Componentes insulino-inmunorreactivos del plasma
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TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR María Esperanza Lázaro Martínez Madrid, 2015 © María Esperanza Lázaro Martínez, 1972 Componentes insulino-inmunorreactivos del plasma UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA
Transcript of Componentes insulino-inmunorreactivos del plasma
TESIS DOCTORAL
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
María Esperanza Lázaro Martínez
Madrid, 2015
© María Esperanza Lázaro Martínez, 1972
Componentes insulino-inmunorreactivos del plasma
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA
UîTIVERSIDAD DE MADRID Faoultad de Medioina
T h y l o e l
"CQJPOI^mS lESULPTO IIIUDORREACTIVOS DEL PLAGIA»
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FfefSfdofJte: Sr. 7ÂM)jQ.J2.J.Tr. ZQ/Z£. JH .
VoccA: S r . û c ÛW.z ... .Ru .B .q ..........4L':<M
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Voc&l SQcreîiAfto: Sr.Ik^— ÛJLUULl ^JUC/A\
Tesis presentada para op tar a l grade de
DOCTOR EN mDICD'TA Y CIRUGIA
per la licenoiada
M« Esperanza Ldzaro M artinez
Madrid, Pebrero 1972
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
5315115284
El trabajo experimental que presento oomo Tesis para aspirar
al grade de Doctor en Medioina y Cirugia, ha side realizado en el
Departamento de Métabolisme del Institute G. Marandn (C#S#I#C.) bajo
la direocidn del Profesor, Doctor José Luis Rodriguez Candela, a quien
deseo expresar mi més sincere agradecimiento per la ayuda e interes
que en todo memento me ha dispensado#
Igualmente quiero agradeoer la ayuda recibida de los Drs. José
Gomez Acebo y Roberto Parrilla, con quienes me inicié en los oonoci-
mientos del tema*
Al Dr. Emilio Herrera per su interes y censejos en la confeccién
del manuscrito.
Al Dr. D. E. Chance de Eli Lilly Research Laboratories ( India
napolis U.S.A.) per su obsequio generoso de la insulina, proinsulina
y péptido C utilizados en este estudio.
A D. Amador del Campo per su valiosa asistencia técnioa, y a Dà.
Amparo Ocana.
Este trabajo ha side realizado con una beoa del Ministerio
de Educaoiôn y Cienoia, dentro del plan de formacién de personal inves-
tigador, a quien deseo expresar mi agradecimiento.
I N D I C E
Péginas
n^TRODUCCION:
A.- Insulîna en la sangre .... 2
B.- Métodos para determiner la insulina en la sangre (plas
ma 6 suero) 3
I.- Métodos de valoraoién Tbiolégica ................. 4
a). Métodos de valoracién "in vivo" ...... 5
b). Métodos de valoracién "in vitro" ............... 5
II.- Métodos de valoracién inmunolégioa ............ 8
a). Método de RBD-Hemaglutinaoién-Inhibicién ......... 9125 131b). Método de la hormone marcada con I é con I
(Radioinmunoensayo) ............................ 10
C.- Comparacién de los resultados obtenidos por los Méto
dos biolégicos e inmunolégioos 12
I.- Antagonistas de la insulina ...................... 13
II.T Diferentes formas de "aotividad insulînica del
plasma" (ILA) ........ ...... 15
PàginasIII,- Insulina inmunorreactiva 22
ESQÜEÎ'AA DE LA TESIS;
A.- Planteamiento teérioo del problema investigado 30
■ I.- Seorecién de insulina produoida por carbohidra-
tos ...... 33
II,- Secrecién de insulina produoida por proteinas
y aminoécidos 35
III.- Paotores humorales en el control de la secreoién
de insulina: Hormonas intestinales ............. 36
a). Secretina .... 37
b). Choleoistokinina-Pancreocimina ............ 43
B."- Objetivos .......................................... 48
C.- Situaoiones investigadas........................... 51
MiATERIAIES Y lOTODOSt
A.-Animales de experimentaoién ..... 33
B.- Preparacién de los animales .......................... 53
C.- Product08 utilizados oomo estîmulos insulinogénicos ... 55
D.- Otros product03 utilizados .... 57
E .- Valoracién de las glucemias .... 58
P.- Praccionamiento proteico de los plasmas ........... 6l
G.- Valoracién inmunolégica de la insulina ............... 66125G-l). î'arcaje de la insulina con I .............. 66
pâglnas125G-2)• Purificaoién de la insulina-I 69
G-3)• Determinaoién del porcentaje de hormona marca
da Intacta y del grade de pureza de las fraccio-
n e s ................ 72
G-4) • Cdlculos............... 77
G-3). Radioînmunoensayo 79
H.- Aislamiento de "big insulina", "little insulina" y
"mini insulina" ...... 93
RESULTADOS:
I.- Componentes insulino-inmunorreactivos en el plasma de
conejos en ayuno de 24 boras ........ 97
II.- Componentes insulino-inmunorreactivos en el plasma
oomo respuesta al ayuno prolongado (48 horas) ...... IO4
III.- Componentes insulino-inmunorreactivos en el plas
ma como respuesta a la administracién de glucagén .. 109
IV.- Componentes insulino-inmunorreactivos en el plasma .
como respuesta a la administraciôn de tolbutamida .. II4
V.- Componentes insulino-inmunorreactivos en el plas
ma como respuesta a la adrainistracién de secretina .# II8
Experimento complementario del grupo V 128
VI.- Componentes insulino-inmunorreactivos en el plasma
como respuesta a la administracién de pancreocimina .. 132
paginas
VII,- Componentes insulino-ininunorreactivos en el
plasma oomo respuesta a la administraoién de
gluoosa întravenosa I4I
VIII,- Componentes insulino-inmunorreaotivos en el
plasma oomo respuesta a la administraoiôn de
gluoosa oral I46
Aislamiento de los componentes "big insulina", "li
ttle insulina" ÿ "mini insulina" 153
Caracterizacién cromatogréfica, 155
Caracterizacién inmunolégica .... 162
DISCUSION.......................................... 167
RBSUimN Y CONCLUSIONES ........ 208
CONCLUSION GEl'IERAL ..... 216
BIBLIOGRAFIA ....................... 218
ÏNTRODUCCION
A.- INSULINA EN LA SANGRE.
El .aislamiento por Banting y Best (l),en 1921,de la insu
lina prooedente del péncreas, y su cristalizaciôn por Abel en 1926(2),
continua por algun tiempo con estudios dirigidos a oonocer y caracte—
rizar la naturaleza y estruotura quîmica de la hormona. Esto no se con
signe hasta muchos anos despues, cuando Sanger y col (3), oomo resul-
tado de sus brillantes trabajos, logran oonocer la secuencia de amino-
écidos y caracterizar la estruotura primaria de la insulina de bovino
y, posteriormente de la insulina de otras especies animales y la humana
(4,5).La prueba mâs concluyente de la presenoia de la hormona en la san—
gre circulante séria, pues, la extracciôn e identificaciôn quîmica
de la estruotura primaria de la moléoula de insulina en el material
extraido. No obstante, hasta la fecha carecemos de esta evidencia di
recte, por lo que cuando empleamos el término de insulina endégena 6
plasmâtica, tenemos que aceptar que nos referimos a una sustancia en
sangre 6 plasma, que tiene varias de las propiedades fîsicas, quîmi-
cas, biolégioas e inmunolégicas de la insulina pancreética,
El aislamiento y purificacién de la insulina en sangre ha presen-
tado siempre probleroas de gran complejidad, debido, en primer lugar.
a que la hormona circula a concentraciones muy bajas, que generalmen-8te no exceden del orden de 10 M. Por otra parte, debemos anotar el
gran nümero de sustancias, de las que hay que separar la hormona du
rante el procedimiento de su purificacién. De lo que se deduce la impo
sibilidad de obtener, a partir del plasma 6 suero, suficiente material
para poder estudiar las caracterîsticas qufmicas de la insulina en -
sangre.
2.- METODOS PARA DBTBRMIMR LA INSULINA EN SANGRE ( PLASMA 0 SUERO )
Las diferentes técnicas desarrolladas para valorar el contenido
de insulina en sangre, se basan en dos principios generaImente acep-
tados% la aotividad biolégica de la hormona y su capacidad antigén^
ca. De aquf que los métodos se puedan dividir en:
I) Técnicas biolégioas, que comprenden: à) Valoraciones "in vivo",
basadas en el hecho de que el plasma 6 suero inyectado a animales de
experimentacién produce un efecto insulfnico; este efecto se determi^
na y compara con el efecto producido por soluciones standard de insu
lina (soluciones con concentraciones conocidas de insulina). b) Va
loraciones "in vitro", en las que un tejido aislado se incuba en stæ
ro é plasma, y el efecto producido en el tejido por el suero (valo—
rando uno de los paràmetros metabélicos de la hormona), se compara —
con el efecto producido por soluciones standard de insulina.
Il) Técnicas irmiunol6gioas,en las que la insulina del plasma se dé
termina por su reaocién con antisueros especificos anti-insulina#
En todas estas técnicas, lo que se utilisa para medir el conte
nido de insulina en sangre es, el efecto metabôlico é inmunolégico
de la hormona. No obstante, el efecto metabôlico valorado por las
técnicas biolôgicas, no depende solamente del contenido de insulina
en el plasma; ni es cierto que toda la insulina determinada inmuno-
logicamente corresponds a insulina biologioamente activa. De aquî que,
la aotividad valorada por las técnicas biolégioas se denomine " ao
tividad insulînica del plasma" (ILA), y la aotividad que se détermi
na por las técnicas inmunolégicas sea llamada " insulina inmunorreac
tiva" (ISI).
I). Métodos de valoracién biolégica.-
Hasta aproximadamente 1955 las valoraciones de insulina en
la sangre se hicieron exolusivamente por métodos biolégicos, basados
en medir los efectos metabélicos de la hormona, sobre animales de
experimentacién é en tejidos aislados de estes animales.
Sin embargo, es muy dificil determiner la especificidad de es
tes métodos, ya que no se conoce una reaocién biolégica espeoifica pa
ra la molécula de insulina; por lo que, cuando valoramos la aotividad
biolégica en suero é plasma, no podemos excluir la posibilidad
de valorar al mismo tiempo otros factores diferentes de la insulina.
El empleo de otros criterios, como por ejemplo, ver si la aotividad
biolégica es mayor en la vena pancreética que en sangre periférica,
si aumenta despues de un estimulo fisiolégico de la seorecién de in
sulina como es la glucosa oral 6 intravenosa, é si la aotividad desa
parece con el empleo de procéderas que destruyen la insulina 6 des
pues de una pancreatectomîa, etc..., son factores que ayudan en la
interpretacién de los datos obtenidos.
a) Los métodos de valoracién "in vivo"; son poco sensibles y requije
ren mucho tiempo en la preparacién de los animales; el procéder ezp«e
rimental en sî, es tecnicamente dificil y esté asociado a gran mor-
talidad, por lo que hay muy pocos estudios publicados con esta met£
dologfa (6, 7)*
Sin embargo, las técnicas "in vivo" poseen un interes especial
cuando se aplican a la valoracién de la aotividad insulînica de un
plasma é suero, empleando como "test" a un animal de la misma especie
a que pertenece dicho plasma. En este caso, la valoracién se hace en
las mismas condiciones fisiolégicas en que actua la insulina.
b) Los métodos de valoracién "in vitro" son los més generalizados ; -
utilizan como tejidos metabélicos, principeImente, el musculo diafra^
ma aislado de rata é ratén, y el tejido adiposo de epidîdimo de rata.
Como indices de la aotividad insulînica del plasma, en el musculo
diafragma se valora esencialmente la captacidn de glucosa (8-9-I0-II)
la sfntesis de glucégeno (I2) y la sintesis de proteinas a partir de
aminoécidos-C^^ (I3).
La sensibilidad de estas técnicas es variable, dependiendo del
parémetro y de las raodificaciones introducidas. En cuanto a su esp£
cificidad, un gran ndmero de estudios sugieren que las valoraciones
obtenidas por el método del diafragma de rata son bastante especîf
cas y se dében a un efecto de la insulina en plasma. La mayor parte
de estes estudios emplean modificaciones del método que valora la —
captacién de glucosa. Con esta técnica se ha demostrado que la actd
vidad insulînica del plasma desaparece despues del tratamiento del
plasma con cisteîna y glutatién (9 - II). Tambien se ha deraostrado
que, cuando se ahaden antisueros especîficos anti-insulina al plasma#
no hay estimulacién en la captacién de glucosa ni incorporacién de
glicina-C^^ a proteinas por dicho tejido (14 - 15).
Por otra parte, Mezt y col. (I6) observan mayor aotividad insu
lînica en la sangre de la vena pancreéti ca-duodenal, que en la san
gre de la arteria femoral, y la pancreatectomîa a perros y gatos ha
ce desaparecer la actividadi insulînica del plasma en dicho tejido (I7).
Todo esto parece indicar que, cuando se valora la aotividad in
sulînica del plasma por el método del diafragma de rata, los result^
dos obtenidos se dében a la insulina circulante. No obstante, queda
por aclarar si la aotividad insulînica valorada por esta técnica iii
dica unicamente la cantidad de hormona biologioamente activa del pla£
ma 6 si este contiens otros factores (posiblemente de caracter hor
monal) que influyen en la determinacidn de la aotividad insulînica,
inhibiendo 6 estimulando la aotividad debida propiamente a la insu
lina (I6 - 17 - 18).
El te.jido adiposo de epidîdimo de rata se utilize por primera
vez para estudios metabélicos hacia 1954 (I9), por la gran sensibilj^
dad que tiene para la utilizacién de la glucosa.
Basados en los distintos efectos metabélicos de la insulina, se
han desarrollado una serie de técnicas para valorar la aotividad iii
sulînica del plasma en este tejido.
La mayor parte de los trabajos publicados miden los siguientes
parémetros: captacién de glucosa (20 - 21), oxidacién de glucosa-l-C^^
a , produccién de é "cambio neto de gas" (22 - 23) y la
incorporacién de glucosa-l-C^"^ a lîpidos-C^^ (24).
El método que valora la oxidacién de la glucosa-l-C^^ a -
se debe a Renold y col. (25) y es uno de los més utilizados en casi
todos los laboratorios.
Se ha discutido mucho sobre la especificidad, es decir si el -
método de valoracién en tejido adiposo de epidîdimo de rata valora,
ademas de la insulina, otras sustancias que tienen su mismo efecto
sobre el metabolismo de la glucosa, Esto es debido a los siguientes
hecho8 :
1,- La aotividad insulînica del plasma valorada en tejido adiposo, no
desaparece despues de la pancreatectomîa, mientras que la determinada
por las técnicas inmunolégicas é por el método del diafragma de rata,
desaparece (26,2?)
2,- La aotividad insulînica valorada en el tejido adiposo, solo se in
hibe parcialmente por los antisueros especîficos anti-insulina, en
contraste con la aotividad insulînica valorada por el diafragma de ra
ta, que se inhibe totalmente (22,26,28),
3,- Otras hormonas y aminoâcidos (leucina) présentes en el plasma,
tienen los raismos efectos que la insulina, sobre el métabolisme de la
glucosa en tejido adiposo (29,30,31).
II,- Métodos de valoracién inmunolégica,-
A partir aproximadamente de 1958, el interes de los cientîfi-
008 se dirige al desarrollo de una técnica que, junte a una gran sen
sibilidad, fuese especîfica, para aplicarla a la valoracién de la in
sulina en sangre, Esto se consigne con los métodos inmunolégicos, basa
dos en la capacidad antigénioa de la hormona, puesta en duda por al-
gûn tiempo (32), pero aceptada raâs tarde, cuando Lowell (33) y Lerman
(34) demuestrah que el suero de humanos resistentes a la insulina.
8
podîa neutral!zar en los ratones el efecto hipoglucémico producido
por la insulina. Posteriormente, Moloney y Coval (35) demuestran en
cobayas inmunizados la aparicién dé anticuerpos neutralisantes de la
insulina; y Berson, empleando insulina-I^demuestra la presencia
de anticuerpos anti-insulina en todos los enfermos tratados con la
hormona (36 - 37).
La base de todos los métodos inmunolégicos es, una reaocién an.
tfgeno-anticuerpo, en la que la hormona a valorar actua como antîgeno.
El primer requisite necesario para una valoracién inmunolégica,
es un sistema para poder detectar y medir la reaocién antigeno-ant^
cuerpo, a muy bajas concentraciones de antfgeno.
El gran ndmero de métodos ideados se basan en dos principles -
diferentes;
a) Método de RBD-Hemaglutinacién-Inhibicién. que utiliza la agluti
nacién de eritrocitos sensibilizados como una manifestacién de la -
reaocién antigeno-anticuerpo.
Arquilla y Stavitsky (38) fueron los primeros en el empleo de
este método para la determinacién de la insulina, utilizando anticuer^
pos de conejos inmunizados.
Este método no es suficientemente sensible para aplicarlo a la
valoracién de insulina en sangre, por lo que no se usa en la actual^
dad.
b) Método de la hormona marcada con lodo^^^ 6 con lodo^^ (inmunoensayo).
Las observaciones de Yalow y Berson (37) de que el suero de personas
tratadas con insulina de bovino 6 porcino contiens anticuerpos que se
unen a la insulina, y que, concentraciones creoientes de insulina de
bovino, producen una disminucién progresiva en la unién de la insuli- 131na-I con los anticuerpos, fueron la base para el desarrollo de una
nueva técnica de valoracién de la insulina en sangre (39,40,41,42).
Uno de los grandes avances del radioinmunoensayo es, el alto gra-
do de sensibilidad que puede obtenerse, lo cual es esencial para po
der valorar los niveles fisiolégicos a los que se encuentra la insu
lina en la sangre. No obstante, la sensibilidad y precisién de estas
técnicas depende, de la actividad especîfica de la insulina radioao-
tiva empleada y de la capacidad de reaccién del antfgeno con el an—
ticuerpo,
Desde que Yalow y Berson idearon el método que lleva su nombre,
hasta la actualidad, se han desarrollado un grân nümero de técnicas,
de tal manera que puede decirse que es rare el laboratorio de presti-
gio que no posee su propia raodificacién técnica, Todas las diferen-
tes técnicas se basan en el mismo principio, sus diferencias estén
en los distintos procedimientos empleados para la separaoién de la
insulina radioactive libre, del complejo formado por la insulina ra
dioactive unida al anticuerpo.
10
MTBRIALES Y CONDICIONES EMPLEADOS EN ALGUNOS INMUNOENSAYOS
DE INSULINA EN PLASMA 0 SUERO
Pecha Autores Tampon Incubacidn Técnicas de Limite inferior deseparaoién sensibilidad
i960 Yalow- VeronalBerson O.I M
pH 8,6
i960 Grodsky GlicinaPorsham 0.2 M
pH 8,5 30^urea
1963 Hales- PosfatoRandle O.O4 M
pH 7,4
1963
1965
Morgan Borato Lazarow 0.13 M
pH 8,5
Herbert Veronal y col. pH 7,4
4 dfas 40c
I hora 25»C
6 horas con el Standard 16 horas con la - Insulina
6 a 25 h.40c
2 horas370c
Cromatoelec^troforesis
Precipitado del coraple- jo con sul- fato sédico
Precipitado del oomple- jo con 20 - anticuerpo
ml.
Charcoolde^trano
20juO/ml
6 jj(() /ml.
^U/ml.
7
La especificidad de estas técnicas inmunolégicas viens determ^
nada por las observaciones siguientes:
1.— En los perros pancreatectoraizados no se puede valorar la insul^
na en sangre por las técnicas inmunolégicas (27).
2.— La insulina determinada inmunologicamente desaparece despues del
11
tratamiento del suero 6 plasma con cisteîna. Por otra parte, si se
anade al suero insulina, la insulina valorada por estas técnicas se
eleva en una cantidad correspondiente a la hormona anadida (43).
3.- En personas normales, la inurestién de glucosa produce una ele-
vacién en la concentracién de insulina inmunorreactiva en el plasma
(44 — 45).
Es de considerable interes que, Yalow y Berson demuestran que
un derivado de la insulina (desoctapeptido insulina) que no tiene ac^
tividad biolégica se puede valorar por estas técnicas, mientras que
las cadenas A y B de la insulina no reaccionan con los anticuerpos
anti-insulina (46).
Grodsky y col, (47) estudian los productos de conversién de la
insulina, y encuentran que, tanto la insulina tratada con carboxipep^
tidasa é dinitro-benzol sulfate, é la insulina que ha sufrido una e^
terificacién suave, pueden reaccionar con los antisueros especîficos
anti-insulina.
0,- COMPARACION DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS POR LOS METODOS BIOLQGI-
COS E INMUNOLOGICOS.
En la determinacién del contenido de Insulina en sangre por las
técnicas biolégicas, hay que tener en cuenta que, junto a la insul^
na en sî, el plasma o suero contiens una serie de factores que pue-
12
den actuar, y de hecho aotuan, sobre los mismos parémetros metabéli-
008 que la hormona, unaa veces inhibiendo y otras potenciando su ao-
olôn; de tal manera que, los valores obtenidos por estas técnicas son
el resultado de la accién de la propia insulina y sustancias con ac-
ciôn insulînica ( insulina biologioamente activa), y de posibles an
tagonistes.
I,- Antagonistes de la insulina.-
Un haoho que complice la exactitud de las técnicas biolé
gioas "in vitro" es, la falta de proporcionalidad que se observa en
las concentraciones de la "aotividad insulinica"(lLA) obtenidas en el
suero total é en el suero diluido, siendo mucho mayores los valores oon-
seguidos en el segundo caso,
El efecto de la dilucién se demostré primeramente en las determi-
naoiones heohas con el método del diafragma de rata (48,49), y poste—
riormente Bail y Merrill (23) tambien observan este efecto al emplear
el tejido adiposo de epidîdimo de rata, Los estudios de Yalow y Ber
son (45), y de Haies y Handle (50) empleando los métodos inmunolégi
cos, no encuentran este efecto, y las concentraciones de insulina in—
munorreactiva decrecen proporcionalmente con la dilucién.
El hecho de que el efecto de dilucién se pueda demostrar por el
método del diafragma de rata, parece indicar que se debe a la presen—
13
cia de uno o varios antagonistae de la insulina, cuyos efectos des^
parecerîan con la dilucién. Esta suposicién gana apoyo experimental
cuando Groen y col. (5 1) demuestran que el efecto antagoniste de la
epinefrina en concentraciones fisiolégicas desaparece con la dilucién.
De igual manera, se puede considerar que el efecto de la dilu
cién que se observa en el método del tejido adiposo de epididimo de
rata, se debe a la presencia de un antagoniste de la insulina que -
desaparece con la dilucién. Aunque en el suero normal no se conocen
antagonistes que tengan efecto sobre este tejido; por lo que parece
més probable que el efecto de dilucién, en este caso, depende de la
existencia de un factor que actua activando la ihsulina biolégica—
mente inactive. En favor de esto éltimo esté la observacién de que
el tejido adiposo contiens un factor capaz de activer la "insulina
combinada" (l. bound) (52).
Estudios publicados durante los dltimos anos han deraostrado la
existencia de antagonistes de la insulina, no solamente en el suero de
,perâonaa normales y de pacientes diabéticos, sino tarabién en el -
suero de animales de experimentacién diabéticos (rata y gato).
Hasta ahora se han descrito en el hombre hasta cinco antagoni^
tas, aunque no se sabe con certeza si pueden ser la misma o diferen
tes sustancias, ya que sélo en casos muy excepcionales los investi-
gadores han intentado comparar sus resultados.
14
Vallance-Owen ha publioado nurnerosos estudios sobre los antagonis
tes de la insulina. El describe en el suero de las personas normales y
diabétioas, la existencia de un antagoniste de la insulina, cuyos efec
tos desaparecen con la dilucién del suero (53). Es de considerable in-
terés hacer notar que este antagonists solamente tiene efecto en las
técnicas que emplean el diafragma de rata, mientras que oarece de ao-
cién sobre el tejido adipose de epidîdimo (54).
En trabajos de este mismo investigador, usando las técnicas de frac-
cionamiento del suero por TCA é etanol, encuentra el efecto antagonis
te localizado en la fraooion de la albûmina.
La naturaleza del antagoniste de Vallance-Owen no esté olara,
pues si bien, por una parte parece depender de la presencia de las
glândulas adrenales é de la hipéfisis (55,56), con lo cual su natura
leza séria de origen hormonal, por otra parte, parece tener una serie
de caracterîsticas fisico-quîmicas en comûn con la cadena B de la in
sulina; en este ültimo caso séria un producto derivado de la ruptûra
de la molécula de insulina, formado quizé durante el procedimiento de
extraccion (57)#
II.- Diferentes formas de "actividad insulînica del plasma" (ILA),
Con el desarrollo de las técnicas radioinmunolégicas, se pone de
manifiesto la diferenoia que existe entre la insulina en sangre valora
da por estas técnicas, y la actividad insulinica del plasma valorada por
15
las ténnioas biolégioas. En el primer caso los valores enoontrados
son de très a cinoo veces més bajos.
Esta discrepancia se hace comprensible, cuando se oomprueba que
me no 8 del 10 ^ de la aotividad insulînica total se neutralize por los
anticuerpos especîficos anti-insulina (58,59), lo que se puede inter
preter, al menos, de dos maneras:
10,- La aotividad.insulînica del plasma (ILA) no se debe solo a la
insulina, sinO que junto a esta se valoran una serie de sustancias
con efecto insulînioo,
20.— Una fraccién de la insulina del plasma no reaociona con los anti
sueros especîficos anti-insulina, y por tanto no se puede valorar por
las técnicas radioinmunolégicas, ni neutralizar por los antisueros
especîficos. En este caso, la fraccién de insulina plasmética que no
puede reaccionar con los anticuerpos, tampoco estimula la captacién
de glucosa por el diafragma de rata "in vitro"; séria pues, una for
ma inactiva de la insulina ,
El oonocimiento de la presencia en el plasma de sustancias con
efecto insulînioo, ha hecho en los ultimes anos, que un gran nümero
de investigadores centrasen todo su interes en revisar nuevamente e
interpreter los datos obtenidos por las diferentes técnicas biolégi—
cas, empleando para ello diversos procedimientos, con el fin de se—
parar la parte de "ILA" que se debe a la propia insulina, de la que se
16
debe a otras sustancias con actividad insulinica.
Aunque estas sustancias con actividad insulînica han recibido
diferentes nombres (IM no supresible, insulina combinada 6 insulina
atipica), posiblemente oorrespondan al mismo material, aunque al ser
diferentes los procedimientos empleados en su estudio, son muy diff—
Giles de valorar los resultados obtenidos.
a), "Aotividad ineulînioa supresible (SILA) , y nô supresible (ITSIIA)".
Varios investigadores (28,60), por medio del método del tejido
adiposo de epididimo de rata han demostrado que, en el plasma normal,
solamente una parte de la "IIA" se puede neutralizar con anticuerpos
especîficos anti-insulina, que suprimen totalmente la actividad bio
légica de la insulina pancreética.La aotividad insulînica del plasma
que no se inhibe por los anticuerpos ha sido denominada "actividad no
supresible" (NSILA), y la que se neutralize es reoonocida como "aoti
vidad insulînica supresible" (SILA).
Las caracterîsticas fîsicas de la "NSILA" han sido extensamen-
te estudiadas por Proechs y col. Encuentran que electroforeticamente
la "NSILA" se localize en la zona correspondiente a las globulinas
oijyy3(6l), y la cromatografia en sephadex G-200 indica un peso mole
cular de 70.000 y 150.000,
Por otra parte, el grupo mencionado ha conseguido aislar del
plasma una sustancia con las mismas caracterîsticas biolégioas que
17
la "NSILA". Los estudios de este material purificado han demostrado,
que el peso molecular de esta sustancia depende del pH de la soluoi6n
en que esté diluida. Si el pH es éoido, el peso molecular es de 7*000;
y a pH alcaline corresponde un peso molecular de 100.000 a 200.000
(6l). Estes investigadores sugieren que la sustancia a pH alcaline
forma polimeros, y que estes se disocian a pH âoido.
Para ver si la "N3ILA" tiene la misma estruotura que la insulina
pancreética, tratan el producto con éoido formico, que sépara las ca
denas A y B de la insulina, Con este procedimiento no han sido oapa—
ces de demostrar la presencia de la cadena A en el material que corres
ponde a la actividad no supresible (62).
Las caracterîsticas biolégioas de la "NSILA" son iguales que
las de la insulina pancreâtica, tanto en las técnicas "in vivo" como
en las "in vitro". La inactivacién con oisteina é glutation, ha de
mostrado una inhibicién paroial de su actividad. El tratamiento con
urea y glutation inhibe completamente su actividad.
Los estudios que se han realizado para aclarar el sitio del or
ganisme donde se produce la "NSILA", sugieren que se forma en el hl-
gado (6 3,6 4), y que représenta un producto de transformacién de la
insulina (6 3), aunque los resultados obtenidos empleando la perfusiéh
del hîgado no lo han podido confirmer (6 5).
En cuanto a la actividad supresible "SUA.", los valores obtenidos
18
en todos los estudios realizados, ee corresponden perfeotamente con
los valores encontrados por las técnicas inmunolôgicas (21,59,66),
por lo que es muy probable que ambas téonioas valoren la misma for
ma de insulina en el plasma,
b) "Insulina combinada e insulina libre".-
Antoniades y col. (67,68,69), sugieren que la insulina que cir
cula en la sangre se encuentra en dos formas distintas denominadas,
"insulina libre" (free I.) e "insulina combinada" (bound I.).
La "insulina libre" es similar a la insulina cristalizada, es
secretada por el pancreas cuando se estimula con glucosa, es biologica-
mente activa, y reacciona con los anticuerpos especificos anti-insuli-
na. Posee un peso molecular aproximadamente de ^2,000 (pH 8.0) y una
movilidad electroforética similar a la albümina y globulinas .
La "insulina combinada", puede representar una forma de insulina
combinada 6 ligada a una proteina bdsica del plasma, Tiene la propie—
dad de ser absorvida por una résina de cambio de iones (Dowex—50\v x 8),
y de la que se extrae usando un medio âcido 6 alcaline; en el primer
oaso es inactive sobre diafragma de rata, aunque conserva su activi-
dad sobre tejido adiposo (52,70),
Antoniades sugiere que la "insulina combinada" se produce "in
vivo" en el hîgado y, posiblemente, en otros tejidos extrapancreà-
ticos (71), Las preparaciones purificadas parcialmente tienen un pe-
19
so molecular de 40,000 a 60,000 y una movilidad electroforética si
milar a las globulinas p y oC* reacciona con los anticuerpos espe
cificos, y su actividad biolôgica no se inhibe cuando se incuba duran
te una 6 dos horas con tejido adiposo de rata en presenoia de anti
cuerpos, Cuando se incuba durante un tiempo mayor, se produce una in-
hibicién parcial (72,73)# Por ûltimo, se ha visto que la actividad
biolôgica es muy similar a la de la insulina pancredtica (71,73)#
c)• "Actividad insulinica"(lIA) en los extractos âcido-alcohol,-
Varios laboratorios han estudiado las caracterlsticas de la ac
tividad insulînica (ILA) en el plasma tratado con dcido-etanol (74,
75)# Las técnicas empleadas han sido,6 bien el método original utili-
zado durante mucho tiempo para la extraciôn de la insulina del pdncre-
as, 6 bien una serie de raodificaciones todas ellas basadas en dicho
método. Estos estudios no permiten llegar a ninguna conclusién, ya
que los resultados son muy contradictorios, probablemente debido a las
diferentes modifioaciones introducidas en los métodos.
Las propiedades fisicas de la "ILA" en los extractos TCA-etanol
parece que corresponden a un peso molecular de 300,000, y tambien que
los extractos contienen àlbdmina inmunologicamente activa (76),
d),"Separacion de la actividad insulinica (IIA) por eleotroforesis^f,-
Como en el apartadd anterior, se han utilizado diferentes pro-
cedimientos electroforéticos para la separacién de la "ILA",
20
Algunos investigadores dializan a temperatura ambiente las fra
clones obtenidas por eleotroforesis; este procedimiento aumenta la
"lIA'en las fracciones (77). Mientras que otros omiten este paso.
to da lugar a que los resultados obtenidos no sean en todo compara
bles.
En los estudios realizados con técnicas similares, la"ILA"del
suero se distribuye en dos fracciones. Una de ellas, "Praccidn A",
que comprends la mayor parte de la ''ILA " corresponde a la zona de la
albumina y globulinas «xC ; la otra fraccién, "Praccidn B", corres
ponde a las globulinas ^ (78 - 79 - 80), Aunque una sola inve^
tigacidn parece indicar que la ILA de la "fraccidn B" es inactive
sobre diafragma "in vitro" (80), la mayor parte de las investigacra
nés demuestran que ambas fracciones son activas sobre diafragma y -
tejido adiposo de rata (78 — 79 — 8l — 82).
La adicién de anticuerpos especfficos suprimen la ILA en ambas
fracciones, pero los resultados son diferentes pues algunos investi^
gadores encuentran una supresidn compléta (79 - 80), y otros sdlo —
una inhibicidn parcial (77).
En cuanto a la importancia bioldgica de la"lLA"de las fracciones
A y B, no se conoce bien (80 - 83), aunque se puede suponer que la
*IIA* de la fracci6n A (que parece depender de la concentracidn de glu
cosa en el suero), puede tener importancia en la regulacidn de la —
21
gluoemia (64,80),
Los estudios realizados en perros, valorando la actividad insuli
nica (ILA)de las fracciones A y B en diferentes sitios de la oircula-
cidn (64), han demostrade que la "ILA" de ambas fracciones es mayor en
la vena pancredtica que en sangre periférica y que, despues de la pan-
createctomia tiende a disminuir (84), Estos expérimentes sugieren que
la "ILA" de las dos fracciones es producida probablemente en el pân—
créas,
III,- Insulina inmunologicamente activa (IRI).-
La insulina plasmâtica capaz de reaccionar con los anticuerpos
especificos anti-insulina y, por tanto, valorada por las técnicas in-
munolégicas, se denomina insulina inmunorreactiva (IRI) (45); y sus
valores se corresponden bien con los valores determinados para laao-
tividad insulinica supresible (SILA) por la técnica del tejido adipo
se de rata ( 85,44,63,83), por lo que es muy probable que ambas repre -
senten la misma forma de insulina.
Las propiedades fisicos de esta insulina han sido aclaradas en los
ùltimos anos, por estudios realizados principalmente por Yalow y Ber-
son, mediante la caracterizacién primero, de la insulina exégena pro
cédante del pâncreas y anadida al suero, y una comparacién posterior
con la insulina endégena, Asi se ha llegado a las siguientes con-
22
élusiones: ^
I») La insulina en plasma reacciona con los anticuerpos especificos
de manera similar a la insulina pancredtica (45).
2») La insulina plasmdtica se absorbe a la celulosa y se destruye
con la cisteina de una manera semejante a la insulina cristalina o
Insulina (45).
3*) Por ultracentrifugacidn del plasma, la mayor parte de la insu
lina endégena se récupéra en el sobrenadante, en una zona limftrofe
a la albdmina, de igual manera que lo hace la Insulina I^^^ anadida
al plasma (86).
4®) Por electroforesis del plasma, la insulina endégena se récupéra
en la misma regién que la insulina cristalina (86).
5®) La cromatografla del plasma en sephadex 6—75 indica un peso mo
lecular de la insulina inmunolégicamente activa, similar al peso mol«e
cular de la Insulina I^^^, y mucho mds bajo que el de la albümina -
(87).
Todo ello sugiere que la insulina inmunolégicamente activa prp
bablemente circula en plasma de forma libre, no ligada a ninguna pr£
tefna plasmdtica de alto peso molecular; y por otra parte, que esta
insulina posee las mismas caracterlsticas ffsicas que la insulina -
pancredtica anadida al plasma.
Los estudios realizados, valorando la concentracién de insulina
23
inmunologioamente activa en diferentes situaoiones fisiolôgicas y ex
périmentales, parecen indicar que esta forma de insulina plasmâtica
se produce en el pâncreas, y desarrolla un papel muy importante en la
regulacidn de las concentraciones de glucosa en la sangre (88,89 27)#
Ahora bien, aunque se ha observado que la inyeccién de potentes
antisueros especificos anti-insulina, a ratas (90) y ratones (35) pro-
ducen diabetes agudas, y en conejos y gatos marcadas hiperglucemias
(91), por lo que se admits como probable que toda la insulina hormo—
nalmente activa es capaz de reaccionar con los anticuerpos anti-insu
lina, cabe formarse la pregunta siguiente: i Valoran las técnicas ra-
dioinraunolôgicas solamente insulina biologioamente activa, 6 pueden
valorar en el plasma otros componentes insullnicos que, si bien reao-
cionan con los antisueros especificos anti-insulina, carecen de acti—
vidad biolôgica?,
Los trabajos realizados desde los très ô cuatro dltimos anos po
ne n de manifiesto, una vez mâs, el problema tan complejo que représen
ta el estudio y valoraciôn de la insulina circulante,
Hasta aproximadamente unos cinco anos atrâs, parecia como pro
bable que, la insulina se sintetizaba en las células > como resul-
tado de la combinaciôn de las dos cadenas A y B, sintetizadas a su vez
por separado (92,93).
Steiner y col, en 19&7 publican un trabajo original, donde
24
demuestran que la insulina se sintetiza en forma de una ûnioa oadena
polipeptîdioa, a la que denominan "proinsulina", por oonsidorarla un
precursor en la biosintesis de la hormona.
La existenoia de "proinsulina" fué demostrada por primera vez
en adenomas de islotes de Langerhans humanos (94,95)# Trabajos poste-
riores "in vitro" con islotes pancreâticos normales de rata y de ra-
tôn (96,97) de pâncreas fetal de ternera (98) e islotes de peces, oon-
firman la existenoia de este precursor en las secuencias biosintéti—
cas de la formaciôn de la insulina,
Los resultados realizados con preparaciones de insulina orista-
lizada de origen panoreâtico, han demostrado tambien la existenoia de
"proinsulina" en una proporciôn de 2 a 3 lo que indica que esta mo-
léoula es un components normal de todas las preparaciones de insulina
cristalizada (99,100,101),
La *• proinsulina" es una oadena tSnica, polipeptîdioa, de un peso
molecular aproximadamente de 9*000, que se inicia con la secuencia de
aminoâcidos de la oadena B y termina con la secuencia de aminoâcidos
de la oadena A, ambas cadenas estan conectadas entre si por un segmen-
to peptîdico de 30 residues de aminoâcidos (péptido C) (94,99,100,101).
Esta estruotura, en forma de una oadena sencilla de aminoâcidos, faci
lita la correcta formaciôn de los enlaces disulfure de la molécula de
insulina, que posteriormente es liberada de la "proinsulina" antes de
25
su secreciôn desde las células J3 (93,96,100),
Una vez establecida la importancia de la "proinsulina" en la
biosintesis de la insulina, se penso, que existia la posibilidad que
las células pudieran secretarla en ciertas condiciones fisiolôgicas
6 patolégicas y de esta manera, dicha molécula podria circular en la
sangre como tal estruotura, Eubenstein y col, (102), fueron los pri-
meros investigadores que lograron demostrar la existenoia de la "proin
sulina" en la sangre y orina de personas normales y de enfermes diabé-
ticos, Posteriormente, estudios "in vitro" han demostrado que despues
de una incubacién de 200 minutes, los islotes aislados de la rata se-
gregan al medio de incubacién una pequena cantidad de "proinsulina",
que aunque se podria interpreter como un artefacto del sistema experi
mental, parece mâs probable sea debido a la existenoia de una secre—
ciôn activa de este precursor en las condiciones "in vitro" (96,99)#
El hecho de que la "proinsulina" reacciona con los antisueros es—
peclficos, se observé yâ en el primer estudio de Steiner; no obstante,
la valoraciôn de la "proinsulina" por los métodos radioinminolôgicos
corrientes ha resultado ser muy dificil, por haberse demostrado que
el péptido C contiens los mayores déterminantes antigénicos de la mo—
lécula, y que este péptido C varia mucho en las distintas especies
animales (103), lo que hace muy necesario la existenoia de antisueros
especificos para cada especie. En uno de los ültimos trabajos publica-
26
dos por Melani y col (I04), se ha desarrollado un sistema especîfioo
para la valoraciôn del péptido C.
De otro lado, se ha demostrado que la actividad biolôgica de la
"proinsulina" es mucho menor que la actividad de la propia insulina,V
Cuando se valora por el método que utiliza las células grasas aisla-
das, présenta una actividad biolôgica del orden del 2 ^ de la actividad
de la insulina (10$), y mènes del 5 ÿ en el mûsculo sartorio de la
rana (lOé) , La "proinsulina" de porcino posee una actividad insulî
nica de 3 U/ mg, valorada por la técnica de las convulsiones en el;
raton (107)#
Independientemente de los estudios realizados por Steiner y su gru-
po, Roth y col, publican en I968 un trabajo que desde mi punto de vis
ta personal, si nô es tan espectacular como el realizado por Steiner,
si tiens un indudable gran valor ya que llega a los mismos resultados,
empleando para ello unos medios y conocimientos que estas al alcance
de oualquier laboratorio de investigaciôn: una técnica radioinmunolô-
gica y un método de fraccipnamiento proteico en geles de sephadex,
Roth y col,(108) encuentran que, al filtrar el plasma de per
sonas por una columna de sephadex G-50, la insulina endôgena se sépa
ra en dos componentes, ambos con reacciôn inmunolôgica frente a los
anticuerpos especificos anti-insulina, Uno de estos componentes eluye
en una zona que corresponde a un peso molecular de 6,000 ( la misma
27
posioiôn que la insulina cristalizada de origen panoreâtico); el otro
componente, de un peso molecular de aproximadamente 9*000 eluye en una
posiciôn anterior a la insulina, Ambos componentes se denominan "li
ttle insulina" y "big insulina", respectivamente, Roth en este trabajo
original, ya plantea la posibilidad de una analogie entre el componen
te "big insulina" y la "proinsulina",
Por su parte, Rubenstèin y col.(102) hacen similares conjeturas;
pero es mâs tarde Lazarus y col, (109) quienes, con expérimentes anâ-
logos y resultados semejantes, confirman este hecho, Hoy es admitido,
que el componente "big insulina" corresponde al "pico b" que Steiner
observé en la insulina cristalizada de origen panoreâtico, y por tan—
to dicho componente comprende no solo a la "proinsulina", sino tambien
a las llamadas "formas interraedias",
La relacién entre la "proinsulina" y la "insulina anormal" des
cri ta por Elliot y col.(110,111) en enfermes diabéticos, es dificil
de aclarar ya que se han utilizado diferentes procedimientos téonicos
en sus estudios; sin embargo, ambas formas tienen en comün, su reac-
oiôn inmunolégica con los antisueros especificos anti-insulina y su
baja actividad biolôgica.
28
ESmmJA DE lA TESTS
A.- PIAFTEAI IIENTO TEORICO DEL PROBLEM INVESTIGADO EN lA PRESEN-
TE TESTS.
Como hemos podido observar en la introduccidn de esta Tesis Doc
toral, la valoraciôn de la insulina en la sangre ha presentado siem
pre séries problemas. El desarrollo de las técnicas inmunolôgicas,
basadas en una reacciôn especffica antigeno-anticuerpo, representô
un avance considerable en el estudio de los mécanismes fisiopatolô-
gicos de la secreciôn de insulina.
En los ôltimos diez anos ha aparecido un considerable numéro —
de trabajos, en los que se han estudiado las concentraciones de insu
lina en plasma como respuesta a numerosos estfmulos, tanto en persjo
nas normales y diabéticas, como en animales de experimentaciôn.
No obstante, los trabajos publicados en 196? por Steiner y su
grupo, asi como en 1968 por Roth y colaboradores, han abierto un —
nuevo horizonte en los conocimientos que se tenîan, indicando que -
la fisiologia de la secreciôn de insulina necesîta ser de nuevo revi_
sada completamente, con respecto de la especificidad y significaciôn
de los valores de insulina inmunorreactiva publicados previamente.
Ante estos hechos, es obvia la necesidad de un nuevo planteamien
to en el estudio del mécanisme de secreciôn de la insulina, a causa
30
de la existenoia de diferentes proteinas que se comportan inmunolô-
gicamente como la hormona y biologioamente no actuan como tal.
De los numerosos parâmetros que ciertamente podrfamos elegir -
para esta reinvestigaciôn, hemos escogido el estudio de los compo
nentes insulînicos que normalmente circulan en el animal normal, -
asf como los cambios de estos componentes en situaciôn de ayuno pro
longado; y en una segunda parte hemos querido dedicar nuestra aten-
ciôn preferente a la importancia de los diferentes factores intest^
nales en la regulacidn de la secreciôn de insulina.
La importancia de estos factores en la regulaciôn de la secre
ciôn de la hormona comienza a ser clave en la compresiôn del sfndro
me diabôtico.
Con motivo del empleo del radioinmunoensayo para determiner los
valores de insulina, se ha sabido que numérosas sustancias naturales
son espaces de estimular la secreciôn de la hormona. La concentra-
ciôn de glucosa en la sangre que perfunde el pâncreas, considerada
durante muchos anos como el ônico regulador fisiolôgico de la secr^
ciôn de insulina, sigue manteniendo una situaciôn de priviliegio cjo
mo el factor mâs determinants de esta regulaciôn. No obstante, ult^
mamente se viens dando una gran importancia a factores neurales y —
hormonales sobre la secreciôn de insulina en respuesta a la ingestiôn
de coraida y en el ayuno prolongado.
31
Este actualizado interes por el eje intestinal, como factor im
portante en el aumento de secreciôn de insulina, dériva prinoipal-
mente de la observaciôn independiente de très grupos de investigado
res, que puede concretarse asi; 1) El aumento de insulina résultan
te de la hiperglucemia inducida por la glucosa oral es mayor que,
el que acompana a una hiperglucemia semejante producida por la admi—
nistraciôn de glucosa parenteral ( Me Intyre y col 112,113). 2) La
administraciôn de un extracto crudo de mucosa intestinal conteniendo
"actividad secretinica", mejora la tolerancia de la glûcosa adminis-
trada intravenosamente ( Duprë 114). 3) El glucagon es un potente
estimulador de la secreciôn de insulina ( Candela 11$, Samols 116 ).
Antes de entrer en detalles mâs concrètes sobre el porqué de la
importancia de estas observaciones, debemos hacer hincapié de una ma—
nera sucinta, ( reoientes estudios le dedican una grân extensiôn, Mo
Intyre 117 ) ), en la historia de la secreciôn de insulina inducida
por los oarbohidratos, tanto en el hombre como en los animales ; pa
ra pasar posteriormente a analizar los factores intestinales en re-
laoiôn a la funciôn pancredtica.
32
I.— Secreciôn de insulina -producida por oarbohidratos.
a.- En el hombre podemos ver, que bastante antes de que la glu
cosa pudiera determinarse de una manera concrete, se sabîa que la -
glucosuria se producîa mâs facilmente cuando la glucosa se adminis—
traba intravenosamente, que cuando se administraba por via oral —
( 118,119).
Con posterioridad, Lennox (120) y Koehlen (l2l), y mâs recien-
temente Scow y Cornfield (122), observaron que los valores de gluqo
sa determinados en sangre, eran mas bajos cuando la glucosa se adm^
nistraba por via oral, que al administrarse por vfa intravenosa. Es
tos resultados fueron confirmados despues por Me Intyre y col. (123
), interpretândose como efecto de una mayor secreciôn de insulina
a causa de un estfmulo adicional, que era activado en el yeyuno por
la administraciôn oral de la glucosa.
No obstante, existe una contradiciôn entre los resultados de -
los autores antes citados y los de Elrich y col. £l24 ), eu los Est^
dos Unidos, que no pudieron observar una mejora de las curvas de to
lerancia a la glucosa, cuando se administraba en forma oral, pese a
comprobar un aumento mayor en la secreciôn de insulina.
Un factor a tener en cuenta que quizâ sea bastante clave en la
discrepancia de los resultados, pudiera ser la circunstancia de que
los ôltimos autores administraron la glucosa oral, mientras que en
33
los demas trabajos descritos se realize en forma intrayeyunal.
Pero, con probabilidad, el hecho mâs convincente de la importan
cia del tracto alimenticio en la regulaciôn de la secreciôn de insu
lina, sea el resultado obtenido con la galactose. Este azucar, que
participa del mismo mécanisme de transporte en el intestine que la
glucosa, es un poderoso estimulante de la secreciôn de insulina cuan
do se administra por vfa intestinal, pero carece de efecto al admi
nistrarse intravenosamente (12$). La fructosa, por el contrario, caii
santé de una elevaciôn mas considerable de la gluceraia que la galac
tosa, es incapaz de producir secreciôn de insulina, ya se administre
por vfa oral ô intravenosa; hecho que se debe posiblemente a su no
participaciôn del mismo mecanismo de transporte que la glucosa y ga
lactosa.
b.- En los animales; Ray que tener sin embargo en consideracion
la existenoia de importantes diferencias de especie en cuanto a la
cantidad de secreciôn de insulina obtenida despues de la administra
ciôn de glucosa oral; y asf como hemos visto que esto es un hecho -
demostrable en el hombre, es mucho menos convincente en el perro -
(126) (5 en el pato ( 127). En el perro, Seltzer y Me Neff en I967 ll£
garon a la conclusiôn de que "la secreciôn de insulina estaba en re
laciôn directe con los valores de glucosa en la sangre arterial", -
careciendo de importancia la vfa por la que se administraba.
34
Las razones de estos hallazgos, por el momento son pooo claras,
pero bien pudieran reflejar diferencias en los bâbitos dietéticos,
6 quizâ tambien diferencias en la morfologia intestinal.
II.- Secreciôn de insulina producida por proteinas y aminoâcidos.-
Aunque quizâ por razones puramente histôricas, se ha dado ma
yor importancia a los oarbohidratos como reguladores de la secreciôn
de insulina, se va teniendo gran evidencia de una acciôn similar
( probablemente interdependiente, pero no necesariamente idéntica),
sobre el aumento de la secreciôn de insulina producida por la inges
tiôn de proteinas y de aminoâcidos ( 128), y tambien posiblemente,
por la administraciôn de grasas (12$).
La respuesta insulinémica a los aminoâcidos, tal vez no sea to-
talmente independiente de otros factores nutritives, como se demues—
tra por la observaciôn de Ajdkiewcz y col. (129), que el conside
rable aumento de insulina obtenido despues de una comida, en respues
ta a la administraciôn oral de triptôfano, es un hecho que desapare-
ce al administrarse el triptôfano en ayunas, lo que ha llevado a su-
gerir a este autor que la eliminaciôn de glucagôn puede ser un fac
tor importante en este eje.
35
UI.- Factores humorales en el control de la secreciôn de insulina;
Hormonas intestinales.
Como hemos visto, el papel del intestine en la regulaciôn de -
la secreciôn de insulina adquiere una importancia considerable, y -
el mecanismo por el cual se régula esta secreciôn es completamente
desconocido.
Aunque parece ser que intervienen varies mécanismes (humorales
neurales, circulatorios y reflejos), es el factor humoral al que m^
yor importancia se va concediendo; es decir, serfan una ô mas sustan
cias segregadas por la mucosa intestinal, como respuesta principal
mente a la ingestiôn de alimentes, las que regularfan la secreciôn
de insulina.
Esto nos lleva a no olvidar que el tracto gastrointestinal es
el mayor ôrgano endocrine y probablemente, el mâs complejo, digne -
rival de la hipôfisis. De todas formas, nunca ha sido considerado -
asi por los endocrinôlogos, a pesar de conocerse en la actualidad -
unas seis sustancias, por lo menos, con actividad hormonal (secreti^
na, colecistokinina-pancreocimina (CCK), gastrina, enteroglucagon,
villikinina y serotonina (130), y de la probabilidad de que existan
algunas mas•
Aunque han sido investigadas las propiedades quimicas y farma-
colôgicas de varias de estas hormonas gastrointestinales, su fisio-
36
logfa es desconocida casi totalmente, asi como los trastornos fisra
Idgicos producidos por un exceso o falta de secreciôn,
Nosotros vamos a considerar muy especificamente la secretina y
la colecistokinina-pancreozimina.
a) Secretina,—
La secretina fue la primera sustancia que recibiô el nombre de
hormona y ha sido estudiada extensamente (130 - 131).
Debido a no haberse obtenido preparaciones puras hasta muy re-
cientemente, los trabajos antiguos carecen de Tigor cientffico. No
obstante, pueden sacarse algunas conclusiones de ellos. Y asi las -
observaciones obtenidas entre los anos 1902 y 1940 indican que ex-■ - . '
tractos parcialmente purificados de intestine con "actividad secre
tinica", tenfan capacidad para producir hipoglucemia en el hombre y
en los animales.
Bn el ano 1940, Loew y col. (l32) publicaron un trabajo,
donde demostraban que todo lo anterior no resultaba cierto y que —
extractos de intestine bastante purificados eran incapaces de produ
cir hipoglucemia, por lo que la posible existenoia de un factor hip£
glucemiante en el intestine era una falacia.
Ante tal afirraaciôn, la investigaciôn en este campe decayô comple
tamente. Y es veinticuatro anos mâs tarde, cuando de nuevo recobra
interes este asunto, debido a un importante trabajo de Dupré ( II4).
37
Este autor demuestra que la secretina "cruda" aumenta la asimilaciôn
de la glucosa administrada intravenosamente en personal normales, -
aunque carece de efecto sobre los valores basales de glucosa.
Este trabajo fue confirmado posteriormente, administrando secre
tina sintética y natural,
a-I) Estruotura quimica y funciôn fisiolôgica.
La secretina ha sido aislada del intestine del cerdo en su for
ma pura, y determinada su estruotura primaria (133),
Qufmicamente, es una hormona polipeptîdioa de oadena simple,
compuesta de veintisiete residues de aminoâcidos. No menos de cator
ce, de estas veintisiete unidades de aminoâcidos, ocupan en la secrje
tina la misma posiciôn que en el glucagôn (que tiene veintinueve r£
siduo8 de aminoâcidos); y por tanto, no es de extranar que posean -
en comdn algunas propiedades biolôgicas,
Parece ser que pueden existir pequenas diferencias en la estruo
tura quîmica y actividad biolôfrica, entre la hormona de diferentes
especies animales, pero sobre esto no hay informaciôn suficiente hae
ta el momento.
La acciôn mas conocida de la secretina es favorecer la secreciôn
de agua y bicarbonate por el pâncreas exocrine, y esta es la base -
para determiner su actividad biolôgica ( 134)•
La actividad biolôgica de la secretina pura es aproximadamente
38
de unas 20 U clînicas (Unidades IVI perro) 6 400 U Hammarsten (Uni
dades gato)/mg,
Bodanszky y col. (135) han preparado secretina sintética con -
l/lO de la actividad hiolégica de las majores preparaciones de se
cretina natural.
Aparté de otras consideraciones fisiolôgicas importantes de la
secretina lo que mâs nos interesa dentro de nuestro planteamiento -
experimental, es su relaciôn con la secreciôn de insulina.
a-2) Estimulaciôn de la secreciôn de insulina "in vitro" por —
la secretina.
En 1965, Me Intyre y col. en Londres (ll3 -112 ), y Pfeiffer -
en Frankfurt (136), descrihieron independientemente la estimulaciôn
por la secretina "cruda", de la secreciôn de insulina "in vitro".
Los resultados de Me Intyre no se pueden tener muy en cuenta, dada
la contaminaciôn de su preparado por glucagôn e insulina.
Turner en 1969, a su vez,incuhando "in vitro” piezas de pâncreas
de conejo, observé como el efecto estimulante de la secretina "cruda"
sobre la secreciôn de insulina, dependfa de la concentracién de glij
cosa présente en el medio de incubacién (137).
A los resultados anteriores hay que ahadir los ôltimos trabajos
realizados por Buchanan y col. (138), segun los cuales, la secreti
na no estimula la secreciôn de insulina en preparaciones de islotes
39
aislados; y los resultados de S S Lazarus y col. (l39 ) segun los cua
les fragmentes de pâncreas de rata que responden a otros estîmulos,
no lo hacen a la secretina a concentraciones de 1,25 u/ml de medio
de incubacién.
Estos hallazgos y los de Turner, se enfrentan con los resultados
de Pfeiffer y col. (136 ). La razén de estas discrepancias actualmen
te no es explicable. Sin embargo, no hay que olvidar, que ciertas -
caracterlsticas biolôgicas de las hormonas intestinales difieren s^
gun actuen a altas ô bajas concentraciones, tanto ”in vivo" como -
"in vitro". En este sentido es muy interesante el trabajo de Guidoux-
Grass^ y Felber (140), quienes observaron como la secretina estimula
la secreciôn de insulina en el pâncreas de rata "in vitro", esta
creciôn se inhibe, si, ligando previamente los conductos pancreâticos
el tejido acinar se transforma en tejido graso.
a-3) Estimulaciôn de la secreciôn de insulina "in vivo", por
la secretina.
Los numerosos trabajos realizados con el fin de estudiar el efejc
to de la secretina sobre la secreciôn de insulina en el animal vivo,
han dado lugar a diferentes resultados.
Dupre y col. (141) y Unger y col. (142) utilizando un extracto
crudo de mucosa intestinal con actividad secretinica, observaron en
perros un aumento râpido, aunque pasajero, de la concentracién de -
40
insulina en la sangre de la vena pancreatico-duodenal, acompanado de
una elevaciôn de la glucosa en la sangre arterial. En los animales
que recibieron secretina pura, el aumento de la concentracién de in
sulina fue mayor, aunque por el contrario fue menor la variaciôn de
la glucemia.
Por su parte Dupre y col. (I41), despues de la administraciôn
de secretina a humanos, tambien observaron una elevaciôn pasajera -
de los niveles de insulina en sangre; pero en este caso no hubo nin
guna alteraciôn de la glucemia ni de los niveles de glucagôn en san
gre.
En esta lînea de pensamiento, y con relativa poca discrepancia
(cambios en los valores glucémicos), encontramos una serie de trab^
jos en la literature, como son los de Deckert (143), Bottermann y -
col. (144), Nelson y col. (145) y Jarrett y Cohen (I46), entre otros.
En todos los resultados hay que destacar, pues, que el aumento
de insulina es considerable, pero efimero.
De todo esto se desprende algo claro, y que parece importante
en nuestros objetivosx el hecho de que ningun autor de los citados
anteriormente ha podido describir, a pesar del aumento de insulina,
una concomitante hipoglucemia.
a—4) Efecto de la secretina endôgena sobre la secreciôn de insulina
Los intentes que se han realizado (acidificaciôn de la mucosa
41
duodenal) con el fin de mejorar las curvas de tolerancia a la gluco_
sa, 6 para aumentar la secreciôn de insulina por medio de una eleva
ciôn en la producciôn de secretina endôgena, en su mayor parte han
resultado inutiles.
No obstante Dupre y col. (14?), usando como estimulante para -
la secreciôn endôgena de secretina âcido clorhîdrico, observaron un
efecto insulînico sobre la glucosa inyectada intravenosamente, y una
mejora de la tolerancia a la glucosa. Este trabajo ha sido muy cri-
ticado, especialmente por Jarrett y Cohen, al considerar que las djo
sis de CIH administradas no corresponden a los valores fisiolôgicos,
Young y col. (148), en un trabajo publicado en I968, describen un -
aumento de la secretina despues de la administraciôn de glucosa in—
traduodenal. Aunque estos resultados no estan de acuerdo con los -
trabajos publicados anteriormente por Wang y Grossman (149), y por
Ramirez y col. (I50), el hecho, posiblemente, se deba al empleo por
Young de un radioinmunoensayo muy preciso y sensible para la valor^
ciôn de la secretina.
De todo lo expuesto sobre el efecto de la secretina en la secre
ciôn de insulina, se deduce, la imposibilidad de determiner, por el
momento, su fisiologia. Existe una clara discrepancia entre su falta
de efecto en las preparaciones artificiales "in vitro", y la estimu
laciôn efîmera, pero sustancial, de insulina en el animal vivo,.
42
b ) Cholecistokinina — Pancreociniina.
Otra de las hormonas intestinales importante en la regulacidn
de la secreciôn de insulina, es la cholecistokinina-pancreocimina.
Durante varias generaciones, los fisiôlogos distinguieron dos
fracciones hormonales que actuaban principalmente sobre la vesîcula
biliar y el pâncreas, y que denominaron respectivamente colecisto-
kinina y pancreocimina. En la actualidad se sabe que estas dos sus
tancias representan en realidad propiedades biolôgicas distintas -
del mismo compuesto.
b—l) Estruotura quimica y funciôn fisiolôgica.
Quimicamente, la pancreocimina (nombre que vamos a dar a esta
sustancia), es una hormona polipeptîdica compuesta de 33 aminoâcidos
(151). Su origen y la distribuciôn en el cuerpo humano, sigue el mi^
mo patron que el de la secretina, de quien se puede separar por simples
métodos qufmicos. Sus acciones farmacolôgicas mâs conocidas son, la
contracciôn de la vesicula biliar y la secreciôn de los enzimas pan
creâticos; y son la base para la deterrainaciôn de su actividad biol^
gica.
El material mâs puro obtenido tiene una actividad de 3 U "Ivy
perro" (colecistokinina) ô de 12 U "Crick-Harper" (pancreozimina)/jag
siendo por tanto, 100 â 6OO veces mas potente que las preparaciones
crudas de pancreocimina obtenidas en el pasado, y que desgraciadamente
43
han suministrado la mayor parte de les conooimientos bioldgicos so
bre esta hormona,
El mayor estfmulo para su secrecidn parece ser la entrada en el
duodeno de protefnas, polipéptidos y aminodcidos, <5 la de grasas y
âcidos grasos. Las soluciones simples de azucares, como glucosa y -
galactosa, se cree que no producen estimulacidn de pancreozimina
aunque actualmente parecen plantearse oiertas dudas al respecte
Estas observaciones dan fuerza a los recientes trabajos de Young
y col. (148), quienes describen un aumento en la concentraoidn de -
pancreozimina (medida per radioinmunoensayo) en personas normales,
a los que se ha administrado gran cantidad de glucosa per boca.
b—2) Estimulacidn de la secrecidn de insulina "in vitro", per
la pancreozimina.
La estimulacidn de la secrecidn de insulina en pdncreas incuba
do "in vitro", per la pancreozimina, es poco clara. N. R. Ldzarus y
col. (152) observaron cdmo la pancreozimina no tiene efecto sobre —
la secrecidn de insulina, sin que afectaran esta respuesta diferentes
concentraciones de glucosa en el medio de incubacidn.
Malaisse y Malaisse-Lagae (153)> tambien describieron un efecto
negative de la pancreozimina sobre islotes aislados de rata. Result^
dos iddnticos han side publicados por Buchanan y col. (I38) Turner
(Ï37), por su parte, encontrd, que si bien la concentracidn de gluc£sa
44
en el medio de incubacidn no influia en el efecto negative de la -
pancreozimina (0,5 g/ml) sobre la secrecidn de insulina, en fragmen
tos de pdncreas de conejo "in vitro", la hormona instestinal era capaz
de estimular la secrecidn de insulina en presencia de leucina,
Los unicos investigadores que han descrito resultados positives
son Pfeiffer y Telib (154).
b-3)Estimulacidn de la secrecidn de insulina "in vivo", por -
la pancreozimina.
La accidn insulinoestimulante de la pancreozimina "in vivo", fue
estudiada por primera vez por Dupre (114) y Dupre y Beck (155), qui^
nes observaron cdmo la pancreozimina, en contra de lo descrito para
la secretina, no producia en el horabre alteraciones en las curvas de
tolerancia a la glucosa intravenosa, ni estiraulaba la secrecidn de
insulina. Aunque estos trabajos fueron confirmados por Boyns y col.
(156) en 1967, expérimentes posteriores en muchos centres experiraen
tales han demostrado una secrecidn de insulina considerable despues
de la administracidn de pancreozimina, tanto en el hombre como en -
animales de experimentacidn (142 -157— 158 ). Es dificil explicar,
por el memento, el porqud los primeros experimentos descritos fueron
negatives, pero probablemente la falta de respuesta sea debida a las
diferentes concentraciones de pancreozimina empleada.
45
b-4 ) Efecto de la pancreozimina enddgena sobre la secrecidn de
insulina»
Como en el caso de la secretina, es dificil en este moraento de_
terminer la Importancia fisioldgica y clînica que esta hormona intes
tinal puede tener en el control, de la secrecidn de insulina» Fo ob^
tante la glucosa no es un estfmulo importante en su secrecidn ( 112,
124).
Las proteinas, por otra parte, pueden producir secrecidn de pan
creozimina, y esto si tiene importancia, ya que entonces la pancreo^
zimina actuarîa como mediador, estimulando la secrecidn de insulina
despues de este tipo de alimentacidn (128), y especialmente cuando
se in^ieren como parte de una dieta carbohidratada (159).
Sin embargo, no ha sido posible demostrar experimentalmente di
ferencias en la respuesta insulinogdnica a los amino^cidos administra
dos por via oral d intravenosa, (158).
En contraste con la arginina (que es el mds insulinotrdfico e
hiperglicémico de todos los aminodcidos)(160), las proteinas natura
les, cuando se toman por boca, no producen alteraciones en la gluc<e
mia, y son poco estimulantes dé la secrecidn de insulina (l6l).
Tambien hay que tener en consideracidn, cdmo los triglicéridos,
cuando se administran por via oral, en el hombre, son potentes esti
muladores de la secrecidn enddgena de pancreozimina, pero no estimulan
46
la secrecidn de insulina (l62).
Parece claro, pues que la pancreozimina debe tener un papel me
nos importante que la secretina en la regulacidn de la secrecidn de
insulina, siendo quizd mayor su importancia en presencia de hiperglâ^
cemia.
47
B.- OBJETIVOS
Le todo lo anteriormente expuesto, estd claro, pues, que el in
testine delgado debe ser considerado como un drgano endocrine por -
derecho propio, y tiene una importancia decisive en el control de la
secrecidn de insulina.
Podemos deducir, que las hormonas intestinales secretina y pan
creozimina, de alguna forma hoy desconocida, regulan o ayudan a modu
lar la respuesta de las cdlulas a la ingestidn de comida.
Respecte de la secretina, très hechos destacan claramente*
1.— Su secrecidn despues de la administracidn de glucosa por via oral
2.- La falta de capacidad hipoglucdmica del aumento de insulina pr_o
ducido por la secretina, hecho en si paraddjico.
3.— La accidn insulinotrdfica de la secretina, cuando se administra
en el animal vivo, y su falta de accidn sobre préparaciones artificife
les "in vitro".
Todo esto hace que no tengamos mds remedio que estudiar el "porqud"
de esta falta de accidn hipoglucdmica, y por tanto uno de los pens^
mientos fundaraentales que vienen a nuestra mente, es que,en realidad
no sea verdadera insulina la hormona secretada, sino una hormona que
mas bien se comporte inmunoldgicamente como la insulina, pero difi^
ra bioldgicamente de ella, tratdndose de proteinas del tipo de la —
48
proinsulina (Big insulin) <5 siinilares, desconocidas hasta ahora.
Si esta manera de pensar résulta cierta, los componentes inmu
noldgi cos insulinicos, secretados despues de la administracidn de -
la pancreozimina, deben de ser distintos, principalmente debido a que
la falta de hipoglucemia concomitante que se observa despues de la
administracidn de esta hormona, es debida probablemente a la estimu
lacidn de la secrecidn de glucagdn, que a su vez, serfa un estimulan
te de la secrecidn de insulina.
Tambien es interesante comparer los componentes inmunoldgicos
insulinicos obtenidos despues de la administracidn de estas hormonas
tras diferentes périodes de ayuno, ya que esta situacldn modifica la
estructura de las cdlulas y por tanto, es muy posible que como
consecuencia tambien se modifique la respuesta de la secrecidn de -
insulina*
Muy importante es estudiar la calidad de los componentes insu-
Ifnicos inmunorreactivos secretados despues de la administracidn de
glucosa oral, ya que si es cierto que produce secrecidn de secreti
na, la calidad de estos componentes debe ser similar.
Tambien es de gran interds comparer la respuesta a la glucosa
intravenosa, que sigue siendo el estimulo fisioldgico por excelencia*
La tolbutamida actüa eliminando los grdnulos de secrecidn en -
deposito y la insulina sintetizada "de novo", por lo que los resul-
49
tados deberian ser sirnilares a los de la glucosa y glucagdn, del que
no sabemos su mecanismo de accidn sobre la cdlula (activacidn del -
sistema Adenil Ciclasa),
Por todo lo anteriormente expuesto, hemos planteado el estudio
de los componentes insulinicos inmunorreactivoa en el plasma de la
sangre portal de conejos canulados.
Hemos elegido el conejo como nuestro animal de experimentacidn
considerando que ha sido, junto con la rata; el animal rads estudiado
en la investigacidn de la secrecidn de insulina, tanto "in vivo", -
como "in vitro".
La idea de utilizer sangre portal, viene determinada por la ne
oesidad de hacer un estudio en la sangre que vierte directamente —
del pdncreas, y evitar asi la barrera hepdtica, que sabemos tiene -
gran importancia en el "aclaramiento" insulfnico del plasma.
Canular los conejos nos ha permitido hacer el estudio en aniim
les recupèrados, evitando por tanto, en lo posible el stress quirur
gico y los efectos inhibidores producidos por la anestesia, sobre -
la secrecidn de insulina.
Empleamos la Dihidroergotamina porquB bloquea la secrecidn de
aminas y estabiliza las glucemias (163), con la cual obtenemos unas
condiciones dptimas.
50
C .- SITUACIOySS IirTESTIGADAS.
I) Hemos estudiado las siguientes situaciones expérimentales:
Grupo I,- Animales en condiciones basales ( 24 boras de ayuno)
Grupo II.- Animales en ayuno prolongado ( 48 horas)
Grupo III.- Animales en ayuno de 24 horas y estimulados con glucagdn
Grupo IV.- Animales en ayuno de 24 horas y estimulados con tolbuta
mida
Grupo V.- Animales en ayuno de 24 y 48 horas y estimulados con seore-
tina
Grupo VI.- Animales en ayuno do 24 y 48 horas y estimulados con pan-
.creocimina
Grupo VIT.- Animales en ayuno de 24 horas y estimulados con glucosa
intravenosa
Grupo VIII.- Animales en ayuno de 24 horas y estimulados con glucosa
oral
II) Aislamiento y caracterizacidn cromatogrdfica e inmunoldgica de
los componentes insulino- inmunorreaotivos circulantes en el plasma
del conejo.
51
MATERIALSS Y IffîTODOS
Jl.- Aim'ALES DE EXPERD'EFTACIOF.
En todos los experimentos hemos utilizado conejos domésticos
de ambos sexos, y de pesos comprendidos entre 1.5 y 2.5 kg. Previamen
ta a los experimentos, los animales permanecieron en nuestro criadero
un mlnimo de siete dias, alimentadoé con una dieta sintêtica equili-
brada y elaborada especialmente para animales de laboratorio.
B.- PREPARACION BE LOS ANIMALES.
Despues de un ayuno de 24 6 48 horas (segun el grupo experimen
tal), y durante el cual los conejos tienen libre acceso al agua, se les
inyecta en la vena marginal de la oreja una dosis de 0.3 mg/ kg de pe
so de Dihidergot, oon el fin de provenir el efecto hiperglucémico de
la anestesia (I63). Cinco minutes despues se les anestesia con eter, y
previa laparotomie abdominal, se busca la vena porta, canulândose una
de sus ramas inmediatamente antes de penetrar en el hîgado. El cate-
ter de polietileno se inserta en direccidn contraria al flujo venoso
sanguineo, se estabiliza su posicidn y se mantiene permeable durante
todo el tiempo requerido para el experimento, mediante una instilaciôn
local de una solucidn mùy diluida de heparina.
I,a duraciôn de la intervenoion quirurgica es aproximadamente de unos
53
diez a quince minutes. Una vez finalizada, se deja que los animales
se recuperen totalmente un mîniino de cinco a seis horas.
El procedimiento quirûrgico es perfectamente tolerado; se desecha-
ron aquellos animales que no se recuperaron bien, y aquellos que du
rante la intervened6n tuvieron hemorragia de mediana intensidad, que
hubiera podido influir en los resultados del experimento.
En todos los animales se toma oportunamente una muestra de sangre
para la determinacidn del valor hematocrito, sin que se observaran al
teraciones .
Las muestras de sangre para los experimentos se tomaron de acuer-
do oon el estudio planeado, bien en condiciones basales ( ayuno de 24
y 48 horas), 6 bien tras el estimulo a estudiar.
La sangre de la vena porta se extrae con una jeringa, previamen-
te lavada oon una solucidn diluida de heparina, se pone en tubos y se
centrifuge a 4®C dentro de la media hora siguiente, a 3OOO rpm duran
te 15 minutes.
El plasma obtenido se divide en alîcuotas y se guarda a -20^0,
hasta su posterior valoraciôn. Los plasmas nunca se descongelan mâs
de una vez.
Despues de finalizado el experimento, fueron sacrificados los ani
males, y la necropsia indicd ausencia de hemorragia y la buena canula-
oidn conseguida.
54
c,- PRODUCTOS UTILIZADOS COMO ESTIMULOS IFSULIFOGEÎTICOS. VIA DE AD
MINISTRA CION Y DOSIS EMPLEADAS.
Para este estudio hemos utilizado los siguientes productos:
1.- Glucosa pura cristalizada de la casa Merk, que disolvimos
oportunamente en agua destilada o en soluci6n salina, segun la via
de administracidn empleada.
Para la via oral, la glucosa se administré por catéter intra-
g^strico, a una dosis de I gr/Kg de peso, disuelta en 10 ml. de agua
destilada. Para la via parenteral se administré la glucosa a una de
sis de 0,5 gr/Kg de peso, disuelta en 3 ml de solucién salina, por
inyeccién intravenosa en la vena marginal de la oreja.
2.- Glucagén. obsequio de la casa Novo, envasado en viales lio
filizados, conteniendo cada vial I mg de la hormona, que se disuel—
ve en solucién salina inmediatamente antes de su uso.
La dosis administrada fue de I00y.AU/Kg de peso por inyeccién -
intravenosa en la vena marginal de la oreja.
Las pequenas cantidades de lactosa que este preparado de gluc^
gén contiens, no afectan para nada el estudio realizado.
3.- Tolbutamida (^'astinon), obsequio de Hoechst, que viene en
ampollas estériles, conteniendo cada ampolla I mg de N- j^-metil-ben
zolsulfonil-J -N'-buti1-urea (en forma de sal sédica), a una concen
55
tracién de 50 mg/ ml.
La dosis administrada fué de 50 mg/ kg de peso, por inyecoién intra
venosa en la vena marginal de la oreja.
4.- Hormonas intestinales:
(4-a).- Secretina altamente purificada. Se obtuvo del Prof. Erik Jor-
pes del Karolinska Institutet, Stockolm, Suecia. Se estima que oontie-
ne de 4*330 a 17.500 U/ mg (I64). Viene en viales liofilizados, oon-
teniendo cada vial 75 U clînicas. Lotes I69II y 17041*
El oontenido de cada vial se disolviô en 10 ml de solucién salina
inmediatamente antes de su uso ( concentracién de 7*5 U/ ml).
La dosis utilizada fué de I.5 U/ kg de peso.
(4-b).- Pancreooimina- Cholecistokinina, altamente purificada, procé
dante tambien del Prof. Erik Jorpes. Se estima que contiens 6.000 U/ mg
(164). Viene en viales liofilizados, conteniendo cada vial 30O crick
U. Lote 26912.
El vial se disolvié antes de su uso en 10 ml de solucién salina
(concentracién 30 u/ ml)
Se utilizeron dosis de 100 U/ conejo.
Tanto la secretina como la pancreooimina, se administraron por via
intravenosa, en la vena marginal de la oreja.
56
D.- OT.ROS PRODUCTOS UTILIZADOS.
I.— Preparaciones cristalizadast
a.- Insulina cristalizada de origen bovine, libre de glucagon. Lote
BJ- 4609.
b.- Proinsulina cristalizada de origen porcino. Lote 615- 1039 B 220
- C.
o.- Péptido C cristalizado de origen porcino secuenoia 33- 61. Lote
615- 1039- B 66 - A.
Estos productos fueron un obsequio generoso del Dr D.E. Chance de
Lilly Research Laboratories, Indianapolis U.S.A.
II.- Productos quîmicost
a.- Dihidergot de la casa Sandoz. Viene en ampollas de 1 ml, y cada
ampolla contiens 1 mg de metasulfonato de dehidroergotamina.
b,— Eter etilico para narcosis, de Abello.
o.- Heparina ( sal sôdica grade 1) de Sigma, conteniendo 170 USP Uni-
dades/ mg. Lote 79 B - I6IO.
1 mg de Heparina se disuelve en 30 ml de solucién salina*
57
s.- VALORACION DE IAS GLUCEMIAS.
Utilizamos el método colorimétrico de Soraogyi-Nelson para azu
cares reductores ( 165)> basado en la oxidacidn del azucar en presen
cia de Cu' ' en medio alcalirio. La valoracidn posterior del 6xido cu
proso se realize con el reactive arsenomolibdico de Nelson (166),
El método en si requiere una desproteinizacién previa, para -
eliminar la incompatibilidad analîtica de las proteinas.
(E-I),- Desproteinizacidn:
Réactivés:
ZnSO^ .7HgO 5 iBa(OH) 0,3 N
Estas dos soluciones son équivalentes 1:1, usando fenolftaleina
como indicador.
Procedimiento:
A 0,2 ml. de plasma se anade 0,4 ml. de SO^Zn y 0,4 ml. de Ba(OH)^
y se compléta el volumen a 3 ml con agua destilada. Se agita y fil
tra para obtener un liquide claro.
(E-2).— Valoracién de la glucosa:
a) Réactivés de Somogyi:
28 gr. fosfato disédico anhidro por litre
4 gr. hidroxido sédico "
58
40 gr. tartrato sddico pot^sico por litro
8 gr. sulfato de cobra "
180 gr. sulfato sddico anhidro ••
La solucién se deja reposar durante 24 horas para sedimentacién
de las impurezas. Se filtra y es guardada en céraara a 37°C en frasco
topacio.
b) Réactivés de Nelson;
Se disuelven 25 gr. de molibdato aménico en 450 ml. de agua -
destilada. Se ahaden 21 ml. de H^SO^ concentrade, enfriando el matraz
exteriormente con hielo. Son disueltos 3 gr. de arseniato sédico cri^
talizado con 7*H^0 en 2 ml. de agua destilada . Se mezclan las dos
soluciones, y se dejan en cdmara a 37®C durante 48 horas en frasco —
topacio.
c) Procedimiento;
A 0,5 ml. del filtrado libre de proteinas, anadimos 0,5 ml. de
reactive de Somogyi y se hierve durante 15 minutes. Despues de enfriar
se ahaden 0,5 ml. de reactive de Nelson. Se agita hasta quedar clara
la solucién y se compléta hasta un volumen de 10 ml. con agua dest^
lada. El color (més é menos azul), que aparece inmediatamente despues
de ahadir el reactive de Nelson, es estable durante horas. Las lectju
ras son realizadas en un espectrofotémetro Beckman, modèle D.U. a -
500 ïjx de longitud de onda.
59
La solucién patrén de glucosa contiens 450 mg. de glucosa (Kerk)
y 120 mg. de écido benzoico (Merk) en 100 ml. de agua destilada.
60
p.- FRACCIONAKIEITTO PROTET CO DE LOS PLASMAS.
De acuerdo con Roth y col. (108), el fraccionamiento proteico
de los plasmas lo realizamos por croroatografia, utilizando geles de
sephadex.
(P—l).— Consideraciones tedricas;
El sephadex es un dextrano que contiens grupos hidroxilos, por
lo cual en contacte con ol agua se "hincha" considerablemente, dando
lugar a un gel que fracciona y sépara las distintas moléculas de -
acuerdo con su tamaho y peso molecular.
Las moléculas de un tamaho mayor que los poros del sephadex -
"hinchado" no pueden penetrar en las particules del gel, y por lo -
tanto pasan a través de éste junto con la fase liquida, siendo elui_
das en primer lugar. No obstante, las moléculas de tamaho menor pe-
netran en las particules del gel a diferentes profundidades, depen-
diendo de su tamaho y configuracién, por lo que la mezcla a separar
eluye en relacién directe al tamaho molecular de los diverses compo
nentes.
Cada tipo de sephadex fracciona principalmente dentro de un -
orden particular de pesos moleculares, determinado por el grado de
"hinchamiento" del gel. Las moléculas de un peso molecular mayor que
el limite superior de este orden (limite de exclusién) son totalmente
61
excluidas del gel, eluyendo con el volumen vacîo, por el contrario,
las particulas de peso molecular inferior a este orden eluyen aproxi_
madamente en un volumen igual al volumen total de la columna (entién
dase que al hablar de columna nos referiraos al volumen del gel, nun
ca al del tubo de vidrio donde éste se empaqueta).
(P-2).- Materialest
-Sephadex G-50 fino (Pharmacia, Uppsala, Suecia, lote 8930).
Este tipo de sephadex tiene las siguientes caracteristicas; ta
mano de la particula *= 20 - 30yi; agua recuperada por gramo de seph^
dex seco = 5*0 ±0.3 gr. ; volumen del gel por gramo de sephadex seco
= 10 ml.; orden de fraccionamiento = I.500 a 30.000.
—Columnas de vidrio de I x 60 cm.
— Tampén eluyente. Ya que la concentracién de sales puede influir
en el desarrollo posterior del immunoensayo, las columnas se equili
braron y eluyeron con el mismo tampon utilizado en el inmunoensayo:
tampén veronal sédico 0.05 M (pH8.6) adicionado con albumina huraana
al 0.25 .
(P-3)*- Preparacién del sephadex y empaquetamiento de las odumnas:
En un vaso de precipitados conteniendo 8 gr. de sephadex, se
haden 250 ml. de agua destilada, mientras se agita con una vari11a.
Se deja en repose y a temperatura ambiente un minime de 5 a 6 horas
Una vez que el gel esté completaraente "hinchado", se decanta una parte
62
del agua sobrenadante, se agita bien, teniendo ouidado de no formar
burbujas, y se procédé al empaquetamiento de la columna,
El procedimiento de llenar una columna no ofrece ninguna difi-
cultad. Ahora bien, es condicién importantisima que éste se haga de
una manera correcta, teniendo ouidado de que no queden burbujas de
aire en el interior del gel, y de que el empaquetamiento sea homogé
neo, Cualquier alteracién de estas condiciones puede influir poste-
riormente sobre la buena marcha de las cromatograflas,
(P-4).- Equilibracién de las columnas;
Una vez empaquetada la columna, se lleva a cémara fria a 4®C,
donde se deja equilibrar un dia, eluyendo con tampén veronal sédico
0.05 M (pH 8.6) adicionado con albumina humana 0.25^.
La altura final alcanzada por el gel en la columna debe de ser
50 cm.. Las columnas més cortas no tienen buen poder de separacién.
(P—5)*“ Calibracién de las columnas;
Se hace aplicando a la columna 1—3 ml. de plasma normal de cô
ne jo, previamente incubado durante la noche anterior a 4®C con Insu 125lina-I • Una vez que el plasma desaparece dentro del gel, la colim
na se eluye con el tampén eluyente. Se toman fracciones de I ml. -
que posteriormente son valoradas por D.O. a 275 mu de longitud de —
onda en un espectrofotémetro Beckman (modèle DB), y por radioactiy^
dad en un contador Tricarb de radiacién Gamma (modelo 3002).
63
insulina
ECLO*DO;o' >
ügT)oû:
4
AlbuminaI-!
3-i
I-
2
0,5-1
I- I2 5
i J—.J1 r — L5040301810 ml.
FIGURA 1.- Calibracién de una oolurmia de sephadex Gf-50 fine ( 1 X 50 cm),
l a 3 ml de plasma normal de oonejo incubado a 4-C con una alîcuota 125de insulina-I se filtra por la columna. Se colectan fracciones de
1 ml que se valoran por radioaotividad ( cpm/ ml) y por D.O# a 275 mp de longitud de onda en cubetas de 1 cm de paso de luz, Radioaotividad,------ D.O#Fracciones 10 a 21,— Volumen de elucién de la albürnina plasmdticaFracciones 30 a 40,- Volumen de elucién de la insulina-I^^^Fracciones 53 3, 5^«— Volumen de elucién de las sales plasmdticas,
Para la obtencién de las fracciones hemos utilizado un coleotor
de fracciones autom^tico (modelo Gilson). Este trabajo se ha realiz^
do siempre en cdmara frfa a 4®G y a un flujo constante de 10 ml/hora
La figura n^I muestra la calibracién de una columna de sephadex
g-50 fino (l X 50 cm,). Se observan los volumenes de elucién de lasTPRproteinas plasm^ticas de alto peso molecular (albumina I * ), de
la insulina y de las sales (lodo 125). Las primeras eluyen en
el volumen vacio, y las sales en un volumen aproximado al volumen -
total de gel.125La insulina I anadida al plasma se recoge en las fracciones
nO 30 al 40, ambos inclusive.
De acuerdo a este patrén de elucién, las valoraciones por la —
técnica de inmunoensayo de los componentes insulinicos en los plas
mas procedentes de las distintas situaciones expérimentales estudia^
das, se efectué, valorando cada una de las fracciones coraprendidas
entre la salida de la albürnina y las sales.
65
G.- VALOHACIOH IM.ÎÜITOLOGICA DE LA. IÏÏ3ULIFA.
La valoracién inmunolégica del oontenido de insulina en las fr^
clones procedentes del fraccionamiento proteico de los plasmas, asf
como de la concentracién total de insulina en los plasmas no fraccio_
nados, ha sido realizada por una técnica imnunolégica basada en el
método original de Yalow y Berson(l67), adaptada a nuestras posibi—
lidades con la introducién de modificaciones adecuadas, consistentes
principalmente en:1251.- Marcaje de la insulina con I •
2.- Purificacién de la hormona marcada por cromatrografla en geles
de sephadex.125 1253.— Separacién de la insulina-I libre, del complejo insulina I __
_ anticuerpo, por cromatograffa en papel Whatman 3 MM a temperatura -
ambiante.
Desarrollo de la técnica.—125(G-I).- Marcaje de la insulina con I ;
(G-Ia).- Consideraciones teéricas.- El isétopo seleccionado pa_131 125ra el marcaje de la insulina es el iodo radioactive (l é I ),
que puede introducirse fécilmente en las proteinas que contienen ti_
résina o histidina, sin producir alteraciones graves en su réactiva^
dad inmunolégica.
66
Si bien Yalow y Berson utilizan en su técnica original la hormona131 125marcada con I , nosotros hemos utilizado el I que nos permits ob-
tener insulina radioactive con gran actividad especîfica que podemos
utilizer para numérosas pruebas durante un période de mâs de dos me—
ses.
Para el marcaje hemos seguido bas!camente el procedimiento de Green
wood, Hunter y Glover (l68), por medio de la cloramina T.
Los diferentes pasos del método han de ser realizados tan ràpidamen-
te como sea posible, para evitar danar la hormona y limiter el nûmero
de dtomos de iodo introducidos, que pueden alterar su reaooién 1nmuno—
logica,G - l b ) üateriales y réactives.
1.- Tampén fosfato sédico 0.25 M ( pH 7*5)
2.- Tampén veronal sédico 0.05 M ( pH 8.6), adicionado con albürnina
humana 0.25 ( solucién de albürnina Hubber al 25 )
3*- Agua aoidifioada con CIH ( pH 2.5)
Insulina cristalizada de bovine, libre de glucagén ( Lilly. Lote
Pj - 4609)• Se estima que* contiens una actividad biolégioa de
aproximadamente 25 U/ mg.
5.- Iodine 125- (Amersham, Inglaterra, Code 31,j8-3), con actividades125especîficas de 10 a I5 mCi I / jigr. de iodo.
Se trata de ioduro sédico "libre de portador", en solucién dilui
da de HaOH ( pH 7-9)» libre de agentes reductores.
6 ?
6,- Cloramina T ( Plùka (6, Buoh S3 6, Suiza. Lote 112816-28 K).
Este reaotivo oxida el ioduro a iodo.
7.- Metabisulfito sédico ( Merk). Este reactivo reduce el iodo a io-
duro.
( G-lo).- Procedimiento.
Inmediatamente antes de iniciar el marcaje de la hormona, en cü—
mara fria a 4°C y tomando las precauciones debidas para evitar conta-125minacién ( el vial conteniendo el iodo se introduce en en blinda-
je de plomo), se disuelven la insulina cristalizada y los reactivos,
de la manera siguiente*
1.- 1 mg de insulina cristalizada se disuelve en 2 ml de agua aoidi-
ficada ( pH 2.5) ( concentracién 0.5 mg/ ml)
2.- 35 mg de cloramina T se disuelven en 10 ml de tampén fosfato sé
dico 0.25 M ( pH 7.5)
3.- 24 mg de metabisulfito sédico se disuelven en 10 ml de tampon fos
fato sédico 0.25 M ( pH 7.5)
Marcaje:125Al vial conteniendo 1 mCi de Iodo se le ahaden con micropipe-
ta y de forma sucesiva;
- 20 yil de tampén fosfato sédico 0.25 M (pH 7.5)
- 5^1 de la solucién de insulina cristalizada ( concentracién final 2.^,
- 10 jil de la solucién de cloramina T ( concentracién final 35yigr)
68
-5 0 jul de la solucidn de metabisulfito sddico (concentracidn final
120 ).
Se mezcla bien y se procédé a la purificacidn.125(G—2).- Purificacidn de la insulina I
(G-2a).- Consideraciones tedricas.- Antes de su purificacidn,
la mayor parte de las preparaciones de insulina marcada contienen -
componentes radioactives que se unen y desplazan, no especîficamente
con las seroproteinas (37). Estes componentes representan productos
degradados o danados durante el procedimiento de marcaje, y se pue-
den separar cas! completamente per diverses procedimientos (169)»
La degradacidn puede producirse per irradiacidn, sobreyodacidn
u oxidacidn de la proteina.
Nosotros, a diferencia de Yalow y ^erson que utilizan columnas
de celulosa, hacemos la purificacidn de la hormona marcada per crom^
tografia en geles de sephadex G-50 fine, que ofrecen corne ventajas
la rapidez y facilidad de realizacidn.
( G - 2 b ) Materiales;
1.- Tampdn veronal sddico 0.05 M (pH 8.6) adicionado de albumina hu
mana 0.25^
2.- Sephadex G-50 fino.(Pharmacia, Uppsala, Suecia. Lete 8930)
Este tipo de sephadex posee las caracterfsticas siguientes: ta-
raano de la particule = 20-30 yi ; agua recuperada per gramo de -
69
sephadex seco = 5*0 - 0 .3 gr.; volumen del gel por gramo de sephadex
seco = 10 ml,; orden de fraceionamiente = 30.000 é. I.5OO.
3.- Columnas de vidrio de 0.8 x 24 cm. (para este propdsito tamhien
pueden servir las columnas montadas en pipetas seroldgicas de -
10 ml.).
(G-2c).— Preparacidn de las columnas
En un vaso de precipitados se ponen 2 gr. de sephadex G-5 0 fino
y se anaden 50 ml. de agua destilada, mientras se agita con una vari_
lia. Se deja en repose de 5 ^ 6 horas a temperatura ambiente, se de_
canta parte del liquide sobrenadante, se agita bien y se empaqueta
en la columna tomando las mismas precauciones que se expusieron en
el apartado P-3*
La columna se deja en c^mara frfa a 4®C, equilibrando durante
un dia con tamp<5n veronal sddico O.O5 M (pH 8.6) méis albümina huma—
na 0.25 . La altura final alcanzada por el gel en la columna es de
22 cm./
La columna, previamente calibrada para saber el punto en que -125eluye la insulina I , se conecta al colector de fracciones autora^
tico, y se procédé a la puriflcacidn de la hormona marcada.
(G—2d).- Procedimiento de nurificaoidn
Una vez terminado el marcaje de la insulina, la mezcla del mar_
caje se aplica a la columna de sephadex G-50 fino y se lava el vial
70
rogX
E Q.Ü•Do’ >
ÜoT3&
Insulina -III - 125
9
7
5
3Insulinadegradada
16 219 30Frocciones de 0,5 ml.
.125PJGfURA, 2,- Purificaci6n de insulina-I por cromatografia ancolumna de sephadex G-50 fino ( 0.8 x 22 cm),
125La mezcla del marcaje de la insulina-I se filtra por la columna, colectândose fracciones de 0.5 ml. que se diliiyen con tampon veronal sddico 0.05 M (pH 8,6) adicionado con albdmina humana 0.25 En una pequena alîcuota procédante de cada frac-ciôn se valora la radioactividad ( cpm).
125Fracciones 8 a 10.- Insulina-I degradada125Fracciones 12 a 18.- Insulina-I intacta
Fracciones 20 a 24.- lodo125 libre
con tamp(5n veronal sddico O.O5 M (pH 8.6) mds albumina humana 0,2^%
Cuando la muestra a pasado al gel, la columna se eluye con tamp6n
veronal mds albumina. Se toman fracciones de 0,5 ml. Con el volumen
vacio aparecen productos degradados, la proteina intacta aparece des
pues y en ultimo termine eluye el iodo libre.
De cada una de las fraciones correspond!entes al pico de la in125sulina I (que corresponden a las fracciones no 13-18), asf como
de las fracciones que corresponden al pico del iodo 125 libre (n@ 21
22), se toma una alîcuota para determinar posteriormente el grade -
de pureza.
Cada fracci6n se diluye con tampdn veronal sddico O.O5 M (pH 8.6)
mds albumina humana 0.25^. Se toma una alîcuota para valorar su radio
actividad (cpm), y poder calculer posteriormente la concentracidn de125insulina I de las fracciones seleccionadas para el inmunoensayo.
125La figura nO 2 muestra una curva de purificacidn de insulinal
en sephadex G-5 0 fino.
Las fracciones mas puras se dividen en alîcuotas y son guardadas
en congelador a -20oc, para su uso posterior en el inmunoensayo.
(G—3).— De termina ci (Sn del rorcenta.je de hormona marcada intacta
y del grade de pureza de las fracciones.
(G-3a).- Consideraciones tedricas.
Se realize por cromatoelectroforesis en papel Whatman 3
72
125Por este procedimiento, la separacidn de la insulina I intacta -
absorvida al papel en el nunto de aplicacidn (origen), de los compo_
nentes degradados, despïazados junto con las seroproteinas (proteina)
se realiza mediante un flujo hidrodindroico (37).
Sobre el aparato de electroforesis, cuya superficie permanece
abierta, se colocan horizontalmente las tiras de papel. La evapora-
ci6n da lugar a una concentracidn de las sales del tampdn sobre la
superficie de las tiras. Como consecuencia se produce un flujo del
liquide desde las cubetas del aparato hacia el centre de las tiras
de papel (flujo capilar aumentado por la fuerza osmdtica).
Si se aplican las muestras en el extreme catddico (origen), el
flujo hidrodindmico produce un moviraiento de los solutés hacia el —
dnodo.125La electroforesis simultdnea facilita la separacidn del I ,—
de las proteinas plasmdticas; al mismo tierapo que éstas se desplazan
en bloque llevando con ellas la fraccidn dahada de la insulina mar
cada (proteinas).
(G—3b).- Materiales.
1.- Tamp<5n veronal sddico 0.05 M (pH 8.6), para la cromatoelectrofo_
resis.
2.- Tiras de papel Whatman 3 2*1.
A una distancia adecuada de une de los extremes de las tiras de
73
papel, se marcan con 1dpiz dos lineas, el drea localizada entre ellas
sirve de guia para la aplicacidn de las muestras,
3.- Plasma normal de conejo.
4.- Azul de Bromofenol (British drug Houses),
5.- Equipo de electroforesis.
(G—3c).- Preparacidn de las muestras.
En tubos de 5 % 0.375 cm. previamente numerados, se pipetea una
alîcuota de la mezcla de marcaje, asî como de las fracciones proceden
tes de la purificacidn de la hormona marcada, y correspondientes al
pico de la insulinal^^^ (n 12-16) y del libre (n® l8 <5 2l).
Se compléta el volumen a 100yul con tarapdn veronal sddico O.O5
M (pH 8.6).
Inmediatamente antes de la aplicacidn de las muestras a las ti
ras de papel, se anade a cada tubo una alîcuota del plasma normal de
conejo con azul de bromofenol^ Esta solucidn actua como "carrier" -
indicador.
(G—3d).- Cromatoelectroforesis.
Las tiras dé papel Whatman 3 se humedecen individualmente en
el tampdn veronal, y se colocan numeradas sobre el sororte del apara
to de electroforesis. Ambos extremes de las tiras han de quedar sumer
gidos en el tampdn veronal de las dos cubetas del aparato, y con el
origen situado en el extremo del catodo.
74
7000
6000
&
5000
4000
3000
roO
EÛLOT3O*D'>O*■6 2000
1000
250
Insulina - I
I - 125
Insulina degradada
.1
PROTEINA SALESORIGEN cms.
FIGURA. 3.- Cromatoelectroforesis en papel V/hatman 313vî de■una alîcuota de la mezcla del marcaje de la in-
125sulina-I ,125En el origen se enouentra la insulina-I intacta.
125Con las proteinas esta la fraccidn de insulina-I degradada125Con las sales aparece el lodo libre
85 90
Fraccion n® 16
25 - 25
-5
-7050Fraccion n® 18Fraccio n
2525 *OX
E 5 Q .6I 23
I '4I 10
-5
Fraccion n® 12 Fraccion n® 21-14
-10-6
PROTEINA
-2-
ORIGENSALESORIGEN PROTEINA SALEScms.
FIGURA 4*“ Cromatoelectroforotof_,Tamas en papel V/hatman 3 TTA dealîcuotas procédantes de las fracciones oolectadas
125durante la purificaoiôn de la insulina-I por una columna de sephadex G-50 fino (0*8 x 22 cm),
125El origen représenta la insulina-I intacta, con las proteinas125 125se enouentra la insulina-I degradada y ccn las sales el lodo
libre.El mayor grado de pureza corresponde a las fracciones ns 15 y l6, El porcentaje de hormona degradada en estas fracciones es menor del 3
La cromatoelectroforesis se realiza en odmara fria a 4®C, con
sistema de aire circulante, que favorece la evaporacidn en la super
ficie de las tiras* Se emplea un voltaje constante de 25 voltios/ cm
de longitud de las tiras, y 11 mAmperios,
Despues de 2 a 2,5 horas, la mancha azul indioadora de las pro
teinas plasmâticas se ha desplazado de 10 a 12 cm del origen.
Las tiras se secan & 120^0 durante diez minutes, se cortan en cm
y se lee su radioactividad en un contador Tricarb de radiacidn Gamma125modelo 3002, calibrado para I ,
La figura 3 muestra la distribucidn de la radioactividad en un
cromatoelectroforetograma de una alîcuota de la mezcla del marcaje.
La radioactividad en el origen corresponde a la proteina intacta mar- 125cada (insulina-I ); ccn las proteinas plasmdticas se enouentra la
125hormona degradada (insulina-I degradada). Y, por ültirao, observa-125mos el pico de radioactividad que corresponde al I libre ( sales).
La figura 4 corresponde a las cromatoelectroforesis de alîcuotas125de las fracciones procedentes de la purificaciôn de la insulina-I
en columnas de sephadex G—50 fino,
Como puede verse, las fracciones mds puras corresponden a los125nümeros 15 y 16, El porcentaje de insulina-I danada, es siempre
menor del 8
( G—4) •*“ Cdlculos»
(C-4a),— Actividad especîfica de la insullna-I^^^,
- ' 77
'La actividad especîfica corresponde a la cantidad (me) de I
incorporada a un mg de la hormona,
Adinitiendo quo la hormona se ma rca en una proporciôn de un âto-
mo de I / monômero de insulina ( p.m. ~ 6,000), aunque una fracciôn125de la proteina puede contoner dos 6 mas âtomos de iodo , se puede
calcular la actividad especîfica aproximadamente conociondo;1251) Actividad especîfica del lote de I que usamos,
2) Concontraciôn do insulina cristalizada que empleamos en el marcaje1253) Cantidad de I que queda libre y no reacciona con la hormona
A partir de la cromatoelectroforesis de la mezcla del marcaje,
podemos calcular faoilmento el ^ de libre, se admite que tante125 125 las fracciones de insulina-I intacta como la insulina-I de
gradada, tienen la misma actividad especîfica.
La actividad especîfica conseguida en nuestras preparaciones de
Po/ Kinsulina-I , ha sido siempre de — 4OO uo/ ug de proteina.
125(G-4b),— Determinaoiôn del porcentaje de insulina-I intacta de
las fracciones purificadas.
La pureza de las fracciones seleccionadas para el inmunoensayo,
se détermina a partir de las cromatoelectroforesis, El porcentaje de
hormona intacta es del 91 al 94
78
( Gr-3 ) * - Radi O inmunoensayo.
( G-3a)«- Consideraciones teôricaa.
El radioinmunoensayo estâ basado en una reacciôn entre la insuli—125 131na radioactive (insulina-I 6 insulina-I ) y el anticuerpo espe-
cîfico, dando lugar a la formaciôn de un oornplejo "insulina radioac
tive- anticuerpo"; y de la inhibiciôn competitive de esta reacciôn por
la insulina no radioactive,
Insulina-I^^^_L Anticuerpo anti-insulina : "^Insulina-I^^^- anticuerpo (P) (Ab) (B)
“FInsulina no radioactive K
Insulina - anticuerpo
125Si en el sistema permaneoen constantes la cantidad de insulina-I125y de anticuerpo, la razôn B/p ( compleje "insulina-I - anticuerpo/
125insulina-I libre), disminuye progresivamente al aumentar la con-
oentraoiôn de insulina no radioactive. De esta manera, empleando con-
centraciones crecientes y conocidas de insulina no radioactiva, po
demos obtener una curva standard.
La concentracidn de insulina en soluciones no conocidas ( mues
tras problema), se détermina por comparacidn de su cociente B/p con
la curva standard.
79
la sensibilidad y precisiôn de la técnica depende de la inoli-
naciôn de la curva standard, determinada a su vez por la magnitud -
en las variaciones del cociente B/P en relacidn con la variacidn de
la concentracidn de insulina no radioactiva ( A (b/ F ^ I nsulinaJ ),
siendo por tante requisites necesariosj la obtencidn de insulina ra
dioactiva de alta actividad especîfica^ y el disponer de un anticuer^
po de gran capacidad de reaccidn con el antigeno, aparté de una bu^
na tdcnica de separacidn del complejo insulina radioactiva-anticuer
po, de la insulina radioactiva libre.
Caracterfsticas de la insulina radioactiva: De los estudios rea
lizados sobre el comportamiento electroforético y cromatogràfico de
la insulina radioactiva, se ha obtenido una inforraacidn muy lîtil p^
ra el desarrollo del inmunoensayo*
La insulina, en comun con otras proteinas tiene la tendencia de
ser absorvida por oiertas superficies inertes, como el papel y el vi
drio. Aunque concentraciones relativamente bajas de otras proteinas
taies como seroalbumina (2.5 mg/ml) inhiben completamente la absor-
cidn de la insulina por el material de vidrio usado en el laborato-
rio, la inhibiciôn de la absorcîôn de la hormona por oiertos tipos
de papel no se puede conseguir ni aun utilizando concentraciones —
muy altas de albumina.
Si se aplica a una tira de papel Whatman 3 ô 3 MO una mezcla
80
de insulina radioactiva y plasma control, la primera permanece fi.m
da al sitio de aplicaciôn (origen), mi entras que las proteinas pla^
mâticas se desplazan a una distancia de este.
Si a las tiras de papel se les aplica previamente una concentre^
ciôn de insulina no radioactiva (lOOyag/ml), hasta conseguir saturar
los sitios del papel que absorven a la hormona, la insulina radioa^
tiva aplicada posteriormente emigra cromatogrdfica y electroforôtica
mente.
En contraste, la insulina radioactiva unida al anticuerpo se des
plaza a una zona situada entre las y / globulinas, aun en los pap^
les que no han sido previamente saturados con insulina.
Esta conducts de la insulina fuô aprobechada priraeramente por
Yalow y Berson en su raétodo original, con dos finalidades; I.- Valo_
rar la insulina radioactiva danada, que se une y desplaza junte con
las proteinas plasmdticas y 2.- Separar la insulina radioactiva libre
del complejo insulina radioactiva-anticuerpo (37)* En su método orn
ginal estes autores consiguen ambos propôsitos aplicando los procedien
tes de electroforesis 6 cromatoelectroforesis a temperatura de 4®C.
Nosotros, en nuestra técnica conseguimos los mismos fines apli_
cando una cromatografia simple en papel Whatman 3 y a tempeatura
ambiente.
Ko todos los tipos de papel sirven para estes propôsitos. El —
81
môs utilizado es el papel Whatman 3 KC 6 3 I#; y dentro de estes t^
pos, las caracteristicas varian con los distintos lotes; por lo que
es muy necesario hacer siempre unas pruebas en cada lote con el fin
de buscar las condiciones mas favorables.
Por otra parte, ya que las seroproteinas tarabien se absorven -
al papel, el erapleo de suficiente globulina "carrier" para evitar -
el arrastre del complejo insulina radioactiva-anticuerpo a lo largo
del trayecto de migraciôn, es otra de las pruebas importantes que -
hay que realizar.
(G-5b).- Materi aies ;
IDiluyente standard.- Todos los componentes del inmunoensayo se
preparan en tampôn veronal sôdico 0.05 ^ (pH 8.6) conteniendo albu
mine humana 0.25^ y plasma normal de cobaya al I . La adiciôn de
tas proteinas évita la pérdida por absorcion a la superficie del
drio del antigeno y anticuerpo respectivarnente. Ya que la concentra
ciôn de sales puede influir en el desarrollo del inmunoensayo (37)
el diluyente standard se filtrô siempre por una columna de sephadex
G-50 fino,1252,— Insulina I de bovino.— Se des congela una alîcuota de la horm o
na purificada y guardada para el inmunoensayo.125Ya que la vida media de la insulina I es de dos meses, y du
rante el periodo de almacenaraiento (-20^0) se produce un dano progr^
82
sivo en la hormona, se concluyô por purificar la cantidad necesaria
para cada radioinmunoensayo,125La diluciôn final de la insulina-I requerida en el inmunoensayo
depende de la actividad especîfica, y por tanto difiero de un loto a
otro. Normalinente hemos utilizado una concentracidn de aproximadamen
te 100 jjig/ 50^ 1.
3.- Standard de insulina cristalizada de origen bovino.
El standard se prépara disolviendo 2 mg de la insulina cristali-
zada de bovino ( Lilly. Lote PJ - 4609),(hemos utilizado siempre el
mismo lote de insulina para los standard y el marcaje de la hormpna)
libre de glucagôn, en 10 ml de agua acidificada ( pîî 2.5)*Se divide
en alîcuotas de 0.1 ml ( concentracidn de 200 g/ml) y se guarda en
multiples viales a —20^0. El standard asî proparado se usa durante
sois meses. Inmediatamente antes de montar el inmunoensayo, se des
congela un vial y se diluye la hormona con el tampon utilizado.
4.- Anticuerpo,
En todos nuestros estudios hemos utilizado antisueros de cobaya
anti-insulina de cerdo, especialrnente seleccionados para pruebas de
inmunoensayo (Lote K 9223)
Los antisueros proceden de la casa Wellcome Research Laborato
ries envasados en viales, cada vial contiens un residuo liofilizado
de 0 ,5 ml de suero a dilucidn l/lOOO, en tampon fosfato (O.O4 H pH 7#4),
83
conteniendo thiomertiolato (0 ,6 nlî) y seroalbumina de bovino
Los antisueros liofilizados se pueden guardar a 4^0 por tierapo
indéfinido, determinado por el periodo de validez de cada lote expr^
sado en el envase. Una vez disuelto el producto en el tampôn utili
zado en el inmunoensayo, el anticuerpo se puede guardar a -200C divi_
dido en alîcuotas. No es conveniente descongolarlo mas de una vez.
La dilucidn final utilizada en el inmunoensayo varia segun los125lotes;y dentro de un mismo lote estd en relaciôn con la insulinal
empleada. De esto se deduce, que siempre que se trabaje con insulina
marcada nueva, 6 bien con un lote nuovo de anticuerpos hay que rea
lizar una prueba denorainada: "Curva de binding del anticuerpo".
La concentracidn correcta serd aquella que dé un cociente B/F
comprendido entre I y 2, y en cuyo caso el anticuerpo se combina con
un 60^ d 70^ de la insulina radioactiva.
La dilucidn citada en los envases es solamente una guîa, y re
présenta la concentracidn final de anticuerpo requerida para combinar
se aproximadamente con un 60^ de 100 jajig de insulina radioactiva en
un volumen total de 0 .9 ml.
La figura n@ 5 muestra una tîpica curva de "binding" del anti
cuerpo, obtenida en las condiciones deterrainadas al pie de la grdfica.
La concentracidn del anticuerpo elegida en este caso fué la de
1/15O.OOO, que corresponde a un cociente b/P de 1.5.
84
e-Û
CsJ
OcD(/)C
&Q>5
CVJ
Oc3coc►—t 0,5
iso^Ls0 10 20 30 40 50 60 00 100
Anticuerpo (dilucidn 1/15000)
FIGURA 5*~ ‘’Curva de binding del anticuerpo anti-insulina"Capacidad de combinaci6n de concentraciones crecientes
del antisuero especîfico anti-insulina de porcino ( Lote K 9223)con una concentracidn fi ja ( ^ 100 de insulina-I^^^.La concentracidn de anticuerpo elegida corresponde a la que se com-
12Sbina con un 60 ^ de la insulina-I ' { cociente S/P de 1*5)
5.- T'.uostras problema.
En el estudio realiaado en esta Tesis, hemos valorado siempro,
todas y cada una de las fracciones procedentes de la cromatografia de
los plasmas, y comprendidas entre la salida de la albumina y las sales
(n2 18 al 54)j asî como los plasmas no fraccionados, estes ültimos a
diluciones de l/lO y l/20.
En estas condiciones, es mînimo el dano producido por el plas- 125ma en la insulina-I , durante el periodo de incubacidn. Teniendo
en cuenta que la insulina danada no se combina con el anticuerpo, aun
en estas condiciones en que trabajamos, en todos nuestros ensayos
llevamos contrôles de " migracidn no especîfica" (llME), que nos per—
miten trabajar en condiciones de gran pureza,
Iæ>3 plasmas se descongelan inmediatamente antes del ensayo, se cen-
trifugan a 2,000 rpm durante 15 minutes, y se valoran a las dilucio
nes ya ezpresadas,
6.- Tubos para el inmunoensayo de 5 x 0,375 cm.
86
(G-5c ).- Monta.je del inmunoensayo,
I,— Protocole tipo:
Para un voluraen final de 500yal, se anaden con micropipeta los
reactivos en el orden siguiente:
NO Tampdn vero- Insulina 125Concentracidn Insulinal Anticuerponal+albumina (2.5 insulina (mpg) (-100ytÿug) I/15OOO
^ 1
I 400 — ------ — — 50 502 390 10 0.025 I I I f
3 380 20 0,050 I I I t
4 360 40 0.100 I I I I
5 320 80 0.200 I I I t
6 200 200 0.500 I I I I
7 ---------- 400 1 .000 I I I I
MNE 450 -------------- ---- 50 — —MNE 450 I I
FraccionesnO 18 al 54 Fracciones
jal400 50 50
Plasmal/lO
350
Control plasma 400
Plasma1/20 375
Control plasma 425
Plasma
50
25
25
50
50
50
50
50
50
= Migracidn no especîfica 6 control sin anticuerpo,
87
2.- Incubation,
Los tubos conteniendo las mezclas se dejan incubar durante 4 â
5 dîas. Es coridicidn muy importante que esto se reali ce a 4^0,
(G-5d),~ Cromatogra.fla,
Materiales:
1.- Tampdn veronal sddico 0.05 M (pH 8.6) para la cromatografia,
2.- Tiras de papel Whatman 3 de 4 x 39 cm.
A 8 cm, aproximadamente de uno de los extremes de las tiras, se
marcan dos lineas con lapiz, sirviendo de origen para la aplica^
cidn de las muestras.
3.- Plasma normal de conejo,
4.- Azul de bromofenol.
5.- Cubetas de cromatografia, (Lagoplast S.A. Madrid, segun diseno
nuestro). Se trata de recipientes de pldstico de 65 cm. de lar
go x 5 cm. de alto y 3 cm. de ancho, en los que se introduce un
extreme de las tiras (origen), una de las paredes, mds elevada
(7 cm,) sirve de soporte a estas. )
A 29 cm. de distancia, un soporte longitudinal paralelo a la eu
beta y de la misma altura que el soporte de esta, sirve de apoyo
al extreme distal de las tiras.
Las cubetas acomodan bien hasta I5 tiras de 4 cm. de ancho,
Una tapa de cristal impide la rdpida évaporacidn en la superficie
88
de las tiras y permite en todo momento observar la marcha de la cr£
matografia,
Freparacidn de las tiras de cromatografias
En las cubetas de cromatografia conteniendo tampdn veronal sddi
co, se humedecen individualmente las tiras, y se colocan horizontal^
mente entre los dos soportes de las cubetas. El extreme del origen
ha de quedar completamente sumergido en el tampdn veronal,
Preparacidn y aplicacidn de las muestras;
1.- Inmediatamente antes de la aplicacidn, se sacan del refrigerador
un nG sufuciente de muestras para llenar una cubeta. Se les aîm
de una alîcuota de plasma normal de conejo con azul de bromofenol,
(Esta solucidn sirve de guîa visual para determinar la migracidn
mdxima del complejo antîgeno-anticuerpo, durante la croraatografîa^
Se raezclan bien y se procédé a su aplicacidn.
2.- En el origen de cada tira, se aplica un volumen total de 250yul
de la muestra, (Para evitar el arrastre, esta aplicacidn se rea
liza en très fases: 100-100 y ^0jal respectivamente).
3.- En un tiempo aproximado de 2 ^ 3 horas, la separacidn de la man
cha azul (indicadora de las proteinas) desde el origen, es mdxiraa,
4.— Las tiras se colocan en soportes adecuados y se secan en estufa
a 1200C durante 10 minutes.
5.- La preparacidn de las tiras para valorar su radioactividad se rea
89
liza de la manera siguientes se superponen las areas del origen y la
proteina y se corta la tira por la mitad, al mismo tiempo que se de-
sechan los dos extremos, Cada seccidn se enrolla con la porcidii radi£
activa situada en el interior, y se introducen en tubos especiales.
La radioactividad se lee en un contador Tricarb de radiacidn Gamma125(modelo 3002) calibrado para I •
(G-5e).- Cdlculos;
1.- Obtener en cada tira las cpm que corresponden al origen y a la
proteina. Determinar las cuentas totales que corresponden a cada
tira.1252.- Corregir en cada tira la insulinal dahada, que emigra con las
proteinas. Esta correcidn se hace determinando las cuentas que -125corresponden a la insulinal util para combinarse con el anti
cuerpo.
Calcular ^ de MNE de las tiras control y restarlo de 100. Este —125valor représenta el ^ de insulinal util para unirse al anticuer
po.125
3.- Determinar el ^ de insulinal libre (P).125
4.- Determinar el ^ de insulinal unida al anticuerpo (B).
5.— Determinar el cociente B/p.
6.- Representar la curva dosis/respuesta, utilizando el cociente B/P
y las concentraciones standard de insulina no marcada.
90
2to
MOC
3WC
0)3 OfC< 0.6
S 0,4
§0.2
0.50,2Insulina m/jg.
PIGfllIlil 6.- Curva standard125Hepresentaoiôn grdfioa de oocientes B/P ( insulina—I —
125anticuerpo/ insulina-I libre) en funoidn de concentraciones cre-
.125cientes de insulina no radioactiva.Para una concentracidn fi ja de la insulina-I' '" 100 yjXQ) y delantisuero anti-insulina ( dilucion l/ 150,000), la presencia deconcentraciones crecientes desde 0 a 1 mjig de la insulina no radioactiva, produce una caida del cociente e/p que est'i en raaonIdirecta a las concentraciones de insulina no radioactiva présentes.
7*~ Detorrlnar en cada muestra valorada la concentracidn en por
el volum.en ensayado, y calcular i^g/ ml 6 jilJ/ ml,
la firyira 6 représenta una curva standard obtenida en las con
diciones expuestas al pié de /yrdfica, Puede observarso qua la
caida mâs importante del cociente p/p se produce entre las con
centraciones de 0 y 0,5 mpy de la insulina no radioactiva.
9
H.- AISLÆ'IPIlfO DE LOS CŒPŒlEIfTES "BIG DJSITPDTA", "LITTL2 D'SULDTA"
Y "l'IlTI DiæiIPA",-
Hemos seguido basioamente el procedimiento de Rotli y col. (108).
(H-1). ITateriales.
1,- Sephadex G—50 fino
2,- Columnas de vidrio de 4 x 60 cm
3#~ Tampon veronal sddico 0.05 H (pH 8.6), conteniendo albumina humana
0.25
(H-2). La preparacidn del gel, el empaquetamiento y equilibrio de las
columnas se realizaron siguiendo las pautas eximestas en los apar-
tados F-3 y F-4#
(H-3)# Calibracidn de las columnas.
La altura alcanzada por el gel, una vez equilibrada la columna
fué de 54 cm.
Cuarenta ml de plasma normal de conejo incubados durante unas horas 125a 4®C con insulina-I , se aplicaron a la columna, Una vez que el plas
ma ha penetrado totalmente en el gel, la columna se eluye con el tam
pon veronal sddico 0,05 11 (pH 8.6) adicionado con albumina humana 0.25 i-»
El procedimiento se rea liza en câmara fria a 4®C. El flujo de eluoidn
es constante y se realiza a 10 ml/ hora. Se ooleotan fracciones de 4 ml
y se valoran por P.O. a 275 mu de longitud de onda, y por radioactividad.
93
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|uu /^0 | X LU d 3 pDpiAjtODipna
La figura 7 représenta la calibraciôn de ûna coluKina de sephadox
G“50 fine (4 x 54 cm). Observâmes les volumenes de eluciôn de las pro-
teinas plasmdticas de alto peso molecular (albûmina), de la insulina-
y del 1^-5 libre.
95
RESÜLTADOS
Grupo I.- BIT El, PLAST'A D3 CO-
Krjjos BIT AYITTTO PE 24 HORAS C Grupo control).
Exponenos a continuaciôn les resultados obtenidos en el estudio
realisado on los animales en condioiones basales. Cinco boras despues
de la intea’vonoiôn quirurgica, con los conejos completamente récupé
ra do s se tomaron las muestras do sangre portal heparinizada, valorân-
do en oada uno de los plasmas la ooncentracidn total do insulina y
glucosa.
Para el estudio de los componentes insulino-inmunorreactivos, te-
niendo en cuenta las bajas ooncentracionos de insulina circulante,
asî como el efecto de dilucidn que so produce durante el fracciona-
miento proteico de los plasmas, los volt5menes filtrados por la cclura-
na de sephadox G—50 fino ( 1 x 50 cm), fueron siempro de dos ml.
En la tabla I se reflejan los valores individuales de las gluco-
mias e insulinemias. Los resultados se expresan para la glucosa en
mg ^ ml de plasma, y para la insulina en mjig/ ml de plasma*
Le los distintos componentes insulinlcos, damos su concentracidn
expresada en mpg/ ml de plasma, asî como sus porcentajes respectives.
Asî misino se dâ el porcentaje de insulina recuperada en el frao-
cionamiento proteico de los plasmas.
El promedio de valores encontrado fué, de I56 mg de glucosa ^ ml
de plasma ( ^ 28) para las gluceraias, y de 1.238 mu^ de insulina cir-
9 7
culante/ ml de plasma (f 0.16).
El porcentaje do insulina recuperada on las cromato^rrafias fué sierr
pre del 90 al 97Bn la figura 8 ( consideraoiones técnicas al pié de grafica) re
présentâmes un exporimento tipo, Por el distinto volumen do elucién
en la oolumna de cromatografia, se observa clarajTiente la existenoia
de très fracciones 6 componentes insulinicos, que reaccionan con los
antisueros espocîficos anti-insulina,
lia fraccién mayor aparece como un pico simétrico, en una zona inter
media entre los picos de elucién de las proteinas de alto peso mole
cular ( albüinina) y las sales plasmâticas; correspondiendo por tanto,125a la regién en que eluye la insulina-I en la oalibracién de las co-
lumnas ( fig I pdgina 64).
Una segunda fraccién aparece como un pequeno pico de material in-125munorreactivo, situado en una zona anterior a la insulina-I , entre
esta y el pico de las seroproteinas. Por su posicién cromatogrâfica,
este material corresponde a un peso molecular mayor que el de la in
sulina oristalizada.
Ambos componentes presontan caracterîsticas cromatogrâficas simi-
lares a los descritos por Both y col (lOB) en el hombre,con la deno-
minacién de "little insulina" y "big insulina", respectivamonte.
Por ültimo, nosotros encontramos consistentemente un tercer com-
9 8
ponento 6 fraooién, que por ser mâs retenldo por el sephadex,apar©oe
como un pequeno pico de material inmunorreactive situado en una re-
gién posterior a la "little insulina", entre esta y el pico de las sa
les plasradticas. Este componente , descrito por primera vez en esta Te-
sis Doctoral,por las caracterîsticas cromatogrdficas que présenta, ha
sido denominadO. tentativamento "mini insulina".
En condioiones basales, los valores porcentuales de los très oom-
ponentes circulantes en la sangre portai fueron los siguientes;
"big insulina" - 2 al 11 € , "little insulina" - 86 al 94 ^ y "mini
insulina" - 2 al 4 ^ de la insulina total circulante.
Ante estes resultados, podemos senalar que en los animales de
nuestro grupo control, la concentracién total de insulina inmunorreac-**
tiva circulante en la sangre portai, corresponde a los valores norma
les comunicados por otros laboratories.
Por otra parte, si bien las concentraciones de glucosa corresponden
al limite superior de los niveles considerados como normoglucémicos,
cabe pensar que este hecho no se deba a la accién aguda del stress
quirdrgico, pues aparté de realizar los expérimentes on animales com-
pletamente recuperados, el ernpleo previo de la dehidroergotamina, évi
ta el efecto hiperglucémico de la anestesia con ©ter. Segun este, su-
gerimos la posibilidad, de que los niveles glucémicos relativamente
altos, puedan ser debidos a que nuestras determinaciones ostdn reali—
9 9
zadas en el plasma, y sabemos que en estas condioiones la conoentra-
cién de glucosa es un 15 6 20 mâs elevada que ouando se détermina
en la sangre total (170).
Es de gran interes senalar, la presoncia en el plasma de très com
ponentes insulino-inmunorreactivos ( "big insulina" , "little insulina"
y " mini insulina")^ si bien la mayor parte de la hormona circulante
corresponde a "little insulina".
Control de reaccién inmunolôgica de la posible existenoia en el plas
ma de otros factores iiferentes de la insulina, que puedan interferir
en el radioinmunoensayo.
Los resultados que hemos obtenido al estudiar las caracterîsticas
crornatogrâficas de la insulina inrnunorreactiva circulante en la s an**
gre portai de conejos en condioiones basales, han demostrado de una
manera consistante, la presencia de los très componentes yâ descritos.
Sin embargo ézistia la duda de que estos resultados pudieran ser
debidos a un artefacto de nuestro sistema experimental,
Realizamos pues, un doble control radioinmunolégico, que nos sir-
vi6 para excluir la posibilidad de que otros factores diferentes de
la insulina y présentes en ol plasma,pudieran ser en el inmunoensayo
la causa de -altoraciones del cooiente B/p ( insulina-I^unida al anti>12Scuerpo/ insulina-I libre), y dar lugar a falsos resultados.
100
Para ello, y siguiendo la sistoinâtioa g enoral, dos ml de plasma
procédante de un conejo en ayuno de 24 horag se filtraron de la ma
nera habituai por una columna de sophadex G-50 fino ( 1 x 50 cm), co-
lectando fracciones de 1 ml. La valoracién radioinmunolôgioa de todas
y cada una de las fracciones comprendidas entre los puntos de elucién
de la albûmina y las sales,se acornpahé de dos contrôles, uno de LUE
( en ausencia de anticuerpo) y otro con un exceso de anticuerpo.
El control de l'IîE ( inigracién no especlfica) fué del mismo or-
den en todas las fracciones, y por otra parte, coincidié con los va
lores encontrados norrrialrrente en todoa nuestros ensayos, ( aproximada-
mente un 6 a 7 ÿ-)»
Por su parte,en el control de exceso de anticuerpo, aproximadamen-125te un 93 ^ de la insulina-I se unié al anticuerpo.
Ambos contrôles nos indicaron, como en el radioinmunoensayo, la 125insulina-I estâ inmunologicaraonte Intacta ( no degradada), y que
no existon otras sustancias que interfieran con el antisuero especî-
fico anti-insulina.
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PICtTTRA 8*~ Cromatografia en colvirnna de sephadex G-$0 fino (l z ^0 cn) de dos ml de plasma ( sangre de la vena porta, conejo
en ayuno de 24 horas)*En ordenadas se expresan los mjug de material inmunorreactivo re- ouperado/ fraocidn.En a'bscisas représentâmes el niimero de fracciones. Las fléchas a derecha e izquierda.represontan la localizacidn de la albûmina y las sales, respeotivarnente. Las cifras anotadas en los picos re- presentan la cantidad total do material inmunorreactivo récupéra- do en las oorrespondientes fracciones,
El material innunorreactivo looalizado aproxiniadarnente entre g1 pico de la albûmina y la insulina-1125.El material inrnvmorreactivo localizado aproxiniadarnente a la mitad de distanoia entre los picos de la albûmina y las sales Corresponde al material innunorreactivo localizado entre la insulina-1125 y las sales plasrodticas.
mm
Grupo II.- CŒrCI'Ejn'ES PIAS'^A, c m O
HE3HTESTA AL AYUNO PROIOEGADO.
Est© seguindo grupo d© nuestro planteaniiento experimental, compren-
de el ©studio de los componentes insuline- inrnunorreactivos circulan
tes en sangre portai de con©jos sornetidos a un ayuno prolongado ( 48
horas)^ sin estîmulo, Ijas muestras de sangre pointai heparinizada se to-
maron oinco horas despues do finalizada la intervencidn quirûrgica, con
los animales recuperados totalraente,
Valoramos en cada uno de los animales, la concontraciôn de gluco
sa y de insulina inmunorreaotiva total,circulante en la sangre.
Tratando de ©ncontrar condioiones mds adecuadas para valorar los
componentes insulinicos ên estos plasmas, fué necesario hacer una adap-
taoién de las condioiones técnicas, consistent© en s a) Piltrar volû-
menes do très ml de plasma por la columna de sephadox G— 50 fino ( 1
X 50 cm). h) Aumentar el volumen de la muestra valorada en el radio—
inmunoensayo hasta 4OO jil. Con estas modificaciones logramos que el mé-
todo tuviese sonsibilidad suficiente, para poder valorar las muy ba
jas concentraciones a que se encuentran dichos componentes on estos
plasmas.
En la tabla II se resumen los valores individuales de las gluce-
mias ( en mg de glucosa ^ ml de plasma), la concentracién total do in
sulina circulante ( en mug/ ml de plasma), y los componentes insuline-y i
10
inrnunorreactivos exprcsados tanto en su concentracién ( rnjig/ rnl de
plasma) como su porcentaje respoctivo,
Tambien se ddn los porcentajec de hormona recuperada durante e l
fraccionainiento proteico.
Los valores medics encontrados e.n este grupo de animales corres--
ponden a 0 .75 mug de insulina/ ml de plasma (+ 0,096)5 y de 111,8 m;
de glucosa / ml de plasma (+ 11,92)
El porcentaje de insulina recuperada en las oromatografiao fué
siempre, de 90 a 92 / de la hormona total dotectada en los plasmas no
fracoionados.
En la figura 9 représentâmes un expérimente tipo, Tambien aquî,
la cromatofppafia del plasma de estos animales en ayimo do 48 horas, nos muestra la existenoia de las très fracciones 6 componentes insuli
ne- inrnunorreactivos, cuyos porcentajoc corresponden a los valores si-
guientesî ” big insulina" - 2 al 9 / > "little insulina" - 88 al 98 / y "mini insulina" - 0 al 4 / de la hormona circulante,
Podemos pues resumir el estudio de este grupo experimental se—
nalando que : l)Existe una disminucién de la concentracién total de
insulina circulante en sangre de la vena porta, que es ostadistica—
mente oignificativa ( p /f.0.001) al compararla con el grupo control,
2) Esta disminucién en los niveles de insulina, se acompana de una di
minuoién que tambien es estadisticamente significativa ( p4P,01)de loi
05
valores glucéniicos,3) El porcentaje de los componentes insu11no- in-
munorroactivos es anâlogo al obtenido en los animales control, no sien-
do sus diferencias estadisticamente significativas ( p)0»5). 4) En es
tas condioiones expérimentales, la mayor parte de la hormona circu
lante corresponde a "little insulina".
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FÏGlTRii 9.- Cromatografia en columna de sephadex G-50 fine (l x 50cm) de très ml de plasma (sangTe de la vona porta, cone-
jo en ayuno de 48 horas)•En ordenadas se expresan los mug de material inrnunorreactivos recu- porado/ fraccion.En a'bscisas représentâmes el nl5mero de fracciones* las fléchas a de— recha e izquierda representan la localizacidn de la albûmina y sales, respectivameîite* Las oifras anotadas en los picos representan la cantidad total de material inmunorreactivo recuperado en las correspon- dientes fracciones*
Es el material innunorreactivo localizado aproxirnadamente en- tre el pico de la albûmina y la insulina-1125 Es el material inmitmorreaetivo localizado aproxirnadamente a
^ la mitad de distanoia entro los picos de la albûmina y las sales.Corresponde al material ir.munorreactivo localizado entre la insulina-1125 y las sales plasm^ticas.
Grupo III*- E?i EL PLASLA^caioR E 3 iV r ip / : \A A T.A A IT lE IE T R A C T O E DE GLUCAGOl'T
Realizanios este fprupo experimental estudiando cone303 sometidos a un ayuno previo do 24 horas, y estimulao.os con glucagon intravonoso
( 100^g/ kg do peso)* Las muestras de sangre portal heparinizada se
tomaron cinco minutes despues do aplicado el estîmulo, coincidiendo
con el pico de rndxima secreoidn de insulina (171)* Como en todos los
grupos expérimentales, valoromos concentracidn de glucosa o insulina
total del plasma,
Dehido a las altas concentraciones de insulina circulante en este
grupo de animales, el fraccionamiento proteico de los plasmas lo reali
zamos filtrando por la columna de sephadex G-50 fino ( 1 x 50 cm) volu
menes de 1 ml.
En la tabla III se muestra el resumen do los valores individuales
de las ooncentracionos de glucosa exprosada en mg % ml de plasma, de
insulina total expresada en nijiig/ ml de plasma y, asi mismo exponemos
las concontraciones ( nyg/ rnl de plasma) y porcentajes respectives de
los componentes insulino-inmunori'eactivos * Por ûltimo, damos los por
centajes de insulina recuperada en las cromato^prafias de los plasmas*
Puede comprobarsG, en primer lugar una elevacidn altaraente signi
ficativa ( p 0,001) en la concentracidn de insulina total, cuyo promedio corresponde a 12*28 mug/ ml de plasma ( :p 4.33)* Estos resulta-
100
dos estdn totalrocnto de aeuerdo con el concepto roiteradamente confir-
mado;y que corresponden a la acci6n del glucagon como potente estimu
lante de la secrecidn de insulina ( 171)
Los valores encontrados en las gluceaia-s son sirnilares a los obte—
nidos en los animales del grupo control ( p estadisticamente no signi
ficativa 0.5) > cuyo promedio es de 159*^6 mg de glucosa / ml de plas
ma (± 17*74)• Estos resultados confirman también a este nivol, los obte-
nidos por Samols y col, (171), aportando una mayor consistencia al he
cho de que la secrociôn de insulina producida por el gluoagôn precede
a las modificaciones de la glucemia,
El estudio de los componentes insulino-inmunorreactivos en estos
plasmas queda graficamente exprèsado en la tabla III y figura 10, don-
de exponemos el apropiado experimento tipo.
En cuanto a dichos componentes IRI ("big insulina’», "little insuli
na" y "mini insulina"), en esta especial situaciôn experimental, nues
tros resultados aportan las caracterîsticas siguientes:
Si bien la concentracién de los très componentes esté considerada
en su totalidad muy aumentada, la proporcionalidad en que se encuentran
guarda la misrna relacién que en el grupo de los animales contrôles, no
mostrando diferencias estadisticamente significativas ( p^ 0.5), gien-A
do sus porcentajes como sigue:
"big insulina" - 7 al 10 /•, "little insulina" - 88 al 93 ^ y "mini in~
110
sulina" - 0 al 4 / de la insulina total circulante
Es évidente que de acuerdo con estos resultados: l) El glucagon es
un potente estîmulo de la secreciôn de insulina, 2) Esta estimulaciôn
es anterior a los carnbios glucémicos, 3) La mayor parte de la insulina
circulante en estas condioiones expérimentales corresponde a "little
insulina", aunque la concentracién de los très componentes esté pro—
porcionalrnente elevada.
111
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FIGURA 10,- Croinatografia en ooliffiina de sephadex G-50 fino (l x 50 cm) de 1 ml de plasma ( sangre de la vena porta, cone
jo en ayuno de 24 horas y 5 minutes despues de la estimulaoidn con gluoagôn i,v, ICO jig/ kg de peso)En ordenadas se expresan los njug de material inmunorreactivo recuperado/ fraccidn.En a'bscisas representamos el ni1inero.de fracciones. Las fléchas a derecha e izquierda representan la localizaciôn do la albdmina y sales respeotivarnente. Las cifras anotadas en los picos representan la cantidad de material inmunorreactivo recuperado en las oorrespondientes fracciones.
El material inmunorreactivo localizado aproxirnadamente entre el pico de la albûmina y la insulina-1125*El material inmunorreactivo localizado aproxirnadamente a la mitad de distanoia entre los picos de la albûmina y sales. Corresponde al material inmunorreactivo localizado entre la insulina-1125 y las sales plasmâticas.
Grupo IV.- COJFOI^îIPES IHSULIlTO-raUïïORRBACTIVOS BE BL PIASiA, CŒ'O
RESKIESTA A lA ARBIEISTRACIOE DE TOLBUT.AIÆIDA.
Exponemos a continuaciôn los resultados obtenidos en el estudio roa—
lizado en conejos en ayuno previo de 24 horas, y estimulados con tol-
butamida intravenosa ( ^0 mg/ kg de peso)• Las muestras de sangre por
tai heparinizada se tomaron diez ininutos despues de aplicado el estî—
mulo, coincidiendo este tiempo con la mâxirna secreciôn de la hormona.
Valoramos , la concentracién total do insulina y valores glucômi-
cos. El estudio de los componentes insulino- inrnunorreactivos lo rea
lizamos, filtrando por la columna de sephadex G-50 fino (l x 50 cm) volumenes de 1 inl.de plasma.
En la tabla IV se exponen los valores individuales obtenidos en las
glucomias ( mg de glucosa ml de plasma), y concentraciones de in
sulina total ( mjig/ ml de plasma), Tambien se ddn, las conoentracio-
nes cuantitativas ( mpg/ ml de plasma), y porcentajes respectives de
los distintos componentes insulinicos; asî como el porcentaje de hor
mona recuperada durante el fraccionamiento de los plasmas.
En la figura 11 representamos un experimento tipo, tecnicamente
considerado al pié de grdfica.
En todos los animales estudiados, observamos en primer lugar, una
elevaciôn estadisticamente significativa ( p O.OOl) en la concen-
traciôn total de insulina inrnunorreactiva, cuyo valor medio correspon-
1 1 4
de a 2.875 rrjJig de insulina/ ml do plasma (f 0.34)* Para lo lamente go observa una disminucién^que tambien es estadisticamente significativa
( P 0.005)en los valores que corresponden a la concentracién de glu—
cosa, siendo el promedio de 91.75 mg / ml de plasma ( + 15).El estudio de los componentes insulinicos demuestra, una eleva —
cién en la concentracién cuantitativa de los très componentes. ÎTo obs
tante, el porcentaje de cada ûno de elles demuestra; 1) un aumento del
componente "big insulina" estadisticamente significative ( p O.OO5), con valores de 14 al 17 /• 2) Una disminucién tambien si,gnificativa
( P 0.005) de "little insulina", cuyos porcentajes oscilan entre 76 y 83 /O. 3) Una ligora elevacion significative, ( p <^0.02) del components "mini insulina", con porcentajes del 4 al 6 ^ de la insulina inrnunorreactiva circulante,
ÎJo hay duda, pues :
a) Despues de la adrninistracién de tolbutamida hay un aumento en la
concentracién do insulina circulante, b) Esta estimulacién en la secre-
oién de hormona, se acompana de una disminucién en los niveles de la
glucosa en plasma, c) Aunque la mayor parte de la insulina circulan
te corresponde a "little insulina", hay que senalar una ligera eleva-
cién del componente "big insulina".
115
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FXCÎtJRA 11#- CromatOi^afia en coliimna de sephadex G-50 fino (l x50 cm) de 1 ml de plasma (sangre de la vena porta, cô
ne jo en ayuno de 24 horas y 10 minutes despues de la estimulacidn con tolhutamida i*v# 50 tng/ k g de peso)En ordenadas se expresan los mpg de material inmunorreactivo recuperado/ fraccidn#En abscisas representamos el nümero de fracciones* Las fléchas a derecha e izquierda representan la localizaciôn de la albûmina y las sales, respeotivarnente, las cifras anotadas en los picos representan la cantidad do material inmunorreactivo recuperado en las oorrespondientes fracciones,
El material inmunorreactivo localizado aproxirnadamente entre el pico de la albûmina y la insulina-1125*El material inmunorreactivo localizado a la mitad de distanoia entre los picos de la albdmina y las sales.Corresponde al material inmunorreactivo localizado entre la insulina-1125 y las sales plasmâticas.
Grupo V.- CC'FŒ HGTGS r'GüLIGO-IIEGjrORHivACTIVOS EU El PMSI.'A, CŒO
RTC3PURSTA A LA A~ni']G;I3?EACI0ïï DE SECRETIPA,
Dentro de este grupo se han ©studiado dos situaciones exoorimenta—
les ; A y B,
A, que comprend© el estudio de conejos on ayuno de 24 horas.
B, que induire animales sornetidos previamente a un ayuno prolongado
de 48 horas,
A continuaciôn exponemos los resultados obtenidos en ambas situa-
oiones, despues de la administraci6n intravenosa de la hormona intes
tinal secretina ( 1,5 U/ kg de peso), IjSs muestras de samp?e portai
heparinizada se obtuvieron, coincidiendo con la mdxima secreciôn de
insulina, un minuto despues de la aplicaciôn del estîmulo, (142),
En todos los animales se valoraron concentraciones de glucosa e
insulina total, El estudio de los componentes insulinicos se realizô,
filtrando por columnas de sephadex G-5 0 fino ( 1 x 50 cm) volümenes
de dos ml de plasma on los animales del apartado A, y de un ml para
los del B; siempre de acuerdo para obtener el mdximo de garantie ade-
cuado a las necesidades del rigor experimental,
Los resultados individuales de los animales estudiados en el
apartado A. que dan reseîîados en la tabla V, Como en todo nuestro estu
dio, damos los valores de las glucomias expresados en mg de glucosa ^
ml de plasma, y de insulina total expresados como mjjig/ ml de plasma.
11 E
Los componentes insuline— inmunorreactivos quedan raflejados en su con—
oentraciôn ( mjig/ ml de plasma), y porcentaje respective. Al mismo
tiempo se d^ el porcentaje de hormona recuperada en las cromatografias.
Se ha podido demostrar en primer lu^r, un aumento en ol nivel
de insulina oirculante, cuyo promedio de 5*345 m ig/ ml de plasma (+
-1.06) es estadistioamonte muy significative ( p^O.OOl), al oomparar-
lo con su respective grupe control. Frente a esto, hay un mantenimien-
to en les limites de lo normal de les valores glucémicos, con un pro
medio que corresponde a 162.04 mg de glucosa ^ ml de plasma ( jh 15*96),
siendo per tanto no estadistioamonte diferente ( p 0.5)*
El porcentaje de la hormona recuperada fué siempre de 90 a 100
El estudio de les componentes insulînicos, senala un hecho de grân
interes. Si bien la concentraciôn cuantitativa ( mjxg/ ml) de les très
componentes (" big insulina", "little insulina" y " mini insulina"),
estd logicamente aumentada como consecuencia de la elevacidn de. la
insulina total, los valores porcentuales de dichos componentes sufren
una grân alteracidn, con respecto al patron general encontrado no so
lo en el grupo control, sino incluso en todas las situaciones anterior-
mente estudiadas.
La principal significacidn apareoo ezpuesta en el expérimente ti—
po, figura 12, y tabla V con una elevaoidn muy considerable en el por-
centaje del componente " mini insulina" ( p^O.OOl), cuyos valores co-
119
rresponden do un 28 a 57 ^ do lo, insulina total valorada por el radio- inrnunoensayo, A su vez, el componente "big insulina" se encuentra den-
tro de las proporciones consideradas en el grupo control, yd que no
excede el poroentaje do un 5 a 9 ^ 0,5). Sin embargo, por lo que
se refiere a "little insulina", sus porcentajes son significativamen-
te inferiores ( p <^O.CC)l), comprendiendo sus valores del 38 al 57 ^
de la hormona total valorada por el inmunoensayo,
he acuerdo con estos resultados, podemos concluir que; l) La hor—
mona intestinal secretina, produce una rapida y maroada elevacidn en
los niveles de insulina circulante. 2) No hay modificaciones aprecia-
bles en los valoreè glucëmicos. Este hecho de importancia trasconden-
tal en nuestro estudio, ha sido observado en grân nümero de trabajos
publicados (142,172), Easta la fecha, no se ha encontrado una expli-
caciôn definitive; nosotros pensâmes que pueden aportar un punto de
aclaracion los resultados obtenidos en el estudio de las caracterîs—
ticas cromatogrâficas de la hormona circulante, y que corresponde al
elevado poroentaje en que se encuentra el componente "mini insulina"
en los animales sornetidos a esta situaciën experimental. la activi—
dad biolëgica, naturaleza quîmica y funciën fisiologioa de este corn-
ponente, son por el momento completamente dosconocidas.
Los resultados individuales de los animales portenecientes al
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FIGURA. 12.~ Cromatografia en colnmna de sephadex G-50 fino (l x 50 cm) de do» ml de plasma (sangre de la vena porta, cone-
jo en ayuno de 24 boras y un minuto despues de la estimulacidn con secretina i.v. 1.5 U/ kg de peso).En ordenadas se expresan los rnug de material inmunorreactivo reou- perado/ fraccidn.En abscisas représentâmes el numéro de fracoiones. las fléchas a dérocha e isquierda reprosentan la localizaci^n de la albùmina y las sales, respeotivamente, las cifras anotadas en los picos reprosentan la cantidad de material inmunorreactivo reoujDerado en las oorrespon— dientes fracoiones.
Es el material inmunorreactivo localizado aproximadamente entre el pico de la albùmina y la insulina-1125 Es el material inmunorreactivo localizado aproximadamente a la nitad de distancia entre los picos de la albùmina y las sales plasmâticasCorresponde al material inmunorreactivo localizado entre la insulina-1125 y las sales del plasma.
a-oartedo 3 ( ayuno previo de 48 horas) se exponen en la tabla VI :j figura 13,
Siguiendo la sistemdtica general de nuestro estudio, dames la con-
centraoidn de insulina total en ml de plasma, y los valores co-
rrespondientes a las glucemias en mg de glucosa € ml de plasma. As!
mismo, se expresan los porcentajes de hormona recuperada en las cro-
matografias; y de los componentes insulînicos sonalamos sus concentra
oiones cuantitativas ( rcjjig/ ml) y valores porcentuales,
Como en los animales del apartado anterior, hay una maroada ole-
vaciôn en la concentraoidn total de insulina ( p <(^0,001), con valo
res medios de de insulina/ ml de plasma ( f 1,62). Ko hay car
bios apreciablos en las concentraciones de glucosa, correspondiendo
sus valores a un promedio de I38 mg ^ ml de plasma (4 23*4)> ( p ^ 0,:
En ouanto a los componentes insulînicos, al comparar los dates o'
tenidos en cstos animales con su respective grupo control, observa-
rcosî a) Una marcada elevacidn del componente "mini insulina" ( p
0,001), con porcentajes del 25 al 49 de la hormona total circulan
te, b) Un aumento estadistioamonte significative ( p 0,001) dol co;
ponente "big insulina", cuyos valores porcentuales corresponden dol
19 al 37 c) Una disminuciôn altamente significative de "little in
sulina ( p^O.OOl), que muestra porcentajes dol 33 al 44 ^ de la hor
mona total.
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PICnJIlA 13*“ Cromato^^rafia en columna de sephadex G-50 fino (l x 50 cm) de 1 ml de plasma (sangre de la vena porta, conejo
en ayuno de 4^ horas y 1 minuto despues de la estimulaciôn con sc— cretina i.v. 1.5 U/ kg de peso).En ordenadas se expresan los mug de material inmunorreaotivo recu— perados/ fracciôn, 'En absoisas représentâmes el numéro de fracoiones. Las fléchas a dérocha e isquierda representan la localizacion de la albdmina y las sales, respeotivamente. Iæ s cifras anotadas en los picos representan la cantidad de material inmunorreactivo reouperado en las corres- pondientes fracoiones.
Es el material inmunorreactivo localizado aproximadamente entre el pico de la albùmina y lo. insulina-1125 Es el material inmunorreactivo localizado aproximadamente a
^ la mitad do distancia entre los picos de la albùmina y las sales plasmdticasCorresponde al material inmunorreactivo localizado entre la insulina-1125 y las sales del plasma.
De lo anteriormente expuesto, podemos sugerir los suguientes pun-
tos: l) La seoretlna es un potente estimulante de la secreoidn de in-
Bulina. 2) Su accidn es rdpida e intense, alcanzando valores altos en
tre uno y dos rninutos despues de aplicado el estîmulo. 3) La elevada
ooncentracidn de hormona circulante, no se acompana de cambios conco
mitantes en los niveles glucémicos, 4) Un porcentaje muy elevado do la
insulina seoretada por las células j3 como respuesta a la secretina, co
rresponde al componente "mini insulina", 5) Se observa tambien, una
marcada diferencia en el oomportamiento del componente "big insulina",
en los animales portenecientes a ambas situaciones expérimentales (A y
B ) | mientras en el grupo A este componente muestra valores poroentua-
les similares a los animales control, los conejos en ayuno de 48 ho
ras ( B) presentan una elevaoidn de dicho componente.
En la Discusiôn se cornentar ampliamente la trascendenoia de estos
resultados, y su posible relaciôn a la situacidn de ayuno prolongedo.
Control inmunolôgico de las hormonas utilizadas como estimules
insulino-seoretores.
Las hormonas secretina, pancreocimina y gluoagdn, no tienen de
hecho reacciùn inmunolôgica cruzada con los antisueros especîficos
anti-insulina, A pesar de que las preparaciones utilizadas en este es
tudio son muy puras, y no estdn contaminadas de insulina, era de un
126
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LOCMnscDinc
I<u3
inCM 0.62
0.4
0.2
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FIGURA 14#- Ausenoia de reaocidn inmimoldgica con el antisue- ro anti-insulina de porcino (Lote K 9223) de las
preparaciones cristalizadas de-A—A-secretina,-o—0-pancreocimina y-#—e- glucagdn.La valoraciôn se realizd frente a una curva standard de insulina cristalizada de origen bovino
interés bâsico su comprobaoiôn en nuestro sistema.
Para ello, los diferentes lotes de estas hormonas se analizaron
radioinmunologicamente frente al antisuero espeoîfioo anti-insulina$utilizado en nue stras valoraciones. En la figura I4 se observa, q.ue la
secretina, pancreocimina y glucagôn permanecieron inertes, no mostran-
do ningun grado de reaccidn inmunoldgica con estos antisueros#
Expérimente oomplementario del grupo V .
De acuerdo con los resultados obtenidos en todos los animales del
grupo experimental V, considérâmes de gran interés comprobar si el
oomportamiento que présenta el componente "mini insulina", muy eleva
do despues de la administracidn de secretina, es especlfico de la ac—
oidn aguda de esta hormona intestinal,
Los resultados aportados en la literature por Unger, y mds recien-
temente por Chisholm ( 142,172) entre otros, senalan que, la accidn
de la secretina sobre la secrecidn de insulina es de efectos rdpidos,
intenses y pasajeros, alcanzando la hormona su concentraciôn mdxima
en la sangre, uno 6 dos rninutos despues de aplicado el estîmulo, pa
ra recuperar los valores basales dentro de los diez a quince minutes
siguientes,
Teniendo en cuenta estas consideraciones, a un conejo en ayuno de
48 horas se le administré secretina intravenosa ( 1,5 U/ kg de peso),
128
de la manera yâ expuesta. Se tomaron muestras de sangre portai hepa-
rinizada dentro del primer minuto, y tambien a los noventa minutes des
pues de aplicado el estîmulo, Dos ml de plasma de cada uno de los mo—
mentes expérimentales aludidos, se filtraron por columnas de sephadex
G-5 0 fine ( 1 x 50 cm), valorando radioinmunologicamente las fraccio-
nes coleotadas de la manera yâ descrita.
La figura 15 représenta el expérimente complète. La parte supe
rior corresponde a los componentes insulînicos valorados en el plasma
obtenido un minuto despues de aplicada la secretina. La parte inferior
muestra los componentes circulantes en el plasma tornade noventa mi
nutes despues de la estimulaciôn.
En los dos tiempos del experimento se observa olaramente, la exis-
tenoia de los très componentes insulînicos, apareciendo los componen
tes "big insulina" y "mini insulina" muy elevados en el experimento
que recoge los resultados del primer minuto despues de la aplicaciôn
de la secretina ( parte superior de la fig,); mientras que noventa mi-
nutos despues ( parte inferior de la flg.) el patron de los componen
tes insulînicos ha recuperado sus porcentajes basales,
Este hecho parece indicar la grân posibilidad, de que las altera-
oiones observadas en el patron de los componentes insulino-inmunorreac-
tivos circulantes y debidas a la secretina, son pasajeras y posible-
mente debidas a la puesta en marcha de mécanismes enzimâtioos presen-
129
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FIGfURA, 15•— Cromatografia en colijmna de sephadex G~50 fino (l x 50 on) de 2 ni de plasma (sangre de la vena porta, cone—
jo en ayuno de 46 horas y estimulado con secretina i.v. 1.5 U/ kg de peso)La parte superior de la grâfica corresponde a la sangre ohtenida 1 minuto despues de aplicado el estîmulo.La parte inferior de la grdfica corresponde al mismo animal en el que la sangre se tomé a los 90 minutes de estimulado.
tes en la célula |3 ciel islote, para favorecer la secrecidn de dichos
componentes a la circulaciôn portai, Esto reaimente representaria una
nueva linoa de trahajo que nos proponemos estudiar en un futuro proxi
mo.
131
Grupo VI.- Ca POlTEIJTES ITTStTLIITO-IBCTORREACTIVOS EN EL cmO
RESRffîSTA A LA AH’fllTISTIblCION PE PANCBEOCB-DIA.
Este grupo experimental coraprende, el estudio de los efectos de la
hormona intestinal pancreocimina sobre la seorecidn de insulina, va
lores glùcémicos, y patron cualitativo de los componentes insulînicos
circulantes en la sangre de la vena porta de conejos sornetidos a las
situaciones expérimentales: A) Ayuno de 24 horas, y B) ayuno prolon-
gado de 48 horas,
Siguiendo la sistemâtica general, cada animal recibe una dosis
tînica de 100 U de pancreocimina intravenosa, Ijas muestras de sangre
portai heparinizada se tomaron un minuto despues de aplicado el esti-
mulo, para coincidir con los valores mâximos de insulina circulante
(142).
Para el estudio de los componentes insulino- inmunorreactivos, los
voldmenes de plasma filtrados por la columna de sephadex G-5 0 fino ( 1
X 50 cm), fueron de dos ml en los animales perteneoientes al grupo A,
y de un ml para los del grupo B,
Los resultados individuales de los animales correspondientes al m?u-
po A, quedan expuestos en la tabla VII, Como en todos los grupos estu-
diados, dames la concentraciones de insulina circulante expresadas
en m|ig/ ml de plasma, y los valores glùcémicos en rag de glucosa ^ ml
de plasma, Asi mismo quedan reunidos los valores cuantitâtivos (mpg/ ml)
33
de los componentes insulînicos y sus porcentajes respectives. Por ül-
tirao, exponemos los valores porcentuales de la hormona recuperada en
las croraatografias de ios diferentes plasmas.
En todos los animales estudiados, a pare ce olaramente una eleva- »
ci6n marcadamente significative en la concentraciôn total de insuli
na circulante ( p ^0.001), cuyo valor medio es de 6.717 ml de
plasma ( 4 2.46). De igual manera puede observarse un mantenimiento
de los niveles glùcémicos dentro de los limites normales ( p ^ 0.5)>
con un promedio de 137*6 mg de glucosa ^ ml de plasma ( 4 26.96).
El poroentaje de la hormona recuperada en las cromatografias de
los plasmas, fué siempre dol 85 al 97
El estudio de los componentes insulino-inmunorreactivos, queda
graficamente expuesto en la figura I6 ( experimento tipo), y tabla
VII. Cabe senalar; qv,e existe una elevacién en la concentraoién cuanti
tativa de los très componentes "big insulina", "little insulina" y
"mini insulina", consecutive al aumento de los niveles de insulina to
tal circulante. Ko obstante, su proporcionalidad comparada con los
valores obtenidos en su respective grupo control ( animales en ayuno
de 24 horas), derouestra; a) un mantenimiento dentro de los limites
considerados como normales, del componente "big insulina" (p 0.1),
con valores que oscilan entre 2 y 4 * b) una disminucién muy signi
ficative ( p 4 0.005) del componente "little insulina", cuyos porcen-
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FIGURA. 16.- Cromatografia en columna de sephadex G-50 fino (l z 50 cm) de 2 ml de plasma (sangre de la vena porta, conejo
en ayuno de 24 horas y 1 minuto despues de la estimulaciôn con pan- oreooimina i.v. 100 U)En ordenadas se expresan los mug de material inmunorreactivo recu— perados/ fracciôn.En ahscisas representamos el nümero de fracoiones. Las fléchas a de— reoha e izquierda representan la looalizaciôn de la alhümina y las sales, respeotivamente, las cifras anotadas en los picos representan la cantidad de material inmunorreactivo recuperado en las oorrespon- dientes fracoiones.
Es el material inmunorreactivo localizado aproximadamente entre el pico de la alouiTiina y la insulina-1125 Es el material inmunorreactivo localizado aproximadamente a
^ la mitad de distancia entre los picos de la alhümina y las sales plasmdtioasCorresponde al material inmunorreactivo localizado entre la insulina-1125 y las sales del plasma.
tajes son del 76 al 86 y una elevaôiôn altamente significativa del
componente "mini insulina" (p 41.0#00l), que ooir.prende porcentajes del
11 al 20 / de la hormona circulante.
Ante estos resultados podemos senalar que: 1) la pancreocimina es
un potente estîmulo de la secreciôn de insulina, 2) Su acciôn rdpida
e intonsa, no se acompana do alteraciones apreciablos en los niveles
glùcémicos, que se mantienen dentro de los limites normales. 3) El
patrén cualitativo de los componentes insulînicos, demuestra como üni-
ca nota de interes, una elevacién del componente "mini insulina",no
tan maroada como en el caso de la hormona intestinal secretina; con-
servéndose dentro de los porcentajes normales el componente "hig in-
Bulina", y estando ligeramento disminuido el componente "little insu
lina".
Los resultados individuales del estudio llevado a oabo en los
animales portenecientes al grupo 13. quedan resenados en la tabla V I I I ,
y figura 17 correspondiente a un experimento tipo.
El valor medio encontrado en esta situaoién experimental corres
ponde a 4*339 rnîg de insulina/ ml de plasma, estando estadistioamonte
elevado al compararlo a su respective grupo control ( p <( 0.001). Pa
ra la glucosa, el promedio encontrado fué de 123,2 mg ^ ml de plasma
(+ 13.05), no mostrando alteracién estadisticamente significative ( p^
138
0.1)'.El poroentaje de hormona recuperada oorrespondid do un $Q a 98
El estudio de los componentes insulînicos senala en primer lugar,
una elevacién de la concentracién cuantitativa de los très componen
tes, si bien sus valores porcentuales guardan la misma proporcién
que en los animales de su grupo control: "big insulina" - 7 al 8
"little insulina" - 89 al 92 ^ y "mini insulina" - 3 al 4 ^ ( p O.5,
p ^ 0.3 y p )>0.7, respeotivamente).
De los resultados aportados por ambos grupos expérimentales, se
deduce ;
1) La secrecién de insulina como respuesta a la estimulacién con pan
creocimina es râpida, intensa y alcanza valores muy altos, dentro de
los primeros rninutos despues de aplicado el estîmulo. 2) Las altas
concentraciones de hormona circulante, no se acompanan de alteracio
nes en los niveles glùcémicos. Este hecho de grdn interes, en el caso
de la pancreocimina puede estar justificado por la accién secundaria
de este estîmulo sobre la secrecién de glucagén, yâ observada por
Unger y col (I42), y representaria la consecuencia mâs fisiolégica
del mantenimiento en los limites de lo normal, de la concentraoién de
glucosa en sangre. 3) Los componentes insulino— inmunorreactivos cir
culantes senalan, una elevacién del componente "mini insulina" en los
animales del grupo A, manteniéndose con caracterîsticas de normalidad
137
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FIGrURA 1 7 .- Cromatografia en ooltunna de sephadex G-50 fino (l x 50 om) de 1 ml de plasma (sangre de la vena porta, conejo
en ayuno de 48 horas y 1 minuto despues de la estimulacién con pancreocimina i.v. 100 u).En ordenadas se expresan los m n g de material inmunorreaotivo recu- perados/ fracciôn. 'En ahscisas representamos el nômero de fracoiones. Las fléchas a de- recha e izquierda representan la looalizaciôn de la alhdmina y las sales, respeotivamente. Las cifras anotadas en los picos representan la cantidad de material inmunorreaotivo recuperado en las correspondientes fracoiones.
Es el material inmunorreactivo localizado aproximadamente entre el pico de la alhümina y la insulina-1125 Es el material inmunorreactivo localizado aproximadamente a ,la mitad de distancia entre los picos de la alhümina y las sales plasmdticasCorresponde al material inmunorreactivo localizado entre la dnsulina-1125 y las sales del plasma.
en los del grupo B. Estos resultados podrian indicar, que la impor-
tanoia de dicho componente en la regulaciôn de los niveles glùcémicos,
séria de consideraoién mds secundaria a la fundamentalmente importan
te consideracién del efeoto de la secretina yd comentadô.,
140
Grupo VII.- CŒirOlTRIITES IE5ULIN0-HCTJT0RRSACTIV0S EH EL PLAglA, CCMO
RESHJESTA A L\ AIMPTISTHACIOU DE GLUCOSA IETR.AAŒEOSA.
A oontinuaciôn exponemos los resultados obtenidos en el estudio lle
vado a oabo en conejos en ayuno de 24 boras y administraciôn de glu-
oosa intravenosa ( $00 mg/ kg de peso). Siguiendo la sistemdtica ge
neral, las muestras de sangre portal heparinizada se obtuvieron, en
el tiempo comprendido entre dos a très minutes despues de aplicado el
estîmulo, ooincidiendo con la ôptima concentraciôn de hormona circu
lante (174).
En todos los plasmas estudiamos la concentraciôn de insulina total
y los valores glùcémicos. La valoraciôn de los componentes insulîni
cos se realizô, filtrando volümenes de un ml de plasma por columnas
de sephadex G—50 fino ( 1 x 50 cm).
En la tabla IX exponemos los valores individuales de las concen-
traciones de glucosa ( en mg ^ ml de plasma), y de insulina total ( en
mpg/ ml de plasma). Asi mismo se dd la concentraciôn cuantitativa
(m|Ag/ ml) de los componentes insulînicos y sus porcentajes respecti
ves. En ültimo térrnino damos los valores porcentuales de la hormona
recuperada en las cromatografias•de los plasmas*
En todos los animales se observa una elevaciôn muy marcada en la
concentraciôn total de insulina circulante ( p <^0.00l), con un pro
medio de 6.442 mjig/ ml de plasma ( + 1.013)# Paralelamente se comprue-
1 4 1
ba una elevacién altamente significativa en log niveles glùcémicos
( O.COl), con un valor medio que corresponde a 2B3 mg de glucosa
ml de plasma ( f 44*2)#
El poroentaje de hormona recuperada en las cromatografias de log
plasmas fué siempre del 86 al 97
El estudio de los componentes insulino- inmunorreactivos, senala
un patron cualitativo andlogo al obtenido en los animales del grupo
control, con porcentajes de; "big insulina" - 3 al 7 "little in
sulina" - 88 al 95 ^ y "mini insulina" - 3 al 7 ^ de la insulina to
tal valorada por el radioinmunoensayo ( p ^ 0.4, p ^ 0.9 y p ^ O.O5
respeotivamente)* La figura I8 représenta un experimento tipo, pertene*
ciente al grupo experimental estudiado, y cuyas consideraciones téo-
nioas quedan sucintamente resenadag al pié de grâfica,
Estos resultados evidenoian olaramente que ;
1) La adrninistracién intravenosa de glucosa, produce una elevacién
râpida de los niveles glùcémicos, aoompanada de un aumento en la con—
oentracién de insulina inmunorreactiva en sangre. 2) La accién de la
glucosa intravenosa sobre la secrecién de insulina es de efecto inme—
diato, alcanzando su punto éptimo entre uno y très minutes despues de
aplicado el estîmulo. 3) El patron cualitativo de los componentes insu
lino-inmunorreact ivos del plasma senala, una elevacién cuantitativa de
los tros componentes como consecuencia de la elevacién de la hormona
142
en sangre. Sin embargo, en estas condiciones expérimentales, la mayor
parte de insulina circulante corresponde a "little insulina"
143
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en apiino de 24 horac y 2 minutes desrues do la estimulacldn con ylu- cosa i.v. 500 mj;/ kg de peso).Fn ordonadas se exrrosan los r/mg de material inî.:unorreactivo rocu— p G x-a d o s/ ira colon, 'Kn abscises représentâmes el nümero de fraccienes. Las flcohas a de* reoha e iaq.uie.rda represcntan la loceliaaciôn do la alLumina y las sales, respectixnrmente* Las cifras anotadas on los pices rcrrasontan la caxitidad do rratoi ial im.unorr oa et ivo récupéra do en las corrospon- d i G n t G B f r a c c i o n e s.
As cl material iirrjnorroaot ivo localisa do apr oxirxa de monte entre cl pico do la albumina y la insulina-l].25 1:3 el material inmunorrea. et ivo localisa do aproxir.r. dament e a la mitad do distancia entre los picos do la al\:ur,i'..:a y las sales }' 1asmatioasCorresponde al material inmunorroactivo localinado entre la
[_______ I insu 1 ixia"1125 y lac 'a.los del pla..cria
Grupo VIII.- CafFQjTELlTES INSULIITO-IimilTORRSACTIVOS Eli EL PIuiSi:A, CG-0
RESHIS3TA A JA ADMIIIISTRACIOIT LB GIUC03A ORAL.
Este grupo comprende el estudio de conejos en ayuno previo de 24
horas, Siguiendo la sistemâtica experimental, los animales cinco bo
ras despues de la intervencidn quirûrgica, reoibieron por sonda intra-
gâstrica una dosis de 1 gr de glucosa/ kg de peso.
Para la extracidn de las muestras de sangre portal heparinizada,
los animales se dividieron en dos grupos de acuerdo al oriterio si—
guiente :
Grupo A . que comprends los conejos a los que las muestras de sangre
se les extras 45 minutes despues de aplicado el estîmulo, coincidien—
do con los valores mâximos de insulina circulante (172).
Gruuo B. que incluye los animales a los que se les extras la sangre
portai 90 minutes despues de administrada la glucosa.
En ambos grupos valoramos oonoentraciôn total de insulina inmuno—
rreaotiva y nivelas glucémioos. El estudio de los componentes insuli-
no-inmunorreactivos se realizô de manera andloga en ambos grupos, fil-
trando por columnas de sephadex G-50 fino ( 1 x 50 cm) volumenes de
1 ml de plasma.
La tabla IX reune los resultados individualss de los animales
pertenecientes al grupo_A. Las conoentraciones de insulina total se
expresan en mpg/ ml de plasma, Los valores gluoémicos en mg de glu-
14G
oosa 0 ml de plasma* Tambien que dan senaladas las concentraciones
cuantitativas ( myg/ ml de plasma) y porcentajes respectives de los
distintos componentes insuline- innunorreactivos* Por ültimo damos el
poroentaje de hormona recuperada on las cromatografias de los plas
mas*
La parte superior de la figura 19 represents el rosultado de un
experimento tipo*
Como respuesta a la administraoiôn de glucosa ora] encontramos,
junto a una ligera elevacidn de los niveles gluoémicos ( p 0.02),
ouyo promedio corresponde a 200*8 mg de glucosa ^ ml de plasma ( +13.8),
un aumento muy significative en la concentracidn total de insulina
circulante ( p O.OO5), con un valor medio de 3#8?1 mjag/ ml de plas
ma ( ^ 1.25)
El poroentaje de hormona recuperada en el fraocionamiento pro-
teico de los plasmas, fué del 92 al 98
El patrôn oualitativo de los componentes insuline- inmunorreacti-
vos del plasma demuestra: a) una elevaoiôn en el poroentaje del com-
ponente "big insulina", que corresponde de un 12 al 20 ^ ( p O.O5)$
b) una disminuoién altamente significative del componente "little in
sulina" ( p^O.OOl), con valores que oscilan entre un 60 a 70 c) Un
aumento tambien muy marcado ( p*/ O.OOl) del componente "mini insu
lins” con valores porcentuales del 13 al 25 ^ de la hormona total va—
147
lorada por ol ininunoensayo,
Ante estes resultados podemos senalar que;
1) la administraoiôn de glucosa intragâstrica produce una ligera hiper-
glucemia, que se acompana de una elevaciôn en los niveles de insulina
en sangre. 2) Las variaciones de los niveles gluoémicos en el plas
ma procedente da sangre de la vena porta, no son tan marcadas como
las que aoompanan a la adrainistraoion de glucosa parenteral. 3) Los
componentes insulino- inmunorreaotivos circulantes, muestran clara-
mente un aumento considerable de los componentes "big insulina" y
"mini insulina", comprendiendo esta dltima valores hasta de un 25 ^
de la insulina total circulante.
El estudio individual de los animales pertenecientes al grupo B,
quoda resumido en la tabla X y parte inferior de la figura 19.
El promedio de insulina total circulante en estes animales, oorres-
pondiô a 2.822 mjig/ ml de plasma ( + 0.312), estando por tante esta-
disticamente elevado ( p O.OOl). Los valores gluoémicos fueron de
162.2 mg de glucosa ^ ml de plasma ( + 20.5), le que demuestra que,
a los 90 minutos de administrada la glucosa, la gluoemia ha retornado
a los niveles basales ( p 0.5)
El estudio de los componentes insulînicos demuestra, una maroada
elevaciôn de los porcentajes correspondientes a los componentes "big
148
insulina" y "mini insulina", con valores respectives de 11 al 21 ^
para la primera, y 17 al 20 ^ para la se^;unda, ( p </ 0.001 y p <( 0.05)# El poroentaje del componente "little insulina" esté logicamente muy
disminuido ( p^O.OOl), mostrando valores que representan un 57 a 63 ^
de la hormona total.
Ante estos resultados cabe senalarj l)La glucosa administrada
por via intragéstrica produce una elevaciôn en los nivelas de insuli
na circulante, que es més acusada a loa 45 q.ne a los 90 minutos despues de aplicado el estîmulo. 2) Como oonsecuenoia de la administra-
ciôn oral de glucosa se produce una elevaciôn en los niveles glucô-
micos, que retornan a los valores normales 90 minutos después de apli-
oado el estîmulo, 3) Los componentes insulino- inmunorreaotivos del
plasma seîialan,una elevaciôn del componente "big insulina" de aouer-
do con los resultados publicados por Both (108), El componente "mini
insulina" muy elevado en ambos grupos expérimentales, estarîa més de
aeuerdo con el hecho observado por Chisholm y col (172), demostran-
do que la glucosa oral produce secreciôn de seoretina, responsable a
su vez de la secreciôn de insulina.
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FIGURA 19.- Cromatografias en columna de sephadex G-50 fino (l x 50 cm) de 1 ml de plasma (sangre de la vena porta,
conejos en ayuno de 24 horas).La parte superior de la grdfica corresponde a la sangre extraida 45 minutos despues de la administraoiôn intragâstrica de 1 gr de glucosa/ kg de peso.La parte inferior de la figura corresponde a la sangre extraida a los 90 minutos de aplicado el estîmulo.
AISIAj:iEI?rO DE L03 Ca'POIJETJTFS "BIG BTSULIFA'», »»LITTI^ lUSULIHA.»* Y
'UDTI II7SUIIFA". -
para poder caracterizar cromatogrdfioa e inmunologicamente los
componentes estudiados, es nocesario disponer de suficiente cantidad
del material a caracterizar; es deoir, hay que aislar a partir del
plasma cada uno do los très componentes "big insulina", "little insu—
lina" y "mini insulina"
Con este fin, se calibra una columna de sephadex C-5 0 fino ( 4 x
54 cm) de la manera yâ expuesta en Material y Kétodos ( pdg 03,fig. 7)*
Cuarenta ml de plasma procedente de seis conejos en ayuno de 48
horas y estimulados con secretina intravenosa (1*5 U/ kg de peso), de
una manera similar a la realizada en los animales del grupo VI, se
filtran por dicha columna y se colectan fracciones de 4 ml. Se valora
radioinmunologicamente una alicuota procedente de todas y cada una de
las fracciones comprendidas entre los volûmenes de eluciôn de la al-
bùmina y las sales. la, figura 20 muestra el patrôn oromatogrdfico ob-
tenido en estas condiciones expuestas.
Con las fracciones correspondientes a cada uno de los très com-
ponentes insulînicos "big insulina", "little insulina" y "mini insu
lina", 80 hicieron très pooles que se dializaron durante 72 horas a
4®C contra carbonate amônico 20 r#; y posteriormente se liofilizaron.
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Cada uno de loa très lioiilizados pertenecientes a los tres com—
ponentes insulînicos se disolviô en dos ml de tarnpôn veronal sôdico
0.05 M ( pH 8.6). Este material sirve para caracterizar los componen
tes, cromatogrdfica e inmunologicamonte.
CAîliCTEHIZACIOE CRŒ'ATOGRAFICA
Recromatografia de los componentes "big insulina". "little insulina"
y "mini insulina".
Un ml del material obtenido en ol aislamiento, y procedente de
cada uno de los tres componentes insulînicos, se filtrÔ de nuevo y
por separado por una columna de sephadex G-50 fino ( 1 x 50 cm)* Las
fracciones colectadas se valoraron radioinmunologicamente.
La figura 21 représenta la recromatografia de este material. Se
observa como cada components insulino- inmunorreaotivo, conserva sus
caracterîsticas cromatogrdficas y permanece libre de los otros corn-
ponentes. Esto indica, que "big insulina", "little insulina" y "mini
insulina" son entidades diferentes con caracterîsticas propias.
Caracterizaciôn cromatogydfica de la "proinsulina" cristal!zada de
origen p3.ncredticot Su relaoiôn con el componente "big insulina".
Una pequena cantidad de "proinsulina" cristalizada de origen por—
155
Ofi
0,4
Q2
0,6
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0.4
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2,775m/jQ
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mis.
FIGURA 21.- Reoromatografia de los componentes "big insulina", "little insulina" y "mini insulina", aislados del
plasma del conejo.1 ml de un ooncentrado libre de sales de cada uno de los tres component es aislados, se filtré por una columna de sephadex G-50 fine (1 X 50 cm).En ordenadas damos los mjig de material inmunorreaotivo recuperado/ fraccién. En abscisas se expresan el numéro de fracciones. Las fléchas indican la salida de la albümina y las sales,Cada componente conserva su patron oromatogrâfico caraoterîstico.
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^ AAO m(
FIGURA 22,- Cromatografia en oolumna de sephadex G-50 fino (l X 50 cm) de la "proinsulina" pancreàtioa de
origen porcino.En ordenadas se expresan los mug de "proinsulina" recogida/ fraociôn. >Eh ahscisas représentâmes el numéro de fracciones. La flécha indica la localizacién de la alhûmina plasmâtica.
La valoraciôn ininunolôgica de las fracciones se réalisé frent6 a un standard de insulina cristalizada de bo- vino, Hecuperacién de un 45La valoraoién inmunolégica fué realizada frente a un standard de "proinsulina" cristalizada de porcino. La recuperacion fué del 100
El antisuero utilizado en ambos casos fué espeoîfioo anti— insulina de porcino.
cino ( Lote 615-1039B-22O-C), obseq.iiio del Dr D,E* Chance, d© Lilly,
U.S.A., se filtré por una columna de sephadex G-50 fino { 1 x 50 cm),
de la manera habitual en este trabajo. Las fracciones obtenidas se
valoraron radioinmunologicamente frente a dos standard, uno de "proin
sulina" cristalizada de porcino, y otro de insulina cristalizada de
origen bovino,
En la figura 22 queda expresada graficamente la posioién en que
eluye la "proinsulina"; su regién es similar a la zona en que apareco
el component© "big insulina", Esto nos hace sugerir, que existe una
gran relacién entre el componente aislado por nosotros en el plasma
y la "proinsulina" de origen panoreâtico,
Por otra parte, tambien se observa la distinta cantidad de "proin
sulina" recuperada, que corresponde a un 45 ^ cuando se valoré fren
te a un standard de insulina, y a un 100 ^ cuando se hizo frente a un
standard de "proinsulina"
125Caracterizacién cromatogrâfica del glucagén-I utilizado como maroador-,
"l'ini insulina", el componente desorito por primera vez en este
estudio,eluye en las columnas de sephadex G-50 en una regién poste
rior a la "little insulina", entre esta y las sales plasmâticas, Con
el fin de obtener el peso molecular aproximado de este component©, una~ 125 pequena cantidad de gluoagén-I de peso molecular conocido ( aproxi-
158
roOKEQ.O*DO*D*5
I
Glucagon -4
I- I2 53
Aibumino2
10 18 30 40 50 mit
PIŒJBA 23,— Crorcatografia en coluinna de sephadex G—50 fino de una pequena cantidad de glucagdn-I125.
La flécha situada debajo del eje de abscisas indica las fracciones en que eluye el componente "mini insulina".
madamente 3^00) y obsequio generoso de la Dra. I, Valverde, so fil-
tr6 por una columna de sephadex G-50 fino ( 1 x 50 cm), Las fraocio-
n©B de 1 ml colectadas, se valoraron midiendo su radioactividad en un125contador de radiaciones Gamma, calibrado para I , En la figura 23
125queda refiejado graficamente la zona en que eluye el glucagôn-I ' ,
que corresponde aproximadamente a la posicion en la cual aparece el
componente "mini insulina",
Caracterizacién cromatO;grâfica de la insulina cristalizada de origen
pancredtico; su relacién con el componente "little insulina",
Una pequena cantidad de insulina cristalizada de origen bovino
( Lote BJ-4609) obsequio del Dr. D.E, Chance de Lilly U,S,A,, se fil
tré por una columna de sephadex G-50 fino ( 1 x 50 cm) siguiendo las
pautas del desarrollo técnico general. La figura 24 muestra las ca
racterîsticas cromatogrâficas do este material, donde se observa como
el poroentaje mayor ( 94 a 96 ) eluye en una posioién similar al com
ponent© "little insulina", y représenta a la hormona verdadera de un
peso molecular aproximadamente de 6OOO, Sin embargo, esta insulina
comercial no es completamente pura, yâ que contiens otros dos picos
de material inmunorreactivo que corresponden a un 4 a 6 ^ de "big in
sulina" y un 2 a 4 ^ de "mini insulina".
160
" LITTLE*'
%
O
^ 0,5
.E 0,4
50 I mis.
PI'GURA 24*-" Cromatografia en oolumna de sephadex G-50 fino (1 x 50 cm) de insulina pancredtica de origen bovino.
En ordenadas so expresan los mpg de material inmunorreactivo recuperado por fraccion.En abscisas représentâmes el mimero de fracciones,la, valoraoién inmunolégica se realizé frente a un antisuero especî-fico anti-insulina de porcino (Lote K9223)*
CARACTERISACIOÎT imUTIOLOGICA.
Reaocién inriunolégioa de los componentes "big insulina", "little in
sulina" y "mini insulina", con los antisueros espeoificos aiiti-insu-
lina de porcino.
Kültiples alîcuotas procédantes de los ooncentrados libres de sa
les obtenidos en el aislamiento de los tres componentes insulînicos,
se valoraron radioinmunologicamente frente al antisuero anti-insulina
de porcino ( Lote K 9223), utilizado en este estudio.
En la figura 25, puede observerse el diferente grado de reacciÔn
inmunolégica que presentan los tres componentes. Mientras que, el com
ponente "little insulina" reacoiona de una forma muy similar a la in
sulina de origen bovino utilizada como standard, los componentes "big
insulina" y "mini insulina" reaccionan en un grado menor.
Reaccién inmunolégica de la "proinsulina" y "péptido C" cristalizados
de origen pancredtico, con los antisueros especîficos anti-insulina.
Cuando valoramos inmunologicamente y en razén de su peso molecular,
"proinsulina" pancreâtica de origen porcino, "péptido C" panoreâtico
de origen porcino ( Lote 615-1039-66B-A, secuencia 33 - 6l), obsequio
del Dr. D.E, Chance de Lilly U.S.A., e insulina pancreâtica de origen
bovino, el grado de reaccién que presentan estos productos frente al
16
R
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&<u3M
IT»CN
I3«nc
0
l
J____1---------
0.1 021 1
1
0.51 1
________1
1 mjjg Insulina 1r—
01
251
50 75f
1001
1501
200 ni "insulin
01
25i
50 75 1001
1501
200lA "slg"insulint .
0 25 50 75 100 150 200jA "little lnsulin
FIGURA. 25*- Reaccién inmimolégica de "big insulina”, "little insulina” y "mini insulina",
llültiples alîcuotas de cada uno de los componentes aislados del plasma se valoraron frente a una curva standard de insulina cristaliza- da de bovino, El antisuero utilizado es anti-insulina de porcino (lote K 9223).
^ ___ 0__0 ____0 Insulina cristalizada de bovino,0___ 0__0____0 "Big insulina"^____P__P____ P "Little insulina"
o "Mini insulina"O O
1.3
1.1
3 0.9mCM
3 0.7
S- 0,5
S ' 0.3
0.1
Insulina de bovino0 0.1 0,2
0 0.15 0.3I 1 L.
0 0.05 0.1
0.5
0.75
1[Proinsulina de porcino
1.5PepddoC de porcino
0.25 0.5Concentracion de Hormona syjG.
FIG?URA. 26,- Reacoi6n inniimolôgioa en razôn de sus pesos molecn- lares de la '’proinsulina” y "péptido C" pancredticos
de origen porcino, y de la insulina pancreética de origen bovino, El antisuero utilizado es especîfico anti-insulina de porcino (Lote K9223).
"Proinsulina""Péptido C"Insulina,
antisuero especifioo anti-insulina do porcino, queda refiejado en la
fi nira 26, La "proinsulina" reacoiona aproximadamente un 455 al com-
pararla con la reaccién de la insulina, mientras que el "péptido C"
permanece inerte, no mostrando ningûn grado de reaccién inmunolégica
con el antisuero anti-insulina.
1 6 5
DISCUSION
Como ya he comentado amp11amente a lo largo de la exposicién —
de esta Tesis Doctoral, la idea fundamental que me guid a realizar
este estudio, fue el poder aportar con los resultados alguna luz a
uno de los problemas que ha tenido siempre el estudio de la fisiopa^
tologia de la secreciôn de insulina: el conocimiento de la natural^
za de la hormona circulante en sangre*
Si con el desarrollo del radioinmunoensayo poseiamos una técn^
ca de gran sensibilidad capaz de detectar las muy bajas ooncentracio
ne8 de insulina en plasma, la introduccidn en los ultimos anos de los
métodos de fraocionamiento proteico estd proporcionando grandes avan
ces en el campo de estudio de las hormonas polipeptidicas* Puede d^
cirse, que laaplicacidn conjunta de ambas tdcnicas (radioinmunoens^
yo y fraocionamiento proteico) estan abriendo nuevos conociraientos
en el estudio de los factores patogénicos de la diabetes y otras al_
teraciones relacionadas con anormal!dades es la produccidn y secre-
cidn de la insulina.
En nuestra introduccidn ya expusimos como poco tiempo despues
que Steiner eh 19^1 (94) demostrara la existenoia de la "proinsulina"
como precursor en la biosintesis de la insulina, Rubenstein (102) e
independientemente Roth ( 108)comunicaron la presencia de esta molé
167
cula en el plasma.
El hecho de que ademas de la insulina, en el plasma circulen -
la "proinsulina" y otros componentes insulînicos, cuyo métabolisme
hepatico probablemente difiere del de la hormona verdadera, hace n£
cesario realizar el estudio en la sangre de la vena porta.
El desarrollo de una sencilla técnica quirurgica consistente en
la canulacidn de una rama de la vena porta, nos ha permitido obtener
un cdmodo sistema experimental para poder estudiar no sdl^ los aspeotos
cuantitativos, sino tambien las propiedades cualitativas de la hor
mone directamente secretada por las cdlulas del pdncreas.
Nuestros resultados indican claramente, que en el plasma portal
del conejo existen, al menos, tres componentes que reaccionan inmu-
nologicamente como la insulina: "Big insulina", "Little insulina" y
"Mini insulina".
En efecto, al filtrar el plasma por columnas de sephadex G-5 0,
la insulina enddgena valorada por el radioinmunoensayo como componeri
te dnico, aparece separada en tres fracciones d componentes que re^
cionan con los antisueros especîficos anti-insulina.
La fraccidn mayor, aparece como un pico siradtrico en una regidn
intermedia entre los picos de elucidn de las proteinas de alto peso125 125molecular (albumina-I ) y las sales plasmdticas ( I ). Esta r£
125gidn corresponde a la zona en que eluye la insulina-I (insulina
168
cristalizada de un peso molecular de aproximadamente 6OOO).
Una segundô fraccidn, de mayor peso molecular, es por tanto me
nos retenida por el sephadex y eluye en una regidn anterior al pico125de la insulina-I , entre ésta y el pico de las seroproteinas. Por
su posicidn corresponde a la zona en que eluye la proinsulina crist^
lizada,de peso molecular aproximadamente 9000.
Ambos componentes 6 fracciones tienen caracterfsticas oromato—
gr^ficas semejantes a los componentes descritros por Roth y col. —
(10 8) en el plasma humano con los nombres de "Little insulin" y "Big
insulin", respectivaraente.
Existe ademas un tercer componente, que por ser m^s retenido —
por el gel, eluye en una zona posterior a la insulina cristalizada125(insulina-I ) entre esta y el pico de las sales plasmâticas. Este
componente descri to por primera vez en esta tesis doctoral ha reci-
bido tentativamente el nombre de "Mini insulina".
Entre las diferentes cuestiones que este hallazgo nos plantea,
vamos a considerar en primer lugar la posible identidad de los très
componentes circulantes.
Debido a que la insulina y componentes insulinicos circulan en
sangre a muy bajas concentraciones, es completamente imposible su —
caracterizacidn directa, Ello equivaldrîa a estudiar la estructura
169
priraaria 6 secuencia de aminoàcidos de cada une de los componentes,
a partir del material extraido del plasma. Hasta la fecha y a pesar
del gran avance conseguido en las tdcnicas para el fraccionamiento
de proteinas, no se ha logrado ohtener material a partir del plasma
en condiciones de gran pureza y en cantidad suficiente para permitir
estes trabajos. Por esta razdn, todos los estudios se han realizado
comparando las caracterfsticas de los componentes insulfnicos del —
plasma con la insulina y componentes insulfnicos de origen pancrea-
tico.
Por nuestra parte, al no disponer de insulina y "proinsulina"
cristalizadas puras de conejo, este estudio ha quedado limitado a -
la comparacidn de las caracterfsticas cromatogr^ficas e inmunoldgi-
cas de los componentes aislados en el plasma del conejo con la insu
lina cristalizada de bovine y la "proinsulina" y "peptido C" crista_
lizadps de origen porcino. El Dr. R, E. Chance de Elly Lilly Research
Laboratories de U.S.A. tuvo la gentileza de enviarnos estos produc—
to8 para la realizacidn del estudio.
El componente "big insulina". por sus caracterfsticas cromatogrd
ficas y por su capacidad para reacionar con los anticuerpos especffô^
COS anti-insulina, représenta el componente de igual nombre descrito
por Roth en humanos (108).
Su zona de elucidn en nuestras columnas de sephadex G-50 corre^
170
ponde a la regidn en que eluye la "proinsulina" cristalizada de por
cino (fig. 22 ), por lo que poderaos concluir de acuerdo con Roth, -
que el componente "hig insOlina" contiens al precursor biosintético
de la insulina.
Por sus resultados, Gorden y col. (175), Ijazarus y col. (109)
y Melani y col. (1?6 ) llegan a la misma conclusion, admitiendo que
el componente "big insulina" no es uiia sustancia unica sino que re
présenta un material heterogeneo formado por varios componentes que
incluyen a la "proinsulina" y/<5 sus "formas interraedias". Estas con
sideraciones nos permiten sugerir, que la "big insulina" que hemos
aislado corresponde al "pico b" que Steiner y Oyer (94) aislaron en
la insulina comercial (ver pag.(%o),
Como la "proinsulina" y las llamadas "formas intermedias" ("corn
ponentes proinsulinicos") muestran distinta capacidad inmunolOgica
frente a los antisueros especfficos anti-insulina, la mezcla en el
plasma de estas diferentes proteinas en cantidades relativamente va
riables segun las circunstancîas, hace que el components "big insu
lina" presents diferentes grades de reacciOn con los anticuerpos -
anti-insulina, reacciOn que va del 25 al 100^ ( 175 )•
Hasta la fecha, para el estudio de los diferentes componentes
insulfnicos en el plasma, la unica técnica de fracionamiento que po_
demos utilizer es la cromatograffa, bien en geles de sephadex 6 bien
171
en biogeles. Njnguno de los dos procedimientos es capaz de separar
la "proinsulina" de sus "formas intermedias", por lo eue aparecen —
como un componente unico; por tanto mientras no se disponga de otras
tdcnicas capaces de separar e identificar estas diferentes proteinas
en el plasma, este material seguird recibiendo el nombre de "big in
sulina" 6 de "CPL" ("componente andlogo a la proinsulina") (175 )•
El prooedimiento segi ido por Roth (108) en el aislamiento del
componente "big insulina" difiere del empleâdo por Rubenstein y col.
(102) y Melani y col. (176) en el estudio e identificacidn del comj o
nente "CPL" del plasma. No obstante las analogias de ambos componeri
tes no s(51o se basan en el orden de sus pesos moleculares y reaccidn
inmunoldgica frente a los antisueros especfficos anti-insulina, sino
que ademas muestran una sensibilidad a la tripsina muy similar.
Una de las c a ra te r is tic a s mcCs s ig n if ic a t iv a s de la "p ro in s u li
na" es, que por la accidn de la tr ip s in a se convierte en in s u lin a .
Gorden c o l. (175) y posteriorm ente Sherman y c o l . (177) empleando
dicho prooedimiento, han sido capaces de c o n v e rtir "big in su lin a" -
125a is lad a del plasma humano y empleando como marcador "p ro in s u lin a -I
en un m ateria l con c a ra c te rfs tic a s cromatogrdficas semejantes a la
" l i t t l e in s u lin a " , Por su p a rte , Melani y co l. (176) derauestran que
la d igestion tr ip s ic a de la fracc io n "CPL" (componente p ro in s u lin ic o )
del suero humano, aumente la capacidad inmunoldgica de este m ateria l
172
frente a los antisueros anti-insulina. La exposicidn de "CPL" a gran
des concentraciones de tripsina, lo convierte en un material con c^
racteristicas semejantes a la insulina y al’desoctapeptido insulina"
Segun esto y aunque parece bastante probable que nuestra "big insuli_
na" corresponde tambien al "CPL" circulante en el plasma, planeamos
para un future prdximo y dentro de nuestra linea experimental, estu
diar el comportamiento que sigue dicho componente "big insulina" al
exponerlo a la accidn de diferentes concentraciones de tripsina.
En nuestro sistema experimental, el antisuero anti-insulina de
porcino que hemos utilizado tiene una capacidad de reaccidn con la
"proinsulina" cristalizada de origen porcino de un 45^ aproximadamen
te (fig. 22,26 ). Resultados andlogos ha obtenido el Dr. Chance en
su laboratorio (comunicacidn personal).
A su vez, el components "big insulina" aislado del plasma de c£
nejo y la proinsulina cristalizada de porcino muestran alguna dif^
rencia en su capacidad de reaccidn con el antisuero (figs.25^26 ).
Este hecho refleja posiblemente la diferente composicidn de aminodci_
dos entre los segmentos conectantes ("peptido C") de la "proinsulina"
de conejo y del cerdo.
Steiner y col. ( 97) ban determinado parcialmente la secuencia
de aminôdcidos de la "proinsulina" de bovino, y Chance y col. ( lO®
la compléta secuencia de arainodcidos de la "proinsulina" de origen
17
porcino# En contraste con las cadenas A y B de la hormona, donde la
mayor parte de las insulinas de mamifero solamente difieren en unos
pocos aminoacidos, los "peptidos C" de las "proinsulinas" de origen
bovino y porcino difieren en la m.itad de sus aminodcidos, teniendo
la ultima 5 aminodcidos mds que la "proinsulina" de bovino# Estas -
diferencias quedan refiejadas en la diferente reaccidn inmunolôgica
de ambas proinsulinas frente a un antisuero especifico anti-proinsu
lina de porcino (102). Como consecuencia, el estudio de la "proinsu
lina" en una especie animal determinada y en el hombre, requiere, -
el disponer de "proinsulina" pura de la misma especie asi como anti^
sueros especificos. Los sistemas de reaccidn cruzada no son exactos
y por tanto los resultados obtenidos son relatives y solamente expr^
san una idea aproxiraada de la concentracidn de esta molecula en el
plasma.
"Little insulina", en nuestro sistema experimental se comporta
cromatografica e inmunoldgicamente de manera semejante a la insuli
na cristalizada de bovino (fig. 24)* Estos resultados estan totalmen
te de acuerdo con las conclusiones de Roth y col# (108), Gorden y col#
(175), Melani y col. (I76 ) y Goldsmith y col. (1 7 8), entre otros, in
dicando que el componente "little insulina" représenta a la hormona
verdadera y/o insulina ligeramente raodificada, pero cuyas actividades
174
bioldgica e inmunoldgica corresponde aproximadamente a 24 U/mg ( 97)
Resultados muy recientes de Sherman y col, (177) utilizando c£
lulas grasas aisladas derauestran^que mientras la actividad bioldgica
de "little insulina" es identica a la de la,insulina cristalizada de
porcino, el components "big insulina" posee mener actividad bioldg^
ca y por otra parte ésta actividad corresponde a la que présenta la
"proinsulina" cristalizada de porcino.
El components "mini insulina" desde el punto de vista de sus -
caracterfsticas cromatogrdficas (zona de elucién en las columnas de
sephadex G-50), hemos visto que corresponderfa a un material cuyo -125peso molecular, algo inferior al del glucagdn—I serfa aproximada^
mente de 3000 a 3500 (fig. 23 ). Ahora bien, si el peso molecular de
una sustancia es una de las caracterfsticas que rads pueden influir
en la separacién molecular por este tipo de geles, no podemos excluir
otras diferencias tales como mayor 6 menor asimetrfa de la molécula
y que pueden ser la causa de la mayor retencidn de la sustancia por
el sephadex.
Por si sdlo, este dato nos harfa sospechar que este componente
podrfa corresponder al "peptido C" 6 peptido de conexién de la molé •
cula de "proinsulina", maxime cuando se ha descrito muy recientemen
te que este peptido circula libremente en la sangre de humanos (179 )
175
No obstante, parece poco probable que este nuevo componente co_
rresponda al mencionado "peptido C". Recientes resultados (180) pru_e
ban que en cuanto a esta molecula se refiere, por lo menos en el cer
do, bovino y humano, no existe reaccidn con los respectives antisu^
ros anti-insulina, Por otra parte, debido probablemente a las dife
rencias considerables en sus estructuras, no existe reaccidn cruza—
da entre dichos peptides de conexidn y los antisueros "anti-proinsu
lina" 6 "anti-peptido C" pertenecientes a las otras especies,por es
te los antisueros usados en la deterrainacidn del "peptido C" tienen
que ser especificos para cada e s p e c i e . ( I »
En nuestro sistema, los antisueros que hemos utilizado son de
origen comercial y provienen de los Laboratories Wellcome, siendo —
antisueros anti-insulina de cerdo. Para que estos antisueros puedan
valorar el "peptido C" de conejo, tendrian logicamente que detectar
el "peptido C" de origen porcino, y en case âfirmativo significaria
que la estructura quimica de los peptidos de conexién de la molécula
de'’proinsulina'* en el cerdo y el conejo serian serae jantes, por lo m^
nos en los grupos antigénicos de sus estructuras.
Los resultados que hemos obtenido expresan claramente que no —
existe reaccién inmunoîégica entre el "peptido C" cristalizado del
cerdo y los antisueros anti-insulina de cerdo que hemos utilizado en
nuestras valoraciones (fig. 26 ), En nuestro sistema experimental
176
no hay pues posibilidad de valorar el "peptido C" del conejo.
Por otra parte, tambien ha?/ evidencia de que el "peptido C" elu
ye en la misma posicién que la insulina en las cromatografias en s£
phadex G-50 y en biogel, aunque se puede separar facilraente de la -
hormona por electroforesis en geles de poliacrilaraida a pH 8,9 y en
papel en 30^ de âcido fdrmico, (104% 179)•
Con el desarrollo de un inmunoensayo especifico para el "pepti^
do C", Melani y col, (104) han valorado esta molecula en el suero de
humanos. Las concentraciones de esta molécula en sangre son equimola^
res a las de la insulina, sugiriendo que estas sustancias se almacje
nan juntas en los granulos de secrecién de las células ^ , y son -
secretadas en cantidades equimolares principalmente durante el pro-
ceso de emiocitosis de dichos grénulos. Estos datos difieren eonsid^
rablemente de nuestros resultados, ya que el componente "mini insul^
na" cuyas fluctuaciones en sangre analizaremos posteriormente, no se
encuentra en concentraciones equimolares con la "little insulina".
Por su capacidad para reaccionar con los antisuéros especificos
anti-insulina, aunque en menor grado que la insulina cristalizada de
bovino (fig. 25 ), el components "mini insulina" nos hace sospechar
que en su molécula esté contenida una gran parte de la estructura -
Intacta de la insulina. Sabemos que los antisueros especificos anti-
insulina de bovino y porcino solamente tienen capacidad de reaccio—
1 7 7
nar con sustancias cuya estructura es muy similar a las formas intac
tas de las respectives insulinas de bovino y porcino (181^86). las
insulinas de pez y cobaya, que si bien tienen la configuracién gene
ral de las insulinas de mamifero, su composicién en arainoécidos difi^
re grandemente, no reaccionan o lo hacen en menor grado (ü6-l8â. De
igual manera, la cadena A aislada que conserva intacte un puente di_
sulfuro puede reaccionar debilraente, mientras que las cadenas A y B
aisladas y reducidas son inertes (l8l). Por ultimo, el desoctapepti^
do insulina (insulina que ha perdido los 8 aminoacidos terminales
de la cadena B), conserva casi compléta su cauacidad antigena, pero
posee muy poca 6 ninguna actividad biolégica (46),Otra posibilidad a considerar es que, este nuevo componente d^
tectado en el plasma portai del conejo, fuese un artefacto del sis—
tema experimental utilizado. Con este fin realizamos una serie de ex
periraentos control que en todos los casos dieron resultados negatives
(ver pég. loo y fig. 14 )*Por ultimo es importante recordar que en las recromatograflas
los très componentes inmunorreactivos (figs, 20,21) conservan su p^
trén cromatogréfico caracteristico y pe^manecen libres de los otros
componentes, indicando con ello que, "big insulina", "little insuli_
na" y "mini insulina", son entidades independientes y con caracteri^
ticas propias.
17 8
De un interes muy particular es el hecho de que "mini insulin'
se detects en la insulina cristalina de origen comercial. Si bien '
94 a 96^ de la hormona corresponde a proteina que eluye en la zona
de "little insulina", existe un 4 a 6 que se encuentra en la régie-
cerfespondiente a la "big insulina", y un 2 a 4^ que aparece en la
zona de la "mini insulina" (Pig. 24). Estos datos indican que, "mini insulina" es un componente normal en algunas preparaciones comercir.
les de la hormona, juntamente con la"proinsulina” y apoyaria una vo?
més la idea de que el components "mini insulina" no corresponde al
"peptido C" ya que dicho peptido no esté presents en la insulina -
cristalizada#
Al comparer nuestros resultados con los obtenidos por Steiner
y Oyer ( 94, 97) y posteriormente por Chance y col. (101) vemos que
existe una ligera diferencia. Ambos investigadores no han detectado
el components "mini insulina" en sus anélisis. Sus estudios indican
que cuando la insulina comercial se filtra por sephadex G-5 0 en éci
do acético I M, el 97 a 9 % de la proteina se recoge en la regién -
correspondiente a la insulina ("pico c"), conteniendo insulina pura
6 insulina que ha sufrido ligeras modificaciones (deamidacidn), y -
cuyas actividades biolégicas e inmuno1ogicas es aproximadamente de
24 U/mg ( 97 )• El reste del material, que représenta un 2 a 3 , elu
ye en una zona intermedia entre el pico de la insulina verdadera y
1 7 9
el VOlumen vacio ("pico b"). El material del "pico b" tiene una ac
tividad bioldgica de aproximadamente 5 U/mg y una capacidad inmuno 1*6
gica de 8 a 15 U/rag ( 97 )• A su vez, el fraccionamiento de las pro
teinas del"pico b" por electroforesis en geles de poliacrilamida 6
por cromatografla en DEAE—celulosa, sépara très componentes mayoros
y varios menores; los primeros parecen ser los més importantes y e^
tén representados por la "proinsulina", la "forma intermedia" y la
"forma no convertible". Los tres fracciones proteicas reaccionan in
raunoldgicamente con los antisueros anti-insulina; pero en contraste
a las dos primeras, la "forma no convertible" no es sensible a la -
accidn de la tripsina,por lo oual se sugiere que représenta un dfm^
ro de la insulina cuya estructura no se conoce bien. Los componentes
menores no estén caracterizados, aunque parece ser que representan
formas deamidadas de los componentes mayores.
Aunque no podemos saber con certeza a que se deben las diferen.
cias existantes entre los resultados de los investigadores menciona^
dos y los datos obtenidos por nosotros, parece muy posible cue el gr^
do de pureza de las distintas preparaciones comerciales de la hormio
na, 6 bien la diferente potencialidad de un determinado antisuero —
frente a los componentes "big insulina" y "mini insulina" pueda ser
la causa de estas diferencias.
Sobre este ultimo punto, nosotros hemos podido observer, comô
180
el empleo de diferentes lotos de antisueros influye enormemente en
los porcenta.jes que hemos obtenido de dichos componentes* Por esta
causa, todo este trabajo ha sido realizado utilizando un unico lote
de antisueros.
Una vez caracterizados lbs tres componentes "big insulina", "li_
ttle insulina" y "mini insulina" circulantes en el plasma, otro pun
to de gran interes, es analizar el comportamiento que siguen dichos
componentes insulfnicos en las distintas situaciones expérimentales
que hemos estudiado, y en las cue hasta la fecha no se habfa tenido
en cuenta la presencia en sangre de otras proteinas diferentes de la
verdadera insulina, pero capaces de reaccionar con los antisueros -
especificos anti-insulina y por tanto valorables por las técnicas -
rutinarias del inmunoensayo.
Los experimentos realizados en los animales del grupo control.
nos indican claramente la existencia en el plasma portal de los tres
componentes descritos (fig.8 ).
La concentracidn total de insulina circulante en condiciones b^
sales de ayuno de 24 boras, re^^resenta un valor medio de 1.238 raug/ml
de plasma (DE zt 0,l6). Tabla I
La mayor parte de la hormona circulante corresponde a "little
181
insulina", cuyos porcentajes son del 86 al 94^* El componente "big
insulina" represeta solamente de un 2 a 11^ de la concentraoiôn to
tal de insulina. Por lôs distintos estudios realizados parece ser que
la "proinsulina" corresponde a menos del 5^ (de un 1 a 2^) del conte-
nido total de insulina en el pancréas normal. Nuestros valores sugie-
ren por tanto, que en condiciones basales, aunque una pequena fracoiôn
de la insulina inmunorreactiva circulante podria representar hormo
na sintetizada "de novo", la mayor parte corresponde a hormona alma-
oenada en los grénulos de las células del pdncreas.
Sin embargo, los resultados obtenidos independientemente por
Melani y col. (1 7 6 ), y Gorden y col. (I8 3 ) on el plasma de personas
en ayuno, muestran cifras de "big insulina" que osoilan entre 5 y 48^
de la insulina total. Esto significaria que en estas condiciones, una
gran parte de la hormona circulante corresponde a insulina recien sin
tetizada. Es poco claro el significado que en condiciones basales pue-é
den tener estos altos valores de "proinsulina" circulante, y este es
un punto de gran interés en estudios posteriores.
En ouanto al componente "mini insulina", si bien esté presents
en las condiciones basales de né estîmulo, sus porcentajes que osci-
lan entre un 2 a 4^ de la hormona total circulante, corresponden a
una cantidad minima de material inmunorreactivo. No obstante, su pre-
senoia parece indicar que esta molécula es un components normal de
182
las células ^ del péncreas y cue se vierte a la circulacién junta-
mente con la insulina y"proinsulinaV
En los animales en ayunô de /l8 ho ras. tenemos una situacién
perimental de gran interes ya que el a?/umo prolongado es una situa
cién metabolica que afecta profundamente a las células ^ del pancreas
Se caractérisa por una disminucién en la secrecién de insulina y por
una intolerancia a la sobrecarga de glucosa, denominada "diabetes del
ayuno" ( I84, I85).Lo primero que se deduce de nuestros resultados, es que el ayu
no de 48 horas por si sélo,no altera el patrén general de los compo^ nentes insulino inmunorreactivos del plasma. En estas condiciones,
el porcentaje mayor de hormona circulante corresponde a "little insu
lina" con un valor de 88 a 98^ de la insulina total, (fig. 9 ).
Frente a esto, hay que sehalar una disminucién en la concentracién
absoluta de insulina circulante, que es estadisticaraente significatif
va al compararla al grupo basai(p 0.00l),y que se acompané de una
disminucién tambien estadisticaraente significativa (p ^ O.Ol) de la
concentracién de glucosa sangre. Tabla II
Los cambios paralelos de los niveles de glucosa e insulina cir
culantes indican la existencia de un sistema metabélico finamente —
regulado, donde la insulina puede estar representando un importante
183
papel* Esta insulina corresponde a "little insulina" u hormona cue
consideramos inmunoîégica y biologicamente activa.
En nuestras condiciones expérimentales, parece bastante claro
que, tanto en el ayuno prolongado como en situacién basal, la pre
sencia en el plasma de los componentes "big insulina" y "mini insul^
na", no pueden alterar significativamente los valores de insulina -
total aportados por las técni cas i nmuno logi ca s de rutina, IjOS datos
obtenidos indican, que la insulina total del plasma Valorada por el
radioinmunoensayo, en estos casos se aproxima bastante a las concen
traciones de "little insulina" (Tablas I y II). No obstante, no hay
que olvidar el importante papel que tienen los antisueros especificos
anti-insulina utilizados en estas determinaci ones. La mayor é menor
capacidad de reaccién de estos antisueros (que como ya he dicho depen
de del lote utilizado), con los componentes "big insulina" y "mini
insulina", puede influir grandemente en los resultados obtenidos.
Despues de la administracién de glucagén a conejos en ayuno prie
vio de 24 horas, la concentracién total de insulina en el plasma por
tal se elevé considerablemente (p<^0.000l). Al mismo tierapo, no ob-
servamos ninguna alteracién en los niveles glucéraicos, que mostraron
valores analogos a los observados en los animales no estiraulados —
(P No significativa).
1 8 4
Foa y col. ( 186)en 1932, consideran que el efecto del glucagén
sobre la secrecién de insulina es socundario a la elevacién de la -
glucosa en sangre.
Candela en 196l, fue uno de los primeros investigadores que ojb servé el efecto del glucagon en la secrecién de insulina por el péri
créas de pato incubado "in vitro" (II5 )»
Posteriormente, Samols y col. (171) demuestran que la inyeccién
intravenosa de glucagén pancreatico estimula la secrecién de insulif
na, independientemente de su efecto sobre la concentracién de glucjo
sa en sangre. Aunque este efecto del glucagén se estudié primeramen
te en humanos empleando dosis farmacolégicas muy elevadas, posterior^
mente gran numéro de investigadores han demostrado su efecto en gran
variedad de especies animales tanto "in vitro" como "in vivo" ( II6, 187 - 188-189 - 190 - 191 - 192 ), y a concentraciones que corresponden a los niveles fisiolégicos ( I46 - I90 — 191)» Puesto que nue^
tros resultados muestran niveles altos de insulina junto a glucemia
normal en animales tratados con glucagén, de acuerdo con lo propues-
to por Samols y col. (171), podemos sugerir que el glucagén estimula
la secrecién de insulina directamente, y su efecto es anterior e in
dependiente de los cambios glucemicos,
Los datos obtenidos demuestran que en respuesta al glucagén hay
una elevacién en los niveles de "big insulina", "little insulina" y
185
"mini insulina" circulantes• No obstante, como los valores elevados
de los tres componentes coexister con la elevacién en la concentracién
total de hormona en sangre, las proporoiones relativas de estos son
anâlogas a las observadas en los animales control, no siendo sus dife
rencias estadisticamente significatives ( fig. 10 ), El porcentaje
mayor de hormona circulante corresponde pues, al components "little
insulina", que comprends un 88 a 93 lo cual demuestra como el glu
cagén estimula principalmente la insulina alrnacenada en los grânulos
de las células del pâncreas.
En contraste al glucagén, la estimulacién con tolbutamida dié
lugar en nuestros animales, a una elevacién en la concentracién to
tal de insulina circulante (p ^O.OOOl), que se acompané de una dis—
minucién tambien estadisticamente significativa ( p 0.005) eu los niveles de glucosa en sangre*
En estas condiciones expérimentales, hay una elevacién cuantita-
tiva de los tres componentes inmunorreactivos del plasma. Sin embar
go sus porcentajes demuestran, frente a una elevacién significativa
(p <]0.C05) del componente "big insulina", una disminucién proporcio-
nal (p ^ 0.005) del componente "little insulina", y una ligera elevacién (p 0,02) del tercer componente, fig. 11 .
Estos resultados sugieren que la tolbutamida estimula la secre-
186
cién de insulina de manera diferente a la observada por el glucagon '
La droga hipoglucemica no s61o actua a nival de los grénulos de las
células , estirnulando la secrecién de proteina alrnacenada, sino -
que una parte de la hormona secretada corresponde a insulina recien
temente sintetizada.
Nuestros resultados son muy si milares a los obtenidos por Gor
den y Roth (192). quienes encuentran que la elevacién en el porcentaje de "big insulina" como respuesta a la inyeccién de arginina y
tolbutamida, esté en dependencia directa del tiempo transcurrido de^
de la aplicacién del estîmulo.
Por su parte, Lazarus y col. (109) y Melani y col, (193 )> han
demostrado recientemente en pacientes con insulinomas, que en respues^
ta a la administracién de tolbutamida un ' 0% de la insulina circulan
te corresponde a "big insulina". Resultados similares han obtenido
Goldsmith y col. (I78),
El estudio realizado con las hormonas gastrointestinales secre^
tina y pancreocimina, cuyos efectos sobre la secrecién de insulina
comentaraos extensamente en el phnteamiento de esta Tesis Doctoral,
nos han proporcionado resultados altaraente interesantes.
Despues de la admini stracién intravenosa de secretina nura, los
niveles de insulina en sangre portai se elevaron répida y considéra
1 8 7
blemente, siendo esta elevacién estadisticamente muy significativa
(p O.OOOl), tanto en el ayuno previo de 24 horas como en el ayuno
prolongado de 48 horas. No existen diferencias apreciables en la concentracién total de hormona circulante entre los dos grupos experi
mentales estudiados (p no significativa),
Sin embargo, los altos valores de insulina circulante no se acoT;
panaron de las alteraciones glucémicas que cabria esperar; no hay
diferencias entre las gluoemias en estos animales y las observadas
en su respective grupo control (p no significativa).
Estos resultados estan totalmente de acuerdo y confirman una
vez mâs, las diferentes observaciones aportadas a la literature mun-
dial. Unger y col (142)en el perro, y mâs recientemente Chisholm y
col, (172) y berner y col,(173) en el hombre, demuestran como la secret ina estimula la secrecién de insulina de una manera répida, inter
sa y pasajera, El pico de secrecién maxima de la hormona aparece do
uno a dos minutes despues de aplicado el estîmulo, retornando a sus
valores basales dentro de los diez à quince minutes siguientes.
Teniendo en cuenta que el tiempo de circulacién venosa de la se
cretina, desde el punto de su aplicacién en la periferia hasta las
células |3 del pâncreas es aproximadamente de uno a dos minutes, la
respuesta de los islotes a este estîmulo es anâloga a la originada
por la estimulacién con glucosa intravenosa, Esto sugiere que la hor-
188
ïïiona gastrointestinal estimula un pool de insulina alrnacenada, que
esté dispuesta para su répida secrecién.
La falta de respuesta hipoglucemica observada en todos los es
tudios realizados, y confirmada en nuestros resultados, no ha teni
do hasta ahora una explicacién segura.
Entre las distintas posibilidades que los cientificos interesa
dos en este problema adraiten, podemos destacar las siguientes:
1.- La existencia de factures compensatorios que previenen la hipo-
glucemia.
2.- Que la elevacién de los niveles de insulina circulante no corre^
ponden a hormona biolégicamente activa, aunque si con capacidad
inmunoîégica frente a los antisueros anti-insulina.
3.- Que la secretina puede alterar de alguna manera la extracién he
pética de la insulina.
4.— Que la secretina puede estimular al mismo tiempo la secrecién de
insulina y la movilizacién del glucégeno almacenado en el hîgado
Estas propiedades son caracteristicas del glucagén, y su posibif
lidad se ha sugerido teniendo en cuenta la analogia existent© en
la estructura quimica de ambas moléculas, asi como la comun prjo
piedad de las dos hormonas de ser lipoliticas "in vitro" ( 194 ).
Es muy dificil precisar con exactitud cual pueda ser la causa
de esta falta de respuesta hipoglucémica. No obstante, los resulta-
1 8 9
dos que hemos obtenido son de gran interes y creemos pueden aportar
alguna explicacién al problema planteado.
Las caracteristicas cromatografi cas de la insulina circulante
muestran un patron que difiere grandemente del patrén general encon_
trado como respuesta a los otros estimulos estudiados.
A pesar de observarse una elevacién en los niveles cuantitati-
vos de los tres componentes insulfnicos, cuando sus valores se expre
san como porcentajes de los niveles de insulina total en plasma, se
aprecia una marcada elevacién del componente "mini insulina", cuyos
porcentajes llegan a representar en algunos animales mas del 50* de la hormona total circulante (p 0.001). Frente a esto se observa -
una disminucién proporcional (p ^ 0.001) del componente "little in
sulina" y no aparecen cambios importantes en el componente "big in^u
lina" (p no significativa), fig. 12.
El ajnino de 48 horas no influyé para nada en los valores porcen
tuales de "mini insulina" que siguen siendo estadisticamente muy el£
vados (p 0.001). Sf se observa un aumento del componente "big insu
lina" (p <6 0.001) y un descenso mayor en el porcentaje de "little in
sulina" (p < 0.00l);cabe pensar pues, que al prolongar el tiempo de
ayuno hay una disminucién en la formacién de insulina a partir de la
’proinsulina”(fig. 13).
1 9 0
Como respuesta a la estiinulapion con nancreooiiTiina y confirmando
estudios previos,nuestros resultados muestran en ambos grupos expéri
mentales ( ayuno previo de 24 y 48 horas, respectivamente), una ele
vacién répida e intensa en los niveles de insulina total en sangre,
(p ^ 0.005)* Aunque aparentemente se observa alguna diferencia entre
los valores absolutes de hormona circulante entre los des grupos ex
périmentales, estas diferencias no son estadisticamente signifioati-
vas (p no significativa).
Si bien las dosis de pancreocimina utilizadas en este estudio
son bastante elevadas, Meade y col. (195 ) ban obtenido una respues
ta similar en la concentracién de insulina en sangre, empleando el
estîmulo en concentraciones menores.
La falta de respuesta hipoglucémica que hemos observado,es
una confirmacién de los resultados obtenidos por un grân nûmero de
investigadores, en respuesta a la estimulacién con las hormonas in
testinales.
Elevacién en los niveles de insulina circulante, sin altera
ciones en la glucemia se han observado tambien despues de la adminis
tracién de âcidos grasos (196), tetragastrina (195) y xilitol (197 )• Por otra parte, Meade y col.( 195) advierten despues de la es
timulacién con pancreocimina, una disminucién de los PFA circulantes
sin cambios apreciables en los niveles glucémicos. A su vez, Zierler
y Rabinowitz (198) demuestran que la infusion de 10 |iU/ minuto de in-1 9 1
sulina, da lugar a una disminucién de los PFA sin ningûn efecto so
bre la captacién de glucosa,
Estudios "in vitro" sobre diafragma de rata, indican que la pan
creocimina por si misma, no posee ningûn efecto inhibidor (195)*
Hasta ahora, pues, es; lapy dificil llegar a ninguna explicacién
ooncluyente. Meade y col, (l95) sugieren que la disociacién entre la
insulina y glucosa que aparece como respuesta a la pancreocimina, po
dria ser debida a la secrecién de hormona biologicamente inactive,
Nuestros resultados no parecen apoyar la hipôtesis de Meade, ya que
si en los animales en ayuno previo de 24 horas observamos una elevacién
estadisticamente significativa ( p <^0,001) del componente "mini in
sulina", este componente aparece completamente normal, en los anima
les sometidos a un ayuno prolongado de 48 horas (p no significativa),
Tampoco el componente "big insulina" présenta porcentajes elevados
en ninguno de los dos grupos (p no significativa), si bien aparente
mente aparece un poco mas elevado en los animales del segundo grupo,
Parece poco probable que cualquiera de estos dos componentes "big in
sulina" é "mini insulina",sea el responsable de la falta de hipoglu-
cemia que sigue a la administracién de pancreocimina, Cabe pensar,
que en respuesta a la estimulacién con pancreocimina la insulina cir
culante corresponde en su mayor parte a "little insulina", es decir,
a hormona que consideramos biolégica e inmunologioaraente activa
1 9 2
(fig, 15 y 16).
Estudios de Unger y col, (142) en perros senalan que la pancreo_
cimina estimula la secrecién de glucagén, que a su vez eleva los ni_
veles glucémicos,compensando de esta manera la accién de la Insulina
sobre la glucemia lo que en esta situacién experimental séria la ex
plicacién mas aceptable.
De estos datos podemos senalar que, tanto la secretina como la
pancreocimina estimulan principalmente la hormona alrnacenada en los
grénulos de las células del péncreas, El mécanisme que régula esta
secrecién es desconocido, aunque si parece bastante seguro que los
dos estimulos actuan de manera diferente, mientras que la mayor par
te de insulina circulante, como respuesta a la pancreocimina, corre^
ponde a "little insulina"; despues de la estimulacién con secretina
el mayor porcentaje de hormona en sangre aparece como "mini insulina".
La importancia fisiolégica de esto nuevo componente depende en
gran parte de su naturaleza y actividad biolégica. Hasta la fecha,
este es un punto completamente desconocido, por lo que no podemos —
llegar a ninguna conclusién. Bien pudiera tratarse de un producto —
derivado de la insulina é una insulina modificada, que conservando
su capacidad inmunoîégica no favorece la utilizacién de la glucosa
por los tejidos periféricos, aunque puede actuar a otros niveles ~
del métabolisme intermediario,
1 9 3
Apoyando n-uestra hipdtesis estdn los conocimientos adquiridos
por los distintos estudios fisico quimicos realizados; parece ser -
que existen en la insulina una serie de grupos que son necesarios -
para mantener la estructura tridimensional de la moldcula, que a su
vez es absolutamente necesaria para la compléta expresidn de su ac-
tividad bioldgica. Cualquier modificacidn de la moldcula de insulina
que produce una disminucidn de su actividad bioldgica va acompanada
de cambios en la configuracidn de su moldcula.
Sin embargo, si parece bastante claro que la secretina es un —
estimulante muy selecto y eficaz en la secrecidn de "mini insulina",
Dos hechos de gran interes conviene recorder;
1,- La desaparicidn del components "mini insulina" del plasma cuando
los niveles absolutes de insulina retornan a sus valores basales —
(fig. 1 5). Esto sugiere que su elevado porcentaje como respuesta a
la secretina, se debe a que este components es segregado por el pdii
créas como tal moldcula, siendo su presencia en el plasma pasajera
y posibleraente debido a la adaptacidn y puesta en marcha, de un si^
teraa 6 mécanisme enzimdtico hasta hoy desconocido. En esta misma 1^
nea de pensamiento se rauestran Gross, Büber y Pelber (199).
2.- El segundo hecho corresponde a la obseriracidn de gran numéro de
investigadores, de que el efecto de la secretina sobre los islotes
de Langrehans depends de la presencia del pdncreas exocrino.
194
Los originales hallazgos de Guidoux-Grassi y Pelber (140) y de
Vanotti y col, (200), han sido recientemente confirmados por Hinz y
col. (201) y por Goberna y col. (202), que observan como la secretj
na no es capaz de estimular la secrecidn de insulina a partir de
lûtes aislados de pdncreas de rata, ni de "slices" de tejido pancred
tico procedente de gldndulas con insuficiencia exocrina. Por otra -
parte, tambien Hinz demuestra que en las mismas condiciones experimen
taies, la pancreocimina si estimula la secrecidn de insulina.
De todos estes hechos parece bastante probable que la secretina
puede estimular la secrecidn de insulina de los islotes de Ldngerhans
por intermedio del pdncreas exocrino.
Hace tiempo se sabe que la secretina estimula principalmente la
produccidn de agua y bicarbonates por el pancréas exocrino, Queda por
establecer si ciertos enzimas que intervienen en esta parte de la —
funcidn pancredtica, pueden afectar el mécanisme secretorio de los
islotes de Idngerhans. Una publicacidn muy reciente de Pelber y col.
(203), demuestra como la tripsina "in vivo", es capaz de estimular
la secrecidn de insulina de manera andloga a la secretina.
Ho obstante, a pesar de los estudios de Young y Carpenter (204)
entre otros, que demuestran "in vitro", como la tripsina puede actuar
sobre la moldcula de insulina dando lugar a "desoctapeptido insulina"
cuya actividad bioldgica valorada por el efecto hipoglucémico en el
1 9 5
conejo es solanente de un 10 a 20> del efecto producido por 3a ver~
dadera hormona, mientras que conserva su oapacidad inmunOlôgica que
Yalow y Berson (4 ) demostraron que puede variar segun el origen del
antisuero utilizado; trabajos mas recientes de Steiner y Oyer (94)
y de Clark y Steiner (9 6) con "proinsulinas" radioactivas de origen
humano y de rata, asi como un trabajo de Melani y col. (176 ) con el
"CPL" 6 "componente pcoinsulinico", aislado del plasma humano, de
muestran que la exposicidn "in vitro" de estas sustancias a grandes
concentraciones de tripsina las convierte en un material con carac—
teristicas similares a la insulina y al "desoctapeptido insulina".
Como el producto de la digestidn tripsica en los dos trabajos de —
Steiner, no tiene el aminodcido treonina (en la proinsulina humana)
ni serina (en la de la rata) en la posicidn Bi este enzima no nue \ 20 ‘ —
de curaplir todos los requisites necesarios propuestos para el enzima
que convierte intracelularmente la proinsulina en insulina.
Sin embargo, se ha sugerido la posible existencia "in vivo" de
un enzima modificadô y andlogo a la tripsina, que actuaria en conjun
ci<5n con una proteasa de actividad similar a la carboxipeptidasa B,
y convertiria la proinsulina en insulina (97). Aunque este enzima
no ha sido aislado aun, su actividad puede ser parcialmente inhibida
por ciertas sustancias que son inhibidores de la tripsina (20 5).
Todos estes hechos apoyarian nuestra hipdtesis, sugiriendo la
196
posibilidad que el nuevo componente descrito pueda corresponder a un
produoto derivado de la insulina por la accidn de ciertos enzimas.
De un interes muy particular por lo demostrativo de los datos
obtenidos, son, las diferencias existantes entre la respuesta fisio-
lôgica del pânoeas a la estimulaciôn con gluoosa segûn su via de apli-
cacidn sea la via intragâstrica 6 la via intravenosa. La diferente ru-
ta de administracidn afecta grandemente no solo al aspecto cuantitati-
vo, sino que tambien influye en las propiedades cualita^ivas de la
hormona secretada.
Como resnuesta a la estimulaciôn -parenteral con gluoosa. obser
vâmes una intensa y rdpida elevacidn de los niveles gluoômicos ( p <
O.OOl), que actuando directamente sobre los islotes de Langer-
hans induce un aumento de secrecidn de insulina, alcanzando la hor
mona concentraciones muy elevadas en sangre portal tres minutos des—
pues de aplicado el estîmulo ( p <^0.00l).
Cuando la glucosa la administramos por sonda intra^dstrica.
tambien se aprecia una elevaciôn en los niveles glucémicos, pero en
este caso es mâs lenta y menos pronunciada mostrando valores estadis-
ticamente significatives (p <^0#02) a los 45 minutos de aplicado el
estîmulo. Por trabajos previamente publicados sabemos, como la res
puesta maxima a este tipo de estimulaoidn se obtiene 45 minutos. des-
1 9 7
p u o 3 de adniinistrada la glucosa, A este tiempo, los valores absolu
tes de insulina que detectamos en sangre portal tambien aparecen ole-
vados (p 0*005) ; esta elevaciôn que continua significativa (p<; 0 ,001)
a los 90 minutos de aplicado el estîmulo, coincide con los valores
glucémicos yâ normalizados (p no significativa). Tablas X y XI,
Segun las observaciones cldsioas de Mo Intyre y col.(112 ), en el
horabre son mâs elevados los niveles de insulina circulante que aoom-
panan a la hiperglucemia inducida por glucosa oral, que la insuline-
mia résultante de un grade similar de hiperglucemia producida por la
glucosa parenteral,
Por su parte, Seltzer y col, ( 126) en perros, llegan a la
conclusiôn de que la secrecidn de insulina es una funcidn que dépen
de directamente del grade de hiperglucemia alcanzado, no interviniendo
para nada la ruta seguida en la administraciôn de la glucosa. Esta
observacidn puede explicar nuestros datos, y sugiere la posibilidad
de como en la respuesta pancreâtica pueden existir importantes dife
rencias propias de cada especie, que probablemente dependen de los
hdbitos dietéticos del animal, as! como de la morfologia del pân-
creas e intestine,
Pero lo que verdaderamente atrae nuestro interés son, las di
ferencias observadas en las caracterîsticas cromatogrâficas de la hor
mona circulante.
1 9 8
Mlentras que, en respuesta a la estimulaciôn parenteral con glu
cosa,el porcentaje mayor de insulina en la sangre portai corresponde
a "little insulina", es decir a insulina que considérâmes inmunolô-
gica y biologicamonte activa ( figu* 18 ), confirraando,que la gluco
sa intravenosa estimula la hormona alinacenada en los granules de secrec
creciôn de las células |3 del pancreas; la insulina secretada como res
puesta a la administraciôn oral de la glucosa, présenta unas caracte—
rlsticas muy particulares. En estas condiciones expérimentales, sola
mente un 50 'v 4e la hormona circulante corresponde a "little insuli
na", encontrândose muy elevados los otros dos componentes restantes
"big insulina" y "mini insulina" ( p 0,001), fig I9 , tablas X y XI.
La elevaciôn en los valores porcentuales del componente "big insu
line" fué observada por primera vez por Roth en el hombre, y en esta
misma situaciôn experimental, Fosteriormente Gordon y col, ( 192) han
realizado un estudio muy completo tambien en humanos, de la dinâmica
de secrecidn de "big insulina" como respuesta a la glucosa oral. Sus
resultados demuestran como el mayor porcentaje de este componente en
sangre periférica esté en razÔn directa al tiempo transcurrido desde
la aplicacidn del estîmulo, Estos investigadores dividen la respuesta en
en tres fases: en la primera fase, que corresponde aproximadamente a
los primeros 30 minutos, la concentracidn de "big insulina" en san
gre es baja, compardndola con los cambios presentados en la concentra-
190
ciôn total de insulina circulante. La segunda fase comprends de los
45 a 90 minutos, y en alla la razôn "big insulina"/insulina total se
se eleva mucho independientemente de los cambios ocurridos en la con
centracidn absoluta de la hormona. La tercera y ûltima fase, compren
ds desde los 90 minutos y probablemente continua durante las prdximas
horas; en alla "big insulina"/insulina total permanece constante. Re
sultados similares han obtenido Melani y col.(176) y Goldsmith y col
(178 ).Nosotros solamente hemos estudiado los porcentajes de "big insuli
na" a los 45 minutos de aplicado el estîmulo es decir, coincidiendo
con la secrecidn mâxima de la hormona y, tardiamente a los 90 minutos
de la estirnulacidn, Huestros resultados estan de aouerdo con la divi-
sidn propuesta por Gorden, (parte superior e inferior respectivamente
de la fig. 19 )•
La importancia de "big insulina" en la sangre esta determinada
por su naturaleza y actividad bioldgica. Por las razones indicadas en
la primera parte de esta discusidn, considérâmes que esta fraccidn 6
componente corresponde a la "proinsulina" y "componentes afines".
Aunque hay evidencia de que la principal funcidn de la "proin
sulina" es faciliter y asegurar la formacidn correcte de los enlaces
ô puentes disulfure de la molécula de insulina durante el proceso de
biosîntesis de la hormona en las células (3 del pâncreas, es muy
00
posible que esta molécula tambien tenga unas funciones extrapancreâ-
ticas de una naturaleza regulatoria, diferentes quizâ en algunos as-
pectos de la verdadera insulina.
Es probable que, la"proinsulina" despues de ser sintetiaada en
los ribosomas del retîculo endoplâsmico de las células ji ( 206 ), sea
transportada al aparato de Golgi ( 97 - 207 ), donde se convierte en
insulina y posteriormente se almacena en los grânulos de secrecidn
( 2O0 ), La conversidn de "proinsulina" a insulina puede tener lugar
no solo en el aparato de Golgi, sino tambien dentro de los grânulos
durante su proceso de formacidn y maduracidn ( 209 ). Aunque hay pocos
datos concernientes a la proporcidn relative de "proinsulina" e insu
lina almacenadas en los granules de secrecidn, es posible que el pro
ceso de la conversidn no sea siempre complète, y que un pequeno por
centaje de la proteina perrnanezca en los granules como "proinsulina".
De aqui que, la liberacidn de los grânulos despues de la estimulaciôn
con la glucosa oral, podria dar lugar a la secrecidn de pequenas can-
tidades de "proinsulina" junto con la insulina, y la proporcidn rela
tive de estas proteinas podria variar dependiendo del estado de madu
racidn de los grénulos secretados. Por otra parte, tambien debemos
tener en cuenta la posibilidad de la secrecidn de "proinsulina" e in
suline independientemente de la formacidn de los granules, 6 bien la
secrecidn de grdnulos inmaduros 6 "pregrânulos", que contienen mayor
01
proporcidn de "proinsulina" ( 208 ), Esto podria estar de acuerdo con
la hipdtesis de la secrecidn a partir del aparato de Golgi de hormo
ne recientemente sintetizada, d bien de la disolucidn selective de
los grânulos (210-211 ),
Desde otro ângulo, el interes en conocer la actividad bioldgica
de la "proinsulina" ha sido y si,gue siendo muy grande, Sin embargo,
pocos autores han interpretado sus resultados interpolados a los nive
les absolûtes de "proinsulina" circulante, y al posible efecto biold-
gico sobre los tejidos periféricos de las concentraciones relativa-
mente bajas de esta molécula. La mayor parte de los estudios realiza—
dos sobre la actividad de este precursor biosintético de la insulina,
se han hecho "in vitro" sobre tejidos aislados, una situacidn experi
mental que puede diferir considérablemente de las condiciones en que
puede encontrarse en el organisme vivo.
En el animal intacte. Chance y col (101 )utilizando el método de
las convulsiones en el ratén, han demostrado como la "proinsulina" pu-
ra de origen porcino tiene una actividad bioldgica de 3 I u/mg, com-
parada a las 25 I U/mg que tiene la insulina, Por otra parte, cuando
se valora el efecto hipoglucémico en las ratas ayunadas, la"proinsu -
lina" pura de bovino dâ valores de 10 I U/mg de proteina, teniendo un
efecto mener en los animales alimentados ( 212); la hipofisectomia y
adrenalectomia aumentan la respuesta hipoglucémica en estos animales
202
( 213).Los estudios realizados "in vitro" sobre el diafragma de rata
demuestran que, tanto la "proinsulina" cristalizada de porcino como
la "proinsulina" de origen bovino, estirnulan la oaptacidn de glucosa
y formacidn de gluedgeno, aunque su actividad corresponde solamente
a un 20 d 30 ^ de la actividad do la hormona verdadera.Sobre tejido
adiposo y células grasas aisladas, la "proinsulina" influye en los
mismos parémetros metabdlicos que la insulina ( captacidn de glucosa,
oxidacidn de glucosa e incorporacidn de glucosa a triglicéridos),dis-
minuyendo la lipolisis inducida por la epinefrina, teofilina y glu
cagon. Sin embargo, los resultados obtenidos son variables, dependien
do de las condiciones expérimentales y de los pardmetros valorados.
Siguiendo con la exposiciôn de nuestros resultados, en cuanto al
componente "mini insulina", en los animales estimulados con glucosa
oral tambien se encuentra muy elevado, tanto a los 45 como a los 90
minutos despues de aplicado el estîmulo, Sin embargo, el hecho de que
la glucosa oral en contraste con la glucosa intravenosa sea capaz de
elevar el componente "mini insulina" en sangre, hace pensar que su
efecto no sea directe, sino, mediado por al-guna de las hormonas intes
tinales y, concretamente por la secretina. Esta hipétesis esté apo—
yada en los rocientes estudios de Chisholm y col (172 ), quienes uti-
lizando un radioinmunoensayo muy especîfico y sensible para la secre-
20 3
tina observan,como la ingesta de glucosa produce una râpida elevaciôn
de los niveles de secretina en la sangre, que precede a la elevaciôn
de las insulinemias, postulando qua la secretina actuaria como una
Have en la secreciôn de la hormona pancredtica, Por otra parte, la
secretina parece tener un doble papel en la secreciôn de insulina (214),
una estimulaciôn râpida y directa, y una potenciacion prolongada del
efecto glucémico; el efecto potenciador es de tal magnitud que,sugie
re la posibilidad de ser la secretina el factor dominante en la secre
ciôn de insulina inducida por la glucosa oral, Sin embargo, nosotros
no podemos excluir otros factores intestinales que lôgioamente tam
bien pueden influir en la respuesta del pâncreas a la administraciôn
de la glucosa oral.
No sabemos por qué el grupo de Roth no ha detectado este compo
nente en sus estudios con glucosa oral. Tres posibilidades podemos
barajar: l) Los investigadores mencionados estudian los componentes
insulinicos en sangre periférica,mientras que nuestrox estudio estâ
realizado en sangre portai y, refleja directamente la hormona secro-
tada por el pâncreas. No sabemos en este oaso el papel que el hîgado
pueda tener en la extracciôn de "mini insulina"; esto forma parte del
proyecto de estudio que realizaremos posteriormente. La 22 posibili
dad es, recordando una vez mâs, el papel tan importante que tienen en
estas valoraciones los antisueros utilizados. La diferente capacidad
2 0 4
de roacciôn de estos antisueros anti-insulina con los componentes
"big insulina" y "mini insulina", logicamente influye en su deteccion
y en los porcentajes obtenidos* Por ûltimo, Roth y su grupo han rea
lizado todos sus estudios en el hombre; por nuestra parte, el ©stu
dio se ha llevado a cal o en un animal que difiere grandement© del nom
bre no solo en sus hâbitos alimenticios, sino posiblemente tambien en
la morfologia del intestine y del pâncreas, lo que puede influir en
los resultados obtenidos*
Sin embargo, nuestros resultados refuerzan la idea de la grân ir
portancia que estân adquiriendo las hormonas gastrointestinales como
reguladoras de la secreciôn de insulina ô 'sustancias inmunologica-
mente afines, tanto en las situaciones fisiolôgicas, como en las pa-
tolôgicas. En este ûltimo sentido, los recientes hallazgos de Chis
holm y col, (215 ) apoyan su interes, Asi tenemos el importante hecho de que la secretina estâ muy elevada en el plasma de personas predia-
béticas y en la diabètes temprana, indicando que la secretina proba-
blemente tiene un efecto compensador, y el componente "mini insulina"
pudiera ser un importante mediador en estas situaciones limite.
Por ûltimo, no podemos dejar de senalar como la existencia de
los tres componentes insulinicos inmunorreactivos descritos en esta
Tesis,nos hacen recorder las diferentes formas de actividad insuli-
nica del plasma (ILA), estudiadas en los ûltimos anos con el nombre
205
de "insulina combinada" (bound l) (71), "insulina atîpioa" (63), "acti
vidad insulînica no supresible" (PSIIA) (59)> y cuya descripciôn 11©-
vamos a cabo extensamente en la Introducciôn de la Tesis. El hecho de
que estas sustancias solamente sean activas en las valoraciones biold
gica s "in vitro", y sus efectos no se alteren por la presencia de los
antisueros especificos anti-insulina, nos lleva a admitir,qu© dichas
sustancias no estan relacionadas con los componentes inmunorreactivos
descritos,
Por otra parte, si admitimos la posibilidad que el componente que
Elliot y col, (llO) aislaron del suero de enfermes diabéticos juveni
les no tratados con insulina, y al que denominaron "insulina anormal",
pueda ©star relacionado con el componente "big insulina".
De todo lo anteriormente expuesto es lôgico deducir que, nuestros
hallazgos abren un nuevo campo en el conociniento de la fisiologia de
la insulina y probablemente de la diabetes. Respecte al componente "mi
ni insulina", aunque numerosos estudios en cuanto a su naturaleza, bio
logie, fisiologia y patologia, son necesarios, la importancia de nuevos
hallazgos cientificos vione determinada por las nuevas vias que se abren
al conocimiento de la regulaciôn de la sintesis y secreciôn de insulina;
y en este sentido creeraos que el componente "mini insulina" cumplirâ
ampliamente estes requisites.
206
RESUÏvIEN Y COÎICLUSIONES.
1,- En esta Tesis Doctoral, se ha realizado por primera vez un estu
dio conjunto do los aspectos cuantitativos y propiedades cualita-
tivas de la insulina circulante en situaciones expérimentales en
las que hasta la fecha, no se hahia tenido en cuenta la presencia
en la sangre de otras proteinas diferentes de la verdadera insuli
na, pero capaces de reaccionar con los antisueros especificos anti-
insulina, y por tanto valorahles por las técnicas radioinmunolo-
gioas,
Hemos llevado a cabo el estudio en sangre de la vena porta del
conejo, con el fin de analizar la hormona directamente secretada
por las células p del pâncreas,
2,- Para poder efectuar este estudio, fué necesario en primer lugar el
desarrollo y montaje de una técnica radioinmunolégica de gran sen-
sibilidad y precisién, capaz de detectar las muy bajas concentracio
nes en que se encuentran los componentes insulinicos del plasma.
La técnica desarrollada es "una modificacién del método original
208
de Yalo^7 y Serson", consistente en: l) Marcaje de la insulina con I
2) Purificaoiôn do la hormona maroada por oromatografia en geles de sephadex G-50. 3) Separaciôn del oomplejo formado por la insulina-125 125I - anticuerpo de la insulina-I libre, por cromatografia en
papel ïïhatman^^T a temperatura ambiente,
3.- Hemos enoontrado que en la sangre portai del oonejo, la insulina en- dôgena valorada por el radioinmunoensayo como componente ûnico, se
puede separar en tres fracciones 6 componentes que presentan carac—
teristicas cromatogrâficas propias, y capacidad inmunolôgica Trente
a los antisueros especificos anti-insulina,
Dos de estos componentes son similares a los descritos por Roth
en humano8 con los nombres de "big insulina" y "little insulina",
respectivamente, El tercer componente que aparece consistentemente,
se describe por primera vez en esta Tesis Doctoral. Este nuevo com
ponents, por las caracteristicas cromatogrâficas que présenta ha si
do denorninado tentâtivamente "mini insulina",
4*~ En nuestro sisteraa experimental, el componente "big insulina" mues-
tra caracterîsticas oromatogrâficas e inrnunolôgicas anâlogas a las
que présenta la "proinsulina" cristalizada de origen pancreâtico,
por lo que podemos concluir de acuerdo con Roth, Lazarus y Melani
209
entre otros, que este componente représenta al precursor biosinté
tico de la insulina, y probablemente a las llamadas "formas inter-
medias",
5.- El componente "little insulina", por sus caracterîsticas cromato-
grâficas e inrnunolôgicas semejantes a las de la insulina cristaliza
da de origen pancreâtico, corresponde a la hormona verdadera y/ô a
insulina que ha sufrido ligéras modificaciones (deamidaciôn), pero
que conserva intactas sus capacidades biolôgica e inmunolôgica,
6,- El componente "mini insulina", por sus caracterîsticas cromatogrâ-
ficas corresponde a un material de un peso molecular aproximadamente
de 3000 a 3500, aunque no podemos excluir otras propiedades taies como mayor ô mener asimetria de la molécula y que pueden influir
en su patron cromatogrâfico,
Por su capacidad para reaccionar con los antisueros especificos
anti-insulina, este material nos hace sospechar que contiens una
gran parte de la estructura intacta de la molécula de la insulina.
7#- Con el antisuero especîfico anti-insulina de porcino (Lote K 9223)
utilizado en nuestro sistema de trabajo, la "proinsulina" cristali—
zada de origen porcino, présenta un grade de reacoiôh inmunolôgica
de un 45 ^ aproximadamente de la capacidad presentada por la insuli-
210
na de bovino. El "péptido C" do origen porcino apareoe iner
te, no mostrando capacidad de reacoiôn con el antisuero anti-insu
lina,
8,- De nuestros resultados podemos sugerir que, el components "mini in
sulina" no corresponde al "péptido C" circulante en la sangre del
conejo. Al raismo tiempo conviens indicar que, dicho "péptido C" no
se détecta en nuestro sistema experimental.
9#-' "l'Iini insulina" es un componente normal en àlgunas preparaciones
comerciales de insulina cristalizada, donde représenta de un 2 a 4 ^
del material iniriunorreactivo, Tambien el componente "big insulina"
estâ presents correspondiendo do un 4 a 6 de la proteina total.
10.- Los tres componentes inmunorreactivos descritos, "big insulina",
"little insulina" y "mini insulina", circulan en la sangre portai
de conejos normales, y son segregados por el pâncreas en respuesta
a la administraciôn de estlmulos insulinogénicos,
11.- En condiciones basales (ayuno de 24 horas), el porcentaje del com
ponente "big insulina" estâ ligeramente elevado, indicando que, en
esta situaciôn experimental una pequena cantidad del material inmu-
norreactivo corresponde al precursor biosintético de la insulina.
211
El ajmno prolongado por si solo, no altera los valores poroentua-
les del componente "big insulina", que se muestran anâlogos a los
encontrados en las condiciones basales,
El porcentaje de "big insulina" tambien permanece sin alteracio-
nes despues de la estimulaciôn con glucagôn, glucosa intravenosa,
secretina y pancreocimina; elevandose moderadamente a los diez mi
nutos de la estimulaciôn con tolbutamida,
Los valores porcentuales del componente "big insulina" se pre-
; sentan considerablemente elevados a los 45 y 90 minutos de la administraciôn intragâstrica de glucosa,
12,- Ya que el mayor déterminants de la presencia en la sangre del com
ponents "big insulina" parece ser, el tiempo transcurrido desde la
estimulaciôn de la secreciôn de insulina, podemos admitir de acuer—
do con Gorden y col, que, por analogie al papel que représenta la
"proinsulina" en la biosîntesis de la insulina, cuando se estimula la
secreciôn de la hormona, la mayor parte de la insulina segregada
inmediatamente corresponde a la hormona que ha sido sintetizada an
teriormente y que existe depositada en los grânulos de secreciôn de
las células |3 • Al mismo tiempo tambien se estimula la sîntesis de
insulina de tal manera que, con el tiempo, la hormona segregada re
presents material recion sintetizado.
212
13*— El componente "little insulina", représenta, el raayor porcentaje de
la hormona que circula en las condiciones "basales y en el ayuno pro-
longado; observândose en este ûltimo caso, una disminuciôn general
de las concentraciones absolutas de insulina inmunorreactiva.
Los valores porcentuales de "little insulina" permanocen sin al-
teraciones despues de la estimulaciôn con glucagôn y glucosa'intra
venosa, encontrândose li^peramente disminuidos a los diez minutos de
la estimulaciôn con tolbutamida. La administraciôn de pancreocimina
produce una disminuciôn del componente "little insulina" en los ani
males que estan en ajmno de 24 horas, pero este componente aparece
con porcentajes normales en los conejos sometidos a un ayuno de 48 horas.
Los valores porcentuales de "little insulina" aparecen conside
rablemente disminuidos despues de la administraciôn de secretina y
glucosa oral; en estos casos, solamente un 50 ^ de la hormona circulante corresponde a "little insulina",
14*- En nuestras condiciones expérimentales podemos concluir admitiendo que, tanto en condiciones basales y de ayuno prolongado, como des
pues do la estimulaciôn con glucagôn, tolbutamida, glucosa intrave
nosa y pancreocimina, la presencia en la sangre de los componentes
"big insulina" y "mini insulina" no alteran significativamente los
213
valores de insulina total aportados por las técnicas radioinnunolé-
gicas de rutina, siendo "bastante aproximados los valores de "little
insulina" y las concentraciones absolûtes de la hormona circulante.
En las condiciones expuestas, la mayor parte de insulina circulante
corresponde pues, a "little insulina", es decir, a insulina que con
sidérâmes inmunolégica y biologicamonte activa,
15,- "Mini insulina", es el tercer componente que circula normalmente en minimas cantidades en la sangre de la vena porta de animales en con—
diciones basales, Tanto el ayuno prolongado como la estimulaciôn con
glucagôn, tolbutamida y glucosa intravenosa, no alteran los valores
porcentuales del componente "mini insulina".
En el ayuno de 24 horas, la administraciôn de pancreocimina
elevô significativamente el porcentaje de "mini insulina", que por
otra parte, aparece normal cuando los animales estân sometidos a un
ayuno prolongado,
Los valores porcentuales de "mini insulina" aparecen considerable
mente elevados despues de la estimulaciôn con secretina y glucosa oral,
16,— Parece bastante probable que, la secretina sea el estîmulo mas importante y eficaz en la secreciôn del componente "mini insulina",
El hecho que la glucosa oral, en contraste con la glucosa intra-
2 1 4
venosa eleve el porcentaje del componente "mini insulina" apoya la
observacion de Chisholm y col., indicando que la secretina puede ser
un mediador en la respuesta pancreâtica a la administraciôn oral de
la glucosa.
17.— La importancia fisiolôgica del nuevo componente descrito en esta Tesis depends en parte de su naturaleza y propiedades biolôgicas. El es
tudio de ambos puntos comprende nuevas lineas de investigaciôn quo
quedan abiertas para el futuro.
Sin embargo, la falta de efecto hipoglucémico que acompana a los
elevados porcentajes del componente "mini insulina" que circula en san
gre como respuesta a la estimulaciôn con secretina, nos hace pensar
en las siguientes posibilidades: l) Quo el componente "mini insuli
na" corresponda a hormona biologicamente inactive. 2) Que el compo
nente "mini insulina" no favorezca la oaptaciôn do glucosa por los
tejidos periféricos, aunque puede aotuar a otros niveles del méta
bolisme intermediario. 3) El componente "mini insulina" puede ac
tuar alterando Ô bloqueando alguna de las acciones de la insulina
sobre las células.
2 1 5
C0FCIU3I0M GE'BRAI,.
Los resultados descritos en esta Tesis Doctoral, ponen abierta-
mente en duda la espeoificidad de las técnicas radioiniriunolégicas en
la determinacién de la insulina, en sangre, Ciertaraente, no es la in
sulina la ûiiica proteina circulante capaz de reaccionar con los anti—
sueros especificos anti-insulina,, existen por lo menos otros dos corn—
ponentes que a su vez comprenden diferentes proteinas, que pueden ser
valorados en el radioinmunoensayo de rutina, Esto hace bastante proba
ble, que los altos niveles de insulina inmunorreactiva (IRI) que se han
obsorvado en los estadios iniciales de la diabetes méllitus y de otras
enfermedades que entran dentro de la denominacién general de "estados
résistantes a la insulina", se deban a la presencia en la sangre de
estas diferentes proteinas inmunorreactivas, Por esta razén, una vos
mâs, creernos necesario senalar y recordar la importancia de llevar a
cabo una revisién compléta de la'fisiopatologia de la secreoién de la
hormona pancreâtica, para poder interpreter a la luz de los conocimientos
actuales, la significacién de los valores de insulina inmunorreactiva (
(iHl) publicados previamente. En este sentido presentan un interes muy
particular el estudio de la diabetes inellitus, el ayino prolongado,
la obesidad, el embarazo etc,,,; es decir, aquellas situaciones que
2 16
so caraoterizan por presenter una intolerancia a la glucosa acompa
nada de concentraciones de insulina en sangre normales 6 de hiperin-
sulinismo.
2 1 7
BIBLIOGRAPIA
(1) Banting P.O. and Boat C,H, - J* Lab, Clin, I'ed, 7, 251, 7^4
(1921 - 1922)
(2) Abel J.J. - Science 66, 307 (1927)
(3) Sanger P. - Ciba Foundation Colloquia on Endocrinology vol,
19, p. 110 (1956)
(4) Mco l D.S. and Smith L.P, - Nature I87, 483 (1960)(5) Smith L.P, cited by Young P,G, - Brit, Fed, J* II, 1449 (I96I)(6) Cellhorm E,, Feldman J, and Allen A, - Endocrinology 29, 137
(1941)(7) Rafaelsen 0,J, - Rep, IV Kong, Inter, Diab, Federation, Geneve
p, (1961)(8) Gemmill C,L, - Bull. Johns Hopkins Hosp, 66, 232 (1940)
(9) Groen J,, Kaminga C.E,, Willebrands A.F, and Bliokman J,R, -
J, Clin, Invest. 31, 97 (1952)
(10) Vallance-Owen J. - Rep, III Kong. Intern, Diab, Peder. Dllsse1-
dorf 1958 p. 587(11) Randle P.J. - Brit. Fed. J , 1, 1237 (1954)
(12) Perlmutter K,, Weisenfeld S, and Pufson P. - Endocrinology 50,/u# (1952)
(13) Kralh P.P. and V/ool I.G. - Abstr, IVth, Intern,Cong. Biochem,
Vienna, abstr 9, 4, 102 (1958)
(14) Wright P.H. - Biochem. J. 71, 633 (1959)
(15) Manchester E.L., Handle P.J. and Young P.G. - J. Endocrino.
19, 2;# (1959)
(16) Metz H. - Diabetes 89 (I96O)
(17) Vallance-Owen J, and Lukens P.D. - Endocrinology 60, 625 (1957)
(18) Castrillon A.M., Garcia-Pernandez F.C., Candela H.R. and Can
dela J.L.R. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 109, 172 (1962)
(19) Hausberger P.X., Milstein S.?/. and Hutman E.J. - J. Biol. Chem.
208, 431 (1954)
(20) Steelman S.L., Oslapas R. and Busch R.D. - Proc. Soc. Exp.
Biol. Med. 105, 595 (i960)
(21) Beigelman P.M. - Metabolism 9, 5^0 (I96O)
(22) Ramseier E.3., Proesch E.R., Bally P. and Labhardt A. - Rep.
IV Kongr. Intern, Diab, Geneve p,643 (196I)
(23) Ball E.G. and Merrill M.A, - Endocrinology 69, 596 (196I)
(24) Cahill G.P., Leboeuf B. and Renold A,E. -J. Biol, Chem. 234,
2540 (1959)
(25) Martin D.B., Renold A.E. and Dagenais Y.M. - Lancet 2, 76
(1958)
(26) Leonards J.B., Landau B.R, and Bartsoh G. - J. Lab, Clin, Med,
60, 552 (1962)
(27) ïïgdahl R.K, and Goldberg H. - Surgery Gyneo. Obstr. 114, 202
(1962)(28) Samaan N.A., Dempster W,J., Eraser R,, Please N,W, and Still
man D, - J. Endocrin, 24, 263 (1962)
(29) Renold A.E., Martin D.B,, Dagenais Y,M,, Steinke J,, Nicker
son R.J. and Shops M, - J. Clin. Invest. 39, 14&7 (I96O)
(30) Kirsky I.A. and Perisutti G. - Biochem. Biopliys. Acta 50, 603
(1961)
(31) Renold A.E., Zahnd G., Jeanrenaud B, and Boshell B.R. - Ann.
N.Y. Acad. Soi. 74, 490 (1959)
(32) Haurowitz P, - "Chemistry and Biology of Protein" p. 284. Aca
demic Press. Nev/ York 1950
(33) Lowell P.C. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 50, I67 (1942)
(34) Lerman S. - Am. J. Med. Sol. 207, 354 (1944)
(35) Moloney P.J, and Coval M. - Biochem. J. 59, 179 (1955)
(36) Person S.A.m Yalow R.S., Bauman A., Rothschild M.A. and Newerly
K. - Northwest Med. 55, 541 (1956)
(37) Person S.A,, Yalow R.S., Bauman A., Rothschild M.A. and Newe3>-
ly K.- J. Clin. Invest. 35, 170 (1956)
(38) Arquilla E.R. and Stavitsky A.B. - J. Clin. Invest. 35, 458
(1956)
(39) Person S.A., cited in Levine R. and Anderson E.- "Resume of
Conference on Insulin Activity in Blood and Tissue Fluids",
May 9, p. 7 1957. Natl, Inst, Health Bethezda, Maryland 1957
(40) Persons,A. and Yalow R,S, - Advances in Biol, Med, Phys, 6,
349 (1958)
(41) Person S.A, and Yalow R.S, - Ann. IT. Y, Acad. Soi. 82, 338
(1959)
(42) Person S.A. and Yalow R.S. - "Hormones in Plasma" H.IT. Anto-
niades ed.) p. 86, Little, Brovm, Massachusetts i960
(43) Person S.A. and Yalow R.S, - In Ciba Foundation Colloquia on
Endocrinology vol. I4, Inmunoassay of Hormones, Churchill,
London p. 182 (1962)
(44) Morgan C.R. and Lazarow A.- Diabetes 12, 115 (1963)
(45) Yalow R.S. and Berson S.A. - J. Clin. Invest. 39, 1157 (i960)
(46) Yalow R.S. and Berson S.A. — Amer. J, Med, 31, 882 (I96I)
(47) Crodsky C. F,, Peng C.T, and PorshamP.H. - Arch. Biochem. Bio-
phys. 81, 264 (1959)
(48) Randle P.J. - Ciba Foundation Colloquia on Endocrinology vol.
11 p. 115 Churchill, London.
(49) Willebrands A.F., V. d. Geld H. and Groen J. - Diabetes 7,
119 (1958)
(50) Hales C.N. and Randle P.J,- Lancet 1, 200 (1963)
(51) Groen J., V. d. Geld H., Bolingen R. and Willebrands A.F. -
Diabetes 7, 272 (1958)
(52) Gundersen K. and Antoniades H.N, - Proo. Soc, Exp, Biol. Med.
104-, 411 (i960)
(53) Vallance-Ovven J, - Rep, III Kongr. Intern, Diab, Feder, Düssel
dorf 1958 p. 605
(54) Lov/y C., Blanchard C. and Phear D. - Lancet 1, 802 (196I)
(55) Vallance-Owen J,, Dennes E, and Campbell P.K, — Lancet 2, 596
(1958)(56) Vallance-Owen J. and Lilley M,D. - Lancet 1, 804 (196I)
(57) Ensink J, and Vallance-Owen J. - Diabetes 12, 353 (1963)
(58) Ramseier E,B,, Froesch E.R,, Bally P, and Labhart A.— Med.
Hyg. 20, 643 (1962)
(59) Froesch E.R,, Bürgi N., Ramseier E.B,, Bally P, and Labhart A. —
J. Clin. Invest. 42, I816 (1963)
(60) Slater J.D., Samaan IT.A., Fraser R. and Stillman D. - Brit.
Med. J. 1, 1712 (1961)
(61) Proesch E.R., Bürgi H. and Müller W.A. - Proc. Symp. on the
Transport, Pounction of plasma Proteins. Paris 1965 Elsevier
(Amsterdam: ) p. 75 (1966)
(62) Bürgi' H., Müller W.A..,,Hummel R.E., Labhart A. and Froesch E.R. -
Biochem. Biophys Acta 121, 349 (I966)
(63) Samaan M.A., Fraser R. and Dampster J.W. — Diabetes 12, 339
(1963)
(64) Lyngsoe J,, Adams L.C., Creep J.M. and Field R.A. — Acta Endoc.
54, 141 (1967)
(65) Kopetz K#, Bürgi H., Froesch E.R, and Schwarz P. - Biabetolo-
gia 2, 104 (1966)
(66) Sam.ols E. - Inmunochemical aspects of Insulin, In "On the Na
ture and Treatment of Diabetes", p. 227. Editors Leibal B.S.
and Wrensha11 G.A. ICS 84. Excerpta Kedica, Amsterdam (I965)
(67) Antoniades H.N., Bougas J.A. and Pyle H.M. - New. Engl. J.
Med. 267, 218 (1962)
(68) Antoniades H.N., Gunderson K. and Pyle H.M. - Endocrinology
69, 163 (1961)
(69) Gunderson K. - Diabetes 11, 69 (1962)
(70) Antoniades H.N. - Endocrinology 68, 7 (I96I)
(71) Antoniades H.N., Bougas J.A., Camerini-DavaIs R. and Pyle H.
M. - Diabetes 13, 230 (1964)
(72) Antoniades H.N.j Huber A.M., Boshell R.B., Saravis C.A. and
Gershoff S.N. - Endocrinology 76, 709 (1965)
(73) Gundersen K. and Lin B.J. - Diabetes I4, 805 (I965)
(74) Alp H. and Recant L.- J. Clin. Invest. 44, 870 (I965)
(75) Davidson J.K. and Haist R.E, - Lancet 2, 656 (1963)
(76) Alp H, and Recant L. — I'etabolism 13, 609 (l9o4)I
(77) Lingsoe J. - Acta Hed. Scand, 174, 5^9 (1963)
(78) Lingsoe J. - Acta lied. Scand. 175, 401 (1964)
(79) Taylor K.W. and Randle P.J. - J. Endocri. 19, 221 (1959)
(80) Ditschneit H., Cuendet R, and Pfeiffer E.P. - Path. Biol. 12,
148 (1964)
(81) Beigelman P.H. and Onoprienko 1.3* - Diabetes 8, 438 (1959)
(82) Glieman J. - Diabetes 14, 643 (I965)
(83) Lyngsoe J. and Lundbaek K. - Acta Med. Scand. I80, 677 (1966)
(84) Lyngsoe J. - Acta Med. Scand. Suppl. 476, 43 (1967)
(85) Bürgi H., Ramseier E.B., Proesch E.R., Bally P. and Labhart
A. - Helv, Med, Acta 29, 527 (1962)
(86) Berson S.A. and Yalow R.S. - Amer. J. Med. 40, 676 (1966)
(87) Steinke J. and Soeldner J.S. - In Leibel Wrenshall; The Natu
re and Treatment of Diabetes ^Exoerpta Medica. Amsterdam p.
213 (1965)
(88) Sarnols E. - Lancet 1, 462 (I965)
(89) Sarnols E. and Marks V. — Lancet 2, 700 (I966)
(90) Armin J., Graut R.T. and Wright P.H. - J. Physiol. (London)
153, 146 (I960)
(91) Armin J,, Graut R.T. and Wright P.H. - J. Phj’-siol. (London)
153, 146 (I960)
(92) Humbel R.E. - Proo. Natl. Acad. Soi. USA 53, 853 (1965)
(93) Lazarow A. — Recent, Progr. Kormon. Res. 19, 489 (1963)
(94) Steiner D.E. and Oyer P. - Proc. Natl. Acad. Soi. USA 57, 473
(1967)
(95) Steiner D.F., Cunninghan D., Spigelman L. and Aten B. - Scien
ce 157, 697 (1967)
(96) Clark J. and Steiner D.P. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62,
278 (1969)
(97) Steiner D.E., Clark J.L., Nolan D., Rubenstein A.H., Aten B.,
Oyer P.E.- Recent. Progr. Norm. Res. 25, 207 (1969)
(98) Tung A.K. and Yip C.C. - Biabetologia 4, 68 (1968)
(99) Steiner D.F. - Trans. N. Y. Acad. Sol. 30, 60 (I967)
(100) Steiner D.F.&hd Clark J. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 622
(1968)(101) Chance R.E., Ellis R.M. and Bromer V/.W. - Science I6I, I65
(1968)
(102) Rubenstein A.H., Cho S., and Steiner D.F. - Lancet 2, 1353
(1968)
(103) Steiner D.F., Hallund 0., Rubenstein A.H., Cho S and Bayliss
C. - Diabetes 17, 725 (1968)
(104) Melani P., Rubenstein A.H., Oyer P.E. and Steiner D.F. - Proo.
Natl. Acad. Sci. USA 67, I48 (1970)
(105) Glieman J, and Moody A.J. - Cited by Rubenstein A. H. and col.
- Lancet 2, 1353 (1968)
(106) Weiss L. and Narahana H.T, - Cited by Rubenstein A.H. and col.
- Lancet 2, 1353 (1968)
(107) Comunicacidn personal de Novo Company, Copenhagen, Denmark
(108) Roth J., Gorden P. and Pastan I, - Proc. Natl. Acad. Sci. USA
61, 138 (1968)
(109) Lazarus N.R., Tanese T., Gutman R, and Recant L. — J. Clin.
Endocr. 30, 273 (1970)
(110) Elliot R.B., 0 Brien D and Roy C.C. - Diabetes 14, ?80 (I965)
(111) O'Brien D., ShapcottD. and Roy C.C. - Diabetes I6, 572 (I96J)
(112) No Intyre N., Holdsworth C.D. and Tui‘ner D.S. - Lancet 2, 20
(1964)
(113) Mo Intyre N., Holdsworth C.D. and Turner D.S. - J. Clin. Endoc.
25, 1317 (1965)
(114) Dupré J. - Lancet 2, 672 (1964)
(115) Candela J.L.R., Candela R.R., Martin-Hernandez D.,and Casilla
Cortazar. - In Proc. IV Congres, of the Intern. Diabet. Peder.
Geneve, vol Ip. 629 • Editions Medecine et Hygiene Geneve I96I
(116) Sarnols E., Marri G. and Marks V. - Lancet 2, 415 (I965)
(117) Me Intyre N. - Proo. 6th Intern. Congress. Diabetes Federation
Stockholm I967. Intern. Cogress, n 172 p 425. Excerpta Fed.
Pound, Amsterdam (I969)
( 118) Bleld A. and Kraus R, - V/ien Klin, TZochschr 9, 55 (I896)
(119) y/oodyatt R.V., Sansum W.D. and Vfilder R.F, - J, Amer, Fed,
Assoc, 65, 2067 (1916)
(120) Lennox W.G. - J. Biol, Chem. 73, 237 (1927)
(121) Koehler A.E. and Hill E. - J. Biol. Chem. 123, LXX (1938)
(122) Scow R.O, and Cornfield J. - Amer. J. Physiol, 179, 435 (1954)
(123) Fc Intyre N., Turner D.S. and Holdsworth C.D. - Diahetologia
1, 73 (1965)
(124) Elrick ÎT., Stimmler L., Hlad C.J. and Arai J. - J. Clin, Endoc.
14, 1076 (1964)
(125) Marks V. and Samols E. - "Journées annuelles de Diabetologie
de 1'Hotel Dieux", p 179. Editions Fedicales Flammarion. Paris
(1969)
(126) Seltzer R.J. and Fc Neff J. - Clin. Res. 15, 138 (19^7)
(127) Samols E., Tyler J., Marks V. and Fiable P. - Proc. 3rd Inter.
Congr. Endocrinol. Mexico City. Intern, Congress. Ser. n I84
p 206 Excerpta Fed. Found. Amsterdam I969
(128) Dupré J., Curtis J.D., Waddell R.W. and Beck J.C. - Lancet 2,
28 (1968)
(129) Ajdukiewiez B., Keane P.F., Pearson J., Read A.E. and Salmon P.
R. - Lancet 1, 92 (1968)
(130) Jorpes J.E. and l'utt V. - "The Hormones" ( G. Fincus, K.V.
Thimann and Astwood E.B., Edi.) vol 4 P 365* Academic Press,
New York (I964)
(131) Harper A,A. - "Handbook of Physiology" ( An Physiology Soc.
J. Field. Sect, 6 vol 2 p 969. Williams & Wilkins, Baltimore,
Marj^land 196?)
(132<J Loev/ E.R., Gray J.S. and Ivy A.C. - Ame. J. Physiol, 129, 659
(1940)
(133) Mutt V. and Jorpes J.E, - Recent. Advan, Horm, Hess, 23, 483
(1967)
(134) Jorpes J.E. and Mutt V. - Acta Physiol, Scand. 66, 316 (I966)
(135) BodanszkyM., Ondetti M.A., Levine S.D., Narayanan V.L., v.
Saltza M., Sheehan J.T., Williams N.J. and Sabo E.P. — Chem.
& Ind (London) p 1757 (1966)
(136) Pfeiffer E.P., Telib M., Ammon J., Melani P, and Bitsohuneit
H. - Biabetologia 1, I3I (I965)
(137) Turner D.S. - Diahetologia 5, 57 (I969)
(138) Buchanan K.D., Vance J.E., Morgan A, and Williams R.H. - Dia-
betologia 4, 376 ( abstr, 1968)
(139) Lazarus S.S., Shapiro S. and Volk B.W, - Diabetes 17, 152 (I968 )
(140) Guidouz-Grassi L, and Felber J.P. - Diahetologia 4, 391 (1968)
(141) Dupré J,, Rojas L., White J.J., Unger R.H. and Beck J.C. -
Lancet 2, 26 (1966)
(142) Unger R.H,, Ketterer H,, Dupré J. and Eiaentraut A.M. - J. Clin
Invest, 46, 630 (1967)
(143) Deckert T. - Acta Endocrinolofm/ 57, 578 (1968)
(144) Botterraam P., Schwarz K,, Pore11 M.H., Stanhlheber H. and
Souvatzoglou A. - Klin. Woohschr 45, 52 (1967)
(145) Nelson J.K,, Rabinowitz D, and Kerimee T.J. - Nature 215, 883
(1967)
(146) Jarret R.J, and Cohen N.H. - Lancet 2, 861 (1967)
(147) Dupré J., Curtis J.D., Waddell R.W. and Beck J.C. - Proo. 3rd
Intern. Cong, Endocr. Mexico City 1968.- Congress. Ser. n I84
p 202. Excerpta Fed. Pound. Amsterdam (I969)
(148) Young J.D., Lazarus L. and Chisholm D.J. - lancet 2, 914 (1968)
(149) Wang C.C. and Grossman F.I. - Amm. J. Physiol. I64, 527 (1951)
(150) Ramirez E,, Hubei K.A, and Klifton J.A. - Amm. J. Physiol.
211, 260 (1966)
(151) Jorpes J.E. - Gastroenterology 55, 157 (1968)
(152) Ijazarus N.R., Voyles N.R.', Tanese T., Devrim S. and Recant L. -
lancet 2, 248 (1968)
(153) Malaisse W.J. and î-alaisse-Lagae P. - Proc. 2nd Capri Conf.
1968 p 47 Casa éditrice "II Ponte" Milan (I968)
(154) Pfeiffer E,F, and Telib H. - Proo. 2nd Capri Conf. I968 p 30
Casa editrioe "II Ponte" Milan (I968)
(155) Dupré J, and Beck J.C. - Diabetes 15, 555 (1966)
(156) Bojms D.R., Jarrett R.J. and Keen H. - Brit. Med. J. 2, 676
(1967)
(157) Keade R.C., Kneububler H.A., Schulte W.J. and Barboriak J. -
Diabetes 16, I4I (1967)
(158) Ohneda A., Parada E., Eisentraut A.M.and Unger R.H. - J. Clin.
Invest. 47, 2305 (1968)
(159) Rabinowitz D., Merimee T.J., Maffezzoli R. and Burgess J.A. -
Lancet 2, 454 (1966)
(160) Floyd J.C., Fajans S.S., Conn J.W., Knopf R.F. and Rull S. -
J. Clin. Invest, 45, 1479 (1966)
(161) Sukkar M.Y., Hunter W.M. and Passmore R. - Lancet 2, 1020 (1967)
(162) Baylis E.M., Greenwood P., James V., Konkins J., London J.,
Marks V. and Samols E. - Proo. Symp. Growth Hormone, Milan
1967. Intern. Congr. Ser. n I58 p 89. Excerpta Med. Pound.
Amsterdam (I968)
(163) Lucea C., Garrido H. y Parrilla R, - Rev, Iber. Endocr. 93,
223 (1969)
(164) Jorpes J.E. and Mutt V. - Cited by Unger R.H. J. Clin. Invest.
46, 630 (1967)
(165) Sorr.ogyi K, - J. Biol. Chem. l60, 6l (1945)
(166) Nelson N. - J. Biol. Chem, 153, 375 (1944)
(167) Lâzaro-î'Tartinez E., Comez A coho J, and Parrilla R. - Rev. Espan'
Fisiol, 26, 21 (1970)
(168) Greenwood F,C., Runter W. and Glover J.S, - Biochem J, 89, 114
(1963)
(169) Berson S.A. and Yalow R.S. - Ann, N. Y. Aca, Sci. 70, 56 (1957)
(170) Zaline E. and Knowles H.C, Jr. - Diabetes I4, I65 (I965)
(171) Samols Ei Marri G. and Marks V, - Diabetes I5, 855 (1966)
(172) Chisholm D,J,, Young J.D, and Lazarus L. - J. Clin. Invest.
48, 1453 (1969)(173) Lerner R.L. and Porter D, Jr. - J, Clin, Invest. 49, 2276 (1970)
(174) Blackard W.G., Nelson N.C. - Diabetes 19, 302 (1970)
(175) Gorden P. and Roth J. - Arch, Intern, Fed, vol 123, 237 (1969)
(176) Melani F,, Rubenstein A.H. and Steiner D.F. - J. Clin. Inves.
49, 497 (1970)
(177) Sherman B.M., Gorden P., Roth J, and Freychet P. - J. Clin.
Invest. 50, 849 (1971)
(178) Goldsmith S.J., Yalow R.S. and Berson S.A. - Diabetes 18, 834
(1969)
(179) Rubenstein A.H., Clark J.L., Folani F. and Steiner D.F. -
Nature 224, 697 (1968)
Engl. J. Med. 283, 713 (1970)
(194) Rudman D. and Del Rio A.E. - Endocrinology 85, 2144 (19^9)
(195) Meade R.C., Kneuhuhler H.A., Barboriak J.J, and Schulte 7/.S, -
Diabetes 18, 397 (19^9)
(196) Horino M., Machlin L.J., Hertelendy P. and Kipnis H.D. - En
docrinology 83, 118 (1968)
(197) Ku2Tu.ya T,, Kanazawa Y and Kosaka K. - Metabolism I5, 1149 (1966)
(198) Zierler K.L. and Rabinowitz D. - J. Clin. Invest. 43, 950 (I964)
(199) Gross G., BUber V., Felber J.P. and Fagnenat P. - Biabetologia
6, 47 (1970)
(200) Vanotti A., Hadjikhani H., Easel J., Guidoux L. and Felber J.
P. - Amor. J. Proctol. 20, 68 (I969)
(201) Hinz F., Katsilambros N., Schweitzer B., Raptis S. and Pfeiffer
E.P. -Biabetologia 7, 1 (1971)
(202) Goberna R,, PussgSnger R.D., Raptis S., Telib H. and Pfeiffer
E.P. - Biabetologia 7, 68 (1971)
(203) Bttber V. and Felber J.P. - Horm. Met. Res. 3, 61 (1971)
(204) Young J.D. and Carpenter P.H. - Fed. Proc. I8, 201 (1959)
(205) Kemmler W., Clark J. and Steiner D.F. - Diabetes 19 ( suppl l)
358 (1970)(206) Sorensen R.L., Steffes M.V/., Linda 11 A.V/. - Endocrinology 86,
88 (1970)
(207) Howell S.L., Kostiariovsky F, and Lacy P.E, - J, Cell, Biol,
42, 695 (1969)
(208) Logothetopoulos J. *- Diabetes 15, 823 (1966)
(209) Steiner D.F. - N. Engl. J. Fed. 280, 1106 (1969)
(210) Haist H.R, - in "On the Nature and Treatment of Diabetes".
Leibel B.S. and VTrenshall C.A. editors. Excerpta Fedica Found,
Amsterdam 12 (1965)
(211) Creutzfeldt V/.C., Creutzfeldt C., Frerchs H., Perings E. and
Sikinger K. - Horm. Fetab. Res. 1, 53 (1969)
(212) Puls W. and Kroneberg G. - Biabetologia 5, 325 (1969)
(213) Lazarus N.R,, Penhos J.C., Tanese T., Michaels L., Gutman R.
and Recant L. - J. Clin. Invest. 49, 487 (1970)
(214) Eraegen E.W., Chisholm B.J., Young J.D. and Lazarus L. - J.
Clin, Invest. 49, 524 (1970)
(215) Chisholm D.J., Lazarus L., Young J.D. and Eraegen E. - Diabe
tes 19, 365 (suppl 1) (1970)
![insulino resistenza copia - Omeoweb – [Omeo]Web …omeoweb.com/documenti/biblioteca/insulinoresistenza.pdfSviluppo del Diabete di tipo II SINDROME METABOLICA INSULINO RESISTENZA](https://static.fdocuments.net/doc/165x107/5c69fa6b09d3f27a7e8bf484/insulino-resistenza-copia-omeoweb-omeoweb-del-diabete-di-tipo-ii-sindrome.jpg)