correccion de mitocoxinas1

MICOTOXINASEl reto de controlarlas

AFPA

OCH3

OCH3

REYES DE LA CRUZ VILMA JULIA CUSTODIO VILLANUEVA MARA

REVISIN IDIOMTICA: - Silvia Catalina Custodio Villanueva Licenciada en Lengua y Literatura Universidad Nacional de Trujillo Maestra en Gestin y Docencia Educativa Universidad Csar Vallejo de Trujillo

REVISIN TCNICA: - Gilberto Torres Surez Ingeniero agrnomo Universidad Nacional del Centro del Per Fitopatologo Universidad Nacional Agraria La Molina

PRLOGO

Las autoras del libro MICOTOXINAS, EL RETO DE CONTROLARLAS, Vilma Julia Reyes De la Cruz y Mara Custodio Villanueva, Investigadoras de la Universidad Nacional del Centro del Per, brindan esta obra, con el objetivo de dar a conocer y difundir, aspectos importantes relacionados a las micotoxinas, productos del metabolismo fngico; las cuales mediante los alimentos podran llegar a organismos susceptibles y afectar su salud. En la elaboracin de este libro, las autoras han utilizado informacin obtenida de referencias bibliogrficas nacionales e internacionales, as como su anlisis crtico. Por lo que, resulta un material de consulta muy valioso para aquellos interesados en este tema especfico. En la obra expresan, con sencillez y claridad, conocimientos slidos sobre las micotoxinas, y no slo constituye una fuente de informacin, sino tambin, de motivacin para desarrollar investigaciones cientficas futuras en esta rea. Las autoras describen aspectos importantes sobre las diversas caractersticas de los hongos toxignicos ms comunes y las micotoxinas que producen, las propiedades qumicas de estos metabolitos fngicos, sus efectos perjudiciales e implicancias en la seguridad alimentaria, as como, los diversos factores que afectan el crecimiento de los hongos y la produccin de micotoxinas. Tambin abordan los principales mtodos de deteccin de micotoxinas, desde el muestreo hasta su identificacin, y el control de las micotoxinas incluyendo la regulacin, la prevencin de la produccin de

micotoxinas y la detoxificacin de estos metabolitos de importancia en salud pblica. Los lectores del libro, hallarn respuesta a muchas de sus diversas inquietudes relacionadas a las micotoxinas y fcilmente descubrirn en su contenido, aquello que se conoce sobre estos metabolitos fngicos, y lo que an falta por conocer. No todo est hecho y dicho, an falta mucho por investigar y conocer. Ser el lector acucioso, inquieto y creativo, quien emprenda nuevas investigaciones para ampliar los conocimientos en el rea micotxica. Las autoras de este libro deben sentirse satisfechas de la gran contribucin que brindan a los numerosos estudiantes, profesionales y tcnicos, de las ciencias biolgicas, agropecuarias, alimentarias y de la salud en general; quienes obtendrn conocimientos especficos, de utilidad en sus diversas actividades acadmicas, cientficas y tecnolgicas. M. Sc. Santos Nlida Murga Gutirrez Profesora Principal Doctorado en Ciencias Biomdicas Departamento Microbiologa y Parasitologa Facultad de Ciencias Biolgicas Universidad Nacional de Trujillo Miembro activo de: Asociacin Peruana de Microbiologa Asociacin Latinoamericana de Micologa Asociacin Peruana de Fitopatologa

NDICE DE CONTENIDO

Pgina NDICE DE CUADROS NDICE DE FIGURAS INTRODUCCIN I. HONGOS TOXIGNICOS 1. Aspergillus sp. 1.1. Aspergillus flavus y parasiticus 1.2. Aspergillus ochraceus 1.3. Aspergillus versicolor 2. Penicillium sp. 2.1. Penicillium citrinum 2.2. Penicillium crustosum 2.3. Penicillium islandicum 2.4. Penicillium verrucosum 3. Fusarium sp. 3.1. Fusarium equiseti 3.2. Fusarium graminearum 3.3. Fusarium moniliforme 3.4. Fusarium sporotrichioides II. LAS MICOTOXINAS EN LOS ALIMENTOS 1. Principales micotoxinas y hongos que lo producen i ii iii

2. Investigacin de micotoxinas en los alimentos 3. Propiedades qumicas de las micotoxinas 3.1. Propiedades qumicas de las aflatoxinas 3.1. Propiedades qumicas de las ocratoxinas 3.2. Metabolismo de la aflatoxina B1 en el hgado III. FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO FUNGAL Y PRODUCCIN DE MICOTOXINAS 1. Factores que afectan el crecimiento fungal 1.1. Ingredientes 1.2. Conservantes 1.3. Actividad de agua 1.4. Temperatura 1.5. Oxgeno 1.6. pH 2. Factores que afectan el desarrollo y produccin de micotoxinas 2.1. Factores fsicos 2.2. Factores qumicos 2.3. Factores biolgicos 3. Factores de crecimiento fungal y produccin de micotoxinas de los principales hongos toxignicos 3.1. Aspergillus sp. 3.2. Penicillum sp. 3.3. Fusarium sp. IV. EFECTOS TXICOS DE LAS MICOTOXINAS 1. Toxicidad de las micotoxinas 2. Bioterrorismo 3. Implicancia en la seguridad alimentaria

V. PRINCIPALES MTODOS DE DETECCIN DE MICOTOXINAS 1. Mtodo de anlisis qumico de micotoxinas 1.1. Muestreo 1.2. Extraccin 1.3. Clarificacin (clean up) 1.4. Concentracin 1.5. Separacin de componentes del extracto 1.6. Deteccin y determinacin 1.7. Confirmacin de identidad 2. Mtodo de inmunoensayo enzimtico 2.1. Procedimiento 3. Resultados 4. Investigaciones sobre los mtodos de deteccin de micotoxinas VI. CONTROL DE LAS MICOTOXINAS 1. Regulacin 1.1. Aflatoxinas B1, B2, G1, G2 en alimento humano 1.2. Aflatoxina M1 en alimento humano 1.3. Aflatoxinas en alimento animal 1.4. Otras micotoxinas 2. Prevencin de formacin de micotoxinas 2.1. Estrategias de produccin a travs de la planta hospedera 2.2. Prcticas agronmicas 2.3. Medidas postcosecha 2.4. Agentes antifungales 2.5. Programas de seleccin y diversificacin 3. Decontaminacin de micotoxinas 3.1. Inactivacin trmica 3.2. Irradiacin 3.3. Extraccin con solventes

3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8.

Tratamiento con enzimas Compuestos qumicos Adsorbentes Amonicacin Ozonizacin

4. Control de factores combinados 5. Control biolgico 6. Estrategias de control de micotoxinas en la cadena alimentaria 6.1. Buenas prcticas agrcolas (BPA) 6.2. Buenas prcticas de manufactura (BPM) 6.3. Anlisis de riesgos y control de puntos crticos (HACCP) 7. Conclusiones VII. VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS APNDICE

NDICE DE CUADROSN TTULO

01. Principales micotoxinas y hongos que lo producen 02. Principales productos que se han encontrado contaminados con micotoxinas 03. Propiedades fsicas y qumicas de algunas aflatoxinas y sus metabolitos 04. Propiedades fsicas y qumicas de algunas ocratoxinas 05. Efectos inhibitorios de componentes de especies en el crecimiento de hongos toxignicos 06. Concentracin mnima inhibitoria (MIC) de conservantes 07. Temperatura y Aw para el desarrollo de algunos mohos y para la produccin de micotoxinas 08. Lmites de crecimiento y de produccin de aflatoxina por A. flavus y A. parasiticus 09. Lmites de crecimiento y produccin de ocratoxina por A. ochraceus 10. Lmites de crecimiento y produccin de toxina por P. citrinum

11. Lmites de crecimiento y produccin de toxina por P. crustosum 12. Lmites de crecimiento y produccin de toxina por P. islandicum 13. Lmites de crecimiento y produccin de toxina por P. verrucosum 14. Lmites de crecimiento y produccin de toxina por F. equiseti 15. Lmites de crecimiento y produccin de toxina por F. graminearum 16. Lmites de crecimiento y produccin de toxina por F. moniliforme 17. Lmites de crecimiento y produccin de toxina por F. esporotrichoides 18. Efectos de las micotoxinas sobre los rganos 19. Regulaciones de micotoxinas en alimento humano y animal 20. Porcentaje de adsorcin final de Mycosorb frente a diferentes micotoxinas

NDICE DE FIGURASN TTULO

01. Estructura qumica de las aflatoxinas y morfologa de los hongos que las produce 02. E s t r u c t u r a q u m i c a d e l a o c r a t o x i n a , esterigmatocistina, patulina y morfologa de los hongos que las produce 03. Estructura qumica de la citrinina, moniliformina, zearalenona, fumonisina y morfologa de los hongos que lo producen 04. Condiciones de actividad de agua y temperatura favorable para el crecimiento y produccin de micotoxinas por hongos 05. Visin general de las rutas de biotransformacin para aflatoxina B1 06. Poblacin y dos tipos de lotes 07. Muestra y muestreo 08. Submuestra para anlisis

INTRODUCCIN

Se ha probado actualmente que las micotoxinas son contaminantes naturales; metabolitos secundarios producidos por especies fungales, los cuales contaminan los alimentos distribuidos a nivel mundial, especialmente en cereales, nueces y frutas, causando intoxicacin aguda, crnica, mutgena y teratognica, a los consumidores a mediano y largo plazo. Existen miles de metabolitos pero pocos presentan retos significativos en la seguridad alimentaria. La flora fngica natural, asociada a los alimentos, es determinada principalmente por tres gneros Aspergillus, Penicillium y Fusarium. Por otro lado existen muchos trabajos de investigacin publicados a nivel nacional e internacional, que an no se conocen. En nuestro pas debido a la poca difusin o diferente idioma en el que se publican; sin embargo, muestran la importancia, la regulacin, los mtodos y el control de las micotoxinas que en este libro trataremos con amplitud. Tambin es importante mencionar que aunque existan mtodos de detoxificacin, es mejor prevenir el crecimiento de hongos y produccin de micotoxinas en plantas y animales que servirn posteriormente para consumo. Por lo tanto, controlar la cadena alimentaria a travs de programas de prevencin es una estrategia posible para establecer productos certificados. Creemos que este volumen contribuir significativamente a conocer nuevos temas relevantes en esta rea de investigacin y que servirn para mejorar la industria de alimentos. Las Autoras.

MICOTOXINAS, EL RETO DE CONTROLARLAS

I. HONGOS TOXIGNICOS Algunos hongos toxignicos tienen una evidente relacin ecolgica con las provisiones de alimentos humanos. La flora fngica natural que coexiste con la produccin de alimentos est denominada por tres gneros: Aspergillus, Fusarium y Penicillium (79). Los hongos son pequeos organismos productores de esporas, generalmente microscpicos, eucariticos, ramificados y, a menudo, filamentosos que carecen de clorofila y que tienen paredes celulares que contienen quitina, celulosa o ambos componentes (4). Son denominados mohos y estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y se conforman de filamentos que se desarrollan principalmente en la punta por extensin de la clula terminal, cada filamento conocido como hifa, es un tubo multinucleado que contiene citoplasma (cenoctico o septado)(25). Las especies de Fusarium son organismos patgenos destructores de las cosechas de cereales y de otros productos y producen micotoxinas antes de la cosecha o inmediatamente despus de la misma. Determinadas especies de Aspergillus y de Penicillium tambin son patgenos vegetales o comensales, aunque estos gneros estn relacionados habitualmente con los productos y con los alimentos tanto durante la desecacin como durante el almacenamiento (79). Aspergillus, Fusarium y Penicillium estn clasificados en el subreino fngico Deuteromicotina, cuya produccin es por esporas producidas asexualmente, conocidas como conidios y en la clase hyphomycetales, cuyos conidios se forman en algn tipo de estructura de fructificacin area sencilla. En estos tres gneros, los conidios se forman a partir de las clulas especializadas (filides), en las que tiene lugar la mitosis, y a partir de los cuales se generan los conidios (79). En Aspergillus y Penicillium, las filides estn agrupadas; los- 15 -


conidios son los ms o menos esfricos y muy pequeos, no sobrepasando generalmente las 5 m de dimetro. En Aspergillius, las filides siempre estn agrupadas apretadamente alrededor de los pices hinchados (vesculas) de tallos largos(estipes) con o sin una fila intermedia de clulas de sostn(mtulas), mientras que en Penicillium las filides suelen nacer en agrupaciones parecidas a los dedos de la mano, en estipes ms diminutas, tambin con o sin una o dos filas de clulas intermedias de sostn (mtulas y ramos) (129,128). En Fusarium, las filides no estn agrupadas y los conidios pueden ser de dos tipos: pluricelulares (macroconidias) y unicelulares (microconidias). Lo caracterstico del primer tipo son grandes y de forma creciente , mientras que los del segundo, que se producen nicamente en algunas especies, son pequeos y generalmente cilndricos (129). 1. Aspergillus sp. Segn Pitt y Hocking (129), las especies de Aspergillus son muy corrientes en el medio ambiente, principalmente en los suelos y en la vegetacin en estado de descomposicin, as como en los alimentos, de modo especial, en los cereales y en las nueces. Eaton (54) tambin menciona que los inculos de A. flavus pueden encontrarse en el suelo, aire y en los vectores (insectos) y stos pueden ser conidias, micelios, esclerotia o combinaciones de ellos. 1.1. Aspergillus flavus y A. parasiticus A. flavus y A. parasiticus fueron clasificados por Raper y Fennell (136) como pertenecientes al grupo de Aspergillus flavus, trmino incorrecto sustituido en la actualidad por el trmino correcto Aspergillus Divisin Flavi (67). A. flavus y A. parasiticus estn emparentados con A. oryzae y con A. sojae, especies que son importantes en la fabricacin de alimentos fermentados,- 16 -


en Asia; pero no producen aflatoxinas(79). Recuento e identificacin: El recuento satisfactorio de A. flavus y A. parasticus se puede conseguir en cualquier medio antibacteriano con inhibidores para reducir la dispersin. Se recomiendan los medios: Agar Diclorn Rosa Bengala Cloranfenicol (DRBC) (85) o Agar Dicloran Glicerol al 18% (DG18) (75,144) y tambin el agar extracto de malta (MEA) (103), las colonias crecen con rapidez relativa, medianamente profundas, de color verde-amarillo y que presentan estructuras de fructificacin (parecidas a mechones) observadas con el estereomicroscopio y pueden ser contadas como A. flavus y A. parasiticus. El medio ms eficaz para su confirmacin e identificacin de estas especies es el Agar Aspergillus flavus y parasiticus (AFPA)(129). El AFPA tiene dos ventajas principales: el recuento se puede realizar despus de una incubacin de 2 das a 30 C y ambas especies se identifican fcilmente por la presencia de colores intensos naranja-amarillos en el reverso de las colonias, (157). Diferenciar A. flavus de A. parasiticus resulta ms difcil. Las paredes de los conidios de A. flavus generalmente son desde lisas a finamente rugosas, mientras que las de A. parasiticus son claramente rugosas cuando se observan con una amplificacin de 1000 aumentos(86). La diferenciacin de estas dos especies tiene importancia: A. flavus generalmente produce slo aflatoxinas B y menos del 50% de los aislamientos son toxignicos, mientras que A. parasiticus elaboran aflatoxinas G, as como aflatoxinas B, e invariablemente son toxignicos (86). A. flavus tambin produce con frecuencia otra- 17 -


micotoxina, el cido ciclopiaznico (CPA), pero A. Parasticus no produce CPA. 1.2. Aspergillus ochraceus A. ochraceus es la especie que con mayor frecuencia se encuentra en el grupo Aspergillus ochraceus de Raper y Fennell (136). En la actualidad denominado correctamente Divisin Circumdati del gnero Aspergillus (67). Recuento e identificacin Como especie xerfila, A. ochraceus crece lentamente en los medios de actividad de agua (Aw) elevada. Se recomienda el recuento en un medio de Aw reducida, ejemplo DG18 (129,144). Las colonias de A. ochraceus pueden ser identificadas por los siguientes caracteres: colonias relativamente profundas de color, desde uniformemente pardos claro a amarillo-pardo, que observadas al esteromicroscopio de pocos aumentos revelan estpetes largas que sostienen las cabezas radiadas de Aspergillus, dividindose las cadenas de esporas en 2 3 columnas compactas a medida que transcurre el tiempo, frecuentemente el recuento satisfactorio se debe hacer en los medios selectivos como el DRBC (84). A. ochraceus productora de ochratoxina crece con lentitud mediana en los medios de identificacin clsicos, tales como : CYA y MEA. Las colonias son profundas pero no muy compactas y de color desde pardo claro a amarillo-pardo, las estpites son largas, las cabezas grandes, las vesculas esfricas y las mtulas y filides apretadas compactamente. Los conidios son pequeos, de color pardo claro y su pared es lisa (136,86).- 18 -


A. ochraceus produce dos toxinas principales: ocratoxina A y cido peniclico. La ocratoxina A se produce a temperaturas bastante elevadas, de modo ptimo a 25-30 C , mientras que el cido peniclico se produce a bajas temperaturas, de modo ptimo a 10-20 C. 1.3. Aspergillus versicolor Se encuentra comnmente en los alimentos desecados. Esta especie es la principal productora de la micotoxina esterigmatocistina, una dihidrodifuranoxantona cancergena, que es precursora de las aflatoxinas (38). En la actualidad, A. versicolor, la especie ms importante del grupo Aspergillus versicolor de Raper y Fennell (1965), se clasifica correctamente en la Divisin Versicolores del gnero Aspergillus (67). Recuento e identificacin Como especie Xerfila, A. versicolor crece lentamente en los medios micolgicos ordinarios y slo una parte de los aislamientos crece a 37 C. Se recomienda el recuento en un medio de Aw reducida, por ejemplo en el medio DG18 (75). Unas colonias pequeas gris-verdes que muestran colores rojizos oscuros en el exudado o en el reverso y que muestran las cabezas parecidas a mechones, caractersticas de Aspergillus, son indicativas de A. versicolor. Las colonias que crecen lentamente, bajas, compactas y verdes en el medio CYA o en el medio MEA son caractersticas de A.versicolor, pero tambin lo son de otras varias especies de Aspergillus y de Penicillium. Las gotas rojizas de exudado y los colores naranja o rojizopardo del reverso en el medio CYA son ms- 19 -


caractersticas. Microscpicamente, A. versicolor se distingue por las estpites relativamente cortas con paredes gruesas de color amarillo, por las vesculas que generalmente son elipsoidales, en vez de esfricas; que poseen mtulas y filides slo en los dos tercios superiores. Los conidios son muy pequeos (2-2,5 um de dimetro), su pared es lisa y de color verde claro (134,129,86). La especie emparentada A. sydowii tiene algunas caractersticas en comn con A. versicolor, pero las colonias son de color azul en vez de gris-verde. A. sydowii no produce ninguna micotoxina de importancia. 2. Penicillium sp. En el gnero Penicillium, la clasificacin se basa principalmente en la morfologa microscpica; el gnero se divide en subgneros basados en el nmero y disposicin de las filides, en las clulas del pednculo principal (estpites). La clasificacin de Pitt (127) incluye cuatro subgneros: Aspergilloides, en el que las filides se sostienen directamente en los estpites; Furcatum y Biverticillium, en los que las filides son sostenidas por las mtulas; y Penicillium en el que suele haber tanto mtulas como ramos. La mayora de las especies toxignicas importantes y las responsables de la alteracin de los alimentos se encuentra en el subgnero Penicillium. 2.1. Penicillium citrinum Clasificado en el subgnero Furcatum Divisin Furcatum (127), P. citrinum. Recuento e identificacin El rasgo distintivo ms caracterstico de P. citrinum es su- 20 -


penicilio, que est formado por un ramillete de tres a cinco mtulas divergentes, generalmente, engrosadas apicalmente. Observadas con un estereomicroscopio, las filides que salen de cada una de las mtulas suelen sostener conidios tan largos como una columna larga. Las colonias de esta especie, en los medios CYA y MEA, son de tamao mediano (25-30 mm y 14-18 mm respectivamente). Normalmente, el crecimiento tiene lugar a 37C, pero las colonias rara vez sobrepasan los 10 mm despus de 7 das (79). 2.2. Penicillium crustosum Fue clasificado como P. verrucosum variedad cyclopium (143) Recuento e identificacin P. crustosum crece con relativa rapidez, por lo que, el recuento se realiza mejor utilizando un medio moderno que contenga inhibidores de la expansin de las colonias como el DRBC (129). Para identificarlos: Produce penicilios grandes con los ramos, mtulas y filides caractersticos de este subgnero. Es una de las especies de la Divisin Penicillium dotadas de crecimiento ms rpido que produce colonias de color verde apagado con una textura granulosa tanto en el medio CYA como en el medio MEA. P. crustosum se caracteriza por poseer estpites grandes de pared rugosa y conidios de pared lisa, generalmente esfricos. Sin embargo, el rasgo distintivo ms caracterstico de los aislamientos tpicos es la produccin de cantidades enormes de conidios en el medio MEA, que se desprenden de la colonia cuando se sacude la placa de petri (79).- 21 -


2.3. Penicillium islandicum Es un representante del subgnero Biverticillium de Penicillium, que se caracteriza por la produccin de penicilios con ms mtulas cnicas unidas, con mtulas y filides de longitud aproximadamente igual y filides puntiagudas (127,128). Recuento e identificacin: Los medios DRBC y DG18, probablemente son eficaces para identificarlos (129). Entre las especies que producen el tipo de Penicillium caracterstico del subgnero Biverticillium, P. islandicum se puede diferenciar fcilmente, por la formacin de colonias compactas de crecimiento lento, que son desde naranja brillante a pardas tanto en el micelio como en el reverso. Las colonias suelen ser similares a 25C y 37C. Los conidios son generalmente azules (79). 2.4. Penicillium verrucosum P. verrucosum est clasificado en el subgnero Penicillium que incluye varias especies micotoxignicas que se encuentran en los alimentos (127). Recuento e identificacin El agar diclorn rosa bengala extracto de levadura sacarosa (DRYS) es un medio selectivo para el recuento de P. verrucosum y de P. viridicatum. P. verrucosum produce una coloracin violeta-parda en el reverso del medio (64). El aislamiento y la identificacin de P. verrucosum en cultivo puro son esenciales para la confirmacin.- 22 -


P. verrucosum se distingue por el crecimiento lento en los medios CYA y MEA a 25C (17-24 mm y 10-20 mm despus de 7 das, respectivamente); (130), por los conidios de color verde intenso, por el exudado desde transparente a amarillo claro y por las estpites rugosas (128). Por su aspecto general es similar a la especie P. viridicatum de la que se diferencia muy claramente por el crecimiento ms lento; a la especie P. solitum, de la que se diferencia por tener conidios amarillo-verdes, en vez de verde oscuros. 3. Fusarium sp. Como consecuencia de los diversos sistemas taxonmicos utilizados o como consecuencia de una identificacin incorrecta a los aislamientos de Fusarium que producen una determinada toxina les han sido asignadas denominaciones diferentes. Marasas y col (93) estudiaron ms de 200 aislamientos de Fusarium toxignicos y dieron informacin puntual sobre la identificacin de las especies y las toxinas producidas (79). Se ha reportado el desarrollo de un medio selectivo de aislamiento de especies de Fusarium de campos de esprrago Agar miclobutanil (MBA) en Canad (168). Se consideran cuatro especies ms importantes en la salud humana: F. equiseti, F. graminearum, F. moniliforme y F. sporotrichioides (23,79). Actualmente se realizan trabajos con el fin de determinar la capacidad de transmisin de Fusarium, de la semilla a la progenie, obtenindose, en resultados preliminares, alto porcentaje de transmisin. Las plantas que se originan de semillas enfermas, sembradas en tierra estril, manifiestan los sntomas tpicos de la enfermedad, en plantas en diferentes estados de desarrollo (154).

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3.1. Fusarium equiseti Especie fngica de amplio espectro, patgeno de plantas, de distribucin amplia y saprofita del suelo. F. equiseti tiene una asociacin continua con la enfermedad animal. La implicancia en la leucemia humana parece posible (93). Gran parte de la bibliografa antigua sobre F. equiseti emplea denominaciones tales como F. roseum: F. roseum gibbosum, F. roseum avenaceum, F. roseum culmorum o F. roseum equiseti. En la actualidad resulta imposible determinar cul de las denominaciones que se emplean se refiere realmente a F. equiseti (93). Recuento e identificacin: Las colonias de F. equiseti en agar extracto de levadura Czapek (CYA) , en agar extracto malta (MEA) y en PDA generalmente cubren una placa petri completa, mientras que en DCPA, las colonias son ms pequeas. El micelio y el reverso de las colonias son blancos o de color desde salmn claro a pardo. Los macroconidios estn curvados de modos diferentes; no producen microconidios (79). 3.2. Fusarium graminearum Fusarium graminearum se incluye en la Divisin Discolor. La especie tiene un telemorfo(estado sexual) perfectamente identificado, Gibberella zeae, cuyos informes son frecuentes en la bibliografa. En Australia se han encontrado dos biotipos muy diferentes de esta especie. El grupo I de F. graminearum, que causa la putrefaccin en la corona del trigo, produce el estado de Gibberella slo cuando los aislamientos estn acoplados en parejas compatibles. Sin embargo, el grupo- 24 -


II de F. graminearum que causa enfermedades en las partes areas y en los granos de los cereales, forma con facilidad el estado de Gibberella en el cultivo de un aislamiento nico (y de una espora nica) (28). Aqu la denominacin F. roseum ha causado gran confusin en relacin con el F. graminearum. Recuento e identificacin Las colonias de F. graminearum cubren una placa petri cuando crecen en los medios CYA, MEA o PDA durante 7 das; las colonias en el medio DCPA son algo ms pequeas. En los medios CYA y MEA, las colonias son velludas, de tintes cambiantes o suaves de color rojogrisseo o amarillo. En el medio PDA, las colonias generalmente son de colores intensos, con micelios desde compactos a velludos de un color desde rosa-grisseo a pardo-oscuro y un reverso de color encarnado oscuro, mientras que, en el medio DCRA, el aspecto de las colonias est dominado por racimos (esporodoquio) de macroconidios de color desde salmn a naranja, con frecuencia, dispuestos en forma de anillos concntricos. Los macroconidios son relativamente rectos y su pared es gruesa, con una clula basal en forma de pie; no producen microconidios (79). 3.3. Fusarium moniliforme Fusarium moniliforme ha causado la leucoencefalomalacia (LEM) equina. Esta enfermedad est asociada al maz. F. moniliforme tambin causa intoxicacin por vainas de judas enmohecidas de caballos, en Japn; el anormal desarrollo de los huesos o raquitismo en los pollos y en los cerdos, en los EE.UU, y el elevado cncer esofgico (93).- 25 -


Recuento e identificacin Las colonias de F. moniliforme en PDA son blancas y a veces estn teidas de color morado. Los macroconidios pueden tener una ligera forma de hoz o ser casi rectos. Los microconidios son abundantes, generalmente son unicelulares de elipsoidales a claviformes con una base aplanada y estn dispuestos en cadenas largas. 3.4. Fusarium sporotrichioides Fusarium sporotrichioides causa aleukia txica alimentaria (ATA)(100). F. sporotrichioides est clasificada en el gnero Fusarium Divisin Sporotrichiella. En la actualidad es una especie perfectamente definida (114). Sin embargo, algunos lo identifican como F. tricinctum sensu stricto es una especie de baja toxicidad (93). Recuento e identificacin Las colonias de F. sporotrichioides crecen con rapidez en los medios CYA, MEA, PDA o DCPA, y son profundas y velludas; el micelio es de color rosa claro o de color salmn y el reverso, en el medio PDA, es de rosa-grisceo a color vino de Borgoa. En el medio DCPA, los macroconidios y los microconidios son abundantes: los microconidios son tanto fusiformes como piriformes y nacen en filides con ms de un poro frtil.

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II. LAS MICOTOXINAS EN LOS ALIMENTOS 1. Principales micotoxinas y hongos que las producen Las Micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por Hongos, que son dainos para el hombre y los animales. Estos hongos pueden ser patgenos o saprofitos, y pueden contaminar los alimentos durante la produccin, procesamiento, transporte o almacenamiento. As, la materia prima o alimento procesado pueden estar contaminados (174) con algunas micotoxinas mostradas en el cuadro 01. 2. Investigacin de micotoxinas en los alimentos La incidencia de micotoxinas varia entre productos, segn las condiciones climticas y regiones. La contaminacin secundaria de productos animales puede resultar del consumo, por el animal, de alimentos contaminados con micotoxinas. La micotoxicosis humana, de considerable importancia, se debe a aflatoxinas y ocratoxinas, que son considerados carcinognicos, y otras micotoxinas de Fusarium (78). A. flavus tiene alta afinidad por las nueces y por las semillas oleaginosas. Los cereales tambin son un sustrato corriente para el crecimiento de A. flavus y es casi siempre, consecuencia de una manipulacin defectuosa. Los niveles de aflatoxina en los granos de tamao pequeo, rara vez son importantes (153). Las especias a veces contienen A. flavus (129) y sus recuentos de viables pueden ser muy elevados. Sin embargo, las cantidades de especias que se consumen son tan insignificantes, que la presencia de aflatoxina no parece ser un peligro real. Los impactos econmicos debido a micotoxinas son las prdidas en la cosecha directa y almacenamiento, a travs de reduccin de eficiencia de produccin, programas de regulacin y gastos en diagnstico y procesamiento. Los- 27 -


Cuadro 01: Principales micotoxinas y hongos que las producenMICOTOXINA AFLATOXINA B1, B2, G1, G2 STERIGMATOCISTINA GENERO Y ESPECIE PRODUCTORES

Grupo Aspergillus flavus (A.flavus), A. parasiticus Grupo Aspergillus versicolor, grupo A. nidulans y Emericella spp., grupo A. glaucus y Eurotium ssp., grupo A. ustus Grupo Aspergillus ochraceus (A. ochraceus, A. alliaceus, A. malleus, A. sclerotiorum, A. sulphureus), Penicillum verrucosum, P. purpurescens Penicillum expansum, P. griseofulvum, P. vulpinum, P. roquefortii, Aspergillus clavatus, A. giganteus, A. terreus Grupo Aspergillus terreus, grupo A. flavipes, Penicillum citrinum, P. verrucosum, P. expansum Grupo Aspergillus ochraceus, Penicillum simplicissimum, P. aurantiogriseum, P. fennelliae Aspergillus flavus, A. tamarii, Penicillum commune, P. cammembertii, P. veridicatum, P. chrysogenum, P. crustosum, P. griseofulvum, P. hirsutum. Fusarium graminearum, F. culmorum, F. sporotrichioides, F. poae, F. semitectum, F. acminatum, F. sambucinum, F. crookwellense, F. equisiti, Myrothecium rorium, M. verrucaria, Trichotecium roseum, Stachybotrys atra. F. graminearum, F. culmorum, F. crookwellense, F. semitectum, F. equisiti, F. sambucinum, F. oxysporum Fusarium moniliforme, F. poliferatum Alternaria alternata, A. Solani A. alternata, A. citrii, A. kikuchiana, A. mali, A. tenuissima, Phoma sorghina, Pyricularia oryzae Claviceps purpurea, C . fusiformis, C. paspali

OCRATOXINA A

PATULINA

CITRININA CIDO PENICLICO CIDO CICLOPIAZNICO TRICOTECENOS -DEOXINIVALENOL -NIVALENOL -T-2 TOXINA, -DIACETOXISCIRPEROL -SATRATOXINAS G y H ZEARALENONA

FUMONICINA B1 , B2 ALTERNARIOL Y SU METIL ESTER CIDO TENUAZNICO ERGOTALCALOIDE

Fuente: JICA, 1998 (80)- 28 -


costos elevados resultantes de productos contaminados con micotoxinas tienen efectos directos e indirectos en el comercio internacional de productos y alimentos procesados (174). Sin embargo, el uso de sustancias qumicas agrcolas, agentes antifungales y conservantes para prevenir el crecimiento de hongos y bacterias en alimentos son estrictamente controlados por las leyes en cada pas (80). Se han realizado muchos trabajos de investigacin a nivel mundial, desde hace ms de 20 aos, respecto a micotoxinas en los Alimentos, algunos ejemplos son: 2.1 Aflatoxina B1 aislada de alimento balanceado de aves y sus efecto micotxico en pollos tipo Broiler Gallus domesticus var. Ross El efecto de la aflatoxina B1 en los pollos Broilers fueron necrosis, infiltracin grasa e hiperplasia de los conductos biliares en el hgado y vescula biliar)(8). 2.2 Evaluacin de Aflatoxina B1 en maz del departamento del Meta En las muestras de maz provenientes del Meta se encontr alta incidencia de contaminacin con Aflatoxina B1, de las cuales el 11,7% contenan 20 ppb y cerca del 30% contenan 100 ppb. La contaminacin empez desde las fincas hasta la etapa de almacenamiento y/o comercializacin (30). 2.3 Screening and Quantitation of Ochratoxin A in corn peanuts, beans, rice and cassava Se ha desarrollado un mtodo de observacin y cuantificacin de ocratoxina A. Se ha usado un mtodo de extraccin con metanol-KCl acuoso, seguido de un agente clarificante y particin con cloroformo. Parte del- 29 -


extracto de cloroformo se ha usado para observar y la otra parte para cuantificar por TLC. Los lmites de deteccin son 80 ppb (screening) y 10 ppb (cuantificacin). La observacin toma 40 minutos usando una minicolumna de xido de aluminio/silicagel, desarrollado para este propsito. El sulfato de amonio result eficiente para clarificar muestras de maz y casaba; el sulfato cprico, para man, habas y arroz (166). 2.4 Deteccin rpida de hongos aflatoxignicos en harinas y alimentos balanceados para animales El medio agar coco con oxitetraciclina permiti la deteccin rpida de hongos aflatoxignicos al exponerse el reverso de la placa bajo luz UV de 365 nm (163) . 2.5 Determinacin de aflatoxinas en harinas de maz y trigo en los mercados mayorista, 3 de Febrero y Caquet Se ha evaluado 45 muestras, de tres mercados de Lima, de los cuales 24,5% presentaron contaminacin con aflatoxinas. El grano que present mayor contaminacin fue el arroz, con 5 muestras. El mercado 3 de Febrero presenta el mayor porcentaje de muestras contaminadas (11.11%) sobrepasando los lmites de la OMS (32). 2.6 Natural co-ocurrence of aflatoxins and Fusarium mycotoxins (fumonisins deoxynivalenol, nivalenol and zearalenone in corn from Indonesia Fueron recolectadas y analizadas 17 muestras de maz de Indonesia, usando HPLC y GC. 61% de las muestras fueron contaminados con aflatoxinas, con un nivel de 119 ng/g. En todas la muestras se han detectado fumonisina, con un nivel promedio de 895 ng/g. En 12% de las muestras se ha detectado deoxinivalenol, nivalenol y zearalenona, con 21-32 ng/g, 49-169 ng/g y 11-12 ng/g- 30 -


respectivamente (9). 2.7 Riesgos de contaminacin con aflatoxinas en man (Arachis hipogaea) de produccin nacional. Se analizaron 38 muestras de man crudo, mediante el mtodo inmuno enzimtico (ELISA) competitivo directo. El 82% de las muestras present contaminacin con aflatoxinas totales (B1 + B2 + G1 + G2). La concentracin de aflatoxinas se distribuyeron desde no detectables hasta 146,9 ug/Kg, con un promedio de 16,82 ug/Kg; existiendo riesgo de contaminacin de man en el pas (11). 2.8 Determinacin de aflatoxinas en algunos productos naturales utilizando el medio agar coco y elisa ligada Se ha evaluado aflatoxinas usando el medio agar coco oxitetraciclina (CAMO) por el mtodo ELISA competitiva, en 50 muestras, divididas en suplementos alimentarios y medicamentos vegetales, se compar con el medio Agar Saboraud Oxitetraciclina (ASO) y se determin que no se encontr diferencia significativa en ambos medios de cultivo. El grupo ms contaminado fue el de los medicamentos vegetales con un promedio de 41,9 ppb encima de lo sugerido por la FDA(102). 2.9 Determinacin de aflatoxina y fumonisina en maz de consumo humano Los resultados muestran que el 80,5% de maz tiene fumonisina, siendo la jora la que presenta cantidades no detectables de esta toxina. El 87,8% de todas las muestras fueron positivas para aflatoxina independientemente de la forma de maz. Se encontraron rangos de 0-16,5 ppm de fumonisina y de 0-169,2 ppb de aflatoxina en todas las muestras analizadas(123).- 31 -


2.10 Development of ochratoxin A during Robusta (Coffea canephora) coffee cherry drying. Se ha detectado la contaminacin de ocratoxina A (1%)en granos de caf secos y en caf fresco dependiendo de la madurez, siendo menor cuanto ms verde. La contaminacin de OTA ocurri independientemente del lugar de ubicacin. El estudio sugiere un secado y descascarado apropiado combinado con la etapa de recoleccin de caf verde para reducir la contaminacin de OTA(26). 2.11 Determination of ochratoxin A in red wine and vinegar by immunoaffinity high-pressure liquid chromatography. De las 31 muestras de vino tinto originarios de pases del mar mediterrneo y 15 muestras de vinagre, todas estuvieron contaminadas con OTA. El 72% tuvo ms de 0,1 g/L. Las muestras mas contaminadas fueron los vinagres balsmicos (95). 2.12 Contaminates de origen biolgico Los contenidos de OTA son muy variables. En los vinos los valores ms bajos se encuentran en los vinos blancos y cavas (0,003-0,025 g/L); despus los rosados con valores entre 0,010 y 0,30 g/L, y finalmente, en los tintos con valores de hasta 2,0 g/L, que aveces se superan en Italia y Francia, que son los pases con valores ms altos. En reunin de la SCMA de marzo del 2001 se propuso un lmite de 1,0 g/L y est vigente hasta la actualidad para vinos. La incidencia de OTA en el mosto viene condicionada al parecer por diversos factores: distancia al mar, clima, vinfera y fecha de vendimia principalmente (167). 2.13 Mycotoxins in fruits, juices and dried fruits- 32 -


Se indica la presencia de micotoxinas (aflatoxinas, ocratoxina A, patulina, alternariol y tricotecenos) en frutas secas y jugo de frutas. Este estudio se realiz en Schleswig-Holstein Alemania. Adems se ha demostrado que la presencia de hongos no necesariamente est asociado a micotoxina, esto depende ms de factores endgenos y ambientales (51). 2.14 Survey of maize-based retail products for mycotoxins Se ha detectado deoxinivalenol, zearalenona, fumonisina B1, B2 y B3 en polenta, snacks y cereales de maz en un promedio de 0,587; 0, 157 y 0,227 mg/Kg respectivamente (66). 2.15 Determinacin de aflatoxina total y ocratoxina A en maca seca y harina de maca (Lepidium meyenii walp) Se ha determinado la concentracin de aflatoxina total y ocratoxina A en la maca seca y harina de maca, as como, los factores fisicoqumicos y microbiolgicos que influyen en su produccin. Para ello se ha recolectado muestras de 4 comunidades productoras y de 4 mercados principales. Se ha determinado la concentracin promedio de aflatoxina total 0,8295 ppb (g/Kg), cifra que indica buena calidad de maca seca y la concentracin promedio de ocratoxina A 8,703 ppb. Dicha cifra sobrepasa el lmite mximo permitido por la USL 123/2005. En harina de maca, el promedio de aflatoxina total es 12,4528ppb encontrndose concentraciones altas en la harina tostada a granel del mercado Central de Lima, los factores influyentes son la humedad relativa, el pH y la acidez. El promedio de ocratoxina A es 2,8916 ppb encontrndose concentraciones altas en la harina del mercado de Chupaca, los factores influyentes son los azcares reductores y el pH (138).- 33 -


As existen cientos de trabajos de investigacin de alimentos contaminados con micotoxinas, Yoshizawa (174) ha hecho una compilacin de otras investigaciones determinando las micotoxinas presentes en cada uno de los alimentos (cuadro 02). En los pases desarrollados se emplean procedimientos rigurosos de seleccin y limpieza para reducir las aflatoxinas a niveles bajos en aquellos alimentos que ofrecen un riesgo conocido. En los pases exportadores e importadores, con el fin de garantizar que los cultivos y los alimentos sensibles satisfagan las rigurosas exigencias de las leyes sanitarias, se emplea la toma de muestras fundamentadas estadsticamente, la extraccin de muestras de gran volumen, la homogenizacin antes de la toma de las submuestras y pruebas normalizadas para detectar las aflatoxinas (172). Los pases en desarrollo, con frecuencia son menos afortunados. Las normas de consumo local, establecidas en aquellos pases donde los frutos en nuez y el maz, que se hallan por debajo de los patrones de calidad, se pueden consumir sin ningn tipo de seleccin o de inspeccin, significa que con frecuencia la ingestin de aflatoxinas es excesivamente elevada, especialmente en las zonas rurales (79). En conclusin, no hay duda de que en el mundo occidental el riesgo de exposicin a las aflatoxinas es remoto. La fuente ms factible son los cacahuetes o la manteca que con ellos se elabora, pero las medidas de control son muy rigorosas y efectivas. Desgraciadamente en los pases en vas de desarrollo, la situacin es muy distinta y no hay duda de que se estn ingiriendo involuntariamente bastantes aflatoxinas como para producir efectos graves a largo plazo (74). Incluso se ha- 34 -


sugerido que los metabolitos txicos de los mohos constituyen el mayor peligro transmitido por los alimentos, para la salud humana a nivel mundial (97). La causa de contaminacin fungal cambia con las diferentes plantas de procesamientro. Esto sugiere la necesidad de establecer medidas preventivas para cada alimento y para cada produccin (78). 3. Propiedades qumicas de las micotoxinas 3.1. Propiedades qumicas de las aflatoxinas El trmino aflatoxinas se refiere a cuatro compuestos del grupo de metabolitos bis-furano-cumarina denominados aflatoxinas y son naturalmente producidas por A. flavus y por A. parasiticus y por una especie descrita recientemente A. nomius. Las cuatro principales aflatoxinas producidas de modo natural se conoce como aflatoxina B1, B2, G1 y G2. Cuando las aflatoxinas B1 y B2 son ingeridas por vacas en lactacin un porcentaje de las mismas aproximadamente 1,5% (65) es hidroxilado y excretado en la leche como aflatoxinas M1 y M2 que son compuestos de menor toxicidad que las molculas originales pero que son importantes a causa del consumo extendido de leche por los nios (174). Se distinguen por su color fluorescente cuando son expuestas a luz UV de onda larga: B (azul) y G (verde) con subndices que indican la movilidad cromatogrfica relativa. Las estructuras de las aflatoxinas B1 y G2 fueron determinadas por Asao et al. (12) y las de la B2 y G2 que son dihidroderivados de los compuestos madres, por Hartley et.al. (72). La fluorescencia permite detectar estos compuestos a concentraciones muy pequeas 0,5ng y es la base de todos los mtodos fsico-qumicos utilizados para deteccin y cuantificacin (118).- 35 -


Cuadro 02: Principales productos que se han encontrado contaminados con micotoxinaMICOTOXINA AFLATOXINA B1, B2, G1, G2 GENERO Y ESPECIE PRODUCTORES Man, pistachos, nueces, nueces de Brasil, almendras, trigo, cebada, avena, mijo, trigo negro o prieto, semillas de algodn, semillas de ajonjol, especias, frutos secos. Semilla de amapola, albaricoque, pepas de melocotn, pepitas de calabaza, maz, arroz y habas. Sorgo, comida cocida, derivados de man, semilla de algodn y soja. Productos lcteos. Trigo, cebada, arroz y comidas cocidas. Trigo, cebada, avena, arroz, maz sorgo, arroz, habas, arvejas, nueces, semillas de caf y productos crnicos (rin, carne, derivados de carne, productos lcteos. Jugo de frutas, jugo de manzana, manzanas podridas, frutas, y comidas cocidas. Maz, habas y tabaco. Man, maz, semillas, queso, salchicha. Trigo, cebada, maz, aceite de semillas de nabo, otros alimentos. Maz, trigo , cebada, avena, centeno y sorgo. Maz, y comidas cocidas Sorgo, pecana, manzanas, alimento mezclado

AFLATOXINA M STERIGMATOCISTINA OCRATOXINA A

PATULINA CIDO PENICLICO CIDO CICLOPIAZNICO TRICOTECENOS

ZEARALENONA FUMONISINA B1 , B2 ALTERNARIOL Y SU METIL ESTER

Fuente : Yozishawa,1998 (174)

En estado puro, las aflatoxinas son sumamente estables a temperaturas elevadas, cuando se calienta en aire. Sin embargo son relativamente inestables cuando se las expone a la luz, particularmente a la radiacin UV. En- 36 -


soluciones de cloroformo y benceno son estables si se mantienen por un perodo prolongado en lugar oscuro y fro (118). La presencia de un anillo de lactona en la molcula de las aflatoxinas las hace susceptibles a la hidrlisis alcalina (47). Esta caracterstica es importante por cuanto todo proceso de elaboracin alimentaria que incluye un tratamiento alcalino puede reducir la contaminacin de los productos, sin embargo, la presencia de protenas, el pH y la duracin del tratamiento pueden modificar los resultados (18); mientras que si el tratamiento alcalino es leve, la acidificacin invertir la reaccin, constituyendo la aflatoxina original. Cuadro 03: Propiedades fsicas y qumicas de algunas aflatoxinas y sus metabolitos.Aflatoxinas Frmula Masa molecular relativa 312 314 328 330 328 330 298 328 314 Temp. de fusin oC 269 286-289 244-246 237-240 299 293 >320 230-234 Absorcin UV Emi sin 425 425 450 450 425 425

B1 B2 G1 G2 M1 M2 P1 Q1 Aflatoxinol

C17 H 12 O6 C17 H 14 O6 C17 H 12 O7 C17 H 14 O7 C17 H 12 O7 C17 H 14 O7 C16 H 10 O6 C17 H 12 O7 C17 H 14 O6

12 400 (265nm) 12 100 (265nm) 9 600 (265nm) 8 200 (265nm) 14 150 (265nm) 12 100 (264nm) 11 200 (267nm) 11 450 (267nm) 10 800 (261nm)

21 800 (362nm) 24 000 (362nm) 17 700 (362nm) 17 100 (362nm) 21 250 (357nm) 22 900 (357nm) 15 400 (362nm) 17 500 (366nm) 14 100 (325nm)

3.2. Propiedades qumicas de las ocratoxinas Las ocratoxinas son un grupo de compuestos estructuralmente relacionados. Clasificados de acuerdo con su origen biosinttico como pentactidos en el grupo de los polictidos (165). La ocratoxina A es un compuesto cristalino, incoloro que exhibe fluorescencia azul, bajo la luz UV. La sal de sodio de ocratoxina A es- 37 -


hidrosoluble, como cido es moderadamente soluble en disolventes orgnicos polares (ejem: Cloroformo y metanol). En la hidrlisis cida la ocratoxina A produce fenilalanina y un cido lactnico pticamente activo, ocratoxina alfa, un metabolito que se ha encontrado en la orina de los animales experimentales que ingieren alimentos contaminados con ocratoxina A (36, 73). Cuadro 04: Propiedades qumicas y fsicas de algunas ocratoxinasOcra Frmula toxina A B C C20H18ClNO6 CO6H18NO6 C11M9ClO5 Masa Temperatura de Coeficiente de absorcin molecular fusin (oC) relativa 403 169 (xileno) 36 800 (213nm) 6 400(322nm) 89-96(benceno) 369 221 37 200 (218nm) 6 900(318nm) 256 229 30 000 (212nm) 5 600(338nm)

Fuente: OPS/OMS, 1983(118)

3.3. Metabolismo de la aflatoxina B1 en el hgado Con una sola excepcin, todas las biotransformaciones primarias de la aflatoxina B1 involucran su conversin a metabolitos hidroxilados, pero slo uno de esos derivados, la aflatoxina M1 tiene una toxicidad oral apreciable (76), incluso este metabolito se puede detoxificar mediante conjugacin con cido tauroclico y glucornico antes de la excrecin en bilis u orina (16). A este respecto, dos metabolitos descubiertos recientemente P1 (45,26) y Q1 son similares por cuanto sufren tambin este tipo de detoxificacin (98). La conversin en el hgado de la aflatoxina B1 a aflatoxicol y aflatoxicol H1 por va aflatoxina Q1 (141) es- 38 -


atpica, porque a diferencia de otras biotransformaciones catalizadas por enzimas microsmicas hepticas, interviene una deshidrogenasa citoplsmica dependiente de NADH. Adems, la formacin de aflatoxicol puede ser inhibida por hormonas sexuales 17-cetosteroides (121), esta ltima es la nica transformacin metablica de aflatoxina in vitro que se sabe que es sensible a las hormonas. Los homogenizados de hgado de ciertas aves y roedores son particularmente activos en la conversin de aflatoxina B1 y G1 a sus hemiacetales o derivados 2 hidroxi, 2,3-dihidro, denominados tambin aflatoxinas B2 y G2 (121). Estos metabolitos se enlazan fuertemente a una protena y probablemente tienen suficiente reactividad, cuando se forman in vivo, para causar muchos de los efectos agudos de las intoxicacin aflatoxignica, (121,122). En la actualidad, slo se tienen pruebas indirectas de la transformacin a epxidos de aflatoxinas B1 y G1 que probablemente sea la forma ms importante de activacin metablica. Cuando las toxinas madres se incuba con microsomas preparados a base de hgado de muchas especies animales, incluido el hombre, se forma un metabolito que al parecer slo tiene una existencia efmera, es sumamente reactivo, tiene un enlace covalente con el ADN e induce a un sistema bacteriano experimental in Vitro (10). Aunque no se ha aislado el metabolito de B1, se ha recuperado 2,3,dihidrodiol, luego de hidrlisis cida leve de un aducto formado cuando el metabolito microsmico se gener en presencia de ADN o ARN aadidos (156) y ms recientemente, luego de inyeccin intraperitoneal in vivo de aflatoxina B1 (155). Se ha supuesto que sta sea la evidencia indirecta de la formacin del 2,3-epxido y en vista de la interaccin con ADN, se acepta hoy generalmente que el epxido de aflatoxiona B1 es el mutgeno bacteriano y el carcingeno proximal (118).- 39 -


Recientemente se ha pensado que la formacin reversible de aflatoxicol que es el reservorio metablico de aflatoxina B 1 estara correlacionado con la susceptibilidad a la induccin de tumores hepticos (77). Por esta razn se ha supuesto que el hgado humano podra ser relativamente ms resistente a la carcinognesis aflatoxignica que al de otras especies, particularmente al de la rata (77, 142). Las figuras 1, 2 y 3 detallan las estructuras de las principales micotoxinas y de los hongos que las producen. III. FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO FUNGAL Y LA PRODUCCIN DE MICOTOXINAS EN ALIMENTOS 1. Factores que afectan el crecimiento fungal Segn (158), el crecimiento fungal es afectado por cinco factores: ingredientes, actividad de agua, temperatura, oxgeno y condiciones de pH. 1.1.Ingredientes

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Aflatoxina B1

Aflatoxina G1

Aflatoxina M1

Aflatoxina B2

Aflatoxina G2

Aflatoxina M2

Aspergillus flavus

Aspergillus parasiticus Fig.1 Estructura qumica de las aflatoxinas y morfologa de los hongos que las producen. Fuente: JICA, 1998 (80) - 41 -


Ocratoxina A

Aspergillus ochraceus

Ocratoxina A

Aspergillus ochraceus

Fig. 2 Estructura qumica de la ocratoxina A, citrinina y morfologa de los hongos que las producen. Fuente: JICA, 1998 (80)

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Moniliformina

Fumonisina F1

Zearalenona

Fusarium species

Fig.3 Estructura qumica de la moniliformina, zearalenona, fumonisina y morfologa de los hongos que las producen. Fuente: JICA, 1998 (80)

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En general, los ingredientes contienen nutrientes que los microorganismos necesitan para crecer. Varios aditivos alimentarios como sal, azcar y conservantes son usados en alimentos procesados para prolongar la vida de los alimentos y prevenir el crecimiento microbiano. Se ha examinado los efectos inhibitorios de especias y otros alimentos en el crecimiento y produccin de micotoxinas de hongos toxignicos usando medios de cultivo lquidos. El cuadro 05 resume los efectos inhibitorios de 9 sustancias antifungales aislados de especias contra el crecimiento de cepas productoras de micotoxinas: A. flavus, A. ochraceus y A. versicolor Cuadro 05: Efectos inhibitorios de componentes de especias en el crecimiento de hongos toxignicos.Sustancia Cinamaldehydo o-Methoxycinamaldehydo Eugenol Thymol Aryl isothiocyanate Citronellol Cuminyl alcohol Geraniol Anethol Concentracin mnima inhibitoria A. flavus A. ochraceus A. versicolor 400 400 400 100 200 200 250 500 250 400 400 200 200 NT 800 800 NT 800 800 NT 800 1600 NT 800 2000 2000 2000

Fuente: Ichinoe,1999 (78)

1.2. Conservantes Los conservantes qumicos se adiciona a los alimentos para prevenir o retardar su deterioro. Hay aproximadamente 30 diferentes compuestos que pueden ser aceptados legalmente como productos antimicrobianos y algunos son observados en el cuadro 06.- 44 -


Cuadro 06: Concentracin mnima inhibitoria (MIC) de conservantesConservante/Microorganismo Penicillium sp. Aspergillus sp. cido srbico 100-2 000 200-20 000 cido benzoico 200-60 000 200- 40 000 Ethylester PHB 200-800 200- 500 Propylester PHB 200-500 100- 500 Natamycina 0,6-1,0 0,1 50 Sulfito de sodio 20-400 200 O-phenylphenol 10-50 Thiabendazole 1 4-40 Fuente: Noordervliet, 1978 publicado por JICA, 1999 (80)

1.3. Actividad de agua Los mohos y levaduras crecen ms rpidamente en condiciones de baja actividad de agua que las bacterias (figura 4). El nivel de actividad de agua que sostiene el crecimiento fungal puede ser considerablemente reducido por la composicin del alimento, acidez, temperatura y concentracin de oxgeno. Un ejemplo de ello es el estudio, en Inglaterra, de sobrevivencia de Fusarium moniliforme a temperatura y humedad relativa controlada (88). 1.4. Temperatura La temperatura ptima que favorece el crecimiento de hongos comunes es 20C - 35C. Aunque el rango de temperatura ptima difiere ligeramente con el tipo de hongo, su crecimiento ser marcadamente fuera del rango. Sin embargo, especies de hongos son capaces de crecer hasta 0C. 1.5. Oxgeno Las levaduras y mohos no pueden proliferar en condiciones anaerbicas. Por esta razn, mtodos de desoxigenacin, reemplazo de gas y formacin de vaco- 45 -


Figura 4. Condiciones de actividad de agua y temperatura favorable (rea sombreada) para el crecimiento y produccin de micotoxinas por hongos. Fuente: Northolt M. and col. (116) mencionado por Ichinoe M. (78)

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son efectivos en la prevencin de crecimiento de hongos. Contrariamente, una alta presin de oxgeno puede reducir en algo el crecimiento micelial, pero no tiene efecto letal. 1.6. pH El pH juega un papel importante en el crecimiento de hongos y se ha demostrado con algunas especies toxignicas de Aspergillus, Penicillium y Fusarium (169). 2. Factores que afectan el desarrollo y produccin de micotoxinas Gimeno (69) seala que los factores condicionantes para el desarrollo de los hongos y produccin de micotoxinas son: 2.1. Factores fsicos Los factores fsicos considerados son: humedad, agua disponible, temperatura, zonas de microflora (zonas del alimento con alto contenido de humedad, susceptibles de desencadenar desarrollo fngico) e integridad fsica de los granos (cuadro 07). 2.2. Factores qumicos: A. pH Los hongos toleran un gran intervalo de pH (2,5 7,5), de un modo general soportan mejor el medio cido que el alcalino. B. Composicin del sustrato Los hongos no son exigentes desde el punto de vista nutricional y ellos se nutren de los micro y macro- 47 -


Cuadro 07: Temperatura y Aw para el desarrollo de algunos mohos y para la produccin de micotoxinas.MOHOS Aspergillus flavus Aspergillus clavatus Aspergillus ochraceus Penicillium expansum Penicillium cyclopium CRECIMIENTO TEMP. Aw 10 0,78 10 0,85 10-12 0,77 0 0,85 0 0,82 MICOTOXINA Aflatoxinas Patulina Ocratoxina A Patulina Ocratoxina PRODUCCION TEMP. Aw 10-25 0,83 12 0,99 12 0,99 0-24 0,99 4-31 0,90

Fuente: Gimeno A. (69)elementos existentes en el sustrato. Los resultados obtenidos indican que la soja es un sustrato pobre para la produccin de aflatoxina, aunque le sean dadas las mejores condiciones de produccin. C. Nutrientes minerales Las concentraciones ptimas de ciertos minerales para la produccin de ocratoxina A por Aspergillus ochraceus NRRL 3114 fueron 0,055-2,2 mg/L de zinc, 0,004-0,04 mg/L de cobre, 1,2 2,4 mg/L de hierro (por litro de caldo de cultivo). D. Potencial xido-reduccin (O2/CO2) La mayor parte de los hongos son aerobios. Una carencia de oxgeno condiciona el crecimiento de los hongos y la ausencia total puede llegar a producir muerte de stos. El anhdrido carbnico puede inhibir la formacin de algunas micotoxinas. 2.3. Factores biolgicos A. Presencia de invertebrados Los insectos actan como agente de diseminacin de la microflora y por lo tanto contribuyen al- 48 -


crecimiento y multiplicacin de los hongos. El propio metabolismo del insecto eleva el contenido de humedad del sustrato, la rotura del pericarpio y permite la infeccin del interior del grano. B. Estirpes especficas: En una misma especie fngica, no todas las estirpes se comportan de la misma forma. As pues, la estirpe NRRL 1957 de Aspergillus flavus no produce aflatoxina; sin embargo, ella es producida por otras estirpes como NRRL 3251, NRRL 3357, NRRL 3517 y NRRL 3353. 3. Factores de crecimiento fungal y produccin de micotoxinas de los principales hongos toxignicos 3.1.Aspergillus sp. Los principales factores de crecimiento de A. flavus y A. parasiticus se resume en el cuadro 08 y A. ochraceus, en el cuadro 09. Cuadro 08: Lmites de crecimiento y de produccin de aflatoxina por A. flavus y A. parasiticus.A. flavus Mnimo ptimo Crecimiento Temperatura Actividad de agua pH Aflatoxina Temperatura (oC) Actividad de agua pH 10-12 0,8 2 13 0,82 33 0,98 5-8 A. parasiticus Mximo Mnimo ptimo Mximo 43 >0,99 >11 12 32 0,80-0,83 0,99 3 4 -7 12 25 0,86-0,87 0,95 3 6 42 >0,99 >11 40 >0,99 >8

16-31 31-37 0,95-0,99 >0,99 -

Fuente: Pitt y Hocking , 1985(129)

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Cuadro 09: Lmites del crecimiento y de la produccin de aflatoxina por A. ochraceusMnimo Crecimiento pH Actividad de agua Temperatura (oC) Ocratoxina Actividad de Agua Temperatura (oC) cido peniclico Actividad de Agua Temperatura (oC) 2,2 0,83 8 0,77-0,80 12 0,81 10 ptimo 3-8 0,95-0,99 24-31 0,95-0,99 31 0,90 16 Mximo 13 >0,99 37 >0,99 37 >0,99 31


3.2. Penicillium sp. El cuadro 10 muestra algunos parmetros necesarios para el crecimiento fungal y produccin de la toxina citrinina; el cuadro 11, de la toxina penitrem A producido por P. crustosum donde se puede ver que no crece a 37C; el cuadro 12 muestra los factores de crecimiento de P. islandimcum que tiene toxina no identificada (puede ser ciclosclorotina, islanditoxina, luteosquirina y eritrosquirina que son las que produce esta especie) y el cuadro 13 muestra los factores de produccin de la toxina de P. verrucosum Cuadro 10 : Lmites de crecimiento y de produccin de toxina por P. citrinumMnimo Crecimiento Temperatura (oC) Actividad de agua pH Produccin de citrinina Temperatura (oC) Actividad de agua PH 5-7 0,80-0,84 9,7 37 Desconocido Desconocido


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Cuadro 11: Lmites de crecimiento y de produccin de toxina por P. crustosumMnimo Crecimiento Temperatura (oC) Actividad de agua pH Produccin de Penitrem A Temperatura (oC) Actividad de agua pH 9,2 Desconocido

Fuente: Hocking y Pitt, 1980 (75)

Cuadro 13: Lmites de crecimiento y de produccin de toxina por P. verrucosumMnimo Crecimiento Temperatura (oC) Actividad de agua pH Produccin de Ocratoxina A Temperatura (oC) Actividad de agua pH Produccin de Citrinina Temperatura (oC) Actividad de agua pH 0 0,79-0,83 0,99 Desconocido >25 >0,99 Desconocido

Fuente: Pitt, 1987 (130)

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3.3. Fusarium sp Los Factores que afectan el crecimiento y la produccin de toxinas de F. equiseti se muestran en el cuadro 14; de F. graminearum en el cuadro 15; de F. moniliforme en el cuadro 16, y de Fusarium sporotrichioides en el cuadro 17. Cuadro 14: Lmites de crecimiento y de produccin de toxinas por F. equisetiMnimo Crecimiento Temperatura (oC) Actividad de agua pH Desconocida 0,92 0,99 5,0-8,0 Mximo Aprox.37 >0,99 >10,4

Fuente: Pitt y Hocking ,1985 (129)

Cuadro 15: Lmites de crecimiento y de produccin de toxinas por Fusarium graminearum.Mnimo Crecimiento Temperatura (oC) Actividad de agua pH Desconocida 0,90 0,99 6,0-8,0 Mximo Desconocida >0,99 >10,2

Fuente: Booth, 1971 (23)

Cuadro 16: Lmites de crecimiento y de produccin de toxinas por Fusarium moniliforme.Mnimo Crecimiento Temperatura (oC) Actividad de agua pH 2,5-5 0,87 0,99 5,5-7,5 Mximo 32-37 >0,99 >10,6

Fuente: Liddell y Burgess, 1985 (88)

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Cuadro 17: Lmites de crecimiento y de produccin de toxinas por Fusariumptimo sporotrichioides Mnimo MximoCrecimiento Temperatura (oC) Actividad de agua pH -2 0,88 0,99 5,5-9,5 35 >0,99 >10,6

Fuente: Joffe, 1982 (82)

IV. EFECTOS TXICOS DE LAS MICOTOXINAS 1. Toxicidad de las micotoxinas Puede darse un efecto especfico txico de las micotoxinas en un rgano dado, pero la mayora provocan lesiones graves en un solo tejido o en varios y determinan efectos secundarios en otros tejidos (49). El cuadro 18 muestra el efecto de las micotoxinas sobre los diferentes rganos. La nefrotoxicidad de las micotoxinas se da principalmente en el caso de la aflatoxina y la ocratoxina A. Derache 1990 (49). Las micotoxinas neurotxicas y especialmente las micotoxinas del temblor (tremrgenas) actan a concentraciones relativamente bajas; el animal afectado sufre temblores, el efecto de una sola dosis dura desde algunas horas a varios das. Se ha descubierto este efecto utilizando un metabolito de una cepa de Aspergillus flavus; este hongo sintetiza tambin el cido kjico y el cido oxlico, que se han designado tambin como tremotxicos.

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Cuadro 18: Efectos de las micotoxinas sobre los rganosMicotoxinas Hepato toxici dad + + + + + Nefro toxici dad + Neuroto xicidad Efecto Endo crino + Efecto Irritante sobre la piel

Aflatoxina Rubratoxina Espordesmina Ocratoxina A P.R. Toxina Citrinina Tremgenos Verruculatoxinas Ac. Ciclopiaznico Citreoviridina Roquefortinas Psoralenas Zearalenona Penitreum A T2

+

+ + + + + + + + + +

+ + +

+ +

+ + + +

+

+

Fuente: Derache, 1990(49)

Segn un estudio comparativo de la ocurrencia natural de micotoxinas de Fusarium (tricothecenos y zearalenona) en maz y trigo, en reas de alto y bajo riesgo de cncer al esfago, en China, se puede demostrar la toxicidad de este hongo (90). En los animales y en el hombre, las aflatoxinas son txicas de modo agudo y de modo crnico. Producen cuatro efectos distintos: lesin heptica aguda, cirrosis heptica, induccin de tumores y teratognesis (153). A pesar de algunos informes en contra (152) existen abundantes pruebas de que la ingesta elevada de aflatoxinas est relacionada causalmente con las elevadas incidencias de cncer (124). La Aflatoxina B1, en el hgado de los diferentes animales forma una amplia variedad de metabolitos. As la vaca puede hidroxilar la molcula y segregar con la leche la Aflatoxina M1 resultante, dando lugar a un modo de contaminacin de la leche- 54 -


y los productos lcteos, incluso aunque estos productos no fueran contaminados con mohos. Existen otros 2 importantes metabolitos implicados en la toxicidad de aflatoxina B1. La formacin de epxido bien pudiera ser la clave de la toxicidad aguda (57). Las micotoxinas con efectos endocrinos son principalmente la zearalenona o F-2, un metabolito sintetizado por varias cepas de Fusarium, como F. roseum, F. tricinctum, F. oxysporum y F. moniliforme. Informes recientes indican que los primates son capaces de detoxificar las aflatoxinas por vas metablicas que no existen en los animales inferiores (99). Los lmites reguladores para las aflatoxinas siguen siendo muy bajos (173). El CPA es producido por varias especies de Aspergillus y Penicillium que incluyen a A. flavus, pero su papel en la salud humana sigue siendo dudoso; sin embargo existen pruebas evidentes de su implicancia en la enfermedad animal (39). Tambin se debe considerar que tres de las micotoxinas ms importantes, la aflatoxina, la ocratoxina y la toxina T-2, son inmunosupresoras, aunque bastante distintas en su actividad contra el sistema inmune (108). La ocratoxina, por otro lado, influye en la sntesis de protenas inhibiendo la fenilalanil tRNA sintetasa; no tiene efecto sobre el sistema de complemento (C3) y suprime la IgG y la IgM pero no la IgA (108). La aflatoxina B1 es metabolizado por el hgado a travs del citocromo P450 sistema enzimtico hacia el metabolito carcinognico epxido de AFB1-8-9 (AFBO), o hacia las formas menos mutagnicas tales como AFM1, Q1, P1 (41). Como se muestra en la figura 5 hay muchas rutas que AFBO puede tomar, uno resulta en cncer, otro en toxicidad y otros en excrecin de AFBO. La forma exo de AFBO rpidamente se- 55 -


une a las macromolculas incluyendo material gentico, por ejemplo, protenas y DNA para formar aductos. Es la formacin de aductos como N7-guanina que conlleva a mutaciones genticas y cncer.Aflatoxin B1 CytochromeP450 CytochromeP450 Hydroxylated Metabolites: AFM1, AFQ 1, AFP 1

Aflatoxin B1 -8,9-epoxide DNA(exo and edo) adducts Glutathione microsomal Sepoxide transferanse (s) hydrolase (?) Aflatoxin B1 Aflatoxin B1 Protein binding 8,9-dihydrodiol glutathione conjugate physiological pH Excretion dialdehydic phenolate Aflatoxin B1 aldehyde reductase Aflatoxin B1 dialcohol ExcretionToxicity

DNA-repair Mutation

Cancer

Fig. 5 Visin general de las rutas de biotransformacin para aflatoxina B1 Fuente: Bammer y col. (13)

2. Bioterrorismo Debido a que un nmero de micotoxinas son letales en dosis relativamente bajas, deben ser cultivadas y crecidas en una amplia variedad de granos, la posibilidad de evitar la contaminacin de micotoxinas de los productos y/o alimentos debe ser reconocido por la industria de alimentos cuando se desarrollan planes de defensa. El impacto de un acto internacional de contaminacin con micotoxina podra ser severo, con consecuencias en la salud pblica que incluye alta mortalidad y consecuencias econmicas devastadoras; miedo- 56 -


general y productos afectados. Antes del 11 de Setiembre del 2001 haba muy poca preocupacin correspondiente a la defensa de la contaminacin internacional. Pero debido a este acto, el almacn de granos y sistemas de entrega, tanto como los sistemas de seguridad de las plantas de procesamiento de alimentos merecen atencin y deben estar en los planes de emergencia, en lugar de tratar posibles incidentes de terrorismo qumico y biolgico. En todos los planes de seguridad se deberan incluir a las micotoxinas. 3. Implicancia en la seguridad alimentaria La advertencia pblica en relacin a las micotoxinas se est incrementando. Karlovsky (83) da tres explicaciones para este fenmeno. Primero, la qumica analtica es capaz de cuantificar las toxinas en un nmero de alimentos. Segundo, los nuevos bioensayos para los estudios toxicolgicos en objetivos especficos han sobrepasado las habilidades de los mtodos menos sofisticados y han permitido la identificacin de los efectos negativos a la salud donde antes nadie haba encontrado. Tercero, la disponibilidad de los mtodos de evaluacin rutinaria que son eficientes y posibles ha permitido por medio de monitoreos internos, obtener resultados de grandes contaminaciones identificadas. La evaluacin de riesgo del peligro en la salud humana asociado con micotoxinas se debe tratar con extrapolacin de los datos de toxicidad obtenidos en modelos animales y exposicin humana. La prevencin de contaminacin de alimentos humanos con micotoxinas podra tener un efecto significativo en la salud pblica, en los pases de bajos recursos econmicos y merece atencin significativa. La industria de alimentos debe tener el liderazgo en estos esfuerzos, as mejorar la sustentabilidad econmica de la industria, resaltando los esfuerzos de- 57 -


seguridad alimentaria, comercio internacional y mejorando la salud pblica (111). V. PRINCIPALES MTODOS DE DETECCIN DE MICOTOXINAS 1. Mtodo de anlisis qumico de micotoxinas Segn Tanaka (158), los procedimientos generales para el anlisis qumico de micotoxinas son los siguientes: 1.1. Muestreo La autenticidad de los resultados depende del muestreo y tcnicas de preparacin de la muestra. Un lote tiene 2 tipos de composicin: (figura 6) Tipo A: Cuando la recoleccin de la cosecha es mezclada y hay contaminacin con micotoxinas, los granos contaminados sern dispersos al azar en la poblacin. Tipo B: Cuando las recolecciones de la cosecha no son mezcladas y son contaminadas pequeas porciones, los contaminantes sern mantenidos en una porcin definida de la poblacin. La poblacin es toda la recoleccin y cuando una porcin de la poblacin es tratada como una unidad para vender, la unidad es llamada Lote. El plan de inspeccin de micotoxinas es prcticamente llevado a cabo en el proceso de la etapa 3 a la etapa 4. . La figura 8 indica la preparacin de la muestra y submuestra analtica. Los anlisis de micotoxina son usualmente llevados a cabo por pequeas porciones subdivididas de la muestra pulverizada y despus el nivel de contaminacin de micotoxina del lote es estimado por el valor promedio de los resultados analticos replicados.- 58 -


Estas alcuotas pulverizadas para anlisis son llamadas submuestras. 1.2. Extraccin La eleccin del solvente depende de las propiedades qumicas de las micotoxinas para ser extrados, tanto como de las propiedades de la matriz. Generalmente, las micotoxinas son extradas con solventes orgnicos como: cloroformo, diclorometano acetonitrilo, etilacetato, acetona y metanol. Estos solventes pueden ser usados en combinacin con algo de agua y electrolitos. La seleccin de solventes para extraccin y redisolucin ejerce una gran influencia en la recuperacin de micotoxinas, as el solvente empleado tiene que ser tomado en cuenta de las propiedades individuales de las toxinas y solventes especialmente de las polaridades. Las tcnicas fsicas para extraccin entre solvente y slidos son: Con licuadora a alta velocidad por un perodo de 3 a 5 minutos. Con equipo de agitacin por un perodo largo de 10 a 30 minutos (despus de pulverizar la muestra)(158). 1.3. Clean-up Los principales mtodos de Cleanup (clarificacin) segn Tanaka (158) son: Dilisis Precipitacin acuosa aninica.- 59 -

Etapa 1 Etapa 3 C3 mezclar bien Tipo A C uniforme 1 Cn Para venta por divisin C uniforme 2 C uniforme X Tipo A Lote pequeo C1 No mezclado Cn-2 Cn Cn-1 Cn-2 C2 C3 C1 C2 C Predispuesto Cn-1 Tipo B Lote grande C parcial 1 C parcial 2 (con dispersin predispuesto de partculas contaminadas) Cn C3 Para venta general C uniforme C uniforme Etapa 4

C1

Etapa 2

C1

C2

C2

C3

Cn-2

Cn-1

(con dispersin uniforme de partculas contaminadas)

C4

5

Cn-1


- 60 Tipo B (con dispersin predispuesto de partculas contaminadas)

Cn

Seleccionado y recolectado por grado de calidad y variedad

Cosechas

Poblacin

Fig. 6 Poblacin y dos tipos de lotes.

C parcial X Tipo B Lote pequeo

Fuente: Yamamoto K, 1998 (173)


Poblacin (Lote)C6 B4 C5A5

Mezclar bien

B6 C1A1

A3

B2A2

Mezcla de A1 A n

Muestra 1 Mezcla A

C3 B1 C4A6 A4

Mezcla de B1 Bn

Muestra 2 Mezcla B

B5 B3

C2 B7

C7

Mezcla de C1 Cn

Muestra 3 Mezcla C

Punto de muestreo Fig. 7 Muestra y muestreo Fuente: Yamamoto (1998)(173)

Extraer de muchos puntos de muestreo

Submuestra 1 Submuestra 2

Submuestra analtica 1 Submuestra analtica 2

Submuestra 3 Muestra

Submuestra analtica 3

Submuestra n

Submuestra analtica n

Subdividir

Tomar pequeas porciones

Fig. 8 Sub muestra para anlisis Fuente: Yamamoto, 1998 (173)

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Cromatografa de Columna. Separacin por solventes. Los mtodos de columna cromatogrfica son usados ampliamente para Cleanup de micotoxinas. La columna debe contener silicagel, florisil, alumina, carbn activado y resina de intercambio de in. Recientemente se pueden obtener columnas preparadas como prepacked column (fase ligada) como: S; (CH2)17 CH3[C18]; C N; Nh2; etc, que tambin est en el mercado. Los mtodos de separacin por solventes lquido lquido son tambin ampliamente utilizados como la tcnica de extraccin cido base y desgrasado. Se han reportado ltimamente nuevas tcnicas de Cleanup, como los procedimientos inmunoqumicos separacin bioqumica compleja. 1.4. Concentracin Cada etapa del anlisis, generalmente es realizado en un evaporador rotatorio a menos de 50C con un batch de agua bajo presin reducida. Cuando los extractos estn finalmente secos, se recomienda la evaporacin bajo gas nitrgeno en un bloque de aluminio caliente a menos de 50C (158). 1.5. Separacin de componentes del extracto Debido a la extraccin previa y cleanup (clarificado) generalmente se necesita separar las micotoxinas de la matriz interfiriendo la deteccin. Se usan procedimientos cromatogrficos como cromatografa de capa fina (TLC),- 62 -


cromatografa lquida de alta performance (HPLC) y cromatografa de gas (GC). Para anlisis de micotoxinas, los procedimientos de separacin usando TLC y HPLC son muy empleadas debido a que la mayora de micotoxinas son no voltiles (158). 1.6. Deteccin y determinacin Despus de la separacin de componentes del extracto, la presencia de micotoxinas se detecta y determina utilizando las propiedades fisicoqumicas de la micotoxina involucrada. En procedimientos TLC, algunas micotoxinas: aflatoxina, zearalenona y otras, pueden ser detectadas como puntos florescentes bajo luz UV. La mayora de micotoxinas dan puntos visibles o fluorescentes despus de rociar agentes como cloruro de aluminio y cido sulfrico, en la placa. Los detectores para HPLC tienen espectrofotmetro (UV), fluorofotmetro (FL), ndice de refraccin, deteccin electroqumica y espectrofotmetro de masa (MS) . La deteccin y determinacin de micotoxinas usando HPLA es ampliamente usado por el detector UV y FL . La variedad de detectores para GC es como sigue: detector de ionizacin de flama (FID), detector de captura de electrones (ECD), detector fotomtrico de flama (FPD), detector thermnico de flama (FTD) y MS. La eleccin de cualquier aparato y detector depende de las propiedades fisicoqumicas de la micotoxina y de la sensibilidad requerida (158). 1.7. Confirmacin de identidad- 63 -


Como los resultados son parmetros que pueden tener falsos positivos, la identidad de la micotoxina en muestras positivas tiene que ser confirmado. El anlisis MS en combinacin con TLC, HPLC o GC es un mtodo de confirmacin; sin embargo, la operacin de MS demanda tiempo y habilidad (158). Las tcnicas qumicas elementales para confirmacin de identidad, segn (158) son como sigue: En TLC: usando diferentes solventes desarrollados, varios agentes de rociado en la placa, redesarrollando despus de derivatizacin. En HPLC: usando fases mviles diferentes o columnas , reaccionando antes y despus de la derivatizacin, midiendo absorcin de UV o longitud de onda de florescencia, usando detector de diodo mltiple. En GC : usando diferente polaridad, columna detector. 2. Mtodo de inmunoensayo enzimtico Los mtodos de inmunoensayo para la deteccin de micotoxinas tienen ciertas caracersticas que los hacen ms aplicables para los ensayos de campo. Utilizan anticuerpos especficos para cada tipo de micotoxina. Requieren de una mnima purificacin de la muestra. Hay dos tecnologas bsicas: A) Elisa y B) columna de inmunoafinidad (IAC), que puede medir el total de aflatoxinas. Son sensibles aproximadamente 2 ppb de aflatoxina y pueden usarse cualitativa y cuantitativamente (21). Cuando se usa una columna de inmunoafinidad, la muestra es forzada lentamente a travs de una columna, en cuyo interior, los anticuerpos capturan la aflatoxina. La flourescencia de la columna es comparada con la flourescencia del producto qumico de- 64 -

y/o


referencia incluido en la columna, que fluorece a la misma longitud de onda que la aflatoxina. Midiendo las diferencias en intensidad entre la muestra y el estndar de referencia se puede determinar la concenmtracin real de la muestra (21). La tcnica ELISA est disponible en varias presentaciones. Es fcilmente adaptable a diferentes tipos de dispositivos y actualmente viene en 4 tipos de presentaciones y sirve para anlisis en serie de gran nmero de muestras. Este ensayo se presenta muy bien para controles positivos durante el anlisis (21). El IAC para aflatoxinas es bsicamente un formato nico que implica el solo uso de columnas y sirve para anlisis individuales. El IAC adems no puede usar controles positivos dentro del ensayo de una misma muestra y se procesa sin incluir ningn tipo de control (21). Hay dos tipos para deteccin de pequeas molculas (micotoxinas), stos son por competicin indirecta y por competicin directa. La mayora de ELISA, comercialmente disponible, son de competicin directa (21). ELISA tiene una sensibilidad, especifidad y exactitud que generalmente determina resultados muy similares a aquellos obtenidos por los mtodos analticos fsicos. Actualmente hay equipos de ELISA disponibles para aflatoxina, zearalenona, vomitoxina, T-2, ocratoxina y fumonisina (21). Algunos ELISAs han sido aprobados por la AOAC-RI Internacional y otras organizaciones en los Estados Unidos como el USDA-FGIS (21). Segn el mtodo de inmunoensayo enzimtico RBIOPHARM (136) aprobado por FGIS (Food and Grain Inspection Service) esta prueba est basada en la reaccin antgeno-anticuerpo. Los micropozos estn recubiertos con- 65 -


anticuerpo de captura contra anticuerpos antimicotoxina. Se agregan estndares de la micotoxina a analizar o la solucin de las muestras, conjugado micotoxina-enzima y anticuerpos antimicotoxina a los micropozos. La micotoxina y el conjugado compiten para unirse a sitios del anticuerpo antimicotoxina (inmunoensayo enzimtico competitivo). Al mismo tiempo, los anticuerpos antimicotoxina se unen a los anticuerpos de captura inmovilizados sobre la placa. El conjugado micotoxina-enzima que no se uni es removido posteriormente en un proceso de lavado. El sustratro/cromgeno es agregado a los micropozos a travs de los anticuerpos; convierte al cromgeno en una sustancia de color azul. La adicin de la solucin stop provoca un cambio de color, de azul a amarillo. La medicin se realiza fotomtricamente a 450 nm; la absorcin es inversamente proporcional a la concentracin de la micotoxina en la muestra. 3. Investigaciones sobre mtodos de deteccin de micotoxinas 3.1 A rapid analisis of ochratoxin A in coffee beans and cereals. Se ha desarrollado un mtodo analtico rpido para la determinacin de OCTA sin usar cloroformo o columna de inmuno afinidad en caf y cereales como: arroz, trigo, cebada y maz. OCTA fue extrado con acetonitrilo-agua-cido actico (40:58:2), y detectado, usando un detector de florescencia (excitacin 335 nm emisin 465 nm) (6). 3.2 Se presenta un mtodo rpido de seleccionar frutos secos contaminados. De 65000 frutos secos se identificaron 120 contaminados; cada uno conteniendo ms de 25043000 ng/g de aflatoxina. Este mtodo consiste en sumergir los frutos secos en un fluido de extraccin y examinar el flujo resultante por espectrofotometra de masa Tandem sin previa purificacin (145). 3.3 Se reporta un ensayo de polarizacin de florescencia- 66 -


simple, portable y rpido, para la determinacin de aflatoxina en granos. Este inmuno ensayo es portable al campo, homogneo y no necesita ningn lavado o purificacin de la muestra. Est basado en la competencia entre aflatoxina libre y un detector de aflatoxinafluoresceina para un anticuerpo monoclonal especfico para aflatoxina en solucin. En este estudio fueron analizados una serie de muestras naturalmente contaminados por FP y comparados con resultados mediante HPLC. Los resultados de anlisis FP de muestras contaminadas (con una mezcla B1,B2,G1,G2 7/1/3/1 w/w) correlacionaron bien con valores r2 = 0,99. Sin embargo, FP desestim los contenidos de aflatoxina debido a la baja reactividad cruzada del anticuerpo usado hacia aflatoxina B2,G1 y G2. Este estudio servira solo para un screening de aflatoxina total (114). 3.4 Se ha evaluado un mtodo de extraccin de fluido supercrtico a escala analtica (SFE) para extraer aflatoxina B1 de maz de campo inoculado con Aspergillus flavus. Se han usado varias presiones (200015 000 psig) temperatura (40C - 80C) dixido de carbono supercrtico (50-500 ml de CO2 lquido y modificadores orgnicos. Las recuperaciones fueron maximizadas incrementando la presin de CO2 y el nivel de modificador orgnico a 10-15% v/v. El mtodo SFE rindi >90% de recuperacin del analito, cuando se compar con el solvente de extraccin convencional. La precisin del mtodo es afectada por el tamao de la muestra y el grado de homogenizacin (159). 3.5 EL uso de UV para identificar estirpes de A. flavus y A. parasiticus que producen aflatoxina (43). 3.6 Se ha desarrollado un inmunoensayo de fase slida para la deteccin y cuantificacin de A. ochraceus en grano de trigo (89).- 67 -


3.7 Se ha detectado la produccin de micotoxinas por A. flavus, A. parasiticus y A. ochraceus despus de 21 das y confirmado por TLC. Las toxinas fueron extradas con 2,5 mL de cloruro de metileno acidificado por 20-60 minutos. La concentracin de micotoxina fue evaluada por TLC. La adicin de cido frmico al solvente de extraccin cloruro de metileno afect en el incremento de la recuperacin de ocratoxina A de agar Czapek levadura (CY) de 20 a 91%. Las recuperaciones complementadas fueron ms altas de CY agar que de Sacarosa extracto de levadura (YES) agar, en un rango de 11%. La recuperacin de citrinina en YES agar fue de 91%, comparado al CY agar . Este mtodo es rpido conveniente y reproducible porque se muestra la superficie del cultivo completo (2). 3.8 Se ha evaluado la aplicacin de sistemas automatizados y manuales para purificacin de ocratoxina y zearalenona en cereales con columnas de inmunoafinidad. Se ha comparado un sistema de extraccin manual agregado al vaco y un sistema de extraccin automatizado (ASPEC) para purificacin de OTA y zearalenona. El lmite de deteccin (LOD) para ocratoxina A con un sistema manual agregado al vaco y tambin para el sistema ASPEC fue 0,1mg/Kg. Los LODs para zearalenona fueron 1,5 mg/Kg para sistema manual y 3 mg/Kg para ASPEC (58). 3.9 Se ha desarrollado un mtodo de screening TLC para la deteccin de ocratoxina A en caf verde a un nivel de control de 10 ug/Kg. El mtodo est basado en la extraccin de OTA con una mezcla de cidos fosfrico y diclorometano; purificacin por particin lquido lquido en carbonato hidrgeno de sodio; separacin por TLC fase normal, y deteccin por estimacin visual de intensidad de fluorescencia bajo lmpara de UV a 366 nm. (131).- 68 -


3.10 Se ha desarrollado un inmunoensayo de enzima a travs de una membrana de flujo para la deteccin de ocratoxina A en caf tostado.1 Se ha desarrollado un mtodo de extraccin y limpieza fase slida. Un coeficiente de particin alto para OTA, en la fase mvil, se ha logrado usando metanol/NAHCO3 acuoso 15% como solvente de extraccin y limpieza. 2 Despus del uso de aminopropil para clean-up no se detect falsos positivos. Los resultados de flujo fueron visualmente evaluados. La sensibilidad lograda para la membrana de flujo fue 4 g/Kg en caf tostado y contaminado con OTA. Los resultados fueron confirmados por HPLC con una deteccin lmite de 1 /Kg (149). 3.11 Se han producido anticuerpos policlonales para OTA inyectando albmina de suero de bobino-ocratoxina conjugado subcutneamente a mltiples lugares en un conejo libred blanco. El antisuero podra ser usado como una dilucin excedente de 1:100 000 en un inmunoensayo enzimtico (ELISA) competitivo que detect concentraciones de ocratoxina hasta 0,1 ng/mL, el 50% de inhibicin ligada de ocratoxina fue 5 ng/mL (151). Los anticuerpos no reaccionan con ocratoxina B coumarin, 4 hidroxicoumarin, L-phenylalanina y aflatoxina B1. La prueba se ha realizado con ajes contaminados coleccionados de mercados y almacenes. El promedio de recuperacin de aj libre de OTA agregado con 1 a 100 g/Kg fue de 90-110% con DS95% cuando la muestra se incub por un perodo > 12h a 20C en presencia de 6N o concentraciones ms altas de HCl y un volumen relativamente alto de metanol (95% v/v). Este mtodo puede ser utilizado para la confirmacin de ocratoxina en muestras biolgicas o para la sntesis de sus steres. El lmite de deteccin del ensayo para OA y OAMe fue 1 ng/mL. y se concluye que el procedimiento puede ser usado para la confirmacin de ocratoxina en muestras biolgicas o para la sntesis de sus steres (87). 3.14 Se ha desarrollado un procedimiento de columna de inmunoafinidad /HPLC para cuantificar bajos niveles de ocratoxina en caf verde, caf tostado y caf instantneo con recuperaciones de ms de 80%. El mtodo fue usado para 116 muestras de caf soluble de varios pases y diferentes fabricantes y mostraron niveles de contaminacin desde cantidades no detectables hasta 15,9 g/Kg. Los niveles ms altos de OTA fueron detectados entre cafs solubles que han sido adulterados con caf arrugado o cscara de caf (5,9 g/Kg). Los resultados de estos estudios indican que el caf soluble puro no es un- 70 -


medio para ocratoxina, encontrndose dentro de los lmites de seguridad (132). 3.15 Se ha desarrollado una ELISA competitiva con anticuerpo monoclonal para determinacin cuantitativa de ocratoxina en diferentes cereales, usando para la extraccin, la mezcla cido ctrico/diclorometano. El lmite de deteccin fue de 0,5 ng/g de OTA. La recuperacin de la toxina de cereales infectados con 5100 ng/mL de OTA vari entre 90 y 130% (14). 3.16 Los anticuerpos dirigidos contra OTA fueron obtenidos de yema de huevo de gallina, usando un procedimiento de purificacin y al aplicarse a un ensayo inmunosorbente, unido a una enzima, se ha logrado recuperaciones de ms de 70-80%. Este estudio demostr que los anticuerpos de huevo de gallina pueden estar listos en rendimiento y pureza para usarse y desarrollar una ELISA altamente sensitiva para OTA (37). 3.17 Se ha desarrollado un inmunoensayo enzimtico sobre la base de membrana de flujo para deteccin de OTA en trigo. Una membrana ABC inmunodyne fue revestida con inmunoglobulinas antiratn de conejo y los lugares unidos a protenas libres fueron bloqueados; luego estas membranas fueron colocados en una capa absorbente dentro de un recipiente de plstico y se hizo un inmunoensayo enzimtico competitivo secuencial. Los reactivos fueron agregados en gotas sobre las membranas: solucin de lavado, una dilucin de inmunoglobulinas antiocratoxina A monoclonal, solucin de lavado, solucin estndar de OTA o solucin extracto de muestra, un conjugado ocratoxina Aperoxidasa de conejo y solucin de lavado. Finalmente, la solucin H2O2 3,3-5,5-tetrametilbenzidine para colorear la reaccin. La intensidad del color del punto en la membrana se visualiza comparando con la solucin- 71 -


control negativo que mostr un color azul intenso. Con la membrana revestida se puede hacer el anlisis en 15 minutos (48). 3.18 Hace 5 aos nuestro instituto (Cereal research communications) empez un programa de investigacin para desarrollar pruebas de ELISA para detectar micotoxinas en alimentos, resultando en Kits don reactivos para T-2 zearalenona y ocratoxina A. Este programa continua desarrollando pruebas de ELISA sensibles competitivas y directas basados en anticuerpo monoclonal y con un Kit de reactivos para medir cuantitativamente la aflatoxina B-1 con un lmite de deteccin de 1,5 ng/g en cereales. El promedio de coeficiente de variacin interensayo e introensayo de las curvas estndar fueron menores a 10%. Con el solvente de extraccin basado en acetonitrilo, los valores promedios de recuperacin de cereales contaminados artificialmente con esta micotoxina fueron cerca del 80%. Esta prueba fue ofrecida para screening de muestras en laboratorios de control (15). 3.19 Las columnas de inmunoafinidad (IACs) son ampliamente usadas para limpieza y aislamiento de micotoxinas extrados de alimentos y fluidos biolgicos, particularmente aflatoxinas, ocratoxina A y fumonisinas. Las columnas son preparadas por unin de anticuerpos especficos para una micotoxina dada a un soporte fase slida especialmente activada y empacando el soporte suspendido en solucin buffer acuoso en un cartucho. La micotoxina en el extracto o fluido se liga al anticuerpo, las impurezas son retiradas con agua o solucin acuosa y luego la micotoxina es desorbida con un solvente miscible como el metanol. Separaciones ms profundas pueden ser realizadas con columnas de inmunoafinidad seguido de LC en un sistema automtico o por- 72 -

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