Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

30
Confocal Laser Scanning Microscopy Principles Microscopy from Carl Zeiss Optical Image Formation Electronic Signal Processing Authors/Sources/References

Transcript of Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

Page 1: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

ConfocalLaser Scanning Microscopy

Principles

M i c r o s c o p y f r o m C a r l Z e i s s

Optical Image FormationElectronic Signal ProcessingAuthors/Sources/ References

Page 2: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

1

������ ������

������������ �

������

����������������������

�� ������������ ��������� ���������������������������������������������������������������������������������������������� �

�� ���������� ���������������� ������ ����� � �� ����������������������������������������������� ! ��� "��������#����� ������ ���� ����������������������������������������������������������������������������������������� ��

����� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��

����� �������������� ����������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��

��� $ %�#����� ������ ���� ������������������������������������������������������������������������������������������������� ��

�������

���������� �������������

�� &�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��

�� ��'���( ����)��'� ����������' ��������������������������������������������������������������������������������������� ��

*� +���� �������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��

*�� ���������� �����������#�������������, ,������������������������������������������������������������� �-

*�� �����,��������������%��+��������������������������������������������������������������������������������������������� �.

-� ���� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��

��������

��������� ������������ ������������������������������������������������������������������������ �/

Page 3: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

2

�����������

�������������������� �� ������������������ � ��

����������� ����������������������������������

�����

����������� ������� � ������������������� �������

���� ����� ������������������� �� ������ �������

������ ��� ��������� ������ ���� �������������

���������������������������������� ������ �!��������

�� � ���������������� ������ �� ������ �������

����� ��������������������

"� �������� ����������� ��������� ������������������

�������������������������������������������� ��� ��

���������������� ���� ���#�� ��

! �� ������� � ������������������� ������$���������

����� ��������������%������ �� ���������� ������������

���������� ���������������������� ����� ����������

&������������ �������������������������������� ���

������ ������������������ �������� ���� ������� �� �

�������

' �� �������������� �� ��������������������������

���������� ������ �������� �� ������� � �������

��������������� �������������������� ������� �� ������

���������������������������� �������

&���� ����� �������� ��������������� ���������������

��� ����������������� ��� ���

&���� �������������� �� ���� ������� ��� �(�������

� ���� ���� ������� ��������� �(���������� ���� �� ��

�������������� �������������� ������)

*� �������������������� ��������������������� ����

�������������������������+����,�������� ����

���� ���� ����� �������������

-����������������������� �������� �.*/�0�.*/���0���

��������$����� ������ ���0������/�1�����2��

��������������

/� 3�0��������0���������� �� ��������� ������������������

�������������������������������� ����� � �

������������3�&��

3. Digitization of the object information contained in the

electrical signals provided by the PMT. (For presenta-

tion, the image data are issued, pixel by pixel, from a

digital matrix memory to a monitor screen).

'������*������������� ��������� ������������������

� ���� ������� �� �������

������������� ���������������������������������� ������������� ����� ������������������������������������� ����������� ����� �� ���� �������������� �������������� ������������������!"��������������#������������������$ ���"���%������������������������� ����������� �������� ������������������������ ����!���� ����������������"����� ������ !�������������� ����������� ��������������� �����������������"��

Digitization

Object Image

Pixel size

ideal optical theory

Noise

Detector, laser, electronics,Photons (light: quantum- noise)

Resolution

Confocal aperture

Resudial optical aberrations

pupil illumination

Page 4: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

3

����� ������ ������������� � ���� �(����� �����

���� ���� ���4�������������� ��������������� �

��� �(����� �����5��� ����������������������� �� ��

�������������������� ���������� ������������������

������������������� ������������������������������

�������������������������������� �����������������

� �������� �����������& � �������� ���� ��� ������

����������������������������� ������������������

�� �������������� ��� �� ������������������������

���������������� ���4� ������������"�� ��������

� �� ������������ �4� ����� ������ ��������

����

& � ���������� ������ � ������ ���� ����� ���� �� �

���������� ������������������� �����������������

����

&����������� ����� ���0���������� ��������� ���������

������������������������� ���0���������!���6������

����������� � ����! �������� ����������������

�(����� ����������������������� ������������ ��� �

� ������� ��

&������������������������ ���� �� �������� �����

������� ������ ������� � ���������� �� ����������

����������������� ��������������������� �(������

������������������������������������ ����� �(���

����� ���������� � ����"������������������� ���3�&�

��� ����������������������������������� ����&�������

� �������������������7��������������������������������

�������������� ��� 4����� ������ ����������� ���

&�������������� ������ ���������� ����������� �

���������������� ������ ���� ������ �(�����������7����

� ����������������������� ���� ��������������������

�(����� ��������� ��� �(������������������������� ����

�� ����� ������&������������� �� ���������

����'������/��

&������� ���� ��� ����� �������������� ������� �� ��

(����� ���� ����������� ������������0����������� �

������� ���8�(����������� ���������������������������

�������&����� ���������� �� ������� � �������������

������������������������� �����������

5����������������� ����������������������� ��� �� �����

������������� �����������$����������-������������

����������� ����������������� ��� �� ����"�������

����������������� ������������������������������

�� ��������� �����

�����&��'�������������������� ������%�������������#���������������������� ���������������������� �(������$������ ����!��� �����$��� ������ ����������������������� �����������#���������������� ������������������������������������������� �������������������(�� ������������������� ����!���������������� �������������������� �� �(������ �������������������� ��)�������$��������� ���� ������������ �������������������������������� ������� ������#��������������� �� ����������#������������������������� ������������� �(�������� � �������������������(������������������� �����)�� ��� ���������������������������������� �����������������������!��������������������������

�����

��������

�������������

����������

�������������������

�������������

������

������������

!�������"����

������������

Page 5: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

4

����������� ���� ������������ �� �������� ��0��������

�����������9 ����������9� ��� ���9����49���������������

���������� �*::�;��������� ��4� ���� ���������� ��

�����<������������� ����� �����������4����6������� ��

�������������������������.::����

&�������������������� ������� �� ������� ����

� ������ ������� � ����� ��� �)����� ������ ������ �

������������ � ������������� ���9����49��� � ����

������������� ����������� ���������6������� ����� �

������������������� ������������ ��� ������������� �

�������������� �(�������

<��������� ����� �������������������� ����������� ��

��� ���� ������ �(��������� ��������������0�������� ���

��� ����������� ���� ���� ������� ����������� ��

������������������������� ������������������

���� ������������������������������������� ����������

�������������������������0���� ������� � ������� ��

�������� ���������������� ���������'������1��� ���

"�� �� ���������������� ����������� �������������

9����49����������������� � ������������������������

����0������������ ���������&���� �������� �� �����

���� �����������������������4��������� ����� ��

����� �� ������������������ ������ ������ �������

���� � ����-���������� � ����� ���������������� �

��������������� ������������������������ ����

������� �����

-����������� ������������������������������������ �

��������������� �� ������� � ������ ����� ��1 ����

������0�����

'������1���� ������������������� ���� �� ������

����� ���� �� ������� �� ������� ��� �� �������

���� �������������������� ����������� ����� �

�(�����

1 See also such methods as multitracking, in which the channels in theoverall image appear completely separated thanks to their sequentialrecording (no 'crosstalk’).

Fig. 3 Non-confocal (top) and confocal (bottom) image of a double-labeled cell aggregate (demonstration object). In the non-confocalimage, specimen planes outside the focal plane degrade the informa-tion of interest from the focal plane, and differently stained specimendetails appear in mixed color. In the confocal image (bottom), speci-men details blurred in non-confocal imaging become distinctly visible,and the image throughout is greatly improved in contrast.

Page 6: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

5

�������� ��� ������ ��������� � ������������������� �

������ ���9����49������������� ��� ������ ���������

�� ������� ��������������� �������� ��������������

� ���������������������� �����������������������

��������������� ����� ������� ������0���6������ ��

�� ����������������&������������1 ���������������� �

�������� ���� ��� ��������������������� ������ �(����

&���$���������������� ��������� ���� ��������� �

��������4��� �������������������������������������

������������ ���������������������6�������� ��=�:�.0

�������������4�����5��� ������ ������ ������� �����

�(��������������������� ������1 ��������1 ���� ��

������ ������� �� ���������� ������� ������� ����

�������'������>�� �����0����� ���1 ����������

1 ���� ������� ��� ��������� �����

�����*�����+�%������������������������,-���������������� ������������ ���������.������ � ����������������������/������������ �������&01���������������#������������������ �� �������������(������2����������'����+�3��#������������������,-�������� ��������������������������������������

"������� ���� �������� ��������������������� �� ��������

������������� �������������������������������

������ �� ����%����������$����� �� ��� �� �������

����������������������� ���� ���4� ��������������

�� ������� �������� �������#�������$�������������

������

&���� �� ��������� ���3�������������������������� �����

� ����� ������� �� ������������������������ ����������

� ��� �������� ���� ��������������� ��������������

���� ���� ���� ����� ���������������4����3������������

��#������������ ����� ������ 4����������������#������ �

����������� ������� ��������������������������������

�� ������ ����� �� ����� �����������

&�������� ������*>��� ������������ ������������

������ ��3������"��������� �������� �������������� �����

������������������������������� ������� ��� �����4

����

Page 7: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

6

Page 8: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

7

�����

��������������������

������������ ����������

& �������������� ���������� ������������������ ��

� �� ������������������������������ �������� ���� 4

���������������� ���������� ��������������� �����

�� ������ ������� �� �����������"������ ������� ���

������� ���������� ����� �� �������������� ��

��������� ����� ������ ���������� ��������������� �

� ����

? ��������� ����������� ���������� ���������������

���������������� ������4�� �(������� �����@��������

����A���������� ����������������� ���������� ���

�(���������������� ��������������� ��9����9��&��

����� ���� ����������������������$�����������������

����� ��������������� ���3�'������������������������

��������� ������������������

-��������������������� ������������ ������� ��

� �� ����������� ���������������������� �� ���������

1 ������ ������1 �3�'�

��������������������� ��������������� � �����������

�� ���� � ���� ����������� �� ����������������4���5�$

63��� �4 ���������6��������1 �3�'��� ��� ������4���� ��� ��

������������������

"��������� ���������� �������������������������

�� ���B������������������������ ���� ������� ��

�� ����������� ������1 �3�'��&��������� ������1 �3�'

��� ���� ����������������������� �� �������� �����

���� ��/�*�*�����������0��� �� ���������������������

� ������������� ������ �(������A��������������� ��� � �

�������� ����������������� ����� �� ����������0��� �

����� ������������� ���������������� �(��������������

���������������$����������� �������� ����� �(���������

���������4���5�$�63��� �4 ���������6��

5���������������������������������� ������������ ����

� � ��������� ��������� �������� �����������������

�� ������������������������������������� ��� ���������

�� � ��� �(�������������������� �������������������� �

������������#����������� ���������� ����������������

��������������������� �� �������

' ���������� ���'������.�� ����� ������� ������� �

�+6����+,������ �����������1 �3�'�

'� �������������� ����������������������������0����� �

����1 �3�'�����������CD�.�E� ������� ����������������

����������������� �����������������������������������

��� ��� ��� ���' ��� ������� �� ���� ���� ����� ����

������������4��������������� �����������������0����

��� ����������� ��� ��� ��� ���������������������������

���������������������� ������1 �� ������������0�����

������������� ������ ������ ����� ������������

�0�����

����0��������������������,-!3������2����������7������������89!���������7����������������:��������� ���������������:�������� � ������ ���$���������������� ������� �����%�������)����!��� ���$������������������� �����������������������������,-!3������������������������������ ���� ����������

#

Page 9: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

8

��������

��������������

"����������� ���������� � ������������� �� ������

����������� �������� �������� � ���� ����������� �

����������� ����� ���&���� ������������������� �(���

����"������������� ����������' ���������� ��� �����

������������������ ��������� �(������A�������������% ��

����������������� �� ������������������������ ����� �

�������� ����"������������� ����������������������

�������������������������F���!���6������� � ��� �(���

���������������������������������������������������

��������� ��� ������ ������������G�

&���"������������� ������������#��������������������

�����0������������������ ������� ����� �����*

������� �� ��������� ������������������������ �������

� ����������� �� ������������� ����� ��&��������� � �

�����������������*2�H��������������������

&��������������������������������������������� �������

� ��������� ����#���� �*��� ������������������� �����

� ����&������������������������� � ���� �������������

����� �������&�I�.�/������������ ����� ����� ���������

@������������������� �������&�≤�:�.7

������ 4���������� ���� ���� ��������� ����� �

&=*�1���&���������� ���������� ����#������"��������

�"<���'� ��&�=��1������"������������������ ���������

������������������������������������������ ����� ���

� ������� ��������������� ���� ����5����� ���������

������ ������� ��������������� ���������� �������������

��������������� ����� ���������������������������

J�+�������� ���� �����/�������� �� ���������� �����

����������������������������� �� ������������������

���������� ��������������0��� ���&������������

������������������������������&���� ��������������������

�������� ����������������������������������B0����)�������

�(������������#��.:E� ���������������������������������

��������� ���CE��� ���� ��� �� ������� ���������

"������������� ���K�������������� ���� ��� �� �.E������

���#�������� � ��L:E� �����������������������������

�������������������� ���������� 0���� ��� �� � �

���� ����������������� �7������� ����� ��� ���������

������������������� �������0����� �������������� �� ��

�������������*:E�

&���������� ����� �������������������� � �����������������������������&=�������

�����

7��������������������������

)2

( 21 �

−=η ��&���������������������������0����� ������������������������ ��������� ���� ω⋅λ⋅=��

��� 71,0 �������

)1

1ln(14.051,0

η−⋅+=ω � With T< 0.6, the Gaussian char��������������&I*�����"���������������� ������������������

������������������ �� � �

Diagram 1

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

Truncation Factor T>5.2 (Airy)Truncation Factor T=1.3Truncation Factor T<=0.5 (Gauss)

Intensity distribution at the focus

Lateral distance [AU]

Rel

ativ

e in

tens

ity

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

0.09

0.18

0.27

0.36

0.45

0.54

0.63

0.72

0.81

0.9Efficiency

Pupil diameter [mm]

Rel

ativ

e ef

fici

ency

Page 10: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

9

������������������� ����������������������������������

�������������������������������������������

��������������������������������������������������

���������������� !"#�������������������������������

�$���������%&'���$������������

(������� ���� �WRW"������������������$�����������

$�����������$���������� �����������������������

$����� �LOO)�$�������������"�������������������$��

�� �GHW)�$���������"������������#�����������* !

���������������������������$���������+������

$�,��������$���������������������,����$���#���

�������$�,��������$���������������,��������

�������$�����!�����������#��������������$�����������

����������������+

)z,y,x(PSF)z,y,x(PSF)z,y,x(PSF detilltot ⊗= (1)

� �LOO������$�����������������������������������$

�������������,����-����.�����������������������������

��������������������������������$����������������

��$���,�������-������������������������������������

�,������$�$������������������$�$�������������"�������

����������������$�������$�������������������

�������/0�+�-���������#����������������������#

������������������.����������������������1��!�����#

� �LOO������������������������������������������2����

���������������$�������#���$�����������������������������

�����������������3���������������������������

����������4���������������������������������$������

����$��������������������/51"�

� �GHW����������������������������������������#��������

����#�������$��������.��������������������$��������

����������������--"#����$����������������������$��������

����������������.�)���������� �GHW������������������������

������������ �LOO��(�����������$�$����������������

* !�������������������������������������� �LOO����

� �GHW��!�����������#��������������$��������������

���������⊗"�����������3�����#�� �WRW�≤�� �

LOO��

������$�������������������������#�����������������

�����������������������$�������������������������

$�������������

-�������������������#����������������������������

���3��������������

���������$������������������#���������������������

������$����������������������$�����������������-

��������������$��������������6�$����#���������

��������$������������7����������������������������

�����������$���������#��������������������������

�����,��������������$$�����������������������������

����������#��������������,�������������������

��$$�������������$������������$���������������

�����������������$���������$�����������!(�����

�����#������������"�� ������������������������������

�������������������

������������ ����������������� �������

������ �����

���������3���������������������������$�������

��$��������������������������* !������$�������#�����

�����������������������������������������,�������

�����������$�����2�����������#�������������������

�����������������������(��������������������������������

������������������$�$�����������������������������������

�����$���������������������������������$�����2���������

�����$�#�����������$���������������������������

$�����2�������������,�����(������������������

�������������������$$���������$�������������������

������������������#����$��������������$������������

��������������������������$���������������������

$�������������������������8��9���9�:����������;����

��������� ������������ ��"#�������$���������������

$�$������������������������������������������������

��������������$�������������$�������������"�

(��������������$�������������#��������� �GHW��$�

$����������������������������� �LOO��-��������������

�� �<�&�=%��9"#����� ��������$$����������3���������.�#

���������$�������������������������������������

������$�������������"�

�������>��������������������$���-�����������������$���

���������������������������������� �LOO������ �

GHW��

��������$���������������

Page 11: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

10

�����/��<������!������ ���������(��!������ �������� �������=82���(>���������� ��������������������������������%�����!��� � �3��GHW������)������ ������������������������������������3��LOO ����

��������� ���������� ����#���3�'GHW������������ ��� ���

����������������� ������� ������������� �����

� �� ������� ��������� ��������4���� ��� �� ������� ���

���������������� ������ ������ ��� ���� ���� �

������������������� ����������"�� ���� �����������

� ���� ������ ������ ������� � ����������������

������&���� �� ��������� ������������������������

�������

����������������

��� ������ ������������������ �� �����������0��

$�������������������� ������ �(���������������������� �

����� ������� ������� ��������� ����� � �����������

@����������������� ����� ������� �� ������� � ������

������������� ��0��������������#������������ �����

"������4����������"�� �������������"����������"<���

��������)

����

λ⋅= 22.11

NA = numerical aperture of the objective

λ = wavelength of the illuminating laser light

&���"������������������������� ��� ����#������������ ��

��������

&���������� �������������������� �������������� �"<�

��������� �� ��������������A�� ������������ �7������

������������"������4����� (������ �� ���������� �����

���� ���� ������������

"�� � ���������������� ��� ����#�� ���������0��

������� ������������ ����������� ���������� �����������

���������3� ���������� ������K�������������� �������� �� ��

�����0���� ����4� ����K�������������K<�)

21

��

���

λ⋅=

n = refractive index of immersion liquid

&���K���������������������������� ���������������������������� �� ������ ���������������4�������� �� �������

FWH

Mde

t, ax

ial

FWHMdet, lateral

FWH

Mil

l, ax

ial

FWHMill, lateral

a) b)

Geometric-optical Confocality Wave-optical Confocality

PSFdet>>PSFill

PSFdet>PSFill

PSFdet>=PSFill

c)

Page 12: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

11

�������������� �������������

��������������

K� ���� ��������� ����������� ������������3%�I�*"<��

�������� ��0�������������������������� �������������

0������ ��� ������������������������ ������������

�(����� ������� ������������� ���)����� ��������

�� ������������0���� �� ��3�'LOO������������������������

��������� ���� �����

M��������������� ���� ���������� ������0�����������

�0���� �� ������������������ ��� ��������������������

������������ ��3�'LOO��8����������� �� ��� � ���� �

��������������� �������� �� ������$��� ������)

"0��)

)(

88.022

,����

��� �����������

−−

λ⋅= (2)

��?�������������$������������� ���� �@%�?�������� ����������

���������������#���� �λH[F�?�(�� �����������$��������� ����

���?"�O�:�.���$��� ���/����������� 0��������)

2

.67.1

��

� ���λ⋅⋅≈ (2a)

�����)

�� ��� ���

����������λ

= 51.0, (3)

"�� ����� ������� �$��� �� �/�� ��� �1�� ��� � �� ���������

�� ���� ��4� ���� ��� ������ ��� ����������� F1G��� ��� �

���4������ ����������������� ������� ������������ �� ��

���� � ���������� ���� ���������������� ������ �������

������ ������� �����������0��������� ���������� ������

�������� ��� ����� ������ ��� ����! ������ � � ����� ��

����� ��� ��� �������� ���� � ���� � �� ��� ��� �������

����� ��������� ����������� ���� � � ����� ��� �� ���� �

���������� ���λHP2λH[F����������� 4�������

�������� �����������

8���������������4�������������������� ���������������

������ ���� ��������� ����������������� ������� �

�� �� ������������������������ �������������� ��������

� ����������� �������������������������������� ������������

�������� ��������������������� �����������������0�

������������3�'GHW��&���� ��������������� �������������

���������������� �� �(���������� ��������� ������ ������

�� � ���

%������������������ ������� ���� ������������������

���������� ���������������4��������������������$��

�� �)

22

22det,

288.0

⋅⋅+

−−

λ⋅=��

���

���� ��� ��

����� (4)

��λHP ?���������(�� �����3A��?���#��!��������� ��������=B�>������?�������������$������������� ����@%��?�������� ����������������#����

B$��� �� �>�� � �� ���� ���� ������ ����� ����4��� � ��

����� � �� ������� ������ ��� ����� ������ ������ ' ��

������ �(��������������������� ���������������������

������ ����� ������ ����� ������ ���� � ��� �� � ������ &��

�� ������� ������ ����� ��� ��� ����� ������ ���� � ��� �

� �����7� � �� � ������ �(������� ��� �� ����������� �0��������

����������� �����������

��4���������������� ���� ������� ������� �� ������������

�� � ������ ����� ����� �������� ������ ���������� �� ��

���� ��� ��������� "� ���� ���� ��� �������� �� � ���������

������ ���������� �� ���� ��� ������ ���� ������ ����� ����4�

�����������

Page 13: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

12

������������������� ������������������������������

� ������������������� ��� ������������������������������

������������ ������� ������ ��� ����������������������

�� ��������������������� ��������������������������������

��������������������������������������������� ������

Diagram 2 Axial optical slice thickness as a function of the pinholediameter (red line). Parameters: NA = 0.6; n = 1; λ = 520 nm.The X axis is dimensioned in Airy units, the Y axis (slice thickness) inRayleigh units (see also: InfoBox "Optical Coordinates"). In addition,the geometric-optical term in equation 4 is shown separately (blueline).

����������� ��������������������!�"� #�������� �����

������������������������������ $����������

������������������������%&'LOO�����%&'GHW�����������������

����������������������������� $���������� �����������

��� ��������!� #��'������� ����������������!� #������

����������������������(�������������������������������

������������������������ �)&*�

)���������������+�����������������������������������������

�� ����������$����������%&'GHW�� �������������������������

�(�� $����� ����� $��������������� ��$�������������,���

����� ���

� ������������������ ������������������������ ��������

�������� ��������������������������� �)&*��-������������

������������ ����������'./*GHW�D[LDO����,��������� ���������

�� ������������������� $���� $��� �������$����������

� ���������������������$���������������0������0��1��

����������� ��� �� �����

-���������� �������������������������������23��"� #

������� $�4�������� $���� 4����������������������������

��������� �������� �������������������������������� ������

��������5��������������������%&'GHW������� �� ��������5�����

�����5�������������������������������%&'LOO��6����� ������

������ ���'������7���

-������������������� ������� ����������������������� ���

���� �������������������(������������������������������ ����

��������%/�8�3�������������������������������� ������-�

����������%&'GHW�����%&'LOO������������� ���������� ��%&'

( )2),,(),,( ������������ ��� = (5)

-��� ��������������5���������������������������$�������

��5�������������������������(������������� ������ ���λ��������������������� ������ � λ ����������������$������

�$��������������� �������9

� ���

����

222

λ+λ

λ⋅λ≈λ (6)

������������������������1�������������������������(�� ����

����� ��� ����������$���������������������������9

(�� ��9

)(

64.022

,����

���� �����

−−

λ⋅= (7)

-��: �2�3�"�����������;������������(��������$

228.1

��

� λ⋅⋅≈ (7a)

Lateral:

������ ������

λ= 37.0, (8)

2 For rough estimates, the expression ���� λ⋅λ≈λ suffices.3 It is not possible to transform eq. (4) into eq. (7) by forming a limit(PH→0).

1.2 1.48 1.76 2.04 2.32 2.6 2.88 3.16 3.44 3.72 40

0.7

1.4

2.1

2.8

3.5

4.2

4.9

5.6

6.3

7

Pinhole-diameter[AU]

FWH

M[R

U]

Page 14: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

13

F? ��)�-�������� �(��������������� ����������� ��������

� ���������� ����������� ������$��� ��L���:�>.�������

��:�D>������:�CC�������� ��*�/C������$��� ��L��' ��

��� ������������ �������������4�������� �� ��:�L������

��������$��� ��L��&����4�������������������� �����

��� ������������������ ���������������4������������� �

��������� ���������������������������G�

'� ���$��� ���L������L��������������������������� �

���� ��������������������������������������0��� ���������

���� ����$����������������$���� ������������������ �

������������������ )sin(α⋅= ��� � ������ �(�������

& ��������������������� ���� ����������� ������� ������

� ���� �(������������������������ ���������������

����������������������?"��

"���?"�I�*���� ������� �������������������� �

��$������ �� ������ ������������ � ������������������

� ���������������� �� �(������������ �&����/��

"�� ���� ��������������������� ����������� ��/�*

� ������0�������������� ���� �����������������

3%=:����������� ����������� �� ��*�>�

'����������� �������� ��������������� ����������

����������� ����������������� ���������� ������ �

�� �� ���������� �������������������������B$��� �

�L������C��������������������� ��������������4��

������������ ������� ���� ���������������

'� ����������� ��������� ���������� ��������������

������� �� �������3%=:������������������� �3�������

������ �������� ������ �������������$��� ����������� �

3%=:�� ��������� �������������������� �*�"<��� �

� ����� 0���� ���������������������������� ����

�$��� ���L������C���&������ ������������ ���������

���� ������������������4����� ��������1�

�������� ����� �������������3%�O�*�"<����������� �

�������� ���������������4�������� ���� ������

� �������������&�������4��� ������ ����������������

���������������������� ���� ���� ������� �����������

&����������������������������������� ���������� ���� ���

���$��������������� ����� ������������������ �� �

���������������4����% ������������� ����� ������� �

���� ���������������������*�"<�

0��PPPPPPPP������������� � � � � � � �

Diagram 3Theoretical factors for equations (7) and (8), with pinhole diametersbetween 0 and 1 AU.

& �� ����������� ������ ��� ����� ���� ����������

���������� ��� ���������� ���� ����&����*��� ������

�������� ������� ������������ ���������� �������3�����

�������� ���������>�� ������*.�� ������ �����

������ �� ���������������4���� ������� � ��� �(������

��?"�=�*�>������=�*�./��λ�=�>CC��������������>�������$��� ���L������ ������ ������������ ��

(����������������������?"������

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10.35

0.46

0.57

0.68

0.79

0.9

Pinhole diameter [AU]

Fac

tor

Page 15: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

14

�������

�������������� ������ ���������� ������

�������∞���������� ������

���������

��������������� ������������������

��� ����������������������������������������������������� ���������������������� �������������������������������������������� �������������������������������� ��� ���������������� ������������������������ ��� �������������!��������������������� ����������� ��������������������� ��������������"������ ���������������������������������������� ���#������������������������������������$�������%������������������������������� ��������������������

��������������� ���������

2

2

2

2880

⋅⋅+

−−

λ⋅��

���

�����

� �

&��������������� ��'�()����� ���������������������������� ����� ����� ��*+,'GHW-��. ��'�()�������������� ������������������������������������ ����������������������������� ���� ����(�����+(����� ���������� ������������ ��������������/��

��������������� �������

�����

22

640

−−

λ⋅

. ����������������� ��'�()����� �����+,'�0�� ����� �����������������������������

λ ����������������������� �������

� ����"����������������� ���"���������������. ��������1�23����������������������������������� ����

4��5"������������*�������������� �������-

2��

� �λ⋅

&��������������� ������ ����� �������������������������������������617���� ���"����������������������������� ��� ���������8��� ������������� ��������������� ����������������������������������������������������������� ������������(������������������������� ��������������������� ������������������������� ����������

4��5"�����������

�����

� ��

22

880

−−

λ⋅

'�()����+,'LOO�*������������������������� ������������ ��������������� ������-��������������

9��������������� ����� ��

4��5"�����������

�����

22

640

−−

λ⋅

'�()��������+,'���������������

5�������������� ����������������������������������� ������������ �������������������������������������

:��'������������;�'�()����+,'����� ������������������*�����������-�0��������������� ���� �������

267.1

��

� �λ⋅⋅

:��5����"����������4������95�<�1�=

267.1

��

� �� λ⋅⋅

:��5����"����������4������95�<�1�=

228.1

��

� λ⋅⋅

3��>�������������

��

�λ⋅51.0

'�()����� ������������������������ ������������������0�������������� ��� �������-����?@A����������

3��>�������������

��

�� λ⋅51.0

'�()�����+,'LOO�*������������������������� ������������ ��������������� �������-�����?@A��������������������� ��������� �� ������ ������ �� ���� ����������������� ������

3��>�������������

��

λ⋅37.0

'�()��������+,'����?@A����������

����������� ��������� �� ������ ������ �� ���� ����������������� ������

������������ ���� � � ��������� ������ ���� ������ ������������������� �� ���������� ��� �� � ��������������������������������� ��� �������!���������� � ���������������"�#������!��������!�

$���→�#%�������������� ������&�∞����! ����� '� ����������� ����! �����&�(�)���� � �

Page 16: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

a)

Var

iati

on o

f pi

nhol

e di

amet

er

b)

Var

iati

on o

f nu

mer

ical

ape

rtur

c

) V

aria

tion

of w

avel

engt

h

d)

Var

iati

on o

f ref

ract

ive

inde

x

15

Diagram 4 (a,b,c,d)

Page 17: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

16

Page 18: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

17

�������

������ �� ���������� ��

�������������

�������������� ��������������������������������������

����������������� ����� ��������������������������������

������������������������������� �������������������

���������

����������������������������� � !"�����������������

��������������������#����������������������������

���� ������������������������ ������� ��������

���������������� � �$���������%�� �������&&'�����

���(���������������� ���������������������������#��

���� ������������ ������������������������������

���������������������������� ����

&������ ���������������� ��������� ����������������

���������������������� �������������� �����������

���������� ����)������$������(�������������������

������������%����� ����� ��#���������������������������

������������������� ������������ ���������� ������������

)��������� ���� ������������������������� ������������

������������������������ �� ������������$�����������

���� �� �� �(������������ ��� �������������������������

������������������������������������������� ����

�������

��������� ������������������ �� ���������������������

����� ��� ���� ����� ���� ��������� ��� ������ � �%�� ��

�������������� ����������������*�����#��� ����������

��������*���������������������� �� �����������������

���+�,��-�$���� ������������������������� ��(��#����������

���� �������� ���������� ��� ���� ���� ����� ���� ������

����� ������ �����������������%�����������������

�����������������������������������������#�������

����� ��� ��� ��� ���� ����� $���� ����(� ������� ��� ���

�%��������������������������������%���$����.�����/(�

����������������������������������

������� �����*������������������������������������ ��

���$�"#(��#����"#������������������ ��������������*���

���������$%(������������ ���������� ����������$�(��!��

�� ����������� ������������������ ���������������������

�������������������������������$%�0��•�VFDQ

(���#����"#

������������� ���������������� ������ �����������

#�������������� ���������� ��������� ����� ��������

��� ���������� �$�1'(�������������������������������

����������������)����������������������������������

$%� �(�$.�����2(�

Fig. 7 Pointwise sampling of a continuous signalT = spacing of two consecutive sampling pointst = time of signal detection (t<<T)

#���)�� ��������������������������������������������

�������������1'��������������� �����

• !�� ��3�#�������$�(��������� ����������$��������

����(������ ��������������������$#(������� �

$%� ����(�$����.�����2(�

• ����������3�#������� ��������������������������

�������������������������%� �����

���������

t T�����

Samplingof a contionous signal

Page 19: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

18

�������

�������

. �����������������������������������������������

������������ ���� �������� ����������

&� � ��������������������������� �� ��� �����������

$� ���������������0�� ���������������� ���������(��

������������� �������������������� �������������

� ������������������������% ��������������� ��������

�������%�� �������� ������������. �������������������

���������%�������45+���������������������)���

������� � !"�������������� ��������������������

6,�7+��8��������4//���� ���� �������������������*�����

����������� �������������,++�98�������� ����������

����������*������� ������������������������������

��*����������������� �����������������6++:�

8�����&�����������;<%16�78������������������������

�����������������������������������������������������

7�,/���6+��81��=��#���������������������%����������

����� �%����;�<4���6+���������1��=������������������

� ������������������������������������*�����������

���� �� �����������$%����� �������7��8���

4//���(����������� ��� �������������7+����������%����

����������� �%����� ��7�4/���6+����������1��=��������

�������������������������������

#����������������� ����������������������� �������������

������� � !"��������������������������������������

��������������������� ������������ ����������

��� � � ����

#��������������������������������������� �����������$.(

�������

#�������������������� ���� ��� �����������

������ ��� ����������������σ ������� �����������)������

�� ��>�����������%�������������� �%������ ���3

���� ⋅⋅σ= �?������1���@

������ �������������������������������������������

����������������%������������� ���������������� ����

�����������������%������������������������ �����

��������� ��� ���������������������������������� �

���������������#�����%������������������������

������������ ������$0������������(���������%����

�������.���� ���������������������4�4������$���*������

���������������������������������������(��A�������

�����������%�������������������� ����������

7�72���6+��������1�����#���������������������%������

������� �%����6�7;���6+���������1��=����

����������������������6�7;���6+����������1��=��������

� ����������� ��� ��������������������

������������������%�������������� �%�� ��������

����������������������������������������B�����������

��������������������������������������������%�� ��

���������������������� ����������������� �����������

�����,++�98��������� ��6��8��'������4��������������

��������������������%�������������� �%��������� ����

������������ �����������������*���������������� �����

���4//�����'������;� ��������������%������������������

�������� ����������� ��� ����#�����������������������

������������%���� ���������� �����������������

��������������$ ������������ ��(�

#������ ���� ��� ��������������������������������������� �����������3

���������%�$��( σ16+��� >� σC>16+���

D������� ,,4 <�7, +�2/ +�56

. �������� 45+ 7�,, +�26 6�/6

#�%���D��� ,5; <�< +�,6 6�;/

&��<�6/ ,,+ 4�52 +�64 +�;5

&��,�6/ ;,+ 2�;; +�6/ 6�<2

!�����3�E�����������F� ���� �&������ �"�����������7;/�18�������

��������%�� ����������.�0�6�6,���6+���������1�������66,�������19���

Page 20: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

19

Diagram 5 Excitation photon flux at different laser powers Diagram 6 Excited-state saturation behavior (absorbed photons) of fluorescein molecules

8���������������������������� ���� ����� ����������

�� ��� ������������������������� ���������������%�����

����������������� ���������� �������������)����������

����������������7�2���6+����#������������� ����������

�� ��� �����������������������%�������0�7;�+++�����

$ n Q Q b= / (����������������������

8���max�

�� = ������������������������%����������

�������������������������� �������������� ����������� ��

�� �����������66,�9��

�������������������������������������%�����������

����������������� ��������� ���������������������

������8� ������������������������� ������������ ����

.D���$� ������������������������������� ������(��%���

����������������� ������������������� �� �������������

���������������� ��������������������������������%����

���������������������� �������������������������

�����������������

��������������������������������������������� �����

����������������������������� ���������%��������

������� ��������������������������� ��� ������������

�������%����������������������$�����)�������(�������� �

�����������)��������� ����������������������������

����

����������� ����������������������������������������

���������������������� ���������������������������� ��

�� �������������������� ��������������������������

�� �����������/+:���������������� ������������������

������*��������������$G��0��6�7(�

8���������� ���������������������������������������

�����)��������� �� ���������������)���������������

��������"#�������������������� ���������6+:�����������

������������������������������������������������

� ��������

��������%�� ������������ �%����.�0�66,�������19�����

����� ����������4�9���1%� � ��������������6+�������

�������1%� �

��������������������������*�������������� ������ ��� ��

�� ��������� ��������� ��� ������������ ������������������

�� �������������� ��������8��������� ������������

��������������������������������� ��� �����������������

��� ����� �������������� ���������������������������

�� ���������������������������������������� �����

������� ��� ���������� �������#���������������������

����� ��������$0����������������(�����������������

������� �%����� �����������%���������������6++�98�

8���������� ����� ��������H�0�6<�;���6+��������

λ�0�4//��������G��0�6�7����������������������������

���6�9"� 1 ��������� ����� ������������/+������� ��

�� ����#�����������������������������������7/+����

��� �������1%� ��8��������������������������

+�6�9"� 1 ��������������������� ���������������

7/1%� �

�����������������������������������������������%�����

�������� ����������������� �� ���������������������

���������� �$I�6+++(����������������������������������

������������������������������������������������

����� �������������������������������������

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

2.14 1023

4.29 1023

6.43 1023

8.57 1023

1.07 1024

1.29 1024

1.5 1024

Laser power [mW]

Inci

dent

pho

tons

[1/

s*cm

²]

1 1017

1 1018

1 1019

1 1020

1 1021

1 1022

1 1023

1 1024

1 1025

1 1014

1 1015

1 1016

1 1017

1 1018

1 1019

1 1020

1 1021

Incident photons [1/s*cm²]

Abs

orbe

d ph

oton

s [1

/s*c

m²]

Page 21: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

20

��������������)��� �����������������������������������

��������������������������%� ��������������%� ����

�����#����������� ����������$�������������������� ���

������� ����(����������������������������������������

����%� ������#�������������� ����������������������

��� ���$������� ����������������� ����������������

����%����������������� ����������������������(�

F������ ����������������������������������� ����������

����������������������������������������� ��8����

���� �����������$������ ����������(��������������������

�������������������� ������������������������� ����

����������$!GD(��#����������&�� �J����������� � !"�����

����������������������������������������� ���.������

����������� !"�,6+�������� ����������������������%�

�����%����� ���$�����2+:(��#������� �����������������

����������������������������������������������� ��

����������������������%� �����

��������������������������������������������������������

���� ��� ���������������� ������������������������

������#����� ����������� ����������$.8E"ODW(���������

������� �������� ������������$�����)������<(�

#��������� ���������������������������������������

����������������������������������G�)������������

�������� ������������������� ������������������

���� ����� �����������������������������������������

�� ������������%����%� ���������

�SL[0�+�,�%�.8E"

ODW��$���+�7,��-(�

�����������������%�� �������������������������%�

������������� �����4�%�4�%� ������������������������������ ��

8���������������*����$�������� ������������(�����

������������� ��������������������������������� �

$.�����/(�

�������������������� ���������������������������� ��

����������������������G�)������������$�������� ��(�

���������������������� ���� �����#�������������

.�����5�������� ��������������� ����������������������%�

�������������������� �����������������������$�����

��� ��(��������������������������������������������

���������������B���� ������� ��������������%� ����

���������������#����� �������������������������������

� ��������������� ����������������������������������

���� ����������$�����������<(��-�������������� �������

���������������������������� ��$� ����(��������� ��������

���������������������������������������������)�� ����

���� ���)�� ����������%� �������

Fig. 8 The graph illustrates the scanning of a two-point object withthe minimum number of sampling points needed to avoid a loss ofresolution (spacing of sampling points 0.25 AU).

0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75

AU

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Rel. intensity

Page 22: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

21

Fig. 9 Undersampling, correct sampling and oversampling of a continuous signal

��)�����������������������������������������������

��%��������������� ���������������������������F�

���������������������� ����������� ���������� ���� ��

�������������� ����������������������� ���������������

���������� ����$�����*���� ���(��������������������

%� �����$��������������������%� ����� ��(��#������ ��

��������������� ���������� �������������� ������������

���������� �������������� ���������%� �$���������%�� �

�� ��(�

��������������������������&�� �J����������� � !"���������

��� �������� ��������$%� ����(��.������������������� �

�������������������������G�)������� ��������%� ����

�3L[���������*��������������

.�����&�� �J����������� � !"�������������� ������� ��

������������������ ����������������������� ����������

��������������3

������ ����������������������������

���Pix

⋅⋅= 7.12

Number of pixels = number of pixels per line,Zoom factor = scanning zoom set in the software(Example: Zoom factor 2 reduces the edge length of the scanned fieldby a factor of 2),Magnification obj = objective magnification

.����%�� ������������������������;����4+%���������

��*������$G��0�6�<(����������������� �����,67=���������

�� ����%� �������������6++�����8�������������������

6������%� �������� �����;6,����

������������������%� ���������������������$'(�������

��������$'�0�4,/��������λ�0�4//��������G��0�6�<(�

������������6��������%�� ����� ����������������%� ��

�����������������������������������������%� ��������

�������������������� �����$%� ����� ����(��8�������

�������;������G�)������������������ ����������

E������������������������ ������������� ���������� �����

������������� ����������� ���������������������������

8������������������� !"������������&�� �J�������������

���������� ������������� �������� ���������������

�����������������������%� ���������� ���

$#�������������%� ��$K1L(�������������������� �����

��������������4�%�7�����7+4/�%�7+4/(�

pixel

0 10050 150

pixel

0 10050 150

inte

nsi

ty

0

100

50

150

inte

nsi

ty

0

100

50

150

inte

nsi

ty

0

100

50

150

pixel

0 10050 150

Oversampling Correct Sampling Undersampling

a) c)b)

Page 23: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

22

��������

#������������������������������������������ � !"

�������������������������$���������������������������

����(�� �������������������������������� ����$�����������

������ ��������� �(��������� �������������������������������

���������� �������������������������������� �������������

������������������������ ������������������������������

������ �������������������B���������������������� ���

������������������������

������� ����������� ���$.�����6+(���������������������

������������������"#�������������� ����������������

���� �����������$���������������� �� �� �(������� �����

���������������������� ���#�������������������������

�������������������������*�������� �������������

��� ���������� ����$ ���(�������������� ��������

$����(��#������ ����������������������������7��-

����+�+,��-������������������6��-�������� ��*���

�)�� �������������������������������������������� ����� ���

���������������#������������� �������������������

���������������

8�������� ����������I6��-������ �����������

$���������������������������������������(��������

��� ���������������� �������������

"��������������� ������������������������)�����������

��������������������������������������� � ��� ��8��

������ ��������� ��$�������������������������

M�6++++(�� ����������������������������������������

����)�� ������ ������� ��$�������������������������

I�6+++(��� ����������������������������� ����

#���������� ��������������������������������������������

����������������������� �������������� �����������

������������ �����������������8�����������"#����� �

$�����������E��������(������������������������%����� �

��������������������������������������������������

��� ������������������� �� ��������� ��������

������ ��������� �(�

#���������������% ���������� ��������������������������

�� ���������������������� ����� ����� �����

Fig. 10 As shown in Part I, small pinhole diameters lead to improvedresolution (smaller FWHM, deeper dip). The graph on the rightshows, however, that the constriction of the pinhole diameter is con-nected with a drastic reduction in signal level. The drop in intensity issignificant from PH<1 AU (AU = AE).

0.5 1 1.5 2x[AE]

0.2

0.4

0.6

0.8

1

d=0.05AE

d=0.25AE

d=0.50AE

d=1.00AEd=2.00AE

0.5 1 1.5 2x[AE]

0.2

0.4

0.6

0.8

1

d=0.05AE

d=0.25AE

d=0.5AE

d=1.0AE

d=2.0AE

Page 24: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

23

�������

����������� �

!������������������������������ !"��%�������������������

���� ����������������� ��������������������1'�����������

N������ �����������������������������������������3

�������������

������������������������������ ����������������� �����

�%������������������ ������������ �����������������

���� ������������ ��� �����G�����������������������

�������������������������������$GI6++++(��������

�������

��������������������������

#�������������������)����������������� ����������������

����������� h ⋅ ν ������������������������ ���������������

������ ���#���������������������������������������

������������������E�����

��������=∆ ����������� /=

�� � ��������� �������������� � �� ��� ����� ���� �������� ��������� �������� �� ��������� �� !������� ��"����� ����������#$�%������������ ���������� ������&�'(((#)�� ����� �������������������� �������� �� �����������"�� �� *

� ���� ���������� ������"����±√��$

G������������������

( ) ���������

���������

⋅=

λ

�� � �+,�� λ #���-�������"� ������� �� ����������. �/���λ 0'���������� λ⋅ /ch 0������/���. ����"0���������12����������

���� ������!����������"��#�������������

&������������������������������������ ��������� � �

���������������������������"#��#����� ���������� � �

������������������������������6�6�����6�7,���������

����������������������������������� ������ ���$���(�

O����� ������������������������������� ���������������

�����"#��� �������������������������� ���������������

��������������������� ������������������������������

�������� �������������� � ������

���$������

'����������������������������������������� ������� ���

������G����������������������������������������������

G���������� ��� ��������������� dN ��'���������������

�����������"#��� ��������6+++�HB����� ������� �������

��������� �� ���������������

'������������������������������ ���������������E�������

�������������������������� ���� dNN ≤ �����������*��������

������������ ��������������������������������������

��������������������������������������������������

��� ����������������� ����������B��������� �������

����� �����������������

������� ��������������������������������������� ���

���������������������������������������&&'������������

����������������%������������� �����������������������

#���������)������������� N∆ �����������������$GPG�(���

��������� ������������������ ������������������

( )( )2d q1NNseN ++⋅=∆

���������������� ����� ����������������������������

( )( )2d

2

2

q1NNse

NSNR

++=

�� � � ���� ���������� �������� ����� ����

�������/���� #)� ����������������� ������������ ������"� �������)- � �1*��*� �1����� ������������� ��� �)�� ���� ��������1� ������������ ���� ����������/���� $

N%�� �3

.���G06+++��G�06++����06�7������)0+�+,�

SNR

SNR

=+ ⋅ +

=

⋅1000

12 1000 100 1 0 05

251

2

2 2. ( ) ( . )

.

Page 25: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

24

����%�����������������������&

���������� ��'�'����"

���������������������������������$G(����� ���6+++�

� ���������������������� ���������������������������

������������������������������B����������������������

�����������������������)����������������� �����������

������$���� ����� �%������������������������ �%�������

�����������������������N�0��⋅ν(��D��� ������������

���������������������������$���������������������

����������������������(�������������������� ��������

����� �������� ������������������������������������

����� ��� ��.�����66�� ��� ����������������)������

���������� ����

��������� �������)���������������������������������

������� ����������������������%�� ����������������

����������������������������������������������������

����� ������ ��� ����*�������� ������������������������

������������ ��������������������������������������A�

������������������*�����*��������������� ����� ��� ��

������������� �������������������������������� ����

���������D��� ������������Q�������Q���*�������������������

���������� ������ �������������� �����������������

���������������������������������������������

To quantify these relationships, it is sensible ���������

� ����������������������������� �����������������

����������������������������� ������������������� ��

�����#���������� �������� ��������� ���������� ���������

������������ ������������������������ �������������

������� ������ ������������������������������������

������� ����������$�!.(����������� �������������������

���������������� �����������������������������������

������*������������������������� ��������*�������� ��

'������2��������������������������������� ��������

��� ���������� � ��� �������� ������������������%�

�� �����������������*�������������������������������

����� �������1������*��������������������������������

�����������*������������������������������%� �����������

���������������%� ��������������������� ��

#�����������������6++������ �������1������*���������

���������������*��������������������������������

��� ����������������� ����6++������ �������������

���� ����������������������������$�"#��������(��#��

��������������� �����������������������������*�����

����������������������������������������� ����������

������%����%� �$%� �����������������������������(�

8�������� �������������������������� ������������

������������������������������������������������������

���������)����$���� ������������������1���������

���1����� ���������(��#����� ��)������� ��������������

��������������������������

Fig. 11 The quantum nature of light can be made visible in two ways:a) by reducing the intensity down to the order of single photonsandb) by shortening the observation time, despite high intensity.

The graph above illustrates case (b) – by cutting down the observa-tion time, it is possible to resolve individual photons of the light flux intheir irregular (statistical) succession.

Op tica lpo wer

t

P(t)

t

P(t)

Optica lpower

Photonarrivals

Page 26: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

25

������ ���������� ������5+:��������������������������

���� ������������������������������� �����������

������*����������������������� ��������� ����������

��������������� �����������7,������ ���������8��

��� �������������� ��������+�7,��-���������������

�������������������$���������������������������������

���(�� ������������ ��������������������������� ����

����� ���������������� ��� ��������������������$≤�,+:����� ��(�����E�0�+�

����������������)��������������������������������%�

���������������������������� ����������������������

������������ �������������

#��������� �� �������������������� ���������� ������

����������������� �����������������������������������

�������������������������� ������������� ������������

����������������$���������������������������*����������

����B�����������(�

Diagram 7 The graph shows the computed resolution probability oftwo self-luminous points (fluorescence objects) spaced at 1/2 AU, as afunction of pinhole size for various photoelectron counts per pointobject (e-). The image raster conforms to the Nyquist theorem (criticalraster spacing = 0.25 AU); the image raster is subjected to interpo-lation. The photoelectron count per point object is approximatelytwice that per pixel (referred to the pixel at the center of the Airydisk). Each curve has been fitted to a fixed number of discrete values,with each value computed from 200 experiments.

The resolution probability is the quotient between successful experi-ments (resolved) and the total number of experiments. A resolutionprobability of 70% means that 7 out of 10 experiments lead to re-solved structures. A probability > 90% is imperative for lendingcertainty to the assumption that the features are resolved. If we as-sume a point-like fluorescence object containing 6 FITC fluores-cence molecules (fluorochrome concentration of about 0.1 µMol), apinhole size of 0.5 AU, a laser power of 100 µW in the pupil and anobjective NA of 1.2 (n = 1.33), the result is about 45 photoelectrons /point object on the detection side.

0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5

ground level = 0e-Distance of sample points = 1/4 AU

0.2

0.4

0.6

0.8

1100e-50e-

30e-

20e-

10e-

6e-4e-

3e-

2e-

probabilityresololution

size [AU]pinhole

Page 27: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

26

��������������� ������� ��������� ������� �����������

���������� ���������� ����� ������� �������� ����������

�������������� ������� ����� ���� ����� ���� �� ����� �

�������� ���������� ����������� �������������������

��������������� ���������������� ���� �������������

����������� ���������������� ����� ���� ������������

������� ������� �� ���� �� ���

������������������� ���� ����������!�� ���������������

������� ����� ������ ������� ����������� ���������� �

�� ��������������������"������������ ���� ������ �� �

��� �#����������!��� ��������

�������������������� ���������

$���������� �������"������������ ������������ ������

%&'������ ����������������������������������������

��������(�� �������������� ����������"������������ ����

)�� ��������������!��� �������� ������������ ���

�������(�*����� ���� �������!������������� ��������!���

������������������!���������������� ��!��� �� ������

���� ����������������� ������"����������������������

��� �������������������� �������������� ������������

��� ����� �� �������������+�������������������������

��������,�-� ��� �������� ���������� �!� ��������������

���������� ����� ����� �����������������"�����

� �� ������� ���!�� �� ���������������������!�����

��������������� �������������"��������������������

����� �����������������(�� ������.�������/����� ������

���������� �������������������������� ������.�������%�

����������012������������ ��������� ���� ������������ ��

������ �������� ����� ���������� ���������������+���

���!��������������� ���������� ����� ���$-�������"� ���

����������������������� ����������� ��� ����3&&�4��

+�������������(�� ���!��������������������� �������

�������������������� ����!������"��������������� ������5

�6�1��������"�� ������� ����"���������� ������ ��

����������� �����������!���� ����(������� ����������(�

������������ �� ��$�� ���� � �� �������������"����� ��

�� ���������� �����������"�����������������

� NnSNR ⋅= *���#����� �!���#������������������"���

������1������������!�����������(�� �������� �������"��

������ ���� � �� ������������� ������������������ ���

� �� ��������(��� NSNR= !���#�"�������!��� � ���������

���� ����������� �������� ��������������� ��� ��������� �

��� ���������������

Diagrams 8 and 9 Improvement of the signal-to-noise ratio. In Dia-gram 8 (left), pixel time is varied, while the number of signal acquisi-tions (scans averaged) is constant. In Diagram 9 (right), pixel time isconstant, while the number of signal acquisitions is varied. The ordi-nate indicates SNR in [dB], the abscissa the free parameter (pixeltime, scans averaged).

������������������

20

21

22

23

24

25

2627

28

29

30

31

32

33

1 10 100

���������������

�������

Diagram 9

����������������������

2021222324252627282930313233

1 10 100

������������� �

�������

Diagram 8

Page 28: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

27

������� ��������������� �� �� �����������������(�� ���

������*���7�� �� ����������������� �������� ��!���� ��

��(�� ��������������

Fig. 12 Two confocal images of the same fluorescence specimen(mesophyll cells). Both images were recorded with identical parame-ters except pixel time, which is 4.48 µs for the top image and 1.12 µsfor the bottom image. According to Diagram 8, the difference in SNRis 6 dB. The same effect can be observed if the averaging method isapplied.

+�� ������8�������� �������������� ���������������������

����������������� ���� �� ���������� ������������������� �

������������ �������� ������� ������� ����������������

� ���� ���������������������� ������������������9)�:

�����������������!������(����!�������������"������

��� ���������� �;��<�1����� �������� ������� ���� ����(�

�� � ���������������������� �������� ������ ���/&=5&'

������� ����� ������������������ ����� ���8������ ��

��� ������������������

�� �� ���

��������������������������"��������� �� ������� �

������ ������������ ���!��� ����������� ���!���������

��� �8� ���!���������� ������� ����� ���� ����������� ���

���� ����������� ������������ �� ����� ������"�� ����

������� �� ����������� ���������������� ��� �����(�����

��� ���� ������������,�-�

���������� ��������������� ������� ����� ���� �������

���������� ��������������������������,�-������"����

������� ��������� ��������� ������������ �*������ ��������

� ��� ��"��� ����� ����������������������$�� �)���������

���7�� � ������������� �������������� ������������� ��

� �� ���

���������!���� ������� �������������������������������

��������� ��� ������������������ �������� ��� ���

&�53�+>*������� ������?�+>������ �������� ����

Page 29: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

28

��������

�������� ������������������

������

������������� �� �����������������

�����������

���������������

����������

�������������✝

�������� ��������������������������������� ������������������������������ �����������������������������������������

� !�����"��#�"�$����������"�%�"�&��������'����������

(������������)������"�%������������ �*+UG�)���&��,�-

����� ���$�����������'�������.��������� /0 112�"�&����

�����"����� �����

*� !�����"��#�"�$����������"�%�"�)� ������#����

3�������� ����&��������������4����"�)&$'."

,,��1- 2"�� 115�

+� !����"�6�7�6������������(�������,��"�*���3������"

83!�8������$�������!�����"�� 19:�

;� !������"�6�"�$��,��"�<�"�=� ����"�!�7�&,����������'���-

���������#� �������� �#��������"������������������7�)�-

��������� �&����3�4�����������'��������������������

����� �����#�����&��������(�������,�"�$������������

6�������������������������������"�8������"�,,��511-

2/2"��20 11:�

:� >�����"�6�3�"�<�?����4��#���� ������ �����(�������,�"

6��������� �!������������� �����(������,�"

,,�� - *:"�%������%����"�*QG�3�������� 11:�

5� #�������"�'�"��������"�.��.���������#����-�,�(���-

��������&������=�������#�����&��������(�������,�"

&%)3�8��������&��������)������"�� 199�

2� @�A����"�!�"�=��������������B���!���C�������������

������������(�������,��������������������!��C��-

���������������+-.��������"����������������"�=��4��-

������ �%������"�� 11:�

9� 6���"�&�"�������"�.����������������� ����� ��������������-

������,����������������������������� �����4������D"

��������� �(�������,�"�8�������"�,,��+1 -;/:��+0 11+�

1� E�������"���"�������"�&�"�������"�.����� ������� �������-

���������������������,��������� ���������4�����������

��������� ������������������������4����������'����*"

3��������%����������"�8�������7�,,��5:+-55+"�� 112�

/� <���������"����������"�)���������,�����������������

����� ������������������ �������������,�"����������

(�������,��8�������,,��+ -+1"�� /0 11+�

� %�����"���"�6��������� �!������������� ������(�����-

��,�"�%������%����"�*QG�3�������� 11:�

*� &���B��"�3�6�>�"��$�����������������,�������������� ���-

���������������� �������������,���F�6��������� �!��-

����������� �����(�������,�"�,,�� +1- :;"�%�����

%����"�*QG�3�������� 11:�

+� &���B��"�3�6�>�"��������"�E�����������4��������������

�D���������4�����,������������������� �������������

������ ��������������������,�7�(�����������,�F�&%)3"

8�������"�,,�� +/- +5"�� 192�

;� $����"�6���"�4���<���4����"�%�"�������"�.�,��������� ��

������������������ � �����,�������������������4��� ���

�������������� ������� ������� ���������������,����

,���������"�����������8�����"�,,��+:1-+51��50 19*�

:� $����"���G�"���������"�.�"�'�����,������ ������ ����

(�������,��"�6��������� �!������������� �����(�����-

��,�"�,,��*52-*22"�%������%����"�*QG�3�������� 11:�

5� ����"���6�"�����"���>�"�$���%�D�������)����"�6���-

������ �!������������� �����(�������,�"

,,��::-55"�%������%����"�*QG�3�������� 11:�

2� �������"�&�"�H��������+-�.���������I�����J�������

��� �������#�����&����(�������,�"�������������"�'���-

�����������>A��"�� 11;�

9� ������"�$�"��������"�.���"�$���������������������������

��� �������������������������� ��������B������������F

��������� �(�������,�"�8�������"�,,��: -55"�� 0 199�

1� ������"�$��"��������"�.���"�&�B��� ���������������� ����

���������������F�<,������#�������8�����"�,,��**2-**1"

�;0 192�

*/� ������"�$�"�&��,,���K��������"�$����������%���������

&��������<,������(�������,�"�.��������%����"�*��

3�������� 19:�

Page 30: Confocal Laser Scanning Microscopy Principles

xy

z

The ConfocalLaser Scanning MicroscopeOverview

• Scanning unit – moves the focused laser beam acrossspecimen line by line

• Scanning speed: defines frame rate and pixel time, i.e. timefor collecting photons

• Pixel time: influences SNR of image; the longer the pixeltime, the more photons per pixel, the less noise

• Pixel resolution: maximum resolution can be achieved ifpixel size is set correctly (at least 4 x 4 pixels (x, y) persmallest detail), ➝ directly adjustable via scan zoom

• x/y frame size: variable from 4 x 2 up to 2048 x 2048 pixels;maximum frame rate with 512 x 512 pixels: 2.5 frames/sec(bidirectional scan (" "); unidirectional scan ("➝"):slower by factor 2)

➝➝

Scanner

• Light source – projected into specimen• Laser power: adjustable via attenuation device

(AOTF, MOTF) and tube current setting (Ar, ArKr only) • Lifetime Ar, ArKr: prolonged by using lower tube current;

but laser noise will be increased, too (8 A = minimum noise)• Stand-by mode: prolongs laser lifetime; not suitable for

image acquisition• Laser line: can be chosen via selection device (AOTF, MOTF)

dependent on fluorescent dye. Generally: the shorter thewavelength, the higher the resolution

• Application goals: (1) Protect specimen (reduction of dyebleaching and phototoxicity) by reduction of laser power.(2) Maximize fluorescence signal (higher SNR) by longerpixel dwell times or averaging

Laser

• Focusing the specimen – acquisition of image stacksor x-z sections

• z interval: distance between two optical slices (step sizeof z motor: min.100 nm, Axioplan 2 imaging: 50 nm)

• Optimum z motor step size: 0.5 x optical slice thickness(compare: min. slice thickness for NA =1.4, n =1.52,λ = 488 nm: about 340 nm)

• Optional: fast z scanning stage (HRZ) = higher precisionof z movement (step size 10 nm, reproducibility 30 nm,working range 200 µm)

Z Control

• Detector – pixelwise detection of photons emitted /reflected by the respective specimen detail

• Parameters: "Detector Gain"= PMT high voltage,"Amplifier Offset"= black level setting, "AmplifierGain"= electronic post-amplification

• Calibration: "Amplifier Offset" on image background(object-free area), "Detector Gain" according to scannedimage (object) - setting aid = "Range Indicator"(➝ "Palette"). Goal: least number of overmodulated(red) and undermodulated (blue) pixels

• Signal amplification: First exploit "Detector Gain" sliderbefore "Amplifier Gain" >1

Photomultiplier (PMT)

• Depth discrimination – confocal aperture to preventdetection of out-of-focus light (optical sectioning)

• Diameter: determines thickness of optical slice; optimumdiameter: 1 Airy unit = best trade-off between depthdiscrimination capability and efficiency

• x/y position: factory-adjusted for all beam pathconfigurations; can be modified manually (➝"Maintain-Pinhole")

Pinhole

• Fluorescence beam path – definable by combinationof main (HFT) and secondary (NFT) dichroic mirrors andemission filters (EF) (➝"Acquire"–"Config")

• HFT: separates excitation and emission light• NFT: effects spectral division of fluorescence emissions

(e.g. NFT 545: reflects light of λ< 545nm and transmitslight of λ >545nm)

• EF: determines bandwidth of fluorescence emission forthe respective channel

Beam Splitter

• Optical image formation – determines image qualityproperties such as resolution (x, y, z)

• Numerical Aperture (N.A.): determines imaged spot size(jointly with wavelength), and substantially influencesthe minimum optical slice thickness achievable

• Refractive index (n): match n (immersion liquid) with n(specimen mounting medium) for better image quality.

• Best confocal multifluorescence images (VIS, UV):use water immersion objectives with apochromaticcorrection (C- Apochromat)

Objective Lens

3 Steps to get a Confocal Image(LSM software running, lasers and HBO turned on)

View specimen in VIS modeFocus the specimen in epi-fluorescence mode using the binocular andcenter the part of interest; select fluorescence filter cube according toapplication (e.g. FITC or Cy3) via SW (window "Microscope Control");match the field of view: change to appropriate objective magnification(consider use of correct immersion medium).

Load an LSM configurationGo to LSM mode (operate manual tube slider). Open window"Configuration control", click on "Store/Apply" and select a predefinedconfiguration from list (Single Track). A click on "Apply" automaticallysets up the system: laser lines, attenuation, filters (EF), beam splitters(HFT, NFT), pinhole diameter, detector settings (channels, gain, offset).Or: Click on "Reuse" button (stored image/image database window)to restore settings of a previous experiment.

Scan an ImageClick on "Find" button (right row in window "Scan Control")=> System automatically opens image window, optimizes detectorsettings (matches PMT gain and offset to dynamic range of 8 or12 bit), and scans an image – ready!See operating manual for scanning a stack of slices, time series etc.

1.

2.

3.

How to enhance the Image Quality(Image scanned)

"More signal!"• Change to longer pixel dwell times by reducing scanning speed• Use "Average" method: Calculation of "Sum"or "Mean" value of pixels of consecutive "Line" or "Frame" scans.• Increase bandwidth of emission filter (e.g. LP instead of BP).• Enlarge pinhole diameter; Note: optical slice thickness increases

accordingly.• Increase excitation energy (laser power); But: pay attention to bleaching,

saturation and phototoxic effects.

"More details !"• Use objective with higher numerical aperture (NA); x/y-resolution

~ 1/NA, z resolution ~ 1/NA2.• Increase "FrameSize"= number of pixels per line + lines per frame,

e.g. 1024 x 1024 or 2048 x 2048 (min. 4 x 2).• Optimize scan zoom (Z), i.e. pixel size ≤ 0.25 x diameter of Airy disk

(e.g.: M = 40x, NA 1.3, λ = 488 nm => Z = 6).• Increase dynamic range (change from 8 to 12 bit per pixel).

"More reliability!"• Use Multitracking: very fast switching of excitation wavelengths; prevents

crosstalk of signals between channels; predefined configurations available.• Use ROI (Region Of Interest) function: significantly reduces excited area

of specimen and increases acquisition rate at constant SNR; several ROIsof any shape can be defined and used simultaneously.

1.

2.

3.

Scanner

Laser

Z Control

Objective Lens

Beam Splitter

Pinhole

Photomultiplier (PMT )