía de fluorescencia– Constante de unión al DNA

Kb= (6.92.6) 104 M-1

– Pares de bases por cromóforo (n): 5.90.3

N

N+N

MSTS-

N

N+N

MSTS-

12

1

2 2

0 0 0 0 0 0

0

0

0 0

1+ n K[L] K[M] 1+ nK[L] + K [M] 4 nK [L] [M]=

2K n [L]

+I II

I I

Dicroísmo circular inducido

• Luz polarizada en un plano• Plano formado por 2 componentes en fase• Dicroísmo circular inducido: Transferencia de asimetría

– Cercanía en el espacio– Molécula capaz absorber

Dicroísmo circular inducido

• Gráficas– Señal correspondiente al

apilamiento de bases y a helicidad.– CD aumenta en presencia de

cromóforo– Este cambio sugiere intercalación

Dicroísmo circular inducido

• Gráficas

Nuevos cromóforos

Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998Dyes and pigments 96 (2013) 554-562

N

NH2

N

NAc. p-toluensulfónico

Anh Acético, 3h,RT

1 2

68%

S OOO

NH2

CH2Cl2, 1hRT

N

N+

N

N+

NH2

MSTS-

O OEt

Br-

3

4

65%

59%

O

O

O

O

AcONa

EtOH, 24h, Reflujo

Et3N

EtOH,5h,Reflujo

N

N+N

MSTS-

N

N+

Br-

5

6 22%

BrO

OAcetona (anh)4h, Reflujo

50%

Nuevos cromóforos

N

NH2

N

NAc. p-toluensulfónico

Anh Acético, 3h,RT.

1 2

68%

Dyes and pigments 96 (2013) 554-562

Nuevos cromóforos

Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998

N

N

2

S OOO

NH2

CH2Cl2, 1hRT

N

N+NH2

MSTS-

3 65%

O

O

AcONa

EtOH, 5h,Reflujo

N

N+N

MSTS-

5 50%

Nuevos cromóforos

N

N+

O OEt

Br-

459%

O

O

EtOH, 24h, Reflujo

Et3NN

N+

Br-

6 22%

BrO

O

Acetona (anh)4h, Reflujo

N

N

2

Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998

Nuevos cromóforos

• Perspectivas– Cromóforos funcionalizados– Compuestos con un aumento de fluorescencia al estar unidos al DNA

Síntesis del Híbrido Losartán-inhibidor de RAS

Híbrido de Losartán

• Introducción– Losartán

• Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona• ARAII

– Inhibidor de RAS• Proteína reguladora• Proteína G monomérica• Activación y proliferación

• Objetivo– Estrategia

N

NHN

Cl

NHN

N N

NC8H17

4

Híbrido de Losartán

• Síntesis del inhibidor de RAS

NH

Br

OH

N

Br

OH

C8H17

NaH 60%1-bromooctano

DMF, 4h, RT

1 297%

N

OH

C8H17

Ac. m-tolilborónicoPd(PPh3)4

Na2CO3 (2M)

DMF, EtOH,5h, reflujo

385%

NC8H17

NOH

H2N-OH.HClpyr

EtOH,2,5h, reflujo

488%

NiCl2.H2ONaBH4

MeOH, 5min,RT

NC8H17

NH2

547%

J. Med. Chem. 2010, 53, 6838–6850

Híbrido de Losartán

• Oxidación de Losartán

A. Avenoza et al. Tetrahedron: Asymmetry 12 (2001) 949-957

N

N

OH

Cl

NN

NN

N

N

O

Cl

NN

NN

HCloruro deoxaliloDMSOEt3N

CH2Cl2 (anh)17h, -78ºC

1 2 57%

Híbrido de Losartán

• Síntesis del Híbrido

Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008

N

N

O

Cl

NN

NN

H

N

NH2

C8H17

CH2Cl2 (anh),24h, RT

N

NHN

Cl

NN

N N

NC8H17NaBH4

(2eq.)

CH2Cl2/MeOH 1:2(anh), 4h, RT

23

25%

Híbrido de Losartán

• Desprotección del Híbrido

Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008

N

NHN

Cl

NN

N N

NC8H17

TFA

CH2Cl2, RT

N

NHN

Cl

NHN

N N

NC8H17

34

Híbrido de Losartán

• Perspectivas– Desprotección del grupo tritilo utilizando Pt/C 5% – Se evita la deshalogenación.

Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008

N

NHN

Cl

NHN

N N

NC8H17

4