Salles propres Régulation de l’humidité et régulation des CTA
Cours Module L5-BH-05 Régulation de l’expression des …aurelien.chateigner.free.fr/Semestre...
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Cours Module L5-BH-05
Régulation de l’expression des génomes
Mercredi de 13h30 à 15h30 & Jeudi de 8h00 à 10h00(sem. 0 à 5/6)
Université d’Orléans – UFR Sciences & Centre de Biophysique Moléculaire UPR4301S. Bourgerie
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Extrait du livret de l’étudiant
Code - Libellé SC-L5BH-05 – Régulation de l’Expression du GénomeNombre de crédits 6 ECTSCoefficient 2Nom du Responsable Alain LEGRANDProgramme Cours : 26h - TD : 14h -TP : 15hMécanismes généraux de la régulation de la transcription et de la traduction chez les procaryotes. Notions de signaux exogènes et endogènes de la régulation. Etude détaillée de quelques systèmes de régulation chez les procaryotes : approches biologiques, physiologiques, génétiques et moléculaires.Mécanismes de régulation chez les eucaryotes : régulation transcriptionnelle : séquences régulatrices et facteurs de transcription. Complexes d'initiation de la transcription. Structure de la chromatine et expression génique. Régulation post-transcriptionnelle : modifications des ARNm (coiffe, épissage, polyadénylation), durée de vie des ARNm, régulation par les petits ARN. Régulation de l'initiation de la traduction. Régulation post-traductionnelle : modifications et durée de vie des protéines.
Contrôle des connaissances 1è session : Cours : Contrôle terminal écrit (2h) + TP : CC2è session : Cours : Contrôle terminal écrit (2h) + TP : Contrôle Terminal
Coefficients de la note finale 1è session : a = 3 ; b = 0 ; c = 1 ; d = 02è session : a = 3 ; b = 0 ; c = 1 ; d = 0
Pré-requis Bases fondamentales de la biologie moléculaire
Cours magistraux
TD TP
intervenants Legrand Bourgerie
MolletNormand
Bourgerie
Cours magistraux
TD TP
Nombres d’heures
Part. 1 : 6 x 2hde S0 à S2Part. 2 : 6,5 x 2hde S3 à S6
Part. 1 : 3 x 2hS3-S4-S5Part. 2 : 4 x 2hS6-S7-S8-S9
3 x 5hde S9 à S12(13h30 à 18h30)
Ouvrage recommandé
1- Lewin « Gènes VI »
PLAN GENERAL
1- les stratégies de régulation2- l’opéron lactose3- l’opéron ara4- l’opéron tryptophane5- les facteurs σ alternatifs6- les gènes des aminoacyl-ARNt synthétases7- la réponse stringente8- les gènes codant les protéines ribosomiques – l’opéron ermC9- la réponse SOS10- les riborégulateurs11- la dégradation des ARNm12- récapitulatif
PLAN des COURS n°1 & n°2
1- Introduction1.1 pourquoi y-a-t-il régulation?1.2 niveaux de régulation1.3 quelques définitions1.4 notion d’opéron
2- Régulation de la transcription2.1 stratégies de contrôle de l’initiation de la transcription2.2 contrôles positif-négatif2.3 rappels sur l’initiation de la transcription chez les procaryotes
3- Opéron lactose3.1 organisation générale3.2 phénomène d’induction - inducteur3.3 lacZ - lacY - lacA3.4 mutants de l’opéron3.5 régulations
3.5.1 négative (répresseur)3.5.1.1 expérience Pajamo3.5.1.2 rôle du répresseur3.5.1.3 structure du répresseur3.5.1.4 opérateur
3.5.2 positive : répression catabolique3.5.2.1 diauxie3.5.2.2 AMPc3.5.2.3 scénarios3.5.2.4 structure-fonction CRP3.5.2.5 opérateurs
3.6 récapitulatif*
Introduction Pourquoi y-a-t-il régulation de l’expression des gènes ?
Pour répondre aux conditions changeantesde l’environnement immédiat
Sept mécanismes susceptibles de modifier la concentration à l’équilibre d’une protéine ;
Sites possibles de régulation :
1- synthèse du transcrit primaire2- maturation post-transcriptionnelle de l’ARNm3- dégradation de l’ARNm4- synthèse protéique5- modifications post-traductionnelles6- ciblage et transport des protéines7- dégradation des protéines
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Principalement, 3 niveaux de régulation de l’expression des gènes chez les procaryotes :
1- transcription : phase d’initiation (le plus souvent) ; phase de terminaison
2- maturation : stabilité du transcrit;
3- traduction : en général aux étapes d’initiation et de terminaison
Quelques définitions
Les séquences codant des produits agissant en transLes séquences agissant en cis
Un locus agit en cis sur un autre locus s’il est sur la même molécule d’ADN ;
L’opérateur est un élément d’activation en cis car il fonctionne uniquements’il est fixé sur le gène dont il contrôle l’expression.
Un locus agit en trans s’il peut contrôler un autre locus, même à partir d’une molécule d’ADN différente.
Le gène du répresseur du lactose (lacI) agit en trans car il peut réguler l’expression de l’opéron lactose même s’il est enlevé du génome d’E. coli et placé sur un plasmide.
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élément régulateur en cis : site pour une protéine de liaison à l’ADN, situé en amont du gène régulé.
élément agissant en trans : protéine elle-même, qui diffuse dans la cellule depuis son site de synthèse jusqu’à son site de liaison sur l’ADN.
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Quelques définitions (2)
Gène structural
gène qui code une protéine (ou un ARN)
Gène régulateur
gène structural qui code une protéine impliquée dans la régulation de l’expression d’autres gènes.
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OPERONGènes structuraux organisés en groupes contenant des gènes codant des protéines dont les fonctions sont apparentées(gènes co-transcrits pour former une molécule d’ARN polycistronique)
À côté de ces gènes, on retrouve :- des séquences adjacentes requises pour la transcription (promoteurs, opérateurs)- des séquences impliquées dans la régulation.
Quelques définitions (3)
Exemple : Les gènes des enzymes successives d’une voie métabolique
*
REGULON
réseau d’opérons fonctionnant avec un régulateur commun
Quelques définitions (4)
Exemples de régulons : opérons codant pour les enzymes du métabolisme glucidique;le système des gènes de choc thermique qui répondent au changement de température;les gènes qui sont induits (chez E. coli) en réponse à des agents
endommageant l’ADN (appartenant à la réponse SOS).
Qu’est-ce-que la REGULATION ?
Deux classes de mécanismes de régulation :
1- mécanismes opportunistes :
2- mécanismes généraux :
Deux modes de régulation de l’expression d’un gène cible par une molécule régulatrice :
1- d’une façon positive c’est à dire que l’interaction déclenche la transcription du gène
2- d’une façon négative : l’interaction empêche la transcription du gène
Quelques rappels sur l’initiation de la transcription chez les procaryotes
l’ARN polymérase catalyse la formation d’une liaison phosphodiester qui résulte d’une attaque du groupement 3’-OHdu dernier nucléotide de la chaîne sur le groupement 5-triphosphate du nucléotide entrant, ce qui s’accompagne d’une libération de pyrophosphate
la transcription comprend 4 étapes qui impliquent différents types d’interactions entre l’ARN polymérase et l’ADN :1- reconnaissance de la matrice2- initiation3- élongation4- terminaison
l’ARN polymérase copie en ARN un brin du duplex d’ADNune unité de transcription est une séquence d’ADN transcrite en un ARN unique,
qui débute au niveau du promoteur et se termine au terminateurla transcription a lieu dans une « bulle », à l’intérieur de laquelle l’ARN est synthétisé par appariement des bases
avec un brin d’ADN de la région transitoirement dérouléeau fur et à mesure de la progression de la bulle, le duplex d’ADN se reforme après son passage.
« Idées fortes »
le facteur σ contrôle la liaison à l’ADN de l’ARN polymérase.
la reconnaissance du promoteur dépend de séquences consensus.
il existe deux modes principaux de terminaison.
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Promoteurs bactériens : organisation
ARN polymérase
Schematic representation of the major form of E. coli RNA polymerase bound to DNA.
β’ 155613
β 150618
σ 70263
α 36512
ω 10105
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ARN polymérase : organisation - structure
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Transcription chez les procaryotes
Initiation Elongation Terminaison*
fixation de σau cœur de l’enzyme
reconnaissance du promoteur
(de Mooney et al. 1998)
1. Un organisme unicellulaire, avec un temps de génération très court, doit pouvoirrépondre rapidement à des changements de son environnement.
2. Les demi-vies de la plupart des ARNm sont courtes (de l’ordre de quelquesminutes).
3. La transcription et la traduction sont couplées et se réalisent dans le mêmecompartiment cellulaire.
Ces constatations impliquent que la régulation génique doit prendre effet tôt, et il est effectivement constaté que le point de contrôle majeurest l’initiation de la transcription.
Stratégies de contrôle de l’initiation de la transcription (chez les bactéries)
2 modes distincts de contrôle de l’initiation de la transcription
1- un contrôle constitutif qui dépend de la structure du promoteur
2- un contrôle de régulation qui est sous la dépendance de protéines régulatrices
CONTRÔLE CONSTITUTIF
niveau de base de l’initiation de la transcription déterminé par la structure du promoteur.
variabilité dans la séquence consensus du promoteur : modification de l’efficacité du promoteur
Comment la séquence du promoteur affecte l’initiation?
3 hypothèses :
1- de la séquence de la boîte -35 dépend la reconnaissance par la sous-unité
σ et donc le taux de fixation de l’ARN polymérase
2- la transition du promoteur fermé au promoteur ouvert dépend de la boîte à -10
3- la fréquence des initiations avortées (c’est à dire celles qui se terminent de manière prématurée) pourrait dépendre de la séquence au niveau du nucléotide +1 ou immédiatement en aval.
Conséquences de ces variations de séquences
Promoteurs FORTS – FAIBLES : les plus efficaces induisent 1000 fois plus d’initiation productives que les plus faibles
TAUX de BASE : pour un gène donné niveau de transcription pré-programmé par la séquence de son promoteur
Autres types de régulation de l’initiation de la transcription
CONTRÔLE de REGULATION
Principe de base de la régulation de la transcription : (déduit de l’étude de l’opéron lactose)La liaison d’une protéine spécifique à un site donné de l’ADN influence l’ensemble des évènements composant l’assemblage du complexe d’initiationet\ou l’initiation d’une synthèse productive d’ARN par l’ARN polymérase.
LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST NEGATIF :
Répresseur : protéine qui empêche l’expression d’un gène.
Opérateur : site cible de la protéine répresseur.
Lorsque la protéine répresseur se fixe à l’opérateur, l’ARN polyLorsque la protéine répresseur se fixe à l’opérateur, l’ARN polymérasemérasene peut plus initier la transcription ce qui empêche l’expressione peut plus initier la transcription ce qui empêche l’expression du gène.n du gène.
répresseurinducteur
répresseur inactif
REPRIME INDUIT
INDUCTION
En vert : gène régulateurEn bleu : gène structural
Cas du répresseur lac avec l’IPTG p.e.
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CONTRÔLE NEGATIF DE LA TRANSCRIPTION
Répresseur inactifcorépresseur
répresseur actif
REPRIMEINDUIT
REPRESSION
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LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST POSITIF :
Un facteur de transcription doit assister l’ARN polymérase pour l’initiation au niveau du promoteur.
activateur inactifinducteur
activateur actif
REPRIME INDUIT
INDUCTION
Cas de la CRP associée au l’AMPc
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CONTRÔLE POSITIF DE LA TRANSCRIPTION
activateur actifcorépresseur
activateur inactif
REPRIMEINDUIT
REPRESSION
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En résumé
Contrôle négatif : le répresseur inactive la transcriptionContrôle positif : l'activateur active la transcription
Opéron inductible : avec inducteur : activation de la transcriptionOpéron répressible : avec corépresseur : inhibition de la transcription
Exemples de régulateurs positifs :métabolisme de l’arabinose – AraCmétabolisme du maltose – MalTmétabolismes carbonés (opérons gal, lac… ) – CRP
Exemples de régulateurs négatifs :AraCGalR
L’opéron lactose (chez E. coli)un exemple d’opéron inductible négativement régulé
lactose : disaccharide pouvant être utilisé comme source de carbone unique pour la croissance d’E. coli.
L’opéron lac : organisationL’opéron lac : organisation
3510 pb 780 pb 825 pb1040 pb
3 gènes structuraux: z, y & a- codant pour les enzymes impliquées dans le métabolisme du lactose- sont exprimés continuellement à faible taux- sont induits environ 1000 fois quand le lactose est présent- sont modulés par le taux de glucose du milieu
laci : un gène adjacent n’appartenant pas à l’opéron, codant pour le répresseur lac
*
Opéron lactose : quelques détails d’organisation
fonction répresseur β-galactosidase perméase transacétylase
polypeptide
36038000
1021116000
26030000
27530000
aaDa
protéine Tétramère152000
Tétramère500000
Protéine membranaire30000
Dimère 60000 D
a
Expériences de Jacob et Monod : élucidation du fonctionnement de l’opéron lac(1er article : 1960)
François Jacob et Jacques Monod ont pu déduire l’organisation et le fonctionnement de l’opéron lactose en étudiant une série de mutations affectant la synthèse de la β-galactosidase et de la lactose perméase. Les mutations étaient introduites soit dans le chromosome bactérien, soit sur un facteur F plasmidien reproduisant l’opéron.
Les gènes de structure lac sont contigus sur le chromosome d’E. coli.Ces gènes sont associés à des éléments de contrôle.
Prix Nobel de Physiologie & Médecine, 1965 (avec André Lwoff)
Jacques Monod
Lactose Glucose
Lactose Glucose-6P glycolyse
Galactose
Galactose-1P Glucose-1P
Glucose
Croissance d’E. coli sur un mélange de glucose et lactose
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Les enzymes du métabolisme du lactose sont inductibles
Cinétique d’induction de l’activité β-galactosidase chez E. coli
(d’après Cohn, M. J. Bacteriol. (1957) 21, 156)
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Les inducteurs de l’opéron lac
• Lactose, (substrate de l’opéron), converti en son isomère (par transglycosylation), l’allolactose.
• Allolactose, inducteur naturel (ou inducteur physiologique, isomère du lactose).• inducteur gratuit : induit l’opéron mais pas métabolisé.
Par exemple : isopropylthiogalactoside (IPTG)
O
OH
HOOH
OH
OO
HOOH
OH
OH
O
OH
HOOH
O
OH
OHO
HOOH
OHlactose
O
OH
HOOH
SCH
CH3
CH3
OH allolactose
IPTG ou isopropylthiogalactoside
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lacZ
code l’enzyme β-galactosidase dont la forme active est un tétramère d’environ 500kDa
Réaction catalysée : coupe les β-galactosides et libère les sucres qui les constituent
Exemple : le lactose est hydrolysé en glucose et galactose
Equation de la réaction catalysée par la β-galactosidase
*
organisation de l’opéron lac
lacY
code la β-galactoside perméase, une protéine de 30kDa liée à la membrane (protéine transmembranaire); elle transporte les β-galactosides dans la cellule
La lactose perméase :
- utilise le gradient de protons à travers la membrane de la cellule bactérienne pour co-transporter H+ et le lactose (le gradient de protons résulte du métabolisme oxydatif)
- présente 2 états conformationnels principaux : E-1 : caractérisé par un site de liaison de faible affinité pour le lactose,
orienté vers l’intérieur de la celluleE-2 : caractérisé par un site de liaison à haute affinité pour le lactose,
orienté vers l’extérieur de la cellule.
Structure de la β-galactoside perméase
organisation de l’opéron lac
Abramson J, Smirnova I, Kasho V, Verner G, Kaback HR, Iwata S. Science. 2003 301(5633):610-5 Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli.
protéine monomérique enchassée dans la membrane(12 hélices α transmembranaires)
lactose
Ext. Int.
Membrane
H+ + lactoseE2 E1
H+
E2-H+-lactose E1-H+-lactose
CYCLE de TRANSPORT
*
organisation de l’opéron lac
lacA
code la β-galactoside transacétylase, une enzyme qui transfère un groupement acétylede l’acétyl-CoA aux β-galactosides (comme l’IPTG).
Le métabolisme du lactose ne nécessitant pas de thiogalactoside transacétylase, le rôle physiologique de cette enzyme demeure inconnu.
Les mutants de l’opéron lac
Analyse génétique de l’opéron
Quels sont les éléments essentiels du système de régulation ?
*
Le répresseur ACTIF ne peut se fixerà l’opérateur mutant Oc
lacI promoteur/opérateur lacZ lacY lacA
Opérateur MUTANT Oc
L’opéron est transcrit puis traduit
lacI- promoteur/opérateur lacZ lacY lacA
Le gène lacI- commande la synthèse d’un répresseur défectueuxqui ne se fixe pas à l’ADN.
L’opéron est transcrit puis traduit
Utilisation de diploïdes partiels
Conjugaison : transfert de matérielgénétique
F-pilus
(1)
(2)
(3)
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lacI-
promoteur/opérateur
Le gène lacI- conduit à la synthèse d’un répresseur qui ne se fixe pas à l’ADN.
lacZ lacY lacA
lacI+
Le gène lacI+ conduit à la synthèse d’un répresseur de type sauvage qui se fixe à l’opérateur
L’inducteur déplace le répresseur de type sauvage de l’opérateur
Le gène lacIs conduit à la synthèse d’un répresseur qui ne peut fixer l’inducteur; il est donc fixer en permanence à l’opérateur
lacIs lacZ lacY lacApromoteur/opérateur
lacI+
Le répresseur de type sauvage n’influence pas la liaison à l’ADN du répresseur lacIs
Les mutations non inductibles lacIs sont dominantes
Les mutations de l’opérateur sont constitutives, car le promoteur est incapable de fixer la protéine répresseur;Ceci permet à l’ARN polymérase d’avoir libre accès au promoteur.Les mutations Oc agissent en cis, car elles ne touchent que les gènes structuraux qui leur sont contigus.
mutations Oc
Les mutations qui inactivent le gène lacI entraînent l’expression constitutive de l’opéron, car la protéine du répresseur mutant ne peut plus se fixer sur l’opérateur.
Les mutations constitutives du gène lacI sont récessives.
Les mutations non inductibles lacIS sont dominantes.
mutations du type lacI-
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