Comment pourrait on obtenir un nouveau recombinant Myxo-VHD.
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Comment pourrait on obtenir un nouveau
recombinant Myxo-VHD
Virus de la Myxomatose 2OO nmADN double brin161 773 Paires de bases
Virus de la VHD
40 nm
ARN simple brin
7437 bases
VHD 125 fois moins volumineux que celui de la myxo
Virus pathogène de la VHDStructure déterminée aux rayons X .
• La capside que l’on voit est uniquement constituée d’une même protéine repétée plusieurs fois (VP60, 579 aminoacides).
• Le code est à l’intérieur sous la forme du brin d’ARN de 7437 b.
VHD souche Pascal Harlaud
• 1/ Foie de lapin mort de la VHD envoyé par Pascal Harlaud.
2/ Extraction de l’ARN viral
broyage,centrifugation,
purification
3/ Transcription en ADN
Le code VHD est un ARN simple brin. (7437b)
Il est fragile.
Nous l’avonstraduit en ADNdouble brin, plusstable pourl’étudier et lemodifier.
ReverseTranscriptase-PCR
4/ Lecture du code ADN
a) description du code (4 lettres A, T, C, G)
Code ADN
à
Double brin
b) Lecture du code
Rouge = T
Noir = G
Vert = A
Bleu = C
Code des 7437 pb de l’ADN complémentaire du virus VHD Pascal H.
Nous avons
• Identifié et isolé la seule partie du code qui exprime la protéine VP60.
En rouge les1737 pb du gène de la VHD codant pour la VP60
Travaux réalisés pour cloner le géne de laVP60Travaux réalisés pour cloner le géne de laVP60
Genome viral completExtrait du foie d’un lapinEnvoyé par Pascal.
Vecteurs de clonage Bluescript II(plasmides) DNA 3000 PbCapables de vectoriserles DNA
Ligation de l’ ADN du génomeavec le vecteur de DNA
plasmide recombiné
Incorporation dans une bacterie
Multiplication du plasmide par la bactérie. Et extraction du plasmide. (nous avons maintenant cet objet)
fraction du génomeCorrespondant à la VP60
P.VP60
Géne de la Thymidine kinase
PCR
TK Gauche TK Droit
K1L
LacZpiv86
K1L LacZ
Génome RHDV
pTG2131
pTKLacZ pTKVP60
Digestion
Constructions des vecteurs de transfert OK.
Nous ne sommes pas allés vers le recombinant. (1 an de travail supplémentaire si on veut)
P7.5
P7.5 promoteur
VP60
TK
TK
TK TK
K1LpromoteurLacZ donne gal
Digestion
P.VP60
pTKPBluescriptII
Nous avons cet objet Nous avons cet objet
Génome du virus de la Myxo (BE4)
161 773 bp