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Consideraciones en el análisis de riesgo de eventos transgénicos de papa EFR

MarcoDallaRizzaCoordinaciónUnidaddeBiotecnología

[email protected]

IX Conferencia de la Red Latinoamericana y del Caribe de Biotecnología Agropecuaria y Forestal (REDBIO)

“ IX Encuentro REDBIO 2016-PERÚ ”

“Biotecnología para el Desarrollo y Uso Sostenible de la Biodiversidad”

Junio 27 – Julio 1, 2016 , Lima – Perú

Boschi, F; Murchio S; Ferenczi, A; Vilaró F y M Dalla Rizza

EFR

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Es el conjunto de medidas y accionesrequeridas para minimizar los potencialesriesgos que puedan ocurrir cuando seutilizan Organismos Vivos GenéticamenteModificados (OVGMs), derivados yproductos que los contengan, está basadaen la aplicación de criterios científicos ytiene en cuenta los aspectos ambientales yde salud pública.

Bioseguridad

Consideraciones en el análisis de riesgo de eventos transgénicos de papa EFR

‘Biotecnología para el Desarrollo y Uso Sostenible de la Biodiversidad’

Murchera de la papa (Bacterial Wilt) causado por R. solanacearum

Por qué es importante trabajar en Bacterial Wilt?

• Es un patógeno cuarentenario, en USA considerado agente de Bioterrorismo

• Tiene alto rango de húespedes (más de 200 especies)

• Distribución geográfica amplia (en papa más de 40 países)

• El control químico es inefectivo

• No existe resistencia genética

• Se disemina en forma latente a través de tubérculos infectados

• Permanece en el rastrojo de cultivos y suelos, se trasporta por el agua.

Sylvie Priou, P. Aley, L. Gutarra, A. Salas & M. Vargas CIP, Lima, Peru (2005) Characterization of promising sources of high levels of resistance to bacterial wilt (Ralstonia solanacearum) in wild species of potato. APS Annual meeting.

Maria D. Koutsoudis et al. PNAS 2006;103:5983-5988

Infected xylem vessels of sweet corn leaves visualized by scanning electron microscopy


Consideraciones en el análisis de riesgode eventos transgénicos de papa EFR

Solanum commersonii,

2n = 2x = 24 ; 1 EBN

Solanum commersonii

•Resistencia a virus X e Y

•Resistencia a Ralstonia solanacearum

•Resistente a Erwinia carotovora spp carotovora

•Resistencia a marchitez por Verticillium

•Resistencia a Alternaria solani

•Resistencia a Ditylenchus destructor

•Alta materia seca (aptitud industrial)

•Resistencia a frío

•Genéticamente aislada del grupo Tuberosum(barreras post-cigóticas; EBN)

•Alto contenido de glicoalcaloides fácilmente transmitidos a la progenie

RECURSOS GENÉTICOS DE PAPA Y CRUZAMIENTOS INTERESPECÍFICOS

Esquema Cruzamientos Gametas no reducidas 2n Programa de mejoramiento INIA Las Brujas

n F1 (cmm x phu) 3x (2004-06)n BC1 (F1 x tbr) 5x (2008)n BC2 (BC1 x tbr) 4x-5x (2009)n BC3 (BC2 x tbr) 4x (2011)

(2n=4x ; 4 EBN)

cmm x phu(2n=2x ; 1 EBN) 2n=2x ; 2 EBN)

F1-(cmm x phu) x tbr(2n=3x ; 2 EBN) (2n=4x ; 4 EBN)

(2n=5x ; 4 EBN)BC1-(F1 x tbr) x tbr

2n=5x=60

2n=2x=24 2n=2x=24

2n=4x=48

Cortesía: F.Vilaró , M. González, G. Galván. INIA-FagroA. Vaco, M. Giambiasi and P. Speranza. Laboratory of Plant Genetics Evolution and Domestication, Fagro-UdelaR

BC1

BC2• Gran número de plantines para obtener una variedad (103-105-6)• Arrastre de ligamiento (pej, tipo y cantidad de glicoalcaloides)

CRUZAMIENTOS INTERESPECÍFICOS/PUENTE PARA LA INTROGRESIÓN DE GENES cmm a tbr


Alternativa complementaria para potenciar fuentes de resistencia: adquisición de resistencia mediante ingeniería genética para la sobreexpresión de ‘genes de defensa’

üReceptor EFR: Elongation Factor-Tu Receptor: receptor de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) exclusivo de la familia Brassicaceae: Pseudomonas syringae pv. syringae, P. syringae pv. tabaci; Agrobacterium tumefaciens; Ralstonia solanacearum; Xanthomonas perforans.

üEl ligando-PAMP es un fragmento del factor de elongación EF-Tu

ü Genes de resistencia parcial brindan una resistencia más duradera/indefinida y pueden combinarse con otros genes.

ü Transformación mediada por A. tumefaciens; promotor CaMV 35S

ü Variedad susceptible INIA Iporá y clon de mejoramiento 09509.6 con genes cmm introgresados

EFR

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Interfamily transfer of a plant pattern-recognition receptor confers broad-spectrum bacterial resistanceSéverine Lacombe1,5,6, Alejandra Rougon-Cardoso1,5,6, Emma Sherwood1,5,6, Nemo Peeters2, Douglas Dahlbeck3, H Peter van Esse4, Matthew Smoker1, Ghanasyam Rallapalli1, Bart P H J Thomma4, Brian Staskawicz3, Jonathan D G Jones1 & Cyril Zipfel11The Sainsbury Laboratory, Norwich Research Park, Norwich, UK. Nature biotechnology 2010



Sistemas de percepción del daño de patógenos en plantas

Pathogen-Associated Molecular PatternPattern-Recognition Receptor

RespuestaPTI

Inmunidad inducida por PAMP

RespuestaETI

Inmunidad inducida por Efectores

Célula vegetal Genes R

Damage-Associated Molecular Pattern

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F1 de PG-1 x PG-4 es imposible sin el uso de transgenia

La Ingeniería Genética es la única solución para mover alelos

PG-4 PG-3

Transferencia de genes por vías técnicas radicales o imposibles

F1 de PG-1 x PG-3 son anómalos, letales o infértiles

PG-2

Es posible la transferencia de genes Puede ser difícil

F1 de PG-1 x PG-2 tiene cierta fertilidad

S. tuberosum spp tuberosum(4x; 4EBN)

Tom

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de: h

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/8/8

a/21

_1.jp

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RECURSOS GENÉTICOS DE PAPA Y CRUZAMIENTOS INTERESPECÍFICOSPool Génico - primario PG-1

- secundario PG-2- terciario PG-3

PG-1Subespecies A: variedades

cultivadas

Subespecies B: especies silvestres y malezas

PG-1

S. commersonii*(2X; 1EBN)

Arabidopsis thaliana**

S. tuberosum spp. andígena(4X; 4EBN)S. phureja(2X; 2 EBN)

S. chacoense (2X; 2EBN)S. stoloniferum (4X; 2EBN)

Distancia evolutiva (Carvallo et al 2011):* ~ 3 millones de años** 112 hasta 156 millones años

S. demissum (6X; 4EBN), PG-2Genes R1, R2, R3a

S. bulbocastanum (2X; 1EBN), PG-3Genes Rpi/blb2; Rpi/blb3

S. mochiquense (2X; 1EBN), PG-3Genes Rpi/mcq1

S. acaule (4X; 2EBN), PG-2

MEJORAMIENTOGENETICO PARAP. infestans

S. stoloniferum (4X; 2EBN), PG-2

INIA Iporá vs Clon 09509.6-EFR

• el receptor EFR en la papa está reconociendo la presencia de R. solanacearum• el ABC es sensiblemente inferior en al clon-EFR• en las diferentes líneas transformadas del clon existe una tendencia muy diferente de respuesta: presencia de múltiples genes de defensa introgresados vs inserciones diferentes vs expresión diferencial vs número de copias• el ABC en el clon c/s transformar es inferior en relación a INIA Iporá c/s transformar

• existe otra proteína de membrana similar a BAK1 en papa para la activación del gene EFR?• EFR potencia el background genético de la planta

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Por qué la evaluación del riesgo para los cultivos transgénicos?

Después de todo:- Ninguna actividad es libre de riesgo- Toda la agricultura es ‘nociva’- El mejoramiento convencional no está regulado- La ingeniería genética no es inherentemente arriesgada- Ya existe una larga historia de uso seguro (> 20 años, > 18m de agricultores en 28 países, y180 millones de hectáreas en 2015)

Debido a:- La falta de familiaridad con el proceso inicial- Posibilidad de novedad y daños- Desafío presentado por nuevas características- Preocupaciones de la sociedad y la presión pública- Ahora sujeto al derecho internacional

La Evaluación de Riesgo Ambiental de OVGM para

- liberación comercial- ensayos de campo confinados y - la importación de alimentos, piensos y el procesamiento


EFR

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El análisis de riesgos es la actividad de identificar y evaluar todos los cambiosque pudieran resultar de un evento -incluidos los económicos, políticos, éticos ypreocupaciones ambientales.

Incluye el riesgo (en su mayoría basados en la ciencia)y evaluación de los efectos sobre la salud humana y el medio ambiente, gestión del riesgo que establece umbrales y controles, y la comunicaciónde riesgos que implica el intercambio de información sobre el riesgo (Gray 2015).


Comité de Articulación Institucional (CAI)

MSP, MVOTMA, MGAPINIA, LATU, UdelaR, INASE,

IIBCE, Instituto Pasteur

3

4

Consulta Pública

56

9

98

Solicitud

Comisión para la Gestión del Riesgo

(CGR)(Delegados de los

Ministros del GNBio)

Secretaría

MGAP

1

Evaluación del Riesgo en Bioseguridad (ERB)

Trabajo en red de coordinador con técnicos-científicos expertos nacionales, regionales e

internacionales.

2

2

Información

Gabinete Nacional de Bioseguridad

(GNBio)

MGAP, MSP, MVOTMA, MEF,

MIEM y MRREE

7

Comité Consultivo en Biotecnología

(CCB)

Evaluación de Riesgo en OVGM

Gestión del Riesgo

Comunicación del Riesgo

Evaluación del RiesgoCortesía: Alejandra Ferenczi‘Biotecnología para el Desarrollo y Uso Sostenible de la Biodiversidad’


Definición del Problema:• qué queremos proteger?• qué deseamos que no se vea perjudicado?• identificación de las metas de protección ambiental

Daños potenciales previstos más comunes

• OVGM se convierta en una mala hierba o invasivo• El flujo de genes - híbrido maleza / invasiva• Incidencia sobre el Organismos No Blanco• Impacto adverso sobre la biodiversidad• Impacto adverso en los procesos agrícolas


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Características de la planta huésped

• La papa (Solanum tuberosum, 4x, 4 EBN), se reproduce principalmente via tubérculos, no competitivos fueradel cultivo.

• La reproducción sexual es posible vía semilla botánica (80-100% autógamas). Los cultivares muestrangeneralmente reducida fertilidad del polen o inclusive esterilidad.

• Las flores son visitadas por abejorros y el polen dispersado a corta distancia por el viento quedando en elcultivo o vecindad. El análisis a posteriori de las variedades locales en simpatria con una variedad comercial enel centro de origen de la papa no pudo detectar flujo de genes (Ghislain et al., 2015).

• Otras consideraciones: los momentos de floración, la compatibilidad sexual, la población de insectospolinizadores, la viabilidad de las semillas en las bayas y que las variedades sean adoptadas por losagricultores.

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Presencia de especies silvestres

En Uruguay existen dos especies silvestres: S. commersonii (2x, 1 EBN) y S. chacoense (2x, 2EBN) que prácticamente limitanla posibilidad de cruzamiento con la papa cultivada.

Las especies silvestres son hospederos asintomáticos de R. solanacearum.

Además, los efectos de fitness del gen efr no se espera que mejore su capacidad reproductiva(adaptación o fitness) medido como el número de hijos que cada planta da a la generaciónsucesiva (Burke and Rieseberg 2003).

Características del donante

El gen efr proviene de Arabidopsis thaliana y está presente exclusivamente en crucíferas. Elproducto de expresión es una proteína que es un receptor de membrana celular que le permitea la planta activar su mecanismo de defensa contra bacterias fitopatógenas (Lacombe, 2010).

Potencia el sistema de defensa de las plantas. Promotor constitutivo CaMV35S ampliamenteempleado en muchos eventos transgénicos.

En general se encuentra baja copia a nivel celular y es considerada como una proteína difícilde caracterizar en plantas GM.

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Proteínas ‘intractables’ se definen como aquellas proteínas con propiedades que hacen quesea muy difícil o imposible con los métodos actuales de expresar en sistemas heterólogos;aislar, purificar o concentrarse; cuantificar (debido a niveles bajos); demostrar la actividadbiológica; o demostrar la equivalencia de las proteínas vegetales.

Cinco clases de proteínas insolubles: (1) proteínas de membrana, (2) proteínas de señalización, (3) factores de transcripción, (4) proteínas N-glicosiladas, y (5) proteínas de resistencia (proteínas-R, proteínas de reconocimiento de patógenos de plantas que activan la respuesta inmune innata).

Bushey et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 69 (2014) 154–170

Complementando fuentes de resistencia a Ralstoniasolanacearum en papa desarrollados por métodos convencionales y transgénicos EFR

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Equipo de Trabajo:INIA• Unidad de Biotecnología, Ana Arruabarrena, Rafael Narancio, Sara Murchio, Marco Dalla Rizza.• Programa Nacional de Horticultura, Gustavo Giménez, Francisco Vilaró, Diego Maeso, Vilma Walasek.

The Sainsbury Laboratory (TSL)• Dr. Cyril Zipfel, Matthew Smoker, Lena Stranfeld, Diana Horvath

Universidad de la República• Facultad de Agronomía Guillermo Galván, • Facultad de Química María Julia Pianzzola, María Inés Siri, Virginia Ferreira• Tesis de Maestría - Federico Boschi

BioseguridadAlejandra Ferenczi

‘Investigación colaborativa INIA-TSL: evaluación de papa y tomate EFR’

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Agrobiotecnología-INIA

Marco Dalla RizzaCoordinación Unidad de Biotecnología

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MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN!


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