CLONAMIENTO DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL: TLR1, TLR22, …
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Profesor Patrocinante Dr. Jaime Figueroa Instituto de Bioquímica y Microbiología Facultad de Ciencias
CLONAMIENTO DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL: TLR1, TLR22, TLR5 DE MEMBRANA Y TLR5 SOLUBLE EN Salmo salar.
ANÁLISIS DE SU EXPRESIÓN EN CÉLULAS SHK-1 INFECTADAS CON P. salmonis
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico
CAROLINA CONSTANZA SALAZAR RIVERA
VALDIVIA – CHILE 2011
“La ciencia de vivir
es el arte de amar”
Para mis padres, Ximena y Hector.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Jaime Figueroa por su ayuda, guía, apoyo y comprensión en todo momento y también creo
poder decir por su amistad. A los chicos del Laboratorio BMP: Tamy, Clara, Adolfo por estar
siempre que necesitaba alguna ayuda o apoyo. A Lorenza, Mary, Barbara, Andres, Alexei,
Guillermo, Matias, Profe. Gudy por la buena onda y amenas conversaciones que hacían que los
días fueran más que sólo rutina. A Denise por ser mi mentora en el laboratorio, por tu buena
onda, amistad, paciencia y disposición desde mis inicios en el laboratorio y por estar siempre
presente, ayudándome y apoyándome.
A los chicos del PPT, Karlita, Negro, Victor, Claudio, todos en general y al Dr. Yáñez, por
prestarme su ayuda y conocimiento cada vez que lo necesité. Muchas Gracias por todos los
consejos y ayuda.
A la Esme, por ser como eres, una gran amiga. Gracias por todos los buenos momentos y
desahogos. A Pachi, Noe, Cristian, Pablo, Juan Pablo, Dany por su compañía y amistad durante
toda esta travesía, les deseo todo el éxito del mundo.
A mis padres por estar a mi lado apoyándome y alentándome siempre. A mi hermana por
ayudarme, apoyarme y comprenderme. A Nico por estar presente en todo momento, por las miles
de veces que me ayudaste a comprender y entender las cosas y por el apoyo constante. A la Tía
July por la constante preocupación y apoyo durante toda mi vida. A mis amigas y amigos por
estar conmigo siempre.
Al proyecto INNOVA IBM-259 por el apoyo financiero para la realización de esta tesis.
i
INDICE GENERAL
Página
1.- Resumen 1
1.1. Summary 2
2. Introducción 3
2.1. Sistema inmune de peces 3
2.2. Sistema inmune innato y sus Receptores de Reconocimiento de patógenos, 5
RRPs
2.3. Receptores tipo Toll, TLR 7
2.3.1. Activación de los TLR al reconocer su ligando 12
2.3.2. Activación de la respuesta inmune adaptativa por TLR 16
2.3.3. TLR en peces teleósteos 17
2.4. Relación TLR con Piscirickettsia salmonis 22
3. Material y Método 25
3.1. Materiales 25
3.1.1. Reactivos 25
3.1.2. Soluciones 26
3.1.3. Kits 28
3.1.4. Equipos 28
3.1.5. Software 29
3.2. Métodos 29
3.2.1. Extracción de RNA total desde tejidos de Salmo salar 29
3.2.2. Síntesis de cDNA a partir de RNA total 30
3.2.3. Clonamiento del cDNA de los receptores tipo toll TLR1, TLR22, TLR5S 30
y TLR5M de Salmo salar
ii
3.2.3.1. Amplificación de segmentos del cDNA de los receptores TLR1, TLR22, 31
TLR5S y TLR5M
3.2.3.2. Electroforesis de productos PCR en geles de agarosa 35
3.2.3.3. Ligación de los productos de PCR en vector pGEM-T easy 35
3.2.3.4. Transformación con el producto de ligación y selección de clones 35
3.2.3.5. Secuenciación de los productos de PCR clonados 36
3.2.4. Ensayo de cinética de expresión en células SHK-1 infectadas con P. salmonis 36
viva, P. salmonis inactivada, Proteínas totales de P. salmonis y LPS.
3.2.4.1. Siembra de células SHK-1 36
3.2.4.2. Cuantificación de las células SHK-1 37
3.2.4.3. Infección con P. salmonis viva 37
3.2.4.4. Cuantificación de P. salmonis 37
3.2.4.5. Extracción de proteínas totales de P. salmonis 38
3.2.4.6. Inactivación de P. salmonis 38
3.2.4.7. Verificación de P. salmonis 39
3.2.4.8. Infección con LPS 39
3.2.5. Análisis de las cinéticas de expresión por RT-qPCR 39
3.2.6. Desarrollo de sueros policlonales 43
3.2.6.1. Determinación de péptidos idóneos para la inmunización de animales 43
3.2.6.2. Conjugación de péptidos a hemocianina de Concholepas concholepas 43
3.2.6.3. Inmunización de conejos 43
3.2.6.4. Obtención de sueros inmunes 44
3.2.6.6. Ensayo Dot Blot 44
3.2.7. Extracción de proteínas de membrana 44
3.2.7.1. Cuantificación de proteínas 45
iii
3.2.8. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes 45
3.2.9. Western Blot 46
4. Resultados 47
4.1. Clonamiento de los receptores tipo Toll (TLR): TLR1, TLR22, TLR5 de 47
membrana (TLR5M) y TLR5 soluble (TLR5S)
4.1.1. Clonamiento del receptor TLR1 48
4.1.2. Clonamiento del receptor TLR22 55
4.1.3. Clonamiento del receptor TLR5M 62
4.1.4. Clonamiento del receptor TLR5S 69
4.2. Desarrollo de sueros policlonales 76
4.2.1. Determinación de péptidos para la inmunización 76
4.2.2. Evaluación de los sueros obtenidos 81
4.3. Cinéticas de expresión utilizando RT-qPCR 84
4.3.1. Evaluación de la cinética de expresión de TLR 91
4.3.1.1. Evaluación de TLR5M 92
4.3.1.2. Evaluación de TLR5S 92
4.3.1.3. Evaluación de TLR1 95
4.3.1.4. Evaluación de TLR22 97
4.3.1.5. Evaluación de TLR9 97
4.3.1.6. Evaluación de IL-1β 100
4.3.1.7. Evaluación de Myd88 102
5. Discusión 104
5.1. Clonamiento y caracterización de TLR1, TLR22, TLR5M y TLR5S 104
5.1.1. TLR1 105
5.1.2. TLR22 105
iv
5.1.3. TLR5 de membrana 106
5.1.4. TLR5 soluble 106
5.2. Anticuerpos 107
5.3. Cinéticas de expresión 108
5.3.1. Elección de normalizador 108
5.3.2. Evaluación de cinéticas por receptor 109
5.3.2.1. Cinética de expresión de TLR5M 110
5.3.2.2. Cinética de expresión de TLR5S 111
5.3.2.3. Cinética de expresión de TLR1 112
5.3.2.4. Cinética de expresión de TLR22 113
5.3.2.5. Cinética de expresión de TLR9 114
5.3.2.6. Cinética de expresión de IL-1β 115
5.3.2.7. Cinética de expresión de Myd88 116
5.3.3. Evaluación de las cinéticas por desafíos de infección 117
5.3.3.1. Infección causada por P. salmonis viva 117
5.3.3.2. Infección causada por proteínas totales de P. salmonis 117
5.3.3.3. Infección causada por P. salmonis inactivada 118
5.3.3.4. Estimulación causada por LPS 118
6. Bibliografía 120
v
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1 Estructura de un Receptor Tipo Toll, TLR 9
Figura 2 Esquema de asociación entre adaptadores y factores de transcripción 15
en la señalización de TLR
Figura 3 Esquema representativo de las moléculas de señalización de TLR 21
descubiertas en peces
Figura 4 Ubicación de los partidores en la secuencia de trucha y producto de 49
PCR para el receptor TLR1 en salmón
Figura 5 Secuencia nucleotídica del receptor TLR1 en salmón (Salmo salar), 50
n° de acceso HQ664666.1
Figura 6 Análisis de la secuencia aminoacídicas del receptor TLR1 de salmón 52
Figura 7 Alineamiento entre salmón, trucha y humano para TLR1 53
Figura 8 Alineamiento múltiple de TLR1 en peces 54
Figura 9 Ubicación de los partidores en la secuencia de trucha y producto de PCR 56
para el receptor TLR22 en salmón
Figura 10 Secuencia nucleotídica del receptor TLR22 en salmón (Salmo salar), 57
n° de acceso HQ664669.1
Figura 11 Análisis de la secuencia aminoacídica del receptor TLR22 en salmón 59
Figura 12 Alineamiento entre salmón y trucha del receptor TLR22 60
Figura 13 Alineamiento múltiple de TLR22 en peces 61
Figura 14 Ubicación de los partidores en la secuencia de trucha y producto de PCR 63
para el receptor TLR5M en salmón
Figura 15 Secuencia nucleotídica del receptor TLR5M en salmón (Salmo salar) 64
n° de acceso HQ664667.1
vi
Figura 16 Análisis de la secuencia aminoacídica del receptor TLR5M 66
Figura 17 Alineamiento entre salmón, trucha y humano para TLR5M 67
Figura 18 Alineamiento múltiple de TLR5M en peces 68
Figura 19 Ubicación de los partidores en la secuencia de trucha y producto de PCR 70
para el receptor TLR5S en salmón
Figura 20 Secuencia nucleotídica del receptor TLR5S en salmón (Salmo salar) 71
n° de acceso HQ664668.1
Figura 21 Análisis de la secuencia aminoacídica del receptor TLR5S 73
Figura 22 Alineamiento entre salmón y trucha para TLR5S 74
Figura 23 Alineamiento múltiple de TLR5S en peces 75
Figura 24 Péptido elegido y su ubicación en la representación de TLR1 77
Figura 25 Péptido elegido y su ubicación en la representación de TLR22 78
Figura 26 Péptido elegido y su ubicación en la representación de TLR5 79
Figura 27 Ensayo de Dot-Blot para la titulación de los sueros inmune anti 82
TLR1, TLR22 y TLR5
Figura 28 Western-Blot de proteínas de membrana de órganos de Salmo 83
Salar para la detección de TLR1, TLR22 y TLR5
Figura 29 PCR convencional a β-actina de cDNA de cinética de expresión 85
con P. salmonis viva
Figura 30 Curva de disociación para cada juego de partidores 87
Figura 31 Curva de disociación utilizando templados de Cinética de expresión 88
con P. salmonis viva
Figura 32 Curvas de amplificación para los genes normalizadores, β-actina y EF-1a 90
Figura 33 Cinéticas de expresión del receptor TLR5M 93
Figura 34 Cinéticas de expresión del receptor TLR5S 94
vii
Figura 35 Cinéticas de expresión del receptor TLR1 96
Figura 36 Cinéticas de expresión del receptor TLR22 98
Figura 37 Cinéticas de expresión del receptor TLR9 99
Figura 38 Cinéticas de expresión del receptor IL-1β 101
Figura 39 Cinéticas de expresión del receptor Myd88 103
viii
INDICE TABLAS
Páginas
Tabla I TLR en mamíferos, sus ligandos, localización y señalización 10
Tabla II TLR en peces teleósteos: especies que los poseen y ligandos descritos 18
Tabla III Resumen de partidores utilizados para el clonamiento de TLR5S, 32
TLR22, TLR5M y TLR1
Tabla IV Tm y producto esperado de los juegos de partidores utilizados para 34
clonación.
Tabla V Resumen de partidores utilizados para RT-qPCR y secuencia 41
referencia
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
BSA albúmina de suero de bovino
DAB diaminobencidina
DAMP patrones moleculares asociados a daño
EDTA ácido etilendiamino tetracético
EGTA ácido etilenglicol-bis (β-aminoetileter)-N,N,N,N-tetracético
Ig Inmunoglobulina
IL interleuquina
IFN interferon
LPS lipopolisacárido
LRR regiones ricas en leucina
LRR-CT regiones ricas en leucina C-terminal
MHC complejo mayor de histocompatibilidad
PAMP patrones moleculares asociados a patógenos
PBS tampón fosfato salino
PMSF fosfometilsulfonilfosfato
RIA Respuesta inmune adquirida
RII Respuesta inmune innata
RRP Receptor de Reconocimiento de Patrones
TCR receptor de células T
TIR dominio del receptor Toll/IL-1
TLR receptores tipo Toll
Temed N, N, N´, N´-tetrametildiamina
Tris tris (hidroximetil) aminoacetato
SDS dodecil sulfato de sodio
1
1. RESUMEN
El Sistema Inmune Innato es la primera barrera de defensa de los organismos frente a los
patógenos, en este sistema, los patógenos son reconocidos por diversos receptores, entre los
principales están los Receptores tipo Toll, TLR. Los TLR reconocen Patrones Moleculares
Asociados a Patógenos, PAMPs. Cada TLR es capaz de reconocer uno o varios PAMPs de
diversos patógenos, como virus o bacterias, y desencadenar una Respuesta Inmune Innata contra
ellos, además de activar y dirigir una Respuesta Inmune Adaptativa contra los patógenos en el
organismo hospedero. En peces teleósteos se han descrito algunos TLR y además se han
descubierto TLR específicos de peces.
Piscirickettsia salmonis (P. salmonis) es uno de los patógenos que causa fuerte mortalidad en las
especies salmonídeas cultivadas en Chile. El mecanismo de reconocimiento de las células blanco,
de invasividad y los tipos de respuesta generada, son hasta ahora desconocidos. Se estudiaron
algunos de los TLR en el tiempo, involucrados en la respuesta inmune de salmón ante la
infección de P. salmonis viva, P. salmonis inactivada, Proteínas totales de P. salmonis y LPS,
usando la línea celular SHK-1 como modelo. Para ello se clonaron parcialmente los receptores
TLR1, TLR22, TLR5 de membrana y TLR5 soluble, y se analizaron sus cinéticas de expresión
mediante RT-qPCR ante las distintas infecciones. Además se desarrollaron sueros policlonales
dirigidos a segmentos específicos de estos TLR, detectándose por Western Blot.
Con los resultados obtenidos se puede concluir que Salmo salar expresa los receptores TLR1,
TLR22, TLR5 de membrana y TLR5 soluble. Los que modulan su expresión dependiendo de la
forma de exposición de P. salmonis. Además TLR1 y TLR22 logran estimular su expresión
frente al patógeno indicando que reconocen algún PAMPs.
2
1.1. SUMMARY
The innate immune system is the first line of defense of organisms against pathogens, in this
system, pathogens are recognized by different receptors, the principal are the Toll-like receptors,
TLR. TLR recognize pathogen-associated molecular patterns, PAMPs. Each TLR can recognize
one or more PAMPs of different pathogens, such as viruses or bacteria, and trigger an innate
immune response, in addition to activating and directing an adaptive immune response against
pathogens in the host organism. In teleost fish some TLR were described and some TLR were
discovered specifically in fish.
Piscirickettsia salmonis (P. salmonis) is one of the pathogens that cause high mortality in
salmonid species cultivated in Chile. The mechanism of recognition of target cells, invasiveness
and type of response generated, are still unknown. We studied some of the TLR in time, involved
in the immune response of salmon to infection by live P. salmonis, inactived P. salmonis, total
proteins of P. salmonis and LPS, using the salmon head kidney SHK-1 cell line as a model. For
this we partially cloned receptors TLR1, TLR22, membrane TLR5 and soluble TLR5, and
analyzed their kinetics of expression by RT-qPCR to the above mentioned infections. Also
polyclonal serums directed against specific segments of these TLR, were generated and
characterized by Western blot analyses.
These results clearly showed that Salmo salar expresses TLR1, TLR22, membrane TLR5 and
soluble TLR5, which modulate their expression depending on the exposure to P. salmonis.
Additionally an increase of expression of TLR1 and TLR22 in response to infection was
observed, indicating that S. salar recognized some PAMPs.
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1. Sistema Inmune en peces
El sistema inmune lo poseen todos los vertebrados, incluidos los peces teleósteos, para
defenderse de los diversos patógenos a los que se ven enfrentados diariamente. Se han
desarrollado mecanismos para identificar estos agentes patógenos, diferenciándolos de los
componentes propios del organismo, y así poder eliminarlos (Collado et al., 2008). La defensa
por el sistema inmune se basa en dos respuestas: La Respuesta Inmune Innata (RII) y la
Respuesta Inmune Adquirida (RIA). Debido a que la inmunidad adquirida no ocurre
inmediatamente en respuesta a un antígeno o patógeno nuevo, este retardo en la respuesta podría
tener un efecto devastador en el hospedero, las respuestas innata y adquirida están coordinadas,
de tal forma que la respuesta inmunitaria innata representa el proceso inicial e instructor en la
defensa del hospedero en mamíferos (Bautista et al., 2005). En peces teleósteos, al ser
organismos poiquilotermos, cuando se encuentran a temperaturas muy bajas no son capaces de
activar adecuadamente algunas funciones inmunitarias adaptativas, como la producción de
anticuerpos y una lenta proliferación de linfocitos (Rubio-Godoy, 2010). En cambio la RII es
relativamente independiente de la temperatura (Magnadóttir, 2006).
La RII es la primera línea de defensa que controla los primeros pasos de la respuesta inmune en
organismos multicelulares, es capaz de discriminar entre una variedad de patógenos y lo propio,
deduciéndose que no es completamente no específica como se pensaba (Randon-Barragan, 2009).
La habilidad de reconocer rasgos comunes a los patógenos más frecuentes sin necesidad de haber
estado previamente expuestos a los mismos (Rubio-Godoy, 2010), genera una respuesta inmune
4
más rápida que RIA (Randelli et al., 2008), respuesta que carece de memoria inmunológica y que
sus componentes humorales y celulares juegan un importante papel en activar e instruir la RIA
(Imler et al., 2004; Janeway et al., 2002). La RIA desencadena una respuesta de manera
específica para cada patógeno, por lo tanto es más lenta que RII y además posee la capacidad de
crear memoria inmunológica (Rubio-Godoy, 2010); su respuesta puede ser humoral, mediada por
anticuerpos, donde juegan un rol crucial los linfocitos B, o celular, mediada principalmente por
linfocitos T (Janeway et al., 2002).
Los peces teleósteos poseen elementos para ambas respuestas, RII y RIA. Los diferentes tipos
celulares que trabajan en cada sistema, conocidos en mamíferos, se han reconocido en peces
teleósteos, incluyendo células que son morfológicamente y funcionalmente equivalentes a las de
mamíferos como: neutrófilos, macrófagos, monocitos, trombocitos, células B, células
plasmáticas, células T, células natural killer y eosinófilos (Alvarez-Pellitero, 2008).
Dentro de los órganos del sistema inmune es importante recalcar que los peces teleósteos carecen
de médula ósea o nódulos linfáticos, y la producción de células sanguíneas (hematopoyesis) se da
principalmente en el riñón anterior, órgano en el que se localizan células madre hematopoyéticas
(Rubio-Godoy, 2010). Los órganos principales del sistema inmune en peces teleósteos son el
timo, el bazo y el riñón (Alvarez-Pellitero, 2008; Rubio-Godoy, 2010; Zapata et al., 2006). El
riñón anterior posee similitudes morfológicas con la médula ósea de vertebrados superiores, ya
que también sirve como un órgano linfoide secundario y se ha visto que está implicado en la
eliminación de antígenos que están en circulación, además de ser el principal sitio de producción
de anticuerpos. El bazo ha sido implicado en la eliminación de antígenos y complejos inmunes de
la circulación sanguínea, también tiene un papel en la presentación de antígenos y el inicio de la
5
RIA. El timo puede ser considerado como agregación de macrófagos que procesan la
proliferación de células T (Alvarez-Pellitero, 2008). El riñón anterior y el bazo son reconocidos
como órganos linfoides secundarios (análogos a los ganglios linfáticos de los mamíferos),
órganos donde se localizan poblaciones de macrófagos y linfocitos capaces de iniciar una RIA
(Rubio-Godoy, 2010).
La RII comprende tres mecanismos defensivos: la inflamación, fagocitosis y la citotoxicidad no
específica (Rubio-Godoy, 2010). La fagocitosis en particular es de importancia en la inmunidad
innata y también en la adquirida por la presentación de antígenos derivados de patógenos
fagocitados y procesados por los fagocitos (Randelli et al., 2008). Las células efectoras son los
neutrófilos y macrófagos entre otras; además los macrófagos colaboran con los linfocitos por
medio de la presentación antigénica y secreción de citoquinas (Rubio-Godoy, 2010).
La RIA de los peces teleósteos se compone de subpoblaciones de linfocitos, análogas a los
linfocitos B y T de los mamíferos. Los linfocitos B presentan inmunoglobulinas (Ig), pero un
repertorio más limitado que los mamíferos, de clase IgM, IgD, IgT e IgZ (Rubio-Godoy, 2010;
Alvarez-Pellitero, 2008). Un aspecto importante es que la RIA conduce a una producción más
rápida y abundante de anticuerpos tras una exposición secundaria al mismo antígeno (Alvarez-
Pellitero, 2008; Pancer et al., 2006).
2.2. Sistema inmune innato y sus Receptores de Reconocimiento de Patrones, RRPs
La RII, mediada por sus células, tiene la importante decisión de responder o no frente a un
microorganismo en particular, está decisión está a cargo de un limitado número de receptores de
reconocimiento codificados genéticamente, los Receptores de Reconocimiento de Patrones, RRPs
(Akira et al., 2006; Janeway et al., 2002), los que tienen a su cargo el reconocimiento de un gran
6
número de posibles patógenos (Aderem et al., 2000). Las células de RII que expresan RRPs son
macrófagos, células dendríticas, mastocitos, neutrófilos, eosinófilos, células NK entre otras
(Janeway et al., 2002). La inmunidad innata inicia los mecanismos de defensa inmediatos
basados en reconocimiento no clonal de los componentes microbianos usando una variedad de
RRPs. Estos RRPs reconocen Patrones Moleculares Asociados a Patógenos, PAMPs y también
Patrones Moleculares asociados a Daño, DAMPs, que son estructuras endógenas liberadas de
tejidos dañados (Randon-Barragan, 2009). Todos los RRPs poseen 3 características comunes, las
que son: 1) Reconocen PAMPs; 2) Son expresados constitutivamente por el hospedero y pueden
detectar al patógeno independiente del ciclo de vida en el que se encuentre; 3) Son codificados en
el genoma, no clonales, expresados en todas las células de un tipo celular, independientes de
memoria inmunológica y dan lugar a distintas respuestas contra patógenos (Akira et al., 2006).
Los PAMPs se caracterizan por ser: i) Estructuras moleculares que sólo están presentes en
patógenos microbianos, no se encuentran en el organismo hospedero. Esta propiedad permite
discriminar entre lo propio y no propio; ii) Estructuras moleculares que son esenciales para la
supervivencia de los patógenos. Sus mutaciones son letales para el patógeno, por ejemplo LPS
(Moreno et al., 2003); iii) Son estructuras compartidas por un gran número de patógenos, lo que
permite que un número limitado de receptores pueda reconocer una gran variedad de patógenos.
Esta información permite identificar el tipo de patógeno que está invadiendo y permite evaluar el
tipo de respuesta contra él (Medzhitov et al., 2000; Bautista et al., 2005).
Los RRPs se pueden encontrar en la membrana celular, en compartimentos dentro de la célula
(Medzhitov et al., 2000) o pueden ser secretados al torrente sanguíneo y fluidos de tejidos
(Janeway et al., 2002). Sus funciones son: i) opsonización de la bacteria o virus por fagocitosis,
7
además de producción de mediadores de la inflamación, con el fin de impedir la diseminación del
patógeno antes de que se desarrolle la inmunidad adquirida (Moreno et al., 2003); ii) captación de
agentes patógenos por los fagocitos y células dendríticas; iii) activación de las vías de
señalización que dan lugar a la inducción de la transcripción de genes de respuesta inmune, tales
como los péptidos antimicrobianos y citoquinas inflamatorias (Medzhitov et al., 2000; Akira et
al., 2006).
Dentro de los RRPs que se expresan en las células del sistema inmune innato se pueden nombrar
el receptor de manosa de macrófagos (Janeway et al., 2002), receptores tipo RIG-1, receptores
tipo NOD (dominio de oligomerización de unión a nucleótidos) (Kumar et al., 2009), los
Receptores Tipo Toll, TLR (Randon-Barragan, 2009) entre otros.
Los peces teleósteos poseen varios RRPs que están envueltos en la respuesta inmune a patógenos.
Cuatro tipos principales de RRPs han sido descritos, hasta la fecha, en peces teleósteos: TLR,
receptores tipo NOD, receptores tipo-C de lectina, proteínas de reconocimiento de peptidoglican
(Boltaña et al., 2011).
2.3. Receptores Tipo Toll, TLR
Los TLR se encuentran en vertebrados e invertebrados (Imler et al., 2004), son glicoproteínas
transmembranas tipo I, con tamaños moleculares entre 90-115 kDa. Se distinguen por poseer: un
dominio extracelular. El que posee varias Regiones Ricas en Leucina, llamadas LRR, y una
característica Región Rica en Leucina en C-terminal, llamada LRR-CT; y un dominio
intracelular, dominio del receptor Toll/IL-1, llamado dominio TIR, por su homología con el
dominio citoplasmático del receptor de IL-1(Akira et al., 2006; Takano et al., 2010).
8
Las LRRs se encuentran en tándem y consisten en 20-40 aminoácidos de largo, los que contienen
una secuencia consenso de 10 aminoácido, XLXXLXLXXN, característica de las LRR en todos
los TLR (Matsushima et al., 2007; Bell et al., 2003). Además de una secuencia consenso que
sigue a la anterior, XɵXXɵXXXXFXXLX (ɵ corresponde a un aminoácido hidrofóbico), que
sólo la poseen algunas LRR en los TLR. En estas secuencias consenso, inserciones o
irregularidades que en ellas se presenten serían importantes para la unión de cada TLR con su
ligando. Las LRRs en su conjunto forman una estructura tipo “herradura” para el dominio
extracelular del receptor (Bell et al., 2003). También contienen una secuencia consenso, la LRR-
CT, LxxLxLxxNP(F/L)xCxCxxxx (F/L)xxxx, importante para mantener el dominio extracelular
cerca de la membrana plasmática (Matsushima et al., 2007; Bell et al., 2003). El dominio TIR
posee tres regiones funcionales de importancia: box1, box2 y box3 que son conservados en los
TLR de mamíferos y en peces teleósteos (Takano et al., 2010), importantes en la interacción con
proteínas de señalización. El esquema de un TLR se puede observar en la Figura 1.
Los TLR son expresados en células como: neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células
epiteliales mucosas, células B, células T, células trofoblásticas, plaquetas y células
megacariocíticas (Randon-Barragan, 2009; Takano et al., 2010). Se han identificado 21
miembros de TLR en distintas especies (Palti, 2011), de los cuales 10 han sido identificados en
humanos (Kawai et al., 2010; Randon-Barragan, 2009). En la Tabla I se muestra un resumen de
los TLR que se han encontrado en mamíferos junto con los PAMPs que reconocen cada uno de
ellos.
Los TLR una vez activados (al unir su ligando) funcionan en forma de dímeros, ya sean
homodímero o heterodímeros. El TLR2 forma heterodímeros ya sea con TLR1 o con TLR6, se ha
9
Figura 1: Estructura de un Receptor Tipo Toll, TLR. A) Esquema de los dominios
característicos de un TLR. En la región extracelular, LRR: Regiones Ricas en Leucina; TM:
Región transmembrana; En la región intracelular, Dominio TIR (Dominio citoplasmático del
receptor IL-1/Toll). B) Esquema basado en la cristalización del heterodímero TLR1-TLR2 de
humano. En verde y rojo representación de los TLR1-TLR2; en rojo ligando sintético para el
heterodímero; La unión del ligando promueve la dimerización de los dominios TIR (Figura 7 de
Jin et al, 2007).
10 Tabla I: TLR en mamíferos, sus ligandos, localización y señalización.
TLR Localización Ligando Exógeno Ligando Endógeno Expresión
celular
Co-
receptor
Adaptador Factor de
transcripción
Efector
TLR1 Membrana
plasmática
Triacil-Lipopéptidos; factores solu-
bles; Modulina
NC MN; NT;
LB; NK
Heterodímer
o TLR2-1
TIRAP;
Myd88
NF-ƙB Citoquinas
inflamatorias
TLR2 Membrana
plasmática
Lipoproteínas/lipopéptidos; Pepti-
doglican; Ácido lipoteitoico; Pori-
nas; Lipopolisacáridos atípicos;Fac-
tores solubles; Glicolípidos; Protei-
na A membrana externa; Glicoino-
sitolfosfolípidos;Proteínas de es-
tructura viral; Hemaglutininas;Zy-
mosan; Lipoarabinomanano
HSP60; HSP70;
HSP96;HMGB1; Ácido
hialurónico
MN;NT ;
DC; LC
CD36;
RP105
TIRAP;
Myd88
NF-ƙB Citoquinas
inflamatorias
TLR3 Endolisosoma ssRNA; dsRNA mRNA CD; NK MD2;
CD14; LBP;
RP105
TRIF NF-ƙB;
IRF3,7
C.
inflamatorias
; tipo I IFNs
TLR4 Membrana
plasmática
LPS; HSP60 bacterino; Proteínas
envoltura viral; Proteínas fusión
viral; Glicoinositolfos-folípidos;
Taxol
HSP22-60-70-96; HMGB1;
β-defensin2 ; Fibronectina;
Ácido hialurónico ; Heparan
sulfato; Fibrinógeno
MN; CE;
NT; CD
Heterodímer
o TLR6-2
TIRAP;
Myd88;
TRAM;
TRIF
NF-ƙB;
IRF3,7
Citoquinas
inflamatorias
; tipo I IFNs
11 Continuación Tabla I
TLR Localización Ligando Exógeno Ligando Endógeno Expresión
celular
Co-
receptor
Adaptador Factor de
transcripción
Efector
TLR5
Membrana
Plasmática
Flagelina NC MN; CD; LT Myd88 NF-ƙB Citoquinas
inflamatorias
TLR6 Membrana
Plasmática
Diacil-lipopéptidos; Ácido
lipoteitoico; Zymosan
NC MN; CD; LB TIRAP;
Myd88
NF-ƙB Citoquinas
inflamatorias
TLR7 Endolisosoma ssRNA (Virus) RNA endógeno LC; CD; LB Myd88 NF-ƙB; IRF7 C. inflamatorias;
tipo I IFNs
TLR8 Endolisosoma ssRNA(Virus) RNA endógeno LC; CD; LT Myd88 NF-ƙB; IRF7 C. inflamatorias;
tipo I IFNs
TLR9 Endolisosoma Motivos CpG no metilados DNA endógeno MN; CD, LB;
NK
Myd88 NF-ƙB; IRF7 C .inflamatorias;
tipo I IFNs
TLR10 Extracelular NC NC LB NC NC NC
TLR11 Membrana
Plasmática
Molécula tipo profiling ;bacteria
uropatogénica
NC NC Myd88 NF-ƙB Citoquinas
inflamatorias
NC: No se conoce; MN: Monocitos; NT: neutrófilos; CD: células dendríticas; LC: leucocitos; CE: células endoteliales; NK: células
Natural Killer; LB: linfocitos B; LT: linfocitos T; C. inflamatorias: Citoquinas inflamatorias: TNF-α, IL1β, etc. Basado en
Manavalan et al, 2011; Moreno et al, 2003; Janssens et al, 2003; Kumar et al, 2009.
12
reportado en mamíferos que la dimerización con uno o con otro depende del reconocimiento de
distintos PAMPs; por ejemplo, se ha visto que el heterodímero TLR1-TLR2 reconoce
lipoproteínas triacetiladas, en cambio el heterodímero TLR6-TLR2 reconoce lipoproteínas
diacetiladas de bacterias. También se ha reportado que algunos TLR necesitan de moléculas
accesorias para mediar a un reconocimiento eficiente y así poder ejercer su función, tal es el caso
de TLR4 que necesita de CD14 y MD2 para el reconocimiento de LPS en mamíferos (Takano et
al., 2010).
El reconocimiento de los PAMPs por los TLR ocurre en varios compartimientos celulares, como
la membrana plasmática, endosomas, lisosomas y endolisosomas (Kawai et al., 2010). TLR3,
TLR7, TLR8 y TLR9 son expresados en vesículas intracelulares como endosomas y retículo
endoplasmático, en cambio otros como TLR1, TLR2, TLR4 y TLR6 son expresados en la
membrana plasmática. La apropiada localización celular de los TLR es importante para la
accesibilidad al ligando, requiriendo internalización a la célula de algunos de ellos, para mantener
la tolerancia a las moléculas propias como ácidos nucleicos (Kawai et al., 2010).
2.3.1. Activación de los TLR al reconocer su ligando
Una vez que los TLR se activan, se ha sugerido que los dímeros formados por los TLR
desencadenan la señalización induciendo dimerización de los dominios TIR, lo que provee una
plataforma para el reclutamiento de las proteínas adaptadoras de la cascada de señalización
(O´neill et al., 2007; Jin et al., 2007). Existen dos grandes baterías de genes que son activados
por los TLR: genes inflamatorios y genes de respuesta a interferón (IFN). Un ligando particular
va a desencadenar una, otra o ambas respuestas (Purcell et al., 2006).
13
Al reconocer su ligando el TLR recluta en su dominio TIR diversos adaptadores que contienen el
dominio TIR, las interacciones entre TIR-TIR inician la señalización de los TLR. Los
adaptadores que se han descrito, hasta el momento, en mamíferos son Myd88 (Factor de
diferenciación mieloide 88), TIRAP (Proteína adaptadora con un dominio TIR), TRIF (Adaptador
con dominio TIR que induce IFN-β), y TRAM (Molécula adaptadora relacionada a TRIF)
(Kumar et al., 2009). Las diferentes respuestas de los TLR a sus ligandos, puede explicarse en
parte por el uso selectivo de estas proteínas adaptadoras. Las cascadas de señalización
involucradas, finalmente activan los factores de transcripción: NF-ƙB, AP-1 e IRFs. NF-ƙB
regula la expresión de genes de citoquinas inflamatorias, como por ejemplo IL-1β, IL-2, TNF-α e
IL-12 entre otras (Tripathy et al., 2006) y quimioquinas como MCP-1 (Pasare et al., 2004). AP-1
regula la expresión de TNF-α e IL-6 entre otras, además de moléculas coestimuladoras, como
CD80 y CD86 en células dendríticas (Randon-Barragan, 2009). Se ha visto la activación de los
factores de transcripción IRF3 e IRF7 activan la transcripción de IFNβ e IFNα respectivamente
(Kumar et al., 2009). En la Tabla I un resumen de las moléculas involucradas para la señalización
en los TLR descritos en mamíferos
En un comienzo sólo fue descrita Myd88 como proteína adaptadora, por lo que las vías de
señalización se nombraron como dependiente o independiente de Myd88:
Vía Dependiente de Myd88: Es utilizada por todos los TLR menos el TLR3. La estimulación de
TLR por su ligando recluta Myd88 a su dominio TIR lo que desencadena una cascada de
señalización que finaliza con la activación de los factores de transcripción AP-1, por medio de la
activación de MAPK y NF-ƙB, por medio de la fosforilación de IƙB (Kumar et al., 2009; Takeda
et al., 2005). Se ha descubierto que TIRAP actúa como adaptador entre el dominio TIR y Myd88,
14
siendo esencial para la activación de esta vía en los receptores TLR2 y TLR4 en mamíferos
(Takeda et al., 2005; Janeway et al., 2002). Los receptores TLR7, TLR8 y TLR9 activados, en
células dendríticas aumenta la transcripción de IFN tipo 1 a través de la activación del factor de
transcripción IRF7 (Kumar et al., 2009; O´neill et al., 2007).
Vía Independiente de Myd88: También llamada Vía dependiente de TRIF. La inician TLR3 y
TLR4 activados, desencadenando una inducción en la transcripción de citoquinas
proinflamatorias e interferones tipo I, mediante la activación de los factores de transcripción
IRF3 y NF-ƙB (Kumar et al., 2009). En mamíferos, TRAM participa selectivamente en la
activación de esta vía en TLR4 pero no en TLR3 (Takano et al., 2010) actuando como proteína
adaptadora a TRIF. En la Figura 2 se observa un esquema representativo de cada vía.
La regulación negativa de las respuestas de TLR es importante para la detención de la
inflamación. Hasta el momento se han descubierto diversas moléculas que ayudan a regular de
forma negativa la respuesta inmune generada por los TLR en distintos niveles. Dentro de estas
moléculas se incluyen a varias moléculas empalme de los adaptadores y sus proteínas
relacionadas, ligasas de ubiquitina, deubiquitinasas, reguladores transcripcionales y microRNA
(Kawai et al., 2010). Tollip (proteína que interactúa con Toll) fue el primer inhibidor descubierto,
limitando la activación de NF-ƙB en los receptores TLR2 y TLR4 (Rebl et al., 2010).
15
Figura 2: Esquema de asociación entre adaptadores y factores de transcripción en la
señalización de TLR. Se observan los distintos adaptadores usados para las vías de señalización
Dependiente e Independiente de TIR; Myd88, TIRAP, TRIF y TRAM. Vía Dependiente de
Myd88, se observa como ejemplo los receptores todos los TLR menos TLR3 y TLR2. Vía
Independiente de Myd88, se observa TLR3. TLR4 es capaz de activar ambas vías. La activación
de cada una de ellas logra la activación de diferentes factores de transcripción: NF-ƙB, AP-1,
IRF3, IRF7, que ingresan al núcleo, excepto AP-1que es activado dentro del núcleo, y activan la
transcripción de distintas moléculas de la respuesta inmune.
16
2.3.2. Activación de la respuesta inmune adaptativa por TLR
La fagocitosis, junto con el producto de los genes activados por los TLR, instruyen el desarrollo
de la inmunidad adaptativa, relacionando así a los TLR con esta última. La activación de los TLR
en las células presentadoras de antígenos (APC), como macrófagos y células dendríticas, induce
la producción de citoquinas y la expresión de moléculas co-estimulatorias de superficie,
ayudando en la elaboración de la respuesta inmune adaptativa. La señalización por TLR activa
principalmente a las células dendríticas (induciendo y controlando su maduración al reconocer
algún patógeno) a promover una regulación positiva de la expresión de los MHC (necesarios para
la estimulación de linfocitos T vía TCR), de citoquinas inductoras de respuestas tipo Th-1 tales
como la IL-12 o IL-18 (Randon-Barragan, 2009; Pasare et al., 2004), y moléculas estimuladoras
como CD80, CD86 (necesarias para la expansión clonal de células T) (Abdelsadik et al., 2011).
Las células dendríticas maduras migran a los nódulos linfáticos donde presentan los antígenos a
células T vírgenes (Medzhitov, 2001), generando principalmente una respuesta tipo Th-1, que
permite activar la propiedad microbicida de los macrófagos e induce a los linfocitos B a producir
IgG, efectivos para la opsonización de patógenos extracelulares (Moreno et al., 2003). Algunas
citoquinas expresadas, por la activación de los TLR, son importantes para superar la supresión de
linfocitos T reguladores (Pasare et al., 2004).
Algunos TLR se expresan en los linfocito B y T activando proliferación celular, diferenciación y
afectando la memoria celular y la producción de anticuerpos (Abdelsadik et al., 2011). La
activación de los TLR en los linfocitos B induce su proliferación, expresión de moléculas co-
estimuladoras, secreción de anticuerpos policlonales e incluso la expresión de genes necesarios
para la diferenciación de células plasmáticas (Pasare et al., 2004).
17
2.3.3. TLR en peces teleósteos
Se han descubierto 17 TLR en peces teleósteos, estos pueden diferir entre especies de peces, los
cuales son: TLR1, 2, 3, 4, 5, 5S, 7, 8, 9, 13, 14, 18, 19, 20, 21, 22, 23, perdiéndose TLR6 y 10
con respecto a los humanos. La estructura de las LRRs es altamente conservada entre mamíferos
y peces teleósteos, lo que sugiere la capacidad de reconocer PAMPs similares a los reconocidos
por TLR de mamíferos (Takano et al., 2010). Además la conservación estructural de los TLR
sugiere que la regulación de la respuesta inmune es similar en peces y en mamíferos (Rebl et al.,
2010). En la Tabla II se encuentra un resumen de los TLR que se encuentran en peces teleósteos
junto con la especie en que se han descrito y los PAMPs que reconocen. En el salmón del
Atlántico, Salmo salar, se han sido descubierto hasta el momento: TLR8, 9, 13, 22a, 22b y 5
soluble (Boltaña et al., 2011).
Se han encontrado tres grandes diferencias en los TLR publicados en peces con respecto a los
mamíferos:
1) Existe una forma soluble del ortólogo TLR5 en peces y no en humanos. El TLR5S carece
de región transmembrana y dominio TIR (Rebl et al., 2010). TLR5 se ha descrito que
reconoce flagelina, un compuesto del flagelo bacteriano. La flagelina interactúa primero
con TLR5M, facilitando la expresión de TLR5S el cual sirve después para amplificar la
respuesta celular de TLR5M como un feedback positivo (Tsujita et al., 2004), guiando a
una activación fuerte del NF-ƙB en células TLR5 positivas independiente de los tipos
celulares. Esto evidencia un prototipo de inmunidad humoral que se encuentra conservada
en peces (Randon-Barragan, 2009).
18
Tabla II: TLR en peces teleósteos: especies que los poseen y ligandos descritos.
TLR Ligando Especies de peces
TLR1 Triacil-lipopéptidos T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis*2
;
TLR2 Lipopéptidos;
Lipoproteínas; Pam3CSk4
T. rubripes; D. rerio; C. carpio; T. negroviridis; P.
olivaceus; I. punctatus;
TLR3 dsRNA; poly I:C;
componentes bacterianos
T. rubripes; D. rerio; C. carpio; T. negroviridis; O.
mykiss; P. olivaceus; I. punctatus; G .rarus;
TLR4a/b NC D. rerio*1,*2
; G. rarus
TLR5M Flagelina T. rubripes; D. rerio*2
; T. negroviridis; O. mykiss; I.
punctatus
TLR5S Flagelina T. rubripes; O. mykiss; S. salar; I. punctatus;
TLR7 ssRNA T. rubripes; D. rerio; C. carpio; O. mykiss;
TLR8 ssRNA T. rubripes; D. rerio*2
; O. mykiss*2
; T. negroviridis; S.
salar;
NC: No se conoce; *1: TLR4 no está envuelto en el reconocimiento de LPS; *2: Se observa
duplicación génica. Basado en Rebl et al, 2010; Palti, 2011; Takano et al, 2010; Boltaña et al,
2011.
19
Continuación Tabla II:
TLR Ligando Especies de peces
TLR9 CpG DNA no metilado T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis; S. salar; O. mykiss;
P. olivaceus; S. aurata*2
; P. crocea*2
TLR13 NC S. salar;
TLR14 NC T. rubripes; D. rerio
TLR19 NC D. rerio*2
;
TLR20 NC D. rerio*2
; I. punctatus;
TLR21 CpG DNA no metilado T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis; I. punctatus;
TLR22 dsRNA; poly I:C T. rubripes; D. rerio; T. negroviridis; S. salar*2
; O.
mykiss*2
; C. aurata*2
TLR23 NC T. rubripes; T. negroviridis;
NC: No se conoce; *1: TLR4 no está envuelto en el reconocimiento de LPS; *2: Se observa
duplicación génica. Basado en Rebl et al, 2010; Palti, 2011; Takano et al, 2010; Boltaña et al,
2011.
20
2) No existe ortólogo de TLR4 en la mayoría de los peces. Los peces son a menudo
resistentes a los efectos tóxicos del LPS. Una explicación para la falta de respuesta a LPS
es la ausencia del gen TLR4 en la mayoría de los peces, además en los genomas que se
encuentran secuenciados de T. rubripes y T. nigroviridis, no se encontró el gen para
TLR4. Aunque se ha encontrado en G. rarus y carpa común (Palti, 2011) e incluso dos
genes para TLR4 en pez cebra, en el cual se observó que la activación de TLR4
disminuye dramáticamente la activación de NF-ƙB. Hasta el momento no se han
encontrado en ningún pez CD14 o MD2, proteínas importantes para el reconocimiento del
LPS por TLR4 en humanos (Rebl et al., 2010). Además en peces teleósteos no se ha
encontrado TRAM, proteína adaptadora importante en desencadenar la señalización
celular en respuesta a la activación de TLR4, en peces teleósteos (Takano et al., 2010).
3) Existen miembros de TLR llamados “TLR específicos de peces". Corresponden a TLR19,
20, 21, 22 y 23. Los roles de estos TLR aún no están definidos (Palti, 2011). Se cree que
TLR22 puede ser un sustituto funcional del TLR3 de humano ya que actúa contra
infecciones de virus dsRNA (Takano et al., 2010).
Se ha visto que los peces teleósteos poseen las proteínas adaptadoras, Myd88, TIRAP y TRIF,
importantes en la cascada de señalización celular que finaliza con la activación de una respuesta
inmune. TRAM no ha sido descubierto hasta el momento en ningún pez (Takano et al., 2010).
También se han descrito moléculas que componen estas cascadas de señalización y moléculas
reguladoras de estas vías en peces teleósteos. La conservación de moléculas envueltas en la
señalización de TLR sugiere que el programa básico de la regulación génica mediada por la
activación de los TLR es conservada entre especies de vertebrados (Purcell et al., 2006). En la
Figura 3 se encuentra un esquema de la activación de los TLR en peces.
21
Figura 3: Esquema representativo de las moléculas de la señalización de TLR descubiertas
en peces. Algunos TLR y moléculas importantes en la señalización a cargo de los TLR con los
respectivos peces teleósteos en los que han sido descubiertos. En cuadrado rojo se señalan los que
se han descubierto en salmón (S. salar). Esquema extraído de la Figura 3 de Rebl et al., 2010.
22
2.4. Relación TLR con Piscirickettsia salmonis.
Chile es uno de los principales países exportadores de salmones del mundo. La exportación de
salmones es una de las industrias más importantes en el sur de Chile, por lo que el estudio de la
inmunidad de los salmones frente a patógenos es primordial. Piscirickettsia salmonis es uno de
los principales patógenos que afecta los cultivos de salmón en Chile, en estos momentos es una
de las principales enfermedades que están afectando a esta industria. Por esta razón es importante
el estudio del mecanismo de acción de los principales receptores involucrados en una infección
causada por bacterias, los TLR y de esta manera poder evaluar su comportamiento y obtener
alguna información de cómo esta bacteria puede sobrevivir a la respuesta inmune.
Piscirickettsia salmonis es una bacteria gram negativa, intracelular facultativa,
predominantemente cocoide, mide entre 0,5 – 1,5 µm, inmóvil, aeróbia y comúnmente aislada de
ambientes marinos (Fryer et al., 2003). P. salmonis ha sido detectada en distintas especies
salmonídeas como salmón Coho, salmón del Atlántico, salmón del Pacífico y trucha arcoíris
(Toranzo et al., 2005). Produce la enfermedad llamada piscirickettsiosis o Síndrome Rickettsial
Salmonídeo, SRS; anualmente Chile pierde cerca de US$100 a causa de esta enfermedad
(McCarthy et al., 2008). Los signos clínicos se caracterizan por un nado errático y lento en la
superficie del agua y, al examinar los peces, se encuentran úlceras puntiformes, nódulos blancos
en la piel, un hígado con nodulaciones blancas y hemorragias petequiales (Leal et al., 2007).
Los peces tienen muchas respuestas humorales específicas y no específicas además de
mecanismos celulares que resisten las enfermedades producidas por bacterias patógenas. Para
infectar al hospedero y multiplicarse en los tejidos, los patógenos bacterianos deben pasar o
evadir esta defensa (Ellis, 1999). P. salmonis es un patógeno bacteriano por lo tanto posee
23
distintos PAMPs que pueden ser reconocidos por diferentes TLR en el salmón del Atlántico. Al
ser una bacteria gram negativa acuática posee LPS, fosfolípidos, proteínas, lipoproteínas,
peptidoglican (Boltaña et al., 2011), CpG-DNA bacteriano, también se ha descrito que posee la
proteína flagelina (Wilhelmet et al., 2006), entre otros. Estos diversos PAMPs pueden ser
reconocidos por distintos TLR como por ejemplo: TLR1 y 2 que reconocen proteínas de la pared
bacteriana, peptidoglican y lipopéptidos acetilados; TLR5 reconoce flagelina bacteriana; TLR3,
7, 8 y 9 reconocen ácidos nucleicos microbianos (Boltaña et al., 2011); también pueden actuar
algunos de los TLR específicos de peces como TLR22 y 20. Los TLR trabajan en conjunto en el
reconocimiento de un patógeno, debido a que un patógeno puede presentar más de un PAMPs
que permita su reconocimiento, por lo tanto las células pueden reconocer el patógeno por varios
TLR simultáneamente (Underhill et al., 2002).
Por otro lado es importante el estudio de la interacción de diversas formas de exposición de P.
salmonis con los TLR, lo que permitiría ayudar en la mejora de posibles vacunas en desarrollo;
Los TLR se han descrito como receptores de adyuvantes (Seya et al., 2006), por lo que incorporar
ligandos a TLR de manera preferente en una solución farmacológica, permitiría una mejora en
vacunas contra P. salmonis.
24
Dado los datos presentados, se plantea la siguiente hipótesis:
La infección causada por P. salmonis a la línea celular de salmón SHK-1 promueve una
regulación en la expresión de los Receptores Tipo Toll: TLR1, TLR22, TLR5 de membrana y
TLR5 soluble.
Como Objetivo General: Evaluar la expresión diferencial de Receptores Tipo Toll: TLR1,
TLR22, TLR5 de membrana y TLR5 soluble, en células SHK-1 infectadas con P. salmonis.
Objetivos Específicos:
1. Clonar los Receptores Tipo Toll: TLR1, TLR22, TLR5 de membrana y TLR5 soluble, en
órganos linfoides de salmón.
2. Evaluar la expresión de los receptores TLR1, TLR22, TLR5 de membrana y TLR5
soluble, mediante cinéticas de expresión, en línea celular SHK-1 infectada con P.
salmonis; P. salmonis inactivada; Proteínas totales de P. salmonis y LPS, versus línea
celular SHK-1 sin infección.
3. Inmunodetectar los receptores TLR1, TLR22, TLR5 en órganos linfoides de salmón.
25
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Materiales
3.1.1.Reactivos
Merck Winkler Invitrogen
Aceite de Inversión
Acetato de sodio
Ácido acético
Ácido clorhídrico
Acrilamida
Bicarbonato de sodio
Cloroformo
Cloruro de potasio
EGTA
EDTA
Etanol
Formaldehido
Fosfato de potasio diácido
Glicerol
Glicina
Glutaraldehido
Isopropanol
Perhidrol
SDS
Ácido bórico
Albumina de Suero Bovino
Alcohol isoamilico
Azul de bromofenol
Azul de coomasie
Borato de sodio
Chomczynski
Cloruro de sodio
Cloruro de Magnesio
Hidróxido de Sodio
Metanol
Persulfato de amonio
Reactivo de Bradford
Sacarosa
β-Mercaptoetanol
Temed
Tween-20
Eco RI
Suero bovino fetal
Syber safe
Tripsina 0,5%
Sigma
Coadjuvante de Freund
DAB
Glucosa
Inhibidor de proteasa(Mix)
PMSF
Triton X-100
X Gal
LPS
Thermo Scientific
Membrana Nitrocelulosa
Rockland Fermentas, USA.
Anti IgG de conejo unido a
peroxidasa
Marcador de peso molecular de
DNA
Marcador de masa molecular para Biosonda
26
Hemocianina proteínas
Hy Clone Cell Signaling T
L-15
Azul de tripan
RIPA
Ambion Lonza
Agua DEPC Agarosa
Promega UsBio Becton Dickinson
RNAsin
DNA polimerasa
Nucleótidos
Transcriptasa reversa
pGEM-T Easy
Oligo dT; DNAsa
Tris base
Ampicilina
IPT-G
Tinción Gram
Bacto Agar
Bacto triptona
Extracto levadura
3.1.2. Soluciones
- Buffer SB 25X: 10 mM NaOH, ajustado a pH 8 con ácido bórico
- Medio LB: Bacto-triptona 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L, NaCl 10 g/L. Autoclavado.
- Medio LB-Agar: medio LB, Bacto-agar 15 g/L. Autoclavado
- Medio Hanks modificado: NaCl 145 mM, K2HPO4 8,9 mM, Glucosa 11 mM.
- Medio SOB: bacto triptona 20 g/L; extracto de levadura 5 g/L; NaCl 0,5 g/L; KCl 2,5
mM. Autoclavado.
- Medio SOC: medio SOB, MgCl2 10 mM, Glucosa 20 Mm.
- PBS: NaCl 136.89 mM, KCl 2.68 mM, Na2HPO4 10.14 mM, KH2PO4 1.76 mM, pH 7.4.
27
- Reactivo de Bradford: Azul de Coomasie G 0,01%; etanol 4,75%; ácido fosfórico 8,5%.
- Ripa +: Tritón X100 10%; Inhibidor de proteasa Mix; RIPA; PMSF 100µM.
- Solución de bloqueo para Westernblot: PBS 1X; BSA 1%; leche descremada 5%;
Tween-20 0,3%.
- Solución de Chomczynski: Tiocianato de Guanidina 4 M; Citrato de Sodio 25mM; N-
lauril sarcosina 0,5% p/v; autoclavado y posteriormente se agregó β-mercaptoetanol
0,1M.
- Solución de desteñido para geles de poliacrilamida: Metanol 30%, Ácido Acético 7%.
- Solución de revelado: 40 mL de PBS; 30 μL de perhidrol 30% y 10 mg DAB.
- Solución de teñido para geles de poliacrilamida: Azul de Coomassie R-250 0.3%,
Metanol 50%, Ácido Acético 10%.
- Solución TES: Tris-HCl 10 mM pH 7.5; EDTA 1 mM pH 8; SDS 0.5%
- Tampón H1: Sacarosa 0,25M; EGTA 5mM; Tris- HCl pH 8, 20 mM; PMSF 100 mM.
- Tampón H2: Tris-HCl pH 7,4 50 mM; Tritón X-100 0,1%.
- Tampón de carga SDS-PAGE: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8; 20% glicerol, 2% SDS, 5 %
β-Mercaptoetanol
- Tampón de corrida SDS-PAGE: 25 mM Tris, 192 mM Glicina, 0,1% SDS; pH 8,3.
- Tampón de muestra (5X): Tris-HCl 0.3125 M, pH 6.8, SDS 10%, Sacarosa 50%, Azul
de bromofenol 0.010%.
- Tampón de transferencia SDS-PAGE: Tris 25 mM, Glicina 193 mM, 0,1 % SDS, 20%
Metanol.
- Tampón espaciador SDS-PAGE: Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; 04% SDS
- Tampón separador SDS-PAGE: Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; 0,4% SDS
28
- Solución de lavado, TNT: Tris –HCl 0,1 M pH7,5; NaCl 0,15M; Tween 20 0,05%.
3.1.3. Kits
- E.Z.N.A. Plasmid Miniprep kit I, Omega Bio-tek
- SV total RNA isolation, Promega
- Kit 2X Brilliant III QPCR Master Mix, Stratagene
3.1.4. Equipos
- Agitador Orbital: Heidolph polymax 1040.
- Balanza: Satorius TE4101.
- Baño Termo-regulado: N-Biotec.
- Cámara de electroforesis: Biorad Mini-Protean III.
- Cámara de electroforesis horizontal: Labnet Enduro.
- Cámara de Flujo Laminar: Nuaire NU425-400E.
- Cámara de Transferencia: Labnet.
- Centrifuga: Sigma 2-16 multigene.
- Centrifuga, Boeco C-28A. 35
- Espectrofotómetro: Thermo Scientific Evulution 60.
- Fuente de poder: Biorad Power PacTM Universal Power Supply.
- Fuente de poder: Enduro E0303.
- Incubador: Zhicheng ZSD 1270.
- Microcentrifuga: Sigma 1-14.
- Microondas: Somela Faney WT1700.
- Microscopio: LW-Scientific I4 Series.
- Microscopio invertido: Olympus CKX41.
29
- Micropipetas: Axygen, Labnet.
- Nanoview: Healthcare, Bioscience.
- PH meter: InoLab.
- Shaker: Zhcheng, ZHWY-200B
- Sonicador: Cole Parmer
- Termoblock: Labnet
- Termociclador: Eppendorf Mastercycler personal.
- Termociclador en gradiente: Labnet.
- Termociclador tiempo real: Stratagene MX 3005 P, Stratagene MX 3000P
- Transiluminador: Syngene, INGENIUS
- Ultraturrex: IKA, TioBasic I
- Vortex: Brarnstead International.
3.1.5. Software
- MxPro, Mx3005P
3.2. Métodos
3.2.1. Extracción de RNA total desde tejidos de Salmo salar
Se homogenizó el tejido de órganos linfoides (50 mg aproximadamente) en 1mL de reactivo
Chomczynski (Chomczynski y Sacchi, 1987) utilizando un homogenizador Ultramax. En frio se
adicionaron 400 μL de cloroformo:alcohol isoamílico 24:1 y se centrifugó a 13000 x g a 4°C por
10 minutos. En seguida se trasladó la capa superior acuosa (conteniendo el RNA) a un tubo
nuevo y se le agregaron 500 μL de isopropanol frio y se dejó precipitando toda la noche a -80°C.
30
Al día siguiente se sedimentó la muestra centrifugándola a 13000 x g por 30 minutos a 4°C, para
luego eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 200 μL de solución TES y luego
se añadió 400μL de cloroformo alcohol isoamílico 24:1, mezclando por agitación. Se separaron
las fases centrifugando a 13000 x g a 4°C por 10 minutos, extrayendo la fase superior acuosa y
depositándola en un nuevo tubo. El RNA se precipitó adicionando 600 μL de isopropanol frio e
incubando toda la noche a -20°C. Finalmente, se centrifugó a 13000 x g por 30 minutos a 4°C y
se resuspendió en 20 μL de agua DEPC. Posteriormente se cuantificó el RNA por
espectrofotometría a 260nm (espectrofotómetro tradicional o Nanoview), utilizando la relación 1
U.A. = 40 μg/ml.
3.2.2. Síntesis de cDNA a partir de RNA total
La reacción se realizó en un volumen total de 25 μL; en una primera etapa, se parte con una
solución conteniendo 1 μL de oligo-dT 40µM, 5 µg de RNA y agua DEPC hasta llegar a un
volumen final de 13,5µL. Esta se incubó por 5 minutos a 70°C, luego inmediatamente a hielo. La
segunda etapa consistió en agregar a la solución anterior 5µL M-MLV 5X Buffer, 5µL dNTPs 10
mM, 0,5 µL RNAsin, 1 µL M-MLV-RT, llegando a un volumen final de 25 µL, estos fueron
incubados 1 hora a 37°C y luego 10 minutos a 72°C.
3.2.3. Clonamiento del cDNA de los receptores tipo Toll, TLR1, TLR22, TLR5M y TLR5S,
de Salmo salar
Utilizando como referencia las secuencias de mRNA descritas en NCBI para los receptores en
trucha arcoíris (números de acceso: TLR1: NM_001166101.1; TLR22 NM_001124419; TLR5M:
NM_001124744.1; TLR5S NM_001124208), se realizó una búsqueda BLAST y en la base de
datos de EST para Salmo salar, al encontrarse secuencia EST para algún receptor, estas se
utilizaron para diseñar partidores homólogos a salmón, de esta forma se intentó obtener el mayor
31
fragmento posible para cada receptor. En los casos que no se encontraron secuencias EST, se
diseñaron partidores heterólogos utilizando como secuencia molde, la secuencia de trucha.
Para cada receptor se diseñaron distintos juegos de partidores con la idea de intentar obtener la
secuencia completa del mensajero. En la Tabla III se puede ver en detalle un resumen de los
partidores utilizados.
3.2.3.1. Amplificación de segmentos del cDNA de los receptores TLR1, TLR22,
TLR5S y TLR5M
Para las reacciones de PCR se utilizó como templado cDNA, sintetizado de acuerdo a síntesis de
cDNA, desde RNA total de órganos de riñón, extraído según lo descrito en extracción de RNA.
La reacción de PCR se realizó en un volumen total de 25 μL, conteniendo 0.5 unidades de Taq
DNA polimerasa; 5 μL de buffer de Taq DNA polimerasa 5X; 2,5 mM de MgCl2; 0.2 mM de
cada dNTP; 1 µM de cada partidor; 1 µL de cDNA y agua estéril DEPC 25 μL. Para cada juego
de partidores se realizó un PCR en gradiente de temperatura, para obtener la temperatura
adecuada para cada producto de PCR. Los productos entre 500-1000pb. se les dió un tiempo de
extensión (paso 4) de 30 segundos y productos sobre 1000 pb. de 1,30 minutos. La mezcla fue
incubada en el termociclador con las siguientes condiciones térmicas:
Paso 1.- 3 minutos a 94°C
Paso 2.- 30 segundos a 94°C
Paso 3.- 30 segundos a gradiente (55-65°C) 35 ciclos
Paso 4.- 30 segundos a 72°C
Paso 5.- 10 minutos a 72°C
En la Tabla IV se puede ver un resumen de los juego de partidores con sus respectivas Tm y
producto esperado.
32
Tabla III: Resumen de partidores utilizados para el clonamiento de TLR5S, TLR22,
TLR5M y TLR1.
TLR5S
Nombre Secuencia Juego
TLR5S F1 TTC GTG GCA AAC ACT TTC GG A,B
TLR5S R2 TCC AGG ATT TGT AGG TTT GG A
TLR5S R3 TTA GTA GTC CAC AGG GGC TC B
TLR22
Nombre Secuencia Juego
TLR22 F1 GCA GGT GAG AAA GAA CG A
TLR22 R2 GTC TCT TCA CCA GCT TC A,C
TLR22 F3 CTG TAT TGT TGG ATT CTT GC B
TLR22 R4 TGT GGT AAT TGT ATG ATG GG B
TLR22 F5 CCC ATC ATA CAA TTA CCA CA C
TLR22 F6 CTT AAA CTG GGA TCA AAC AA D
TLR22 R7 GTA AAT TCT CCT GCA CCA AC D
TLR22 F8 ATG ACA CTC AAG ATA ACC AT E
TLR22 R9 GTA CTT TCA TGT TAG AGG GG E
33
Continuación Tabla III
TLR5M
Nombre Secuencia Juego
TLR5M F1 CAG GAA CCT TAT ACT GCT GG A
TLR5M R2 GGC CCT CTA AGG ATG TAA TC A,C
TLR5M F3 GCT GAT AAT AAG ATT ACA TC B
TLR5M R4 GTT CCA ACT GTC ATA TTT AC B
TLR5M F5 ATG ATG AGG AAC CTT ATA CT C
TLR5M F6 TGG AAC ACA GCA CCA TGG GG D
TLR5M R7 CCT CCA GAC CGC AGT CAC AG D
TLR1
Nombre Secuencia Juego
TLR1-F1 CTG GGC CGT GGC TGC GTT AA A
TLR1-R2 GCC GGT TGG CAC TCA GGT CC A
TLR1-F3 GGA TAC TGC AGC TAG ACT TC B
TLR1-R4 GGA AGG GAT CAT GTA CTG AG B
TLR1-F5 ATG AGG GCT GTG GCA GTC AC C
TLR1-R6 CGA TGC TGA CCT TCT CCG CC C
34
Tabla IV: Tm y producto esperado de los juegos de partidores utilizados para clonación
TLR5S
Juego Producto esperado (pb.) Tm (°C)
A 598 60,9
B 1741 60,9
TLR22
Juego Producto esperado (pb.) Tm (°C)
A 787 55,8
B 532 60,9
C 2235 60,9
D 857 55,8
E 216 55,8
TLR5M
Juego Producto esperado (pb.) Tm (°C)
A 1238 60,9
B 1358 55,8
C 1280 60,9
D 800 60,9
TLR1
Juego Producto esperado (pb.) Tm (°C)
A 1440 55
B 1225 60,9
35
3.2.3.2. Electroforesis de productos de PCR en geles de agarosa
Los geles se prepararon fundiendo 0,3 g de agarosa en 30 mL de buffer SB 1X (Brody, et al.,
2004) agregando 4 mL de Syber safe 10.000X. Las muestras se prepararon mezclando 10 µl de
los productos de PCR más 2 μL de buffer de carga 6X. Se cargaron las muestras en los pocillos y
la corrida electroforética se realizó a 70 Volt en buffer SB 1X. Una vez finalizada la corrida
electroforética, el gel fue expuesto a luz ultravioleta en el transiluminador para poder ver los
productos de PCR y capturar una imagen digital.
3.2.3.3. Ligación de los productos de PCR en vector pGEM-T Easy
La ligación del amplicón al vector se realizó en una mezcla conteniendo 50 ng del vector, 5 μL
del Buffer de T4 DNA ligasa 2X, 3 unidades de T4 DNA ligasa y 1μL de producto de PCR en un
volumen final de 10 μL. Se incubó a 4°C toda la noche.
3.2.3.4. Transformación con el producto de ligación y selección de clones
Se descongeló lentamente un tubo conteniendo 100 μL de células competentes E .coli JM109, e
inmediatamente se agregó 50µL de las células componentes a todo el producto de ligación
(10μL) y se dejó por 20 minutos en hielo. Luego el tubo fue incubado a 42°C por 45 segundos
para rápidamente colocarlo en hielo por 2 minutos. El contenido se transfirió a 0.95 mL de medio
SOC mantenido a 37°C y la mezcla se incubó con agitación por 1:30 hora a 150 r.p.m. a 37°C.
Transcurrido dicho tiempo, se sembró el cultivo en una placa de LB-agar-ampicilina 50 μg/mL
más 800 μg de IPTG y 800 μg de X-Gal. Se incubó a 37°C por 12 a 16 horas.
Para buscar los clones conteniendo el vector con el inserto, se tomaron con asa estéril al menos
10 colonias blancas, y 2 azules como control, las cuales fueron sembradas en 5 ml de caldo LB
por 12 horas. Después se realizó una purificación de DNA plasmidial empleando el kit comercial
E.Z.N.A. Plasmid Miniprep kit I, siguiendo las indicaciones del fabricante. Con el fin de
36
visualizar el inserto de DNA incorporado al vector, el plásmido purificado fue sometido a una
digestión con EcoRI. Un fraccionamiento electroforético en gel de agarosa permitió visualizar los
insertos buscados.
3.2.3.5. Secuenciación de los productos de PCR clonados
La secuenciación se realizó por el método de dideoxinucleótidos (Sanger et al., 1977). Este se
llevó a cabo utilizando partidores complementarios a las secuencias de los promotores SP6 y T7,
las que flanquean la región de múltiple clonamiento (MCS) del vector. Este proceso fue realizado
por MACROGEN, Corea.
3.2.4. Ensayo de Cinética de expresión en células SHK-1 infectadas con P. salmonis viva, P.
salmonis inactivada, proteínas totales de P. salmonis y LPS
La cinética se realizó en 10 tiempos: a los 30 minutos, 1, 2, 4, 8, 12 horas, 1, 3 y 7 días, para la
infección con P. salmonis viva. La cinética con P. salmonis inactivada, proteínas totales de P.
salmonis y LPS se realizó en los tiempos 2 y 16 horas y 1 día. Cada tiempo se realizó con un n=3.
Para la infección se utilizó la cepa tipo de P. salmonis, LF-89.
3.2.4.1. Siembra de células SHK-1
Para los ensayos de cinética se trabajó con 1x106 células por cada n utilizado en cada tiempo.
Para ello se mantiene un stock de células SHK-1 en botellas de cultivo de 175 cm2 con medio de
cultivo L-15 + 10% SBF (el que fue utilizado en todas las cinéticas realizadas), las necesarias
para poder obtener la cantidad de células requeridas para los tiempos a realizar, pensando que en
confluencia una botella de 175 cm2 se pueden encontrar 7x106 células por botella. Luego de tener
el stock necesario de células se procede a sembrar 1x106 células en botellas de cultivo de 25 cm2.
37
3.2.4.2. Cuantificación de las células SHK-1
Las células fueron soltadas de la botella utilizando tripsina 1X, la que fue neutralizada con medio
de cultivo en una proporción volumen/volumen. Una vez sueltas las células se recolectaron para
proceder a su cuantificación. Para poder visualizar las células se utilizó azul de tripan en una
dilución 1:4 y para su cuantificación se utilizó la cámara de Neubauer. Se contaron las células
que se encuentran en 5 cuadrados del cuadrante central de la cámara y en ambos lados de la
cámara, luego se precedió a utilizar la siguiente fórmula que permite cuantificar las células:
N° de células contadas x dilución x 1000 = X células/mL.
Se calculó el volumen a agregar, que contenga 1x106 células, a cada botella de 25 cm2, y se
agregó medio de cultivo. Una vez sembradas las botellas con 1x106 células, se dejaron en
incubadora a 17°C por 48 horas, tras lo cual se comenzó con la cinética.
3.2.4.3. Infección con P. salmonis viva
La infección se realizó utilizando la proporción de 50 bacterias por célula. Para ello con 14 días
de anticipación, se infectó células SHK-1 (botellas de 175 cm2 en confluencia) con P. salmonis,
para obtener la cantidad necesaria de bacterias para realizar la cinética. La infección se realizó
con 50x106 bacterias, por botella. Botellas control de infección con medio L-15 más 10% SBF.
3.2.4.4. Cuantificación de P. salmonis
Se recolectó el medio de cultivo de las células infectadas con P. salmonis, transcurridos 14 días
necesarios para que las bacterias produzcan su efecto citopático en las células y se encuentren en
el medio de cultivo de las células. Una vez recolectado el medio, se tomó una alícuota de 1 mL y
se centrifugó a 200 x g por 5 minutos para precipitar los restos celulares, luego se tomó el
sobrenadante y se cuantificó, midiendo absorbancia a 600 nm, utilizando como blanco Medio L-
15, y se aplicó la fórmula de Mc. Farland:
38
0,132 1,5x108 CFC/mL A600muestra X
Una vez cuantificadas las bacterias se agregó el volumen necesario, para tener 50x106 bacterias
por botella. Este volumen fue agregado a cada botella con medio de cultivo nuevo.
3.2.4.5. Extracción de proteínas totales de P. salmonis
Se recolectó el medio de las células infectadas con P. salmonis transcurridos los 14 días, este
medio se centrifugó a 200 X g por 5 minutos, se tomó el sobrenadante y se centrifugó a 4000 X g
por 10 minutos a 4°C, el pellet obtenido se lavó dos veces con PBS 1X, luego el sedimento se
resuspendió en 100µL de RIPA+, se incubó por 20 minutos en hielo, luego se sonicó la muestra 3
veces por 5 segundos a potencia 11, se mantuvo la muestra en hielo entre cada pulso, después se
centrifugó a 4000 x g por 10 minutos a 4°C, finalmente se recuperó el sobrenadante y se
cuantificó por el método de Bradford (Bradford, 1976). La infección se realizó con 10µg/mL.
Botellas control de infección medio de cultivo con reactivo RIPA+.
3.2.4.6. Inactivación de P. salmonis (Birkbeck et al., 2004)
Se recolectó el medio de las células infectadas con P. salmonis transcurridos los 14 días, este
medio se centrifugó a 200 x g por 5 minutos, se tomó el sobrenadante y se centrifugó a 4000 x g
por 10 minutos a 4°C, el sedimento se lavó dos veces con PBS 1X, luego fue resuspendido en
PBS 1X hasta llegar a una A600nm igual a 1. Se agregó formaldehido 1 % v/v y se dejó 24 horas a
4°C. Luego se centrifugó a 400 x g por 10 minutos, el sedimento se lavó dos veces con PBS 1%,
y se resuspendió en formaldehido 0,1%. Para preparar la infección se centrifugó a 100 x g por 10
minutos a 4°C y se lavó 3 veces con PBS 1X. Se infectó con 50x106 bacterias por botella, se
cuantificó, según el método cuantificación de P. salmonis, utilizando como blanco PBS. Botellas
control de infección con medio de cultivo más PBS 1X.
39
3.2.4.7. Verificación de P. salmonis
Se realizó Gram para corroborar que sean cocos Gram negativos según la clásica tinción con
Cristal Violeta, lugol, y safranina.
3.2.4.8.Estimulación con LPS
LPS de Sigma fue utilizado para la infección con LPS. La infección se realizó con 10 µg/mL.
Botellas control de infección con medio de cultivo más PBS 1X.
3.2.5. Análisis de las cinéticas por RT-qPCR
Cada n fue tratado de la siguiente manera: Una vez cumplido cada tiempo a cada botella, que
representa un experimento independiente (n), fueron extraídas las células con tripsina y luego se
procedió a extraer el RNA, como dice el protocolo del kit de extracción de RNA. El RNA se
cuantificó en Nanoview y fue tratado con DNAsa, luego se procedió a hacer su respectivo cDNA
según fue descrito. Para verificar la ausencia de DNA genómico se realizó un PCR utilizando
partidores de β-actina que contienen están dirigidos a dos exones adyacentes, separados por un
intron, con lo cual, el DNA genómico rinde un producto sobre los 2000 pb., en cambio el cDNA,
de aprox. 500 pb. Se puede ver como ejemplo la cinética con P. salmonis viva en la Figura 29.
Para las cinéticas se analizaron los receptores: TLR1, TLR22, TLR5S, TLR5M, TLR9 también
Myd88 e IL-1β. Como normalizadores fueron utilizados EF-1a y β-actina. En la Tabla V se
encuentran los partidores utilizados, los que fueron diseñados utilizando la secuencia clonada de
cada receptor o la base de datos de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Cada uno de los juegos
de partidores utilizados fueron diseñados para obtener un producto entre 100 a 140 pb., fueron
comprobadas su T° de alineamiento en PCR convencional. Los ciclos y temperaturas utilizados
en RT-qPCR para los normalizadores y los otros mRNAs a analizar (* 62° para normalizadores y
60° para los demás marcadores estudiados):
40
00:05 25° 1 ciclo
10:00 95° 1 ciclo
00:15 95°
00:15* 60°/62° 40 ciclos
00:15 72°
00:10 95°
00:10 25° 1 ciclo
00:01 70°
00:0195°
Los datos obtenidos en cada ensayo de qRT-PCR fueron evaluados con la fórmula:
2ΔCt (Ct muestra- Ct normalizador)
41
Tabla V: Resumen partidores utilizados para RT-qPCR y secuencia referencia
TLRS qPCR
Nombre Secuencia Referencia
TLR5S Ftp GCT GCT GGA GCT AAG GAA CA Esta tesis
TLR5S Rtp GAG CCC TCA GCG AGT TAA GC Esta tesis
TLR22 qPCR
Nombre Secuencia Referencia
TLR22 Ftp1 GCG GCA TTG AGA TGT CTT TC Esta tesis
TLR22 Rtp1 GCC TTG ACC CTC TCT TCA CC Esta tesis
TLR22 Ftp2 AGG GCT GAG GCT GTT GGA TT Esta tesis
TLR22 Rtp2 GCA CAT CCC ATT CCA TGC GT Esta tesis
TLR1 qPCR
Nombre Secuencia Referencia
TLR1 Ftp1 TCC GGA GAC GTT TCA TCC CA Esta tesis
TLR1 Rtp1 GAG GTT CAG CGC TAA CAG CA Esta tesis
TLR5M qPCR
Nombre Secuencia Referencia
TLR5M Ftp2 TTG ACC GCC AGG ATC CTT GA Esta tesis
TLR5M Rtp2 AAC AGG GCG GTT CTA CCC A Esta tesis
42
Continuación Tabla V
TLR9 qPCR
Nombre Secuencia Referencia
TLR9 Ftp2 TGG GCG TTT GCC AAT CTG A NM_001123653
TLR9 Rtp2 TGT TGA AGC AGG GGA AGC AG NM_001123653
Myd88 Qpcr
Nombre Secuencia Referencia
Myd Ftp2 GAG CAG ACG GAC CAC AAG TT NM_001136545
Myd Rtp2 CTC GAT GAG TTC GCT GGT GA NM_001136545
IL-1β qPCR
Nombre Secuencia Referencia
IL1-β Ftp1 ATC ACC ATG CGT CAC ATT GC NM_001123582
IL1-β Rtp1 GTC CTT GAA CTC GGT TCC CA NM_001123582
β actina qPCR
Nombre Secuencia Referencia
Actina F AAG ATG AAA TCG CCG CAC Lockhart et al., 2004
Actina R ATG GAG GGG AAG ACA GCC Lockhart et al., 2004
EF-1a qPCR
Nombre Secuencia Referencia
EF-1a F GCT TAC AAA ATC GGC GGT AT NM_001173967
EF-1a R CTT GAC GGA CAC GTT CTT GA NM_001173967
43
3.2.6. Desarrollo de sueros policlonales
3.2.6.1. Determinación de péptidos idóneos para la inmunización de animales
Se realizó un análisis de hidrofilicidad de las proteínas en cuestión en búsqueda de las regiones
que pudieran servir como eventuales buenos epitopes para la generación de anticuerpos. Los
péptidos fueron sintetizados en la compañía Genescript, USA.
3.2.6.2. Conjugación de péptidos a hemocianina de Concholepas concholepas
Los péptidos elegidos para la inmunización de los conejos, fueron conjugados con hemocianina
(Bluecarrier, Biosonda) como carrier de acuerdo al siguiente procedimiento: se resuspendieron
los péptidos en buffer borato de sodio 0,5 M pH 9 a una concentración de 8,8 μg/μL. De esta
solución se tomó 225 μL y se agregó 1 mg de hemocianina y 148 μL de agua estéril; luego se
agregó muy lentamente y con agitación 77 μL de de glutaraldehido 2.5%; esta mezcla se dejó 12
horas en agitación, para luego ser dializada en una membrana contra 0.15 M de cloruro de sodio
por 6 horas. Se recuperó la solución desde la membrana de diálisis, con un volumen teórico de
455 μL, lo que arrojó una concentración teórica del péptido de 5 µg/µL.
3.2.6.3. Inmunización de conejos
Los conejos fueron inoculados con una dosis de 500 µg de péptido cada 30 días; para esto, se
preparó una emulsión compuesta de 100 µL de péptido, 500 µL coadyuvante de Freund y 400 µL
PBS; la emulsión del coadyuvante en la solución acuosa se logró por sonicación. La primera
inyección se realizó con coadyuvante completo (incluye Mycobacterium tuberculosis 1 mg/mL
inactivado) y las siguientes con coadyuvante incompleto. Previo a la primera inyección se obtuvo
sangre para extraer suero pre-inmune.
44
3.2.6.4. Obtención de sueros inmunes
Luego de tres inmunizaciones, se extrajo sangre de los conejos (25 mL aprox.) y se dejó coagular
por 15 horas, para luego separar el suero del coagulo y posterior centrifugación para eliminar
células.
3.2.6.6. Ensayo de Dot blot
En membranas de nitrocelulosa de 1 x 5 cm, se colocó 0,5, 1 y 5 µg de muestras: proteínas de
membrana de riñón anterior, proteínas totales de riñón anterior y proteínas de membrana de
células SHK-1, 5 µg de péptido conjugado a hemocianina y 5 µg de BSA como control negativo;
las muestras se aplicaron lentamente de manera que estas no difundieran de manera excesiva en
la membrana. Se realizó un pre-bloqueo, incubando las membranas en solución de bloqueo por 1
hora, para luego aplicar distintas diluciones de los sueros inmunes, usando 1:5000, 1:1000, 1:500
y 1:100, con el fin de evaluar el título de los sueros y determinar la dilución óptima para su uso
en los distintos ensayos; también se incubaron membranas con una dilución 1:1000 de sueros pre-
inmune. La incubación se realizó por 15 horas, para luego lavar 3 veces durante 5 minutos con
TNT, luego se aplicó anti IgG de conejo, conjugado a peroxidasa, en dilución 1:1000. Se
realizaron 3 lavados con TNT por 5 c/u con agitación suave. Para el revelado de las membranas,
se incubó con solución de revelado por 15 minutos, agregando 15 μL adicionales de perhidrol a
los 5 minutos de reacción. La reacción se detuvo sumergiendo las membranas en agua.
3.2.7. Extracción de proteínas de membrana
Se homogeniza el tejido en 1 ml de tampón H1 (proporción 1g. de tejido/ 1 mL. De tampón H1/
20 µL PMSF 100mM). Se centrifugó a 1000 x g por 15 minutos a T° ambiente, se recuperó
sobrenadante, el que se centrifugó a 10000 x g por 15 minutos a T° ambiente, se recuperó el
45
sobrenadante, el que se centrifugó a 20000 x g por 90 minutos a 10°C, se eliminó sobrenadante.
El precipitado se resuspendió en 50 µL de tampón H1, luego se agregó 10 µL de SDS 10% y 10
µL de β-mercaptoetanol 14,3M, se hirvió la mezcla a 95°C por 5 min., luego se agregó 30 µL de
tampón H2, se centrifugó a 20000 x g por 20 minutos a 4°C, se recuperó sobrenadante.
3.2.7.1. Cuantificación de proteínas
Basado en el método de Bradford (Bradford et al., 1976), se fabricó una curva de calibración
entre 5 a 30 µg/mL de reactivo Bradford, utilizando BSA en agua destilada como estándar. La
lectura se realizó después de 10 minutos en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595
nm.
Para determinar la concentración de proteínas de las muestras se tomaron alícuotas de 1, 5 o 10
μL cada una, en dilución determinada y se le agregó 1 mL del reactivo de Bradford. Transcurrido
10 minutos, la absorbancia fue leída y su valor fue interpolado en la curva de calibración. Todas
las lecturas se realizaron contra su respectivo blanco, en este caso se utilizó agua destilada, (que
también se usó para las diluciones de las muestras), con el reactivo de Bradford.
3.2.8. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes
Se prepararon geles, gel separador y gel espaciador, con el sistema de tampón discontinuo en
condiciones denaturantes descrito originalmente por Laemmli (1970). Las dimensiones de los
geles fueron las siguientes 95 x 100 x 0,75 mm y 30 x 100 x 0,75 mm respectivamente,
organizados entre dos placas de vidrio y espaciadores de teflón. El gel separador se preparó con
acrilamida-bisacrilamida 30% (p/v), a una concentración final de 12%, tamponado con Tris-HCl
1,5 M, pH 8.8 y SDS 0,4%. El gel espaciador se preparó a una concentración final de 30% (p/v)
tamponado con Tris-HCl 0,5 M, pH 6.8 y SDS 0,4%. Ambos geles fueron polimerizados con
46
persulfato de amonio 0,05% (p/v) y TEMED 0,15% (p/v) de concentración final. Las muestras
con tampón de muestra y con un 5% (p/v) fueron denaturadas calentándolas por 5 minutos a 95ºC
en termociclador, para luego ser cargadas cuidadosamente en los pocillos del gel. Una vez que el
sistema fue montado e inmerso en tampón de corrida, se le aplicó una corriente de 20 mA hasta
que el indicador del frente iónico llegó al borde inferior del gel.
3.2.9. Western blot
Luego de realizada la electroforesis, se procedió a realizar la electro-transferencia a una
membrana de nitrocelulosa en tampón de transferencia aplicando una corriente de 50 mA por al
menos 15 horas. Posteriormente se tomó la membrana y se bloqueó los sitios inespecíficos con
solución de bloqueo para western blot. Luego se incubó, durante una noche, con el primer
anticuerpo dependiendo del experimento a la dilución indicada en la Figura 28, luego se
realizaron 3 lavados de 5 min c/u con TNT, con agitación suave. Se incubó por 1 hora con el
segundo anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa, a una dilución de 1:1000. Se
realizaron 3 lavados con TNT por 5 minutos c/u con agitación suave. Para el revelado de la
membrana, se incubó con solución de revelado por 15 minutos, agregando a los 5 minutos de
reacción 15 μL más de perhidrol. La reacción se detuvo sumergiendo la membrana en agua.
47
4. RESULTADOS
4.1. Clonamiento de los receptores tipo Toll (TLR): TLR1, TLR22, TLR5 de membrana
(TLR5M) y TLR5 soluble (TLR5S)
Todos los receptores fueron estudiados y analizados de la siguiente manera: a partir de muestras
de RNA de órganos de salmón, se sintetizó cDNA, el cual fue utilizado como templado para las
reacciones de PCR realizadas con los juegos de partidores correspondientes para cada receptor,
obteniéndose así los productos esperados de la región codificante.
Una vez obtenidos los productos de PCR esperados, estos fueron clonados en el vector p-GEM-T
easy y enviados a secuenciar. Recibidas las secuencias nucleotídicas de cada receptor, estas
fueron analizadas por BLAST (para observar si existe similitud con el receptor TLR esperado),
ensambladas y traducidas por la herramienta “Translate” de Expasy, para obtener la secuencia
aminoacídica y el marco de lectura correcto.
Obtenidas las secuencias aminoacídicas se procedió a estudiar la presencia de dominios
característicos de los TLR: las Regiones Ricas en Leucina (LRR), Región Rica en Leucina C-
Terminal (LRR-CT), región transmembrana y el dominio TIR, utilizando las herramientas
bioinformáticas de “SMART” y “SOSUI”, esta última en caso de que la región transmembrana
no fuera detectada por SMART. También se analizó si las regiones LRR poseen los residuos
consenso presentes en la mayoría de los TLR (Matsushima et al., 2007): XLXXLXLXXN y
XɵXXɵ (X: cualquier aminoácido; L y F: cualquier aminoácido hidrofóbico; N puede ser C, S o
T; ɵ: cualquier residuo hidrofóbico) y para LRR-CT se estudió sus residuos consenso
LXXLXLXXNP(F/L)XCXCXXXX (Tsoi et al., 2006). El dominio TIR posee regiones consenso
Box1, Box 2 y Box 3 las que también fueron analizadas (Slack et al., 2000; Jault et al., 2004).
48
Además, las secuencias aminoacídicas se analizaron por alineamiento múltiple, utilizando
ClustalW, pesquisando su similitud aminoacídica respecto a TLR descritos en otras especies, y
realizando una comparación de la posición de los dominios característicos (análisis SMART). En
primer lugar se realizó un alineamiento entre la secuencia obtenida de salmón, trucha y humano
en el caso de los TLR1 y TLR5M. En segundo lugar se realizó un alineamiento múltiple entre la
secuencia obtenida de salmón con secuencias de otros peces ya descritas en la base de datos
NCBI y así poder determinar si poseen homología entre ellas.
4.1.1. Clonamiento del receptor TLR1
Para amplificar la mayor parte posible de la región codificante del receptor TLR1 se utilizaron 2
juegos de partidores, juego A y juego B, utilizando como referencia la secuencia ya descrita en el
banco de datos para el receptor TLR1 en trucha (GenBank NM_001166101.1), como se muestra
en la Figura 4. Una vez obtenido el producto esperado de la reacción de PCR de cada juego de
partidores, se clonaron y se enviaron a secuenciar. Los tamaños esperados son para el juego A un
producto de aprox. 1440 pb. y para el juego B un producto de aprox. 1225 pb., como se observa
en la Figura 4.
Una vez ensambladas y analizadas las secuencias obtenidas de cada producto de PCR, se dedujo
una secuencia nucleotídica, para el receptor TLR1 en salmón, de un tamaño de 2248 pb., la que
se puede observar en la Figura 5. La secuencia ya está publicada en NCBI con el N° de acceso
HQ664666.1. La cual fue analizada por BLAST nucleotídico y se obtuvo un 96% de identidad
con la secuencia de trucha utilizada como referencia.
49
A
B
Figura 4: Ubicación de los partidores en la secuencia de trucha y producto de PCR para el
receptor TLR1 en salmón. A: Se observa una representación de la secuencia del cDNA del
TLR1 en trucha, con un tamaño de 2773 pb., indicando la ubicación de cada partidor diseñado.
En rojo, el juego de partidores A y en azul el juego B, señalando el tamaño del producto esperado
en cada caso. B: Fraccionamiento, en gel de agarosa 1%, de los productos obtenidos. A: juego A
de partidores. B: juego B de partidores. Carril 1: Estándar de tamaño molecular de 100 pb. Carril
2: 10 µL de cada producto de PCR
.
50
CTGGGCCGTGGCTGCGTTAATGGGAGTCCATCAGTGCACCCCCTCCTCCT 50
CAGAAATCCACACCATTATTGTCAACCTCTCCTCCAAAAACATATCCTCT 100
GTTCCCAGAAACCTACCTCCATGCACCGAAGCCCTGGACCTCTCCCAGAA 150
CAACATACACAAACTTGGCCATGAGGATTTCCAAGTTACAACTCACCTGA 200
GATTCCTCAACCTTTCTTGGAATGTCTTGGAGGATATTGATCCGGAGACG 250
TTTCATCCCACTCCGCTCCTGGAGAGTCTGGACCTCTCACACAACCAGCT 300
CCAGAACCTATCTGATCAACGGTACTTGCTGTTAGCGCTGAACCTCAGAG 350
ACCTAGATCTGACCTTTAACATGTTCCACACCATGACCCTGGGGGTGGAG 400
TTCCACAGCCTGACGAAGCTGGAGAGACTGGGGCTCGGAGCAAAAATCAT 450
CAGGGTGGAGGATTTCATCAACATCACTGATGTACACCTGCAAACTTTGA 500
CCCTTCGTCTGGAGAATCTCACAGCCTATGAGAGCGGCAGCCTGAGTGAC 550
GTCCAGGCGGAGAAGGTCAGCATCGGCCTGACGAACAAACCCACCGATCG 600
AAATCTGATCGCAGACGCCCTGTTGATGTTCGACAAGGTTGAGCTGATGG 650
GTATGAACATCAATGGCTACCACAGTTACCTGGTGGAACTTGTGAAGGAG 700
AAAAGGGCAGTCAACACCACACATCTTTACCTGACAAATATGGCCATCAC 750
CTGGGAGCACCTGACAAACACCATAAACGCCTTGTTGCAATCCCCCATCA 800
TCCACCTGAGCACTTCAGACGTGGCCATCCACATCCCACCTTCGATTGAC 850
ACCCCAGGAAGAAACACGTCCCACACTAAATCCTTCTCTGCCAGGCGAGC 900
GGGGGTGGTTAGCTTTTTCTTCTCCCTGGAAGCCCTCTGTAACTTCTTCA 950
TCAACATGCCGGTGGAGCGCCTGGCGATGACTGAGACATCCATCATACAC 1000
ATGACCTGCCCCAAGTCACCCAGCGGGATACTGCAGCTAGACTTCTCAGA 1050
TTGTGCCTTGACTGATACGGTCTTCTCCAGAGTAGAACAGCAAGTCACTG 1100
TAGAGTGTACAACCCTGAATAAAGTAAACATACTGGTTCTGAGAGGGAAC 1150
AACCTCAGGTGCCTTCAAACCCTGAGCAAGAGGGTCCAGAACATGATCTC 1200
TCTGCGTCACCTGGACCTCAGCCTCAACTCGTTGGTTTACAGCGGCCAGG 1250
AATGCCACTGGCCACCGAACATTGTCCACCTGAACCTATCTTCCAATGGG 1300
CTGAGTGAGTCGATATTCAGCTGCCTGCCGAATGGCACCGCCAGCCTGGA 1350
CCTCCAGAACAACCAGATCTCCACTGTACCAGAGACCCTGCTGGCCCTGG 1400
ACTCCCTCCTGGCCCTGGACCTGAGTGCCAACCGGCTGAGGGACCTCCCG 1450
GTGTGCACTGGATTCCCACACCTTAAGTATCTCCTTCTCGGGGAAAACTC 1500
CCTCCATGCCCCATCTGTGAGCTTTCTGGAGACTTGCCCTGTTCTACAGG 1550
TTCTAGATGCTGGCCGAAACCCCTTCACCTGTACGTGTGGCCTGAGGGGC 1600
TTCAGGGATCTGGGTGCTGGGACTGGCCTGGGCAGCGGACACTCTGCAAT 1650
CCAAGTTCTCCACTGGCCAGGAGCCTATCGCTGCAGCTATCCCGAAGCCT 1700
GGAGGAACTCCACACTGGGGGGCTTCCAGATCCCTGAGATCTCCTGCAAT 1750
GTCGGCCTTCTGGCAACGGCCATCTTGTGCCCTGCAGTGGCTATTATCAT 1800
TATTATGGTGACTCTGTGCCACCACCTGGACGTTCCGTGGTACCTGGGCA 1850
TGATCTGGCAGTGGACCCGGGCAAAGCACCGTGCCAGGACCCAGCAGGTC 1900
CGGCCCGAGGAACTGGAGGGGGTGGTGTTCCACGCCTTTGTGTCCTACAG 1950
CCAGCATGATGCAGACTGGGTCAAGGGCCAGCTCTTGCCTAATCTGGAAG 2000
GCTCCGGCGGGGGCCTCCACATCTGCCGCCATGAGAGGGACTTCGTCCCG 2050
GGGAAGACGATCGTGGAGAACATCATCCAATGCGTGGAGAGGAGCCGGCG 2100
CTGTGTGTTCGTCCTCTCTCGCCACTTCGTCCGGAGCGAGTGGCGCCACT 2150
ATGAGCTGTACTTTGCTAGCCATCAGCGGTTGACTCGAGGGTCTGACAGT 2200
GTAATCCTGGTGCTCCTGGAGCCTCTGCCTCAGTACATGATCCCTTCC 2248
Figura 5: Secuencia nucleotídica del receptor TLR1 en salmón (Salmo salar), n° de acceso
HQ664666.1. Secuencia nucleotídica obtenida a partir de las secuenciaciones de los productos de
los juegos de partidores A y B.
51
Una vez traducida la secuencia nucleotídica del receptor TLR1 se obtuvo una secuencia de 749
aminoácidos (marco de lectura en posición +2), la que se puede observar en la Figura 6. La
secuencia se analizó para localizar las regiones características de los TLR: fueron encontradas 5
LRR, una LRR-CT y el dominio TIR, por análisis con SMART y la región transmembrana se
encontró utilizando SOSUI, como muestra la Figura 6. Debido a que la secuencia no incluye el
extremo 5´ de la región codificante (extremo amino terminal), no fue posible encontrar el péptido
señal. También fueron analizados los residuos consenso para LRR, LRR-CT y dominio TIR.
Para estudiar la similitud respecto a otras secuencias descritas, que posee la secuencia
aminoacídica del TLR1 en salmón, se realizaron dos alineamientos: Uno para corroborar que la
proteína posea similitud con la secuencia aminoacídica de trucha y con la secuencia aminoacídica
descrita en humano para el receptor, obteniéndose con la secuencia de trucha un 93% de
identidad y con la secuencia de humano un 47% de identidad; este alineamiento se puede
observar en la Figura 7. El segundo alineamiento múltiple se realizó para comparar la secuencia
de salmón con la secuencia ya descrita del TLR1 en otros peces: el pez cebra (Danio rerio), el
pez globo ocelado (Takifugu rubripes), el pez globo (Tetraodon nigroviridis), el pez mero de
pintas naranjas (Epinephelus coioides), el pez pargo (Lutjanus sanguineus) y el pez gato
(Ictalurus punctatus) con un 48%, 54%, 54%, 58%, 58%, 49% de similitud respectivamente; este
alineamiento se puede observar en la Figura 8.
52
A NH2-WAVAALMGVHQCTPSSSEIHTIIVNLSSKNISSVPRNLPPCTEALDLSQNNIHKLG
HEDFQVTTHLRFLNLSWNVLEDIDPETFHPTPLLESLDLSHNQLQNLSDQRYLLLALNLR
DLDLTFNMFHTMTLGVEFHSLTKLERLGLGAKIIRVEDFINITDVHLQTLTLRLENLTAY
ESGSLSDVQAEKVSIGLTNKPTDRNLIADALLMFDKVELMGMNINGYHSYLVELVEKRAV
NTTHLYLTNMAITWEHLTNTINALLQSPIIHLSTSDVAIHIPPSIDTPGRNTSHTKSFSA
RRAGVVSFFFSLEALCNFFINMPVERLAMTETSIIHMTCPKSPSGILQLDFSDCALTDTV
FSRVEQQVTVECTTLNKVNILVLRGNNLRCLQTLSKRVQNMISLRHLDLSLNSLVYSGQE
CHWPPNIVHLNLSSNGLSESIFSCLPNGTASLDLQNNQISTVPETLLALDSLLALDLSAN
RLRDLPVCTGFPHLKYLLLGENSLHAPSVSFLETCPVLQVLDAGRNPFTCTCGLRGFRDL
GAGTGLGSGHSAIQVLHWPGAYRCSYPEAWRNSTLGGFQIPEISCNVGLLATAILCPAVA
IIIIMVTLCHHLDVPWYLGMIWQWTRAKHRARTQQVRPEELEGVVFHAFVSYSQHDADWV
KGQLLPNLEGSGGGLHICRHERDFVPGKTIVENIIQCVERSRRCVFVLSRHFVRSEWRHY
ELYFASHQRLTRGSDSVILVLLEPLPQYMIPS-COOH
B
C XLXXLXLXXNXɵXXɵ
LRR1 TTHLRFLNLSWNVLEDIDPETFHP
LRR2 TPLLESLDLSHNQLQNLSDQ
LRR3 MISLRHLDLSLNSLVYSGQECHWP
LRR4 PNGTASLDLQNNQISTVPET
LRR5 LDSLLALDLSANRLRDLPVC
D
VFHAFVSYSQHDADWVKGQLLPNLEGSGGGLHICRHERDFVPGKTIVENI
Box1 Box2
IQCVERSRRCVFVLSRHFVRSEWRHYELYFASHQRLTRGSDSVILVLLEP
Box3
LPQYMIPS
Figura 6: Análisis de la secuencia aminoacídica del receptor TLR1 de salmón. A: Secuencia
de 749 aminoácidos del receptor TLR1. En rojo se encuentran señaladas las secuencias de las
Regiones Ricas en Leucina (LRR), en naranjo Regiones Ricas en Leucina C-Terminal (LRR-CT),
en azul región transmembrana y en verde dominio TIR, subrayado región con residuos (en
oscuro) consenso en LRR-CT. B: esquema SMART para el receptor TLR1, indicando en rojo las
LRR, en naranjo LRR-CT, en azul región transmembrana y en verde el dominio TIR. C: residuos
consenso en las LRR, en amarillo se muestran los residuos conservados; L: leucina o residuo
hidrofóbico; X: cualquier aminoácidos; N: puede ser C, S o T; ɵ: cualquier residuos hidrofóbico.
D: Box1, Box2 y Box3, residuos y regiones consenso para el dominio TIR.
53
S.salar --------WAVAALMGVHQCTPSSSEIHTIIVNLSSKNISSVPRNLPPCTEALDLSQNNIHKLGHEDFQVTTHLRFLNLSWNVLEDIDPETFHPTPLLES 92
O.mykiss MRAVAVTLWAVAALMGVHQSTPSSSEIQTLIVNLSSRNISAVPRNLPPCTEALDLSQNNIHKLGREDFQVTTHLRFLNLSWNVLEDIDPETFHPTPLLES 100
H.sapiens ---MTSIFHFAIIFMLILQIRIQLSEESEFLVDRSKNGLIHVPKDLSQKTTILNISQNYISELWTSDILSLSKLRILIISHNRIQYLDISVFKFNQELEY 97
. :* : * . ** ::*: *...: **::*. * *::*** * :* .*: ::**:* :* * :: :* ..*: . **
S.salar LDLSHNQLQNLSDQRYLLLALNLRDLDLTFNMFHTMTLGVEFHSLTKLERLGLGAKIIRVEDFINITDVHLQTLTLRLENLTAYESGS--LSDVQAEKVS 192
O.mykiss LDLSHNQLQNLSDQRYLLLALNLRDLDLTFNMFHTMTLGVEFHSLTKLERLGLGAKIIRVEDFINITDVHLQTLTLRLENLTAYDSGS--LSDVQAEKVS 200
H.sapiens LDLSHNKLVKIS----CHPTVNLKHLDLSFNAFDALPICKEFGNMSQLKFLGLSTTHLEKSSVLPIAHLNISKVLLVLGETYGEKEDPEGLQDFNTESLH 193
******:* ::* ::**:.***:** *.::.: ** .:::*: ***.:. :. ...: *:.:::..: * * : . .... *.*.::*.:
S.salar IGLTNKPTDRNLIADALLMFDKVELMGMNING----YHSYLVELVKEKRAVNTTHLYLTNMAITWEHLTNTINALLQSPIIHLSTSDVAIHIPPSIDTPG 286
O.mykiss IGLTNKPTDRNLIADALLMFNEVELMGMNINGL---VASYVVELVKERRAVNTTHLYLTNMAITWKHLTNTINAVFESPIIHLSTSDVAIHIPPVSDTPG 295
H.sapiens IVFPTNKEFHFILDVSVKTVANLELSNIKCVLEDNKCSYFLSILAKLQTNPKLSSLTLNNIETTWNSFIRILQLVWHTTVWYFSISNVKLQGQLDFRDFD 293
* :..: : :: :: . ::** .:: :: *.* : : : * *.*: **: : . :: : .:.: ::* *:* :: .
S.salar RNTSHTKSFSARRAGVVSFFFSLEALCNFFINMPVERLAMTETSIIHMTCPKSPSGILQLDFSDCALTDTVFSRVEQQVTVECTTLNKVNILVLRGNNLR 386
O.mykiss RNTSHTKSFSARRAGVVSFFFSLEVLCNFFINMPVERLAMTETSIIHMTCPKLPSGILQLDFSDCALADTVFSRVEQQITVECTTLNKVNILVLRGNNLR 395
H.sapiens YSGTSLKALSIHQVVSDVFGFPQSYIYEIFSNMNIKNFTVSGTRMVHMLCPSKISPFLNLDFSNNLLTDTVFEN--------CGHLTELETLILQMNQLK 393
. : *::* ::. * *. . : ::* ** ::.:::: * ::** **. * :*:****: *:****.. * *.::: *:*: *:*:
S.salar CLQTLSKRVQNMISLRHLDLSLNSLVYSGQ--ECHWPPNIVHLNLSSNGLSESIFSCLPNGTASLDLQNNQISTVPETLLALDSLLALDLSANRLRDLPV 484
O.mykiss SLQTLSKRVQNMISLRHLDLSLNSLVYSGQ--ECHWPPNIVHLNLSSNGLSESVFSCLPNGTVSLDLQNNQISTVPETLLALDSLLALDLSANRLRDLPV 493
H.sapiens ELSKIAEMTTQMKSLQQLDISQNSVSYDEKKGDCSWTKSLLSLNMSSNILTDTIFRCLPPRIKVLDLHSNKIKSIPKQVVKLEALQELNVAFNSLTDLPG 493
*..::: . :* **::**:* **: *. : :* *. .:: **:*** *::::* *** ***:.*:*.::*: :: *::* *::: * * ***
S.salar CTGFPHLKYLLLGENSLHAPSVSFLETCPVLQVLDAGRNPFTCTCGLRGFRDLGAGTGLGSGHSAIQVLHWPGAYRCSYPEAWRNSTLGGFQIPEISCNV 584
O.mykiss CAGFPHLKYLLLRENSLHAPSVRVLETCPVLQVLDASRNPFTCTCGLRGFSDLGAGTGLGSGHPAIQLLHWPGAYRCSYPEAWRNSTLEGFQIPEISCNV 593
H.sapiens CGSFSSLSVLIIDHNSVSHPSADFFQSCQKMRSIKAGDNPFQCTCELGEFVKN------IDQVSSEVLEGWPDSYKCDYPESYRGTLLKDFHMSELSCNI 579
* .*. *. *:: .**: **. .:::* :: :.*. *** *** * * . . .: : **.:*:*.***::*.: * .*::.*:***:
S.salar GLLATAILCPAVAIIIIMVTLCHHLDVPWYLGMIWQWTRAKHRARTQQVRPEELEGVVFHAFVSYSQHDADWVKGQLLPNLEGSGGGLHICRHERDFVPG 684
O.mykiss GLLAMAILCPAVAVIIVMVTLCHHLDIPWYLGMIRQWTRAKHRARTQQVRPEELEGVVFHPFVSSTQPDADWVKGQLLPNLEGSGGGLHICRHERDFVPG 693
H.sapiens TLLIVTIVATMLVLAVTVTSLCIYLDLPWYLRMVCQWTQTRRRARNIPLEELQRN-LQFHAFISYSGHDSFWVKNELLPNLEKE--GMQICLHERNFVPG 678
** :*:.. :.: : :.:** :**:**** *: ***::::***. :. : : : **.*:* : *: ***.:****** . *::** ***:****
S.salar KTIVENIIQCVERSRRCVFVLSRHFVRSEWRHYELYFASHQRLTRGSDSVILVLLEPLPQYMIPS----------------------------------- 749
O.mykiss KTIVENIIQCVERSRRCVFVLSRHFVRSEWCPYELYFASHQRLTRGSDSVILVLLEPLPQYMIPSKYYQLKAMMGRHTYLEWPQDRGKHRLFWANLRAAL 793
H.sapiens KSIVENIITCIEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCHYELYFAHHNLFHEGSNSLILILLEPIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWANLRAAI 776
*:****** *:*:* :.:** ** :**:*** ****** *: : .**:*:**:****:*** ***
S.salar ---------------
O.mykiss QADLPTAPVRDDVDE 808
H.sapiens NIKLTEQAKK----- 786
Figura 7: Alineamiento entre salmón, trucha y humano para TLR1. En rosado se muestra el
péptido señal. En rojo regiones LRR. En naranjo LRR-CT. En azul región transmembrana. En
verde dominio TIR. Análisis realizado por SMART, para región transmembrana con SOSUI.
Salmón: S. salar, Trucha: O. mykiss (GenBank NP_001159573.1), Humano: H. sapiens
(GenBank AAI09118). (*) se encuentra el mismo residuo,(:) se encuentran residuos similares
(iguales características químicas), (.) se encuentran residuos parecidos en tamaño y disposición
espacial.
54
S.salar -----------------------WAVAALMGVHQCTPSSSEIHTIIVNLSSKNISSVPRNLPPCTEALDLSQNNIHKLGHEDFQVTTHLRFLNLSWNVLEDIDPETFHPTPLLESLDLSH 97
O.mykiss ---------------MRAVAVTLWAVAALMGVHQSTPSSSEIQTLIVNLSSRNISAVPRNLPPCTEALDLSQNNIHKLGREDFQVTTHLRFLNLSWNVLEDIDPETFHPTPLLESLDLSH 105
E.coioides ---------------MRPVNAALWAAAILMGLQLSSSSPN-----FVDLSSKNLSSVPSDLPETVEFLDLSCNHIQQLHQGDFKSTPLLRFLNISWNNLEGIDPETFLDTSLLEDLDLSH 95
L.sanguineus ---------------MGDSIVVFRTAATLMLQPTVWYLHS-----YIDLSSRNLSSVPRDLPKEAAQIDLSRNFIQVLQRGEFRDTTILRFNNSSWICLQSIHPLVFVGTSLLQDLDLSH 95
T.rubripes MSQNSFCPLVLFRLMMGSTIAIFCAAAMLMPQLSVSYLRN-----YIDLSSRNLSSVPGDLPKEAEYIDLSLNHIRQLKRGDFRNTPILRFLNISGNCLDSIHPETFLHTPLLEDLDLSH 115
T.nigroviridis ---------------MGPSILVFCTAATLMLQPSVSYLRN-----YIDLSSRNLSSVPGDLPKEAELIDLSRNLIQLLQRGDFRNTPILRFLNISWNCLESIHPEVFLGTPLLQDLDLSH 100
D.rerio ---------------MKPS-SGWWLVSVYLTCFHPSLIPA-IQRIIVNYSSQNLSSVPDDLKPSTEDLDLSLNHIQSLNCRDFNTTPRLRFLNLSWNILENIDRDTFTSTPALEMLDLSH 103
I.punctatus ---------------MKAQGLPWLSVVALLVSLPYSSLLN-METFILDYSSRNLSAVPPDLPPSVQCLDVSQNRIWTLKKHDFHRTPRLHFLNLSWNILEDIHPDTFISTPLLATLDLSH 104
. : :: **:*:*:** :* . :*:* * * * :*. *. *:* * * *:.*. .* *. * *****
S.salar NQLQNLSDQRYLLLALNLRDLDLTFNMFHTMTLGVEFHSLTKLERLGLGAKIIRVEDFINITDVHLQTLTLRLENLTAYESGSLSDVQAEKVSIGLT--NKPTDRNLIADALLMFDKVEL 215
O.mykiss NQLQNLSDQRYLLLALNLRDLDLTFNMFHTMTLGVEFHSLTKLERLGLGAKIIRVEDFINITDVHLQTLTLRLENLTAYDSGSLSDVQAEKVSIGLT--NKPTDRNLIADALLMFNEVEL 223
E.coioides NRLTNLSGQRYLLHTENLRVLNLTCNNFLTMTLGSEFSFLVKLESLAVGAPNISVGDFKNIAQVKLRTLTLSLEDQLNYTPGSLKDVNAKRLQITFS-RHQKIDLHVIDDALSLFAEVEL 220
L.sanguineus NRLKNLSGQQYLHHTQNLLVLNLTCNKFPTMTLGNEFRSLVKLEKLALGAKNIKMGDFKNIAGAKLHILTLSLEGDLVYEAGSLKNVQAQRLQIGLTLRTQRVDRDLFADALLLFPELEL 220
T.rubripes NELKDLMDQPYLQHTENLVALNLAHNKFLTMTLAREFGSLVKLQRLTLGGSTISVGDFRNIADVELRVMSLFLEGVLVYEPGSLQDVYARRLQVKFN---NKFPHDLMEDALSFFPEVEL 235
T.nigroviridis NCLKNLTDQPYLQRAGNLLFLNLAYNKFVTMTLAREFSSLAKLERLTLGGNVIRVGDFGNIADVELRLLSLHLEGKLLYEPGSLKDAYARRLQVELN---KEFPLHLINDALSFFPEVEL 220
D.rerio NGLQNLSEQPYLLHLGCLELLDLSSNRFSAMALGEEFSMLKRLQWLGLSAKSISIQDFTHISNLTLRTLFINADGLLTYEGNSLDDVHAEKAVIALS--STNVDIAIANDVFARFKEVEF 223
I.punctatus NSLKNLSHQQYLVKAQNLQYLDLSSNLFAVMALGYEFSKLMKLKWLGLSARIIQNNNFVNVSDLHLQTLFIQAQDLTVYENGSLTGAKSDKIVILMP--SNVFDLPIIVDALTSFKQVEL 224
* * :* * ** * *:*: * * .*:*. ** * :*: * :.. * :* : :: *:: : :. * .** .. : : : : : *.: * ::*:
S.salar MGMNING-YHSYLVELVKEKRAVNTTHLYLTNMAITWEHLTNTINALLQSPIIHLSTSDVAIHIPPSIDTPGRNTSHTKSFSARRAGVVSFFFSLEALCNFFINMPVERLAMTETSIIHM 335
O.mykiss MGMNINGLVASYVVELVKERRAVNTTHLYLTNMAITWKHLTNTINAVFESPIIHLSTSDVAIHIPPVSDTPGRNTSHTKSFSARRAGVVSFFFSLEVLCNFFINMPVERLAMTETSIIHM 343
E.coioides MDLTHDY---SNLSQQLSERKEILTSHLYLTNISIEWSSLTHFVKAVLRTSIRHLSASDVAMSKLPYFDTVVTYTSQMESFTASRAVVTTFFFSQEAVYNFFINLPVKRLVINETSIIHM 339
L.sanguineus MNLTGGY---KDQSDQLIKTAEIHTSHLYLTNISIEWSDLTHYVNVILQTSITHFTASDVAMYKLPYIDTKVVNTSKLQSFTAIRAVVTSFFFSQESVYNFFINLPVEKLAIVETSIIHM 340
T.rubripes LELSRGY---QELSKQLSQRSEIYTSCLYLTHISINWPDFTQYVHVALNTTVTHLGVSGVTMYRLPQNATPVAETSRVKSLTFRRAVVRSFLFSQEAVYNFFINMPVENLALTETSIIHM 352
T.nigroviridis LKLPEGC---RELSRQLSQRAEIYTSRLFLTNVSINWSDFTRCVTVALNTTVSHLSVSDVTLHRLPQTDTPMANTSRVKSVTVREVTVKSFLFSQEAVYNFFINMPVESLALTDTAIIHM 337
D.rerio TKVDGKM---EVVQQMRSR-ALMRTVRLEISNVKTTWEFLTSSVNTILSSTIRELSLTDLTLTEMKDGAN-QSSTHILESFSTKRASVTTFIFDQKMLYDFFINTPARKVSLTESPIIFM 341
I.punctatus RGLYNPE---DFLGILVTRKVRIQTVNLHLSSVWSTWKVITALTNRALMSTICQFSMSNLTLYDMYGDYF-VIQGYSLDSFSIRQASVTVFIFNQLSLYDFIINIPARNLTFAQSPIVHM 342
: . : * * :: : * :* : :.: .: :.: :: .*.: .. * *:*. : :*:** *.. : : ::.*:.*
S.salar TCPKSPSGILQLDFSDCALTDTVFSRVEQQVTVECTTLNKVNILVLRGNNLRCLQTLSKRVQNMISLRHLDLSLNSLVYSGQ--ECHWPPNIVHLNLSSNGLSESIFSCLPNGTASLDLQ 454
O.mykiss TCPKLPSGILQLDFSDCALADTVFSRVEQQITVECTTLNKVNILVLRGNNLRSLQTLSKRVQNMISLRHLDLSLNSLVYSGQ--ECHWPPNIVHLNLSSNGLSESVFSCLPNGTVSLDLQ 463
E.coioides TCPGSQSPIRELDFSYCAMSDSIFTTADATGIKECMNLGNLTKLNLAGNSLKSLQRLSQRVQYMTSLQDVDLSFNSLTYDGLT-ECIWPPKITNMTLASNSLTDSVFKCLPKETETLDLQ 455
L.sanguineus TCPKSQSHIQQLDFSSCALSDSIFSTVQGQTIVECENLANVRKLILGGNNLKNLQLLSKRMQHMKSLQHLDLSLNLLVYDGVK-ECVWPPNITNMTLSSNGLTDTVFKCLPTGIETLDLQ 456
T.rubripes TCPKSESPITQLNFSYCSMTDTIFSRVEGLITVECKTLGNVRTLALAGNNLKSLKSLSIRMQYMKSLQDLDLSLNLLVYDGQK-GCVWPQNISSMSLSSNGLTDSVFQCLPENVERLDLQ 468
T.nigroviridis TCPKSQSPVTHLSFSHCSLSDTIFSRVEGLITIECKTLGNLRTLTLARNNFKSLQSLSKRMRYMKSLQDLDLSFNRLVYDGQG-ECYWPQNISILHLSSNSLTSSAFQCLPTGVERLDLQ 453
D.rerio TCPGTISKIQELDLSDCALTEKIFS---VNPETECGTLVNLTRLVLRGNNLKHLSPLTSRINLMDSLQYIDLSQNTLTYSENQGRCFWPPRVLHVDLSRNGFDEVVFKCLPDSVQVLNLR 456
I.punctatus TCPKVVSMIQMLDLSDCVLTENVF----KDPLGECNTLSNLEILVLKRNNLRQLMPLTSRVQLMSSLRHVDFSQNSLTYEETQGRCNWPSKISHLDLSFNEFEQTVFKCLPTALVNLNLQ 458
*** * : *.:* * :::.:* ** .* :: * * *.:: * *: *:. * **: :*:* * *.*. * ** .: : *: * : . *.*** *:*:
S.salar NNQISTVPETLLALDSLLALDLSANRLRDLPVCTGFPHLKYLLLGENSLHAPSVSFLETCPVLQVLDAGRNPFTCTCGLRGFRDLGAGTGL-----GSGHSAIQVLHWPGAYRCSYPEAW 572
O.mykiss NNQISTVPETLLALDSLLALDLSANRLRDLPVCAGFPHLKYLLLRENSLHAPSVRVLETCPVLQVLDASRNPFTCTCGLRGFSDLGAGTGL-----GSGHPAIQLLHWPGAYRCSYPEAW 581
E.coioides NNQISVIPSSILKLENLKSLNLNSNRLRDLPACNGFPILSELLLRSNSLNTPSVNNLESCAKLKTLDVSNNPFACTCALKNFISLGVRSET-----KKSLTGIELVSWPLDYCCSYPDNV 575
L.sanguineus NNQVSVVPPSILKLENLSSLNLNENRLRDLPVCNGFPILNELLLKTNSLHAPSVNKLESCPKLRTLDISNNPFTCTCALRSFINLGIQSEN-----KKSHTGIQLLSWPLNYYCSYPEAD 576
T.rubripes NNQISAVSSSTLGLVRLWYLNLNANKLLDLPVCHNFPLLQELLLKSNSLHTPSVDRLKSCRSLKTLDASSNPFTCTCDLIGFIQLGLKFE-------KGGAAVTFLQWPHGYYCSYPEAV 588
T.nigroviridis NNQLSVVSSSTLKLKRLLSLNLNANRLLDLPVCDNFPLLQELLLRSNSLHAPSVDRLESCPRLKTLDVSYNAFMCICPLRGFIRLGLESE-------KNRTGVTFLQWPQGYYCSYPEAF 573
D.rerio HNRVSTVPADIHTFDTLQVIDLTFNRLLDLPTCRSFPSLQKLLIRSNSIHSPVPGSLKTCQHLQDLDLSHNPFICTCALRDFASLINAQG-------IKTFKSTLKHWPDGYRCSYPESW 573
I.punctatus NNHISAIPANISGLDSLKVLDLTANRLLDLPDCLGYPKLQKLVLRGNFLHAPSTGSLKTCSHLTVVDMSMNPYICTCPLREFTNLIDEKGTLGGSNSWKYQRITVAHWPDGYRCSYPEYW 574
:*::*.:. : * ::*. *:* *** * .:* *. *:: * :::* *::* * :* . *.: * * * * * . ** * ****:.:
S.salar RNSTLGGFQIPEISCNVGLLATAILCPAVAIIIIMVTLCHHLDVPWYLGMIWQWTRAKHRARTQQVRPEELEGVVFHAFVSYSQHDADWVKGQLLPNLEGS----GGGLHICRHERDFVP 683
O.mykiss RNSTLEGFQIPEISCNVGLLAMAILCPAVAVIIVMVTLCHHLDIPWYLGMIRQWTRAKHRARTQQVRPEELEGVVFHPFVSSTQPDADWVKGQLLPNLEGS----GGGLHICRHERDFVP 692
E.coioides RDSTLKDTQIPEISCNVGLLATTILCPAIAVIIVVVTACHRLDVPWYMGMIWQWTRAKHRARMRQVRPEDLAGVEFHAFVSYSQHDADWVHNSLLPNLEGP----AGGLRICHHEKNFVP 686
L.sanguineus RNSTLQKISIPEVSCDVGLLAATILCPAAVVIVLVLILCHRLDIPWYIGMIWQWTRAKHRARTRQVRPEDLVGVEFHAFVSCSQHDADWVHNSLIPNLEG------GGLRICHHERHFVP 686
T.rubripes RDSNLNNFWIPEISCNSYLLAAAILCPAVVVMTVVLTLCRHFDIPWYLGMIWQWMQAKHRARQRQPRPEVLLGIEFHAFVSYSQKDAAWVFDHLLPNLESP----AGGLRICHHGKNFVP 697
T.nigroviridis KDSNLNNIWISEISCNTGLLAAAILCPAVVTISVVLMLCRHFDIPWYVGMIWQWTRAKHRAR-HQLRPQDLVGIKFHAFVSYSQKDRDWVWDYLLPNLEGP----AGGLRICHHEKNFVP 682
D.rerio SNSTLEDFYLPEISCNAWILAITILIPTISLIVAVSLLCNRLDIPWYVRMMWKWTRAKHYSITSQLKEEDVERLHFHAFVSYSQKNAGWVKSQFLPKLEG-----DCGLRMCHHERDFIP 681
I.punctatus RKAMLKNFSMLEITCNAGLLAVTILVPAIILIIAVGILCQQLDLPWYISMIWKWTRAKHHARSSQQRQEDLQGVHFHAFISYSQRNANWVIGQLLPKLEGEDSSTQNGLRVCHHERDFIP 690
* : *::*: :** :** *: : : *.::*:***: *: :* :*** : * : : : : **.*:* :* : ** . ::*:**. **::*:* :.*:*
S.salar GKTIVENIIQCVERSRRCVFVLSRHFVRSEWRHYELYFASHQRLTRGSDSVILVLLEPLPQYMIPS-------------------------------------------------- 749
O.mykiss GKTIVENIIQCVERSRRCVFVLSRHFVRSEWCPYELYFASHQRLTRGSDSVILVLLEPLPQYMIPSKYYQLKAMMGRHTYLEWPQDRGKHRLFWANLRAALQADLPTAPVRDDVDE 808
E.coioides GKTIIENIIGCVEKSRRSVFVLSAHFVKSEWCHYELYFASHQRLAWGSDSIVLVLLEPLPQYLIPSKYYQLKSMMGRHTYLEWPQDTKKHRLFWANLRAALQTDLPDAPVTGLEE- 801
L.sanguineus GDTIIKNIINCVEKSRRSVFVLSGHFIKSEWCHYELYFASHQRLSQGSDSVVLVLLEPLPQYLIPAKYYQLKSMMGRHTYLEWPQDRAKHRLFWANLRAALQADLPYAPVIELEE- 800
T.rubripes GKPIINNIMTCVEKSRRCVFVLSAHFVKSDWCHYELYFTSHQHLALGSDSVVLVLLEPVPQYLIPSKYYQLKFMMARHTYLEWPQDRAKQRLFWANLRAALQADLPHLTVTEIEE- 812
T.nigroviridis GRTIINNILTCVETSRRCVFVLSAHFIKSNWCHYELYFASHQHLARSSDSVVLVLLEPVPQYLIPSKYYQLKAMMARHTYLEWPQDKAKQRLFWANLRAALQADLPDLTVSDTEE- 796
D.rerio GKTVVQNILRCIEQSRRCVFVLSSHFVQSEWCHYELYFANHQKLTRGMDSILLILLEPLPLYLIPSKYYQLKTMMSRRTYLEWPQEGAKQKLFWANLRAALQAELPNTPDREEE-- 795
I.punctatus GRPILDNILHCIEQSRCCVFVLSSHFVQSDWCHYELYFASHQWITRGMDNIILILLEPLPTYLIPSKYYQLKAMMARRTYLEWPQDTAKQRLFWANLRAALQADLPDCGEREWE-- 808
* .::.**: *:* ** .***** **::*:* *****:.** :: . *.::*:****:* *:**:
Figura 8: Alineamiento múltiple de TLR1 en peces. En rosado se destaca péptido señal. En
rojo secuencias LRR, en naranjo LRR-CT, en azul región transmembrana y en verde dominio
TIR. (*) se encuentra el mismo residuo, (:) residuos similares, (.) residuos parecidos en tamaño y
disposición espacial. Analizado por SMART y SOSUI(*). Salmón: S. salar, Trucha: O. mykiss
(GenBank NP_001159573.1), pez Mero de pintas naranjas: E. coioides (GenBank AEB32452.1),
pez pargo: L. sanguineus (GenBank ADX01348.1), pez globo ocelado: T. rubripes (GenBank
AAW69368.1), pez globo: T. nigroviridis (GenBank ABO15772.1), pez cebra: D. rerio
(GenBank AAI63271) y pez gato: I. punctatus (GenBank AEI59662.1).
55
4.1.2. Clonamiento de TLR22
Para amplificar la mayor parte posible de la región codificante del TLR22 se utilizaron 5 juegos
de partidores, juego A, juego B, juego C, juego D y juego E, utilizando como referencia la
secuencia ya descrita en el banco de datos para receptor TLR22 en trucha (GenBank
NM_001124419), como se muestra en la Figura 9. Una vez obtenido el producto de PCR para
cada juego de partidores, se clonaron y se enviaron a secuenciar. Los tamaños esperados para el
juego A un producto de aprox. 787 pb., para el juego B un producto de aprox. 532 pb., para el
juego C un producto de aprox. 2235 pb., para el juego D un producto de aprox. 857 pb. y para el
juego E un producto de aprox. 216 pb., como se muestra en la Figura 9.
Una vez analizadas, estudiadas y ensambladas las secuencias obtenidas de cada producto de PCR,
se dedujo una secuencia nucleotídica, para el receptor TLR22 en salmón, de un tamaño de 2755
pb. (Figura 10). La secuencia ya está publicada en NCBI con el N° de acceso HQ664669.1. La
cual se analizó por BLAST nucleotídico y se obtuvo un 93% de identidad con su par en trucha,
además de un 97% de identidad con el TLR22a (GenBank AM233509.1) y un 90% de identidad
con TLR22b (GenBank FM206383.1) de Salmo salar.
56
A
B
Figura 9: Ubicación de los partidores en la secuencia de trucha y producto de PCR para el
receptor TLR22 en salmón. A: Se observa una representación de la secuencia de cDNA del
TLR22 de trucha, con un total de 2919 pb., indicando la ubicación de cada partidor. En morado
se indica el juego A, en verde el juego B, en naranjo el juego C, en azul el juego D y en rojo el
juego E de partidores, señalando el tamaño del producto esperado en cada caso. B:
Fraccionamiento, en gel de agarosa 1%, de los productos obtenidos. A: juego A. B: juego B
(carril 1) y juego C (carril 2). C: juego D. D: juego E de partidores. A, C, D en carril 1: Estándar
de tamaño molecular de 100 pb. Carril 2: 10 µL de cada producto de PCR. B en carril 3: Estándar
de tamaño molecular de 100 pb. Carril 1 y 2: 10 µL de cada producto de PCR.
57
ATGACACTCAAGATAACCATGCCGGGAAAACAAAGTGGGTCTACATTCTCTCAGCTGAGA 60
CTCTTTCTTTGTTTCCTGCTGTATTGTTGGATTCTTGCTGGTCCAGTGTGCGGGTACTTC 120
CTGAAAAACTGCCCAATCCGGGGTAATCTCAGTGACAACTTTAACATGAAAGTACTCTGT 180
TATAACAGGAATCTTGAAGTCATGCCTATAAATATTCTGTGGAAAGTAAGTGTTTTAGAC 240
GTGGCCATGAATAACATTTCCAAAATTGGAAAGTTTGATTTTAAAGGCCTGTCAAACCTC 300
AAAATTCTAAACATGTTCATGAACCAGATCTCTCAAGTGGACAATGACGCTCTTGCACAC 360
TTAGAGGCTCTTCAAGAGCTGTATCTGGCTTATAACAGACTCACAACCCTGTCAGACCAT 420
TTGTTTCAGGACCTGGCCAACCTCTCCCTGCTACATCTGGACAACAACCTGATCACAACC 480
ATCGGGTCCTCATCCTTTCAACTTCTCTCCAGTTTGAAGACAGTGAATTTAACCAAGAAC 540
AACCTTCATAATATGAAGGAAGTTCAGCCCATCATACAATTACCACACTTACGGGAATTG 600
TACATTGGGAGCAACAGATTCACCTCTTTCCAATCACAAGAAATATCAAACAAGTCAATA 660
GGGCTGAGGCTGTTGGATTTATCCCGGAATCCATGTATCACGGCAGATGTTCTTCCTTAT 720
CTTGAGGTGTTAGACATCGCCTACTGTGGCCAACTTGGACGCATGGAATGGGATGTGCTG 780
GACAGGTCTTTTCTGAGCAACATCAAAGGTCTCAACTTGAGCGGCATTGAGATGTCTTTC 840
GAGAGGATGGCTATGGAGCTGCAGACTGTCAACTCCTCATTAGTCCATCTGAGACTGTAT 900
GACATTGGTGAAGAGAGGGTCAAGGCTCTCACTGATATTGCCTGCCATATACCTACACTT 960
AGCTTGCTCCGACTGCATCATAACAACATAAGTTCTTTGTCTGAGGAATTTCTGCAGTCA 1020
TGTAAACAAGTGACCGAAGTGGACTTAGAAAATAATAATATTATTCAGCTTTCGGCAGTA 1080
TCATTCAGATCAATGGAGCAACTAAGTACTTTGAGACTGGGCCACAACATGCTTTCTTCT 1140
GTACCAGATGCCACAAGAAATGTATCCACACTAAAGTTCCTGGATCTCAGCTTCAATATC 1200
ATCCTTAAACTGGGATGCTCAGATTTCGCCAATCTTACAGGACTCACACAACTCTTTCTT 1260
TTCCACAATCAAATCTCCAACCTTCCAGGATGTGTATTCAAGGATTTGAAAGAATTAAGG 1320
ATCCTTAAACTGGGATCAAACAAAATCCTGACCTTGAATGATGACTTTATGAGTGGTTTG 1380
TACAAACTAGAATATTTGTCAATGTCATACAATAAGCTGAGCTCAATCTCTAAAGGAGAC 1440
TTTAAAGGCTTAGCATCAATCAAGGCTCTGCTTTTATTTGACAATCAGATTGCTAGTCTT 1500
GAAGATGGAGCCTTTGAGGGATTGGTGAATCTTGCAGAACTTAGACTGCAGTCAAATAAG 1560
ATCACTCAAATAGACATAAGAAAGACTGTGCTCTCAGGACTTCCGCGCTTAAGAACTCTT 1620
GATATATCCTGTAATTATATCACATATGTAAATGATCATAAAGGAAACCCTCCACCCTTC 1680
TCTCATCTGACATCTCTGGAGAACCTTTTGATATTTAGTCAACGTCACAAGGGACTGTGT 1740
CATCTACCAATCAACTTCCTTGAAGGTCTGAAATCTTTATTGTCATTCGAGGCAGGGAGT 1800
CTTAATATTAAGGAGCTGCACCCAGACACATTCATTCACACACCCCAGTTGTGGTTCCTT 1860
GATATCAGTAAGAATGAGTTCACAGCCCTCACTCTAAAGCTGTTTCACCCAATCCCAAGT 1920
CTCAACAGCCTGTACCTGTCCAAAGCCCGACTTCAGTCCTTAGATTTCCTCATAGGAGCA 2980
AACCTCAGTAGAGTCACTTTCTTGCAGGTGAGAAAGAACGACATAACAGTAGTCAATGAG 2040
ACAGTGTTGCATTCTCTCCCTGCCTTGACATACCTGGACATGCAAGATAATGCTTTCACC 2100
TGTGGCTGCAGCGATGCTTGGTTTGTCAATTGGATGGAGAACGACAACCAAACACAAGTT 2160
GTTGGTGCAGGAGAATTTACCTGCAACTATCCTGCCGACCTAAAGGACACCAAGCTGTTG 2220
GATGTTGAGCTTCAGTTCTGTACAGTACACTTAGGACTTTACTACTACATCTCTACCACT 2280
TGTCTGGTCCTCCTCACCCTGGTAGCATCCTTTGCCTACCACTTCCTGAAATGGCAGGTC 2340
ATTTACGGCTATTACCTCATCCTGGCTTTCCTCTATGACACCAAGCAAAGGAATAAGCTC 2400
ACTCCTCATGGCTGTCAATACGATGCCTTCATCTCCTACAACGCCCATGATGAGCCCTGG 2460
GTCCTGAGGGAGCTGGAGGGAGAGCAGGGCTGGAAACTGTGTCTCCACCACCGGGACTTC 2520
CAGCCAGGCAAACCAATCATAGATAACATTATGGAAGGCATCTACGGAAGCCGCAAGACC 2580
ATCTGTGTGATCAGCCGCCGCTACCTGGAGAGTGAGTGGTGCTCCCGGGAGATCCAGGTG 2640
GCCAGCTTCCGGCTCTTTGATGAGCAGAAGGACGTCCTGATTCTGGTGTTCCTGGAGGAG 2700
GATCCCTACCCACCAGCTGTCACCCTACCACCGGATGAGGAAGCTGGTGAAGAGAC 2755
Figura 10: Secuencia nucleotídica del receptor TLR22 en salmón (Salmo salar), N° de
acceso HQ664669.1. Secuencia nucleotídica de 2755 pb., deducida a partir de las
secuenciaciones y análisis de los productos de los juegos de partidores A, B, C, D y E.
58
Una vez traducida la secuencia nucleotídica del receptor TLR22 se obtuvo una secuencia de 918
aminoácidos (marco de lectura en posición +1), la que se puede observar en la Figura 11. La
secuencia se analizó para encontrar las regiones características de los TLR: fueron encontradas 15
LRR, una LRR-CT, la región transmembrana tipo I y el dominio TIR por análisis con SMART,
como muestra la Figura 11. También fueron analizados los residuos consenso para LRR, LRR-
CT y Dominio TIR.
Para estudiar la similitud respecto a otras secuencias descritas, que posee la secuencia
aminoacídica del TLR22 en salmón se realizaron dos alineamientos. El primero, para corroborar
que la proteína posea similitud con la secuencia aminoacídica de trucha; obteniéndose un 88% de
similitud, este alineamiento se puede observar en la Figura 12. El segundo Alineamiento múltiple
se realizó para comparar la secuencia de salmón con la secuencia ya descrita de TLR22 en otros:
pez gato (Ictalurus punctatus), para el pez cebra (Danio rerio), para la carpa china
(Ctenopharyngodon idella), para la carpa común (Cyprinus carpio), para el pez globo ocelado
(Takifugu rubripes) con un porcentaje de similitud de un 45%, 44%, 45%, 45%, 44%
respectivamente. En la Figura 13 se puede observar el alineamiento y sus regiones características.
59
A NH2-MTLKITMPGKQSGSTFSQLRLFLCFLLYCWILAGPVCGYFLKNCPIRGNLSDNFNMKVLC
YNRNLEVMPINILWKVSVLDVAMNNISKIGKFDFKGLSNLKILNMFMNQISQVDNDALAHLEA
LQELYLAYNRLTTLSDHLFQDLANLSLLHLDNNLITTIGSSSFQLLSSLKTVNLTKNNLHNMK
EVQPIIQLPHLRELYIGSNRFTSFQSQEISNKSIGLRLLDLSRNPCITADVLPYLEVLDIAYC
GQLGRMEWDVLDRSFLSNIKGLNLSGIEMSFERMAMELQTVNSSLVHLRLYDIGEERVKALTD
IACHIPTLSLLRLHHNNISSLSEEFLQSCKQVTEVDLENNNIIQLSAVSFRSMEQLSTLRLGH
NMLSSVPDATRNVSTLKFLDLSFNIILKLGCSDFANLTGLTQLFLFHNQISNLPGCVFKDLKE
LRILKLGSNKILTLNDDFMSGLYKLEYLSMSYNKLSSISKGDFKGLASIKALLLFDNQIASLE
DGAFEGLVNLAELRLQSNKITQIDIRKTVLSGLPRLRTLDISCNYITYVNDHKGNPPPFSHLT
SLENLLIFSQRHKGLCHLPINFLEGLKSLLSFEAGSLNIKELHPDTFIHTPQLWFLDISKNEF
TALTLKLFHPIPSLNSLYLSKARLQSLDFLIGANLSRVTFLQVRKNDITVVNETVLHSLPALT
YLDMQDNAFTCGCSDAWFVNWMENDNQTQVVGAGEFTCNYPADLKDTKLLDVELQFCTVHLGL
YYYISTTCLVLLTLVASFAYHFLKWQVIYGYYLILAFLYDTKQRNKLTPHGCQYDAFISYNAH
DEPWVLRELEGEQGWKLCLHHRDFQPGKPIIDNIMEGIYGSRKTICVISRRYLESEWCSREIQ
VASFRLFDEQKDVLILVFLEEIPTHQLSPYHRMRKLVKR-COOH
B
C --XLXXLXLXXNXɵXXɵ
LRR1 LSNLKILNMFMNQISQVDNDAL
LRR2 LEALQELYLAYNRLTTLSDHLFQD
LRR3 LANLSLLHLDNNLITTIGSSSFQL
LRR4 LPHLRELYIGSNRFTSFQSQEISN
LRR5 IPTLSLLRLHHNNISSLSEEFLQS
LRR6 CKQVTEVDLENNNIIQLSAVSFRS
LRR7 MEQLSTLRLGHNMLSSVPDATRN
LRR8 LTGLTQLFLFHNQISNLPGCVFKD
LRR9 LKELRILKLGSNKILTLNDDF
LRR10 LYKLEYLSMSYNKLSSISKGDFKG
LRR11 LASIKALLLFDNQIASLEDGAFEG
LRR12 LVNLAELRLQSNKITQIDIRKTVLSG
LRR13 LPRLRTLDISCNYITYVNDHKGNP
LRR14 TPQLWFLDISKNEFTALTLKLFHP
LRR15 IPSLNSLYLSKARLQSLDFLIGAN
D QYDAFISYNAHDEPWVLRELEGEQGWKLCLHHRDFQPGKPIIDNIMEGIYG
Box1 Box2
SRKTICVISRRYLESEWCSREIQVASFRLFDEQKDVLILVFLEEIPTHQLS
Box3
PYHRMRKLVKR
Figura 11: Análisis secuencia aminoacídica del receptor TLR22 de salmón. A: Secuencia de
918 aminoácidos del receptor TLR1. En rojo se encuentran señaladas las secuencias LRR, en
naranjo LRR-CT, en azul región transmembrana y en verde dominio TIR, subrayado región con
residuos (oscuro) consenso en LRR-CT. B: Esquema SMART para el receptor TLR1, indicando
en rojo las LRR, LRRCT en naranjo, en azul región transmembrana y el dominio TIR en verde.
C: residuos consenso en las LRR, en amarillo residuos conservados, L: leucina o residuo
hidrofóbico, X: cualquier aminoácidos, N: puede ser C, S o T, ɵ: cualquier residuos hidrofóbico.
D: Box1, Box2 y Box3, residuos y regiones consenso para el dominio TIR.
60
S.salar MTLKITMPGKQSGSTFSQLRLFLCFLLYCWILAGPVCGYFLKNCPIRGNLSDNFNMKVLCYNRNLEVMPINILWKVSVLDVAMNNISKIGKFDFKGLSNL 100
O.mykiss MTLKITMPGEQSGSTFSQLRLCLCFLMYCWVLADPVCGYFLKNCTIRGNLSDPSNMKVLCEKRNLEVVPKDIPRKVSVLNVAMNNISKIGKLDFKGLSNL 100
*********:*********** ****:***:**.**********.******* ****** :*****:* :* *****:***********:********
S.salar KILNMFMNQISQVDNDALAHLEALQELYLAYNRLTTLSDHLFQDLANLSLLHLDNNLITTIGSSSFQLLSSLKTVNLTKNNLHNMKEVQPIIQLPHLREL 200
O.mykiss KILNMSRNQISSVDDGSLSHLEALQELGLAHNRLTTLSDHLFQGLANLSLLHQDNNLIATISSSSFQPLSSLKTVNLTKNNLHNMKEVQPIVQLPHLQEL 200
***** ****.**:.:*:******** **:************.******** *****:**.***** ***********************:*****:**
S.salar YIGSNRFTSFQSQEISNKSIGLRLLDLSRNPC----ITADVLPYLEVLDIAYCGQLGRMEWDVLDRSFLSNIKGLNLSGIEMSFERMAMELQTVNSSLVH 296
O.mykiss YIGSNRFTSFQSQEISNTSIELRLLDLSRNPLGIFRITADVLPYLEVLDIAYCGQLGHMEWDVLDRSFLSNVKRLNLSGIEMSLERMGMVLQTVNSSLVH 300
*****************.** ********** *********************:*************:* *********:***.* **********
S.salar LRLYDIGEERVKALTDIACHIPTLSLLRLHHNNISSLSEEFLQSCKQVTEVDLENNNIIQLSAVSFRSMEQLSTLRLGHNMLSSVPDATRNVSTLKFLDL 396
O.mykiss LRLYDISEERVKALTDIACHIPTLSLLRLHHNNISVLSKEFLQSCKQLTEMDVCDNNINQLSELLFRSMEQLSTLKLGHNRLSSMPKATRNLPTLKILDL 400
******.**************************** **:********:**:*: :*** *** : **********:**** ***:*.****:.***:***
S.salar SFNIILKLGCSDFANLTGLTQLFLFHNQISNLPGCVFKDLKELRILKLGSNKILTLNDDFMSGLYKLEYLSMSYNKLSSISKGDFKGLASIKALLLFDNQ 496
O.mykiss SFNIIHKLGCSDFSNLTGLTQLFLFHNQISNLPGCVFQDLKDLRILKLGSNKILTLNDDFMSGLHKLEFLSMSYNKLSSISKGDFKGLASLKTLLLFDNQ 500
***** *******:***********************:***:**********************:***:*********************:*:*******
S.salar IASLEDGAFEGLVNLAELRLQSNKITQIDIRKTVLSGLPRLRTLDISCNYITYVNDHKGNPPPFSHLTSLENLLIFSQRHKGLCHLPINFLEGLKSLLSF 596
O.mykiss IASLEDGAFEGLVNLTELRLQSNKITQIDIRNTVLTGLPHLRTLDISCNYITYVNYDKLDPPPLSHLTSLENLLIFSQRHKGLCHLPINFLEGLTSLLSF 600
***************:***************:***:***:*************** .* :***:******************************.*****
S.salar EAGSLNIKELHPDTFIHTPQLWFLDISKNEFTALTLKLFHPIPSLNSLYLSKARLQSLDFLIGANLSRVTFLQVRKNDITVVNETVLHSLPALTYLDMQD 696
O.mykiss QAGSLNIKDLHPDTFIHTPQLWFLDMSKNEFTALTPKLFHPTPSLNRLYLPKARLQSLDFLKGANLSRVTFLQVRKNDITAVNETVLQSLPALTYLDMQD 700
:*******:****************:********* ***** **** ***.********** ******************.******:************
S.salar NAFTCGCSDAWFVNWMENDNQTQVVGAGEFTCNYPADLKDTKLLDVELQFCTVHLGLYYYISTTCLVLLTLVASFAYHFLKWQVIYGYYLILAFLYDTKQ 796
O.mykiss NPFTCGCSDAWFVQWMESNNQTQVVGAGEFTCNYPADLKDTKLLDVELQFCTVDLGLYYYISTTCLVLLTLIASFAYHFLKWEVIYGYYLFLAFLYDTKQ 800
*.***********:***.:**********************************.*****************:**********:*******:*********
S.salar RNKLTPHGCQYDAFISYNAHDEPWVLR----ELEGEQGWKLCLHHRDFQPGKPIIDNIMEGIYGSRKTICVISRRYLESEWCSREIQVASFRLFDEQKDV 892
O.mykiss RNKHKPHGCQYDAFISYNAHDEPWVLRELLPELEGEQGWKLCLHHRDFQPGKPIIDNIMDGIYGSRKTICVISHRYLESEWCSREIQVASFRLFDEQKDV 900
*** .********************** ****************************:*************:**************************
S.salar LILVFLEEIPTHQLSPYHRMRKLVKR------------------------------------------- 918
O.mykiss LILVFLEEIPTHQLSPYHRMRKLVKKRTYLSWPRVGEHTGVFWQQLRLALETKERPAEENPILSGVQAL 969
*************************:
Figura 12: Alineamiento entre salmón y trucha del receptor TLR22. En rosado se muestra
péptido señal. En rojo regiones LRR. En naranjo LRR-CT. En azul región transmembrana. En
verde dominio TIR. Análisis realizado por SMART. Salmón: S. salar, Trucha: O. mykiss
(GenBank NP_001117891.1). (*) Se encuentra el mismo residuo, (:) se encuentran residuos
similares (iguales características químicas), (.) se encuentran residuos parecidos en tamaño y
disposición espacial.
61
S.salar MTLKITMPGKQSGSTFSQLRLFLCFLLYCWILAGPVCGYFLKN-CPIRGNLSDN-FNMKVLCYNRNLEVMPINILWKVSVLDVAMNNISKIGKFDFKGLSNLKILNMFMNQISQVDNDALAHLEA 123
O.mykiss MTLKITMPGEQSGSTFSQLRLCLCFLMYCWVLADPVCGYFLKN-CTIRGNLSDP-SNMKVLCEKRNLEVVPKDIPRKVSVLNVAMNNISKIGKLDFKGLSNLKILNMSRNQISSVDDGSLSHLEA 123
C.idella -------MKKESRKSMGKLQQITLYIVLCGFIS-ACSAFSLKN-CTISTPLRDI--QPKVLCYNMGFFRIPWWIPRNTRILDISFNDFAQIQIGDFRHLSNLQDLNISNNRISQIQEGALDDLSN 114
C.carpio ---------------MGTLKQITLYVAVCSFIS-SSSAFSLNN-CTIRTPLKDI--QPKVLCYKMGFFGIP-WIPRNTRILDISFNAFAQIQIGDFSHLSNLQDLNISNNKISQIQEGALDNLSN 106
D.rerio ---------------MGTLQQITVCITICAMVS-PCSTFSLTN-CTISSSQKDIKTQPKVLCYKMNFFTIP-RVPNNTWILDISFNSFAQIQIEDLNILLNLQYLNVSNNKISKIQDGAFGSLFN 108
I.punctatus -------MTANLDKLCSKATISLAVLCICIFSF-QVNAFSLTN-CTVSGALNDT-EGLKVLCYNMGFCKVPSPIPSNVRYLDMSFNSISNIRVEEFDDLSYLSYLNLSNSKISWIQEGTAEHFPH 116
T.rubripes -------MGSRIKRSTFFFSPAFFLLSFSQFVI-PLKGFALKNACKISFNVAIC------SGNFVKLQDVPQDIPPTVKGFDLSTNKISRIRTTDFKEFRLLEVLDLKNNIISQVDEGAFINLRS 111
: . . : *.* * : : :* : .. :::: * ::.* : : : *. *:: . ** :::.: :
S.salar LQELYLAYNRLTTLSDHLFQDLANLSLLHLDNNLITTIGSSSFQLLSSLKTVNLTKNNLHNMKEVQPIIQLPHLRELYIGSNRFTSFQSQEISNKSIGLRLLDLSRNPC----ITADVLPYLEVL 244
O.mykiss LQELGLAHNRLTTLSDHLFQGLANLSLLHQDNNLIATISSSSFQPLSSLKTVNLTKNNLHNMKEVQPIVQLPHLQELYIGSNRFTSFQSQEISNTSIELRLLDLSRNPLGIFRITADVLPYLEVL 248
C.idella LTYLNLASNRLEAVSSGMLHGLSNLLVLRLDENNIKDIEESAFSTLQNLKVLNLTKNHLHYIDKVKPVLASPLLEELYIGSNNFDVFNSYEMSTKPLSLKKLDFSNNPLATFQLTDNIFPSLNHL 239
C.carpio LSRLNLASNRLREISRGMLHGLTNLLVLRLDNNYIKDIDVTAFSTLQNLKVLNLTKNHLHYIEKIKPVLASPYLEELYIASNHFDAFKSYEMSTNPLSLKILDLSKNPFATFQLTDNIFPFLNHL 230
D.rerio LTDLNLASNRLNAVSNGMLRGLTNLLVLRLDRNYISVIKESAFSTLHSLQVLNLSKNHLRHIDDVKPVLASLYLEELYIGSNYFNVFNSSELSTKPLSLKRLDLSNNRFAAFQLTNNIFPTLNHL 232
I.punctatus LINLNLANNNLKGVSRGLLDGLADLQVLRLDGNNIEHIDKLAFSNLRNMKVLNLTKNNLQQIANIKPVILSPGLEELLIGSNNFDVFNSYDMPRTSLSLKKIDFSYNPLTKFQITENIFPNLDYL 240
T.rubripes LKKLNLNRNKLGKLDAGLFDGLQNLTELRVTRNRLKMVEPSALKSLL------------------------PNLSVLSMAGNNMRFFESGHLTNTSLQLKSLDLSRNPITVFRITADILPNLTWL 218
* * * *.* :. :: .* :* *: * : : ::. * * * :..* : *:* .:. ..: *: :*:* * :* :::* * *
S.salar DIAYCGQLGRMEWDVLDRSFLSNIKGLNLSGIEMSFERMAMELQTVNS-SLVHLRLYDIGEERVKALTDIACHIPTLSLLRLHHNNISSLSEEFLQSCKQVTEVDLENNNIIQLSAVSFRSMEQL 369
O.mykiss DIAYCGQLGHMEWDVLDRSFLSNVKRLNLSGIEMSLERMGMVLQTVNS-SLVHLRLYDISEERVKALTDIACHIPTLSLLRLHHNNISVLSKEFLQSCKQLTEMDVCDNNINQLSELLFRSMEQL 373
C.idella DLSYCGQNGSMTWNVTEKTYFSSVQTLYFMDVNMSPQNVANVLLSFKN-SLNKIRFNGNVELNKTNLLLSAC-SPMLRVVRLNANKIKHLTDNMFDPCSDLTELDLGDNEISKLSPSMFRGFTQL 364
C.carpio DLSYCGQNGTMTWNITEKTFFSSVKTLYFMDVHISAQNAANVLQSFQN-LLNKIRLNGNVELNKTDLLLNAC-SPMLQVLRLKANKIKHLTEHMFDPCSNLTEVDLGDNEISRLWPSIFIGFTQL 355
D.rerio DLSYCGHNGTMAWNVTEKSYLASVKTLYFMDVNMSIQTADNVLQSFNN-TLNKIRLNGNVRLNKTSLLLSVC-SPMLRVLRLIATKIKHLTNHMFDPCSELSELDLGGNEISNLSQSMFRGFKQL 357
I.punctatus DISYCGQNRTMLWNITDKTFLNSVKVLNLTAVHIPEENIAAILHEVSWASLFKLRLNELKRMNTKTLLQYAC-LPGIRVLRMQRNKISKLTAYMLDPCSNLTELDFGDNEISYISLPVFKELTQL 365
T.rubripes NLRGTFKKRQVTWDV--RTFLGNVSLLDISELRLSLRYMTSLLASVNS-SLTVLRMDKMS-CSLAELINISCSIPTMSALQLQNNKLGSINSSVFHLCTNVKDLDLQRNQINSTDEGAFRSMKEL 337
:: : : *:: :::: .:. * : :.:. . * .. * :*: * * * : ::: .:: :. .:. *.::.::*. *:* * : :*
S.salar STLRLGHNMLSSVPDATRNVSTLKFLDLSFNIILKLGCSDFANLTGLTQLFLFHNQISNLPGCVFKDLKELRILKLGSNKILTLNDDFMSGLYKLEYLSMSYNKLSSISKGDFKGLASIKALLLF 493
O.mykiss STLKLGHNRLSSMPKATRNLPTLKILDLSFNIIHKLGCSDFSNLTGLTQLFLFHNQISNLPGCVFQDLKDLRILKLGSNKILTLNDDFMSGLHKLEFLSMSYNKLSSISKGDFKGLASLKTLLLF 497
C.idella KKLLLQINKLTQITNSFQILTTLEFIDLSRNSINKLTCNDFANLTQVKTLYLYGNKISLIRSCLFKDLKSLEVLKLGTNDLLRIDDAFSNGPHSLKDLQINFNKLSKIEKYTFRNLSQLNSLTLN 497
C.carpio KTLRLQINKLTQITNSFQMLSTLEFIDLSRNSIDTLTCNDFANLTQLKNLYLYSNKISIIKSCLFKDLKSLEVLKLGTNNLLRIGDAFSNGPYSLVELQLTFNKLSKIEKYTFRNVSQLNSLSLQ 478
D.rerio KKLQLQINKLTRVTNSFQILTSLEFIDLSRNHIHKLSCNDFANLTQVKTLYLYSNKISSIRSCLFKDLKSLEVLRLGTNNLLKIDDVFSNGPYFLKELQLSYNKLSLIKSHTFGNLPQLNNLSLE 470
I.punctatus RVLHLQINRLTKVENLFRNLPLLEFLDLSRNRITRLTCSDFANLTQLSSLYLYSNRISKLPSCAFKDLNNLEILRLGSNKLLTIDTAFENDLPSLKVLQLTYNKLSTLPKESFKGLSNLRTLDIG 489
T.rubripes KVLTLSDNRLQSVPVATRNLPNLMKLDLSKNKINALHCDDFANITKLRHLKLNANLISALPSCVFKEVTKLEVLKLQNNSISQLNTAFKMYLPNLKQLHLNSNKLVAINHGEFGGLRSLQNLSLH 458
* * * * : : :. * :*** * * * *.**:*:* : * * * ** : .* *:::..*.:*:* .*.: :. * * *: . *** : * .: .:. * :
S.salar DNQIASLEDGAFEGLVNLAELRLQSNKITQIDIR--KTVLSGLPRLRTLDISCNYITYVNDHKGNPPPFSHLTSLENLLIFSQRHKGLCHLPINFLEGLKSLLSFEAGSLNIKELHPDTFIHTPQ 618
O.mykiss DNQIASLEDGAFEGLVNLTELRLQSNKITQIDIR--NTVLTGLPHLRTLDISCNYITYVNYDKLDPPPLSHLTSLENLLIFSQRHKGLCHLPINFLEGLTSLLSFQAGSLNIKDLHPDTFIHTPQ 622
C.idella DNQISEIEAQAFKGLKNLTSLFLSSNKITAKTLTRHPNVFSGMPNLQNLDLYANSISFA-DNKLKHPPFKDLKQLRVLTLHSQR-RGINKIPSNLLQGLSSMEMFYVGNTNLGHLNPDTFKFSPQ 612
C.carpio DNQISEIESHAFGGLKNLTYLLLSSNKISAKTLTKNQDVFSGMPNLKSLGLDTNSISFS-DDQLKFPPFKDLKHLRVLALHSQR-RGIGKIPSNLLQGLSSLEMFYAGNINLAHLNPDTFKFSPQ 603
D.rerio DNQISEIEGYAFGGLENLTSLFLSSNKITGKTLTTHPNVFSGMPNLQNLDLFANSISFA-YDKLKYPLFKDLKNLRELSLYSQR-RGIGQLPSNLLEGLSSLQMFYIGNTNLNQLNPNLFNFTPQ 604
I.punctatus ENQISEIEPHAFSGLLNLTELLLSSNRITDKAIR-DEEVFSGMPELKTLEIYSNLISYV-DDTLRMPPFLLLGSLEILSIHSQR-RGFGKIPSNLLQGLTSLKMFYGGSMNLKYLHPDTFSSTPK 613
T.rubripes SNQIKKLGMGSFLGLKNLTDIHLQLNMIETEQIAG--GVFNDLINLRRLDLSNNHIRYYNSRPLRNPPFLHLSLLETLYIPSQRRRGRSQLPSNILKGLSNLLEFTCRNSQLVWLPVDTFSYTPR 583
.*** .: :* ** **: : *. * * : *:..: .*: * : * * : * : * *. * : *** :* ::* *:*:**..: * . :: * : * :*:
S.salar LWFLDISKNEFT---ALTLKLFHPIPSLNSLYLSKARLQSLDFLIGANLSRVTFLQVRKNDITVVNETVLHSLPALTYLDMQDNAFTCGCSDAWFVNWMENDNQTQVVGAGEFTCNYPADLKDTK 741
O.mykiss LWFLDMSKNEFT---ALTPKLFHPTPSLNRLYLPKARLQSLDFLKGANLSRVTFLQVRKNDITAVNETVLQSLPALTYLDMQDNPFTCGCSDAWFVQWMESNNQTQVVGAGEFTCNYPADLKDTK 745
C.idella LWFLDLSKNALSEDNSIPAELFHPISRLTKLILSRTQLRSLNFLLNANLSRLSTLRAPGNEIDTINKTLIQSLPRLEVLDLQRNTFTCDCHNEFFIEWAMKTNSTQVFYFNRYTCSYPRSLRGMS 737
C.carpio LWFLDLSKNALSEDHSTPAELFHPISRLTKLILSRTQLRSLNFLLNANLSRLLSLKASGNEIDTINKTLIQSLPRLEVLDLGKNTFTCDCTNEFFIDWAKNSNSTQVLYLNKYMCSYPSSLRGMS 728
D.rerio LWFLDLSKNALREDDAIPPELFHPIPNLTKLIISRTQLRSLNFLLGANLNKLSTLRASGNEIDSVNETLIKSLPRLAVLDLQNNTFTCDCNNAFFIDWAKKNESTQVYYLSRYTCSYPRTLRGTS 730
I.punctatus LWFLDLSKNSFADDKSITANVFHPIPKLSKLIISRSQIHSLNFVLNANLSRLSVIKASENMLDVINQTLIRSLPKLRFLDLMKNTFTCDCNNAFFIEWALKSNYTQVVYLSRYTCSYPLSLRGKS 738
T.rubripes LQRLDISSNEFQD---LSPALFHPIKDVRSLYISRTRLGSLEFLKDARLGKLNFLQSKRNVFSVISEDVLESLPELVYVDFQGNNFTCDCDNAGFLQWVKENNKTQVFDAYNFECNYPLELKSKK 706
* **:*.* : . :*** : * :.:::: **:*: .*.*.:: :: * : :.: ::.*** * :*: * ***.* : *::* . : *** .: *.** *:. .
S.salar LLDVELQFCTVHLGLYYYISTTCLVLLTLVASFAYHFLKWQVIYGYYLILAFLYDTKQRNKLTPHGCQYDAFISYNAHDEPWVLR----ELEGEQGWKLCLHHRDFQPGKPIIDNIMEGIYGSRK 859
O.mykiss LLDVELQFCTVDLGLYYYISTTCLVLLTLIASFAYHFLKWEVIYGYYLFLAFLYDTKQRNKHKPHGCQYDAFISYNAHDEPWVLRELLPELEGEQGWKLCLHHRDFQPGKPIIDNIMDGIYGSRK 867
C.idella LTAFNIESCTLNIDFICFLCSSIVVTLTLLLSFVWHFLRYQVIYAYYLFLAFLYDNKKKQTVST--IRYDTFISYNTEDEPWVMEELVPKLEGEQGWKLCLHHRDFVPGRPIIDNIIDGIYSSRK 858
C.carpio LSAFNTESCTLNIDFICFLCSSIVVILTLLLSFVWHFLRFQVVYAYYLFIAFLYDNKKKQSGST--FQYDAFISYNAKDEPWVMEELIPKLEGEQDWRLCLHHRDFEPGRPIIDNIIDGIYSSRK 849
D.rerio LAEFNTDSCTFNWDYICFVCSSILVILTLLLSFIWNFLRYQVVYTYYLFLAFLYDSRRNQSGQT--FQYDAFISYNTLDEAWVMEELIPKLEGEQGWRLCLHHRDFEPGRPIIDNIVDGIYSSRK 851
I.punctatus ILDLKTEWCNVNIDFIMFVLSSVIVTLTLLVSFIYQFFQWQILYAYYLFVAFLYDSKRKQIHQQHGYKYDAFISYNARDEPWVVKELLPNLEGEQGWRLCLHHRDFEPGRSIIDNIMDGIYSSRK 861
T.rubripes LLDLDTQSCTVNTDFICFISTTCTILLFMAMSFTYHFLRWQLTYAYYFFLALLADKKRKNQQTP--RQYDAFVSYNAHDEHWVLRNLLPKLEEEQGWALCLHHRDFEPGKPIIENITDAIYGSRK 826
: .. : *... . :: :: : * : ** ::*::::: * **:::*:* *.::.: :**:*:***: ** **:. :** **.* ******** **:.**:** :.**.***
S.salar TICVISRRYLESEWCSREIQVASFRLFDEQKDVLILVFLEEIPTHQLSPYHRMRKLVKR----------------------------------------------------- 918
O.mykiss TICVISHRYLESEWCSREIQVASFRLFDEQKDVLILVFLEEIPTHQLSPYHRMRKLVKKRTYLSWPRVGEHTGVFWQQLRLALETKERPAEE--------NPILSGVQAL-- 969
C.idella TICLITRNYLKSNWCSSEVQVASYRLFDEQKDVLILVFLEDIPAHQLSPHHRMRKLVKKRTYLRWPKPGEDTKIFWQKLKMALETKEGHNPE--------SAIL-------- 954
C.carpio TTCLITRNYLKSNWCSSEVQVASFRLFDEQKDVLILVFLEDIPTHQPSPYHRMRKLVKKRTYLRWPKPGEDTKVFWQKLKMALEVKEGHKSD--------FLIP-------- 945
D.rerio TICLITRNYLKSNWCSSEVQVASFRLFDEQKDVLILVFLEDIPTHQLSPYHRLRKLVKKRTYIRWPKPGEDNKIFWQKLKMALETKDSHKSE--------NCIL-------- 947
I.punctatus TICVITNNYLRSTWCSKEIQMANFRLFDEQKDVLILIFLEDIPTHQLSPYHRIRKLVKKKTYLKWPQNGEYTRFFWQKLRMALETKEGPEGE--------KPLLNGQGECDY 965
T.rubripes TICVISRRYLESEWCSREIQVASFRLFDEQKDVLILIFLEDIPTRQLSPFYRMKKMLKSKTYLSWPRAEGHPEVFWEKLRQALLSKDMLDLKPLARGISHKVILSASGS--- 935
* *:*:..**.* *** *:*:*.:************:***:**::* **.:*::*::*
Figura 13: Alineamiento múltiple de TLR22 en peces. En rosado se destaca péptido señal. En
rojo secuencias LRR, en naranjo LRR-CT, en azul región transmembrana y en verde dominio
TIR. (*) se encuentra el mismo residuo, (:) residuos similares, (.) residuos parecidos en tamaño y
disposición espacial. Analizado por SMART. Salmón: S. salar, Trucha: O. mykiss (GenBank
NP_001117891.1), pez globo ocelado: T. rubripes (GenBank NP_001106664.1), pez cebra: D.
rerio (GenBank NP_001122147.1), pez gato: I. punctatus (GenBank AEI59679.1), carpa china:
C. idella (GenBank ADX97523.1) y carpa común: C. carpio (GenBank ADR66025.1).
62
4.1.3. Clonamiento de TLR5M
Para amplificar la mayor parte posible de la región codificante del TLR5 de membrana, TLR5M,
se utilizaron 4 juegos de partidores, juego A, juego B, juego C y juego D, utilizando como hebra
de referencia la secuencia ya descrita en el banco de datos para el receptor TLR5M en trucha
(GenBank NM_001124744.1), como se muestra la Figura 14. Una vez obtenidos los productos
esperados de la reacción de PCR de cada juego de partidores, se clonaron y se enviaron a
secuenciar. Los tamaños esperados son para el juego A un producto de aprox. 1283 pb., para el
juego B un producto de aprox. 1358 pb., para el juego C un producto de aprox. 1288 pb., y para
el juego D un producto de aprox. 800 pb., como se muestra en la Figura 14.
Una vez analizada, estudiada y ensambladas las secuencias obtenidas de cada producto de PCR se
dedujo una secuencia nucleotídica, para el receptor TLR5M de salmón, de un tamaño de 2637
pb., la que se puede observar en la Figura 15, la secuencia ya está publicada en NCBI con el N°
de acceso HQ664667.1. La que fue analizada por BLAST y se obtuvo un 96% de identidad con la
secuencia de trucha utilizada como molde.
63
A
B
Figura 14: Ubicación de los partidores en la secuencia de trucha y producto de para el
receptor TLR5M en salmón. A: Se observa una representación de la secuencia de cDNA del
TLR5 de Membrana (TLR5M) en trucha, con un tamaño de 2640 pb., indicando la ubicación de
cada partidor. En rojo el juego A, en amarillo juego B, en azul juego C y en verde juego D de
partidores, señalando el tamaño del producto esperado en cada caso. B: Fraccionamiento, en gel
de agarosa 1%, de los productos obtenidos. A: juego A de partidores. B: juego B de partidores. C:
juego C de partidores. D: juego D de partidores. En carril 1: Estándar de tamaño molecular de
100 pb. Carril 2: 10 µL de cada producto de PCR.
64
ATGATGAGGAACCTTATACTGCTGGCTATCTTTGGAGAATACCTGCAGGTGGTGAAATGC 60
ACCCCAAAATGCCCAATATATGGCTCTATAGCAGCTTGCACCAGCCAGTCTCTACATCAG 120
GTCCCTGCGCTGCCTCCATACATTACCATTGTGTATATGAGGGATAACTACATCAGTGAG 180
ATCAATGAGACATCCTTCTCTGGGCTTGAAGGGTTAACGGAACTGGACCTCAGTTGGCAA 240
CAGGTGAATGGGCTTATTATAAGAACTAACACCTTTCAAAGGCTGGAAAACTTGGCAGTG 300
CTTTATTTAGGGTATAACACAGGTTTACAAATTGAGCCAGATGCGTTTGTGGGACTGTCC 360
AACCTGAGAGCTCTCTCGCTGTATAGGTGTGACCTGACTGAATCTATTTTACAGGGTGAC 420
TATCTCAGGCCCCTGGTTTCCTTGGAAACACTAGATCTGTATGGTAACCAGGTGAAAAGA 480
ATCCAACCTGCTCTGTTCTTTGTGAACATTACAGATTTCCATGAACTAAACGTTTCCCTA 540
AACCAGATGGAATACATATGTGAGGAAGATTTGCTTGGCTTTCAAGGCAAACACTTTCGC 600
CTCCTCAAGTTGAACAGCCTCTATCTAAATAGCATGACTCAGTATGGCTTTGACTGGAAA 660
CGATGCGGAAATCCTTTTCGGAACATGTCCATGGAGACACTTGATTTATCTTCCAATGGA 720
TTCGATGTGGACAAGGCAAAACTGTTTTTCAATGCAATCCGAGGGACAAAAATCCACCAT 780
CTTATTCTGGAACACAGCACCATGGGGAAATCATTTGGTTTCAGCAACGTGAAAGACCCA 840
GACAGGCAAACATTTGAGGGCCTCAAGAATAGTAGTGTCAAGATTCTAGATTTGTCCAAA 900
TGCTTTATATTTACATTGCAATATGCAGTATTCAGTCCGCTGAGAGAGGTAGAGGACATA 960
ACAATAGCCCAAAACAAAATTAACCAGATTGACAGGGAGGCGTTTTTTGGTCTTCAAAAT 1020
CTACAAAAGCTCAACCTATCACACAATCTTATAGGGGAAATCTATTCTTACACGTTTGAC 1080
AAACTACCCAATATTTTAGAACTAGATTTATCTTACAACCATATTGGTGCATTGGGATAT 1140
CATGCATTTAAAGGACTTCCAAACCTACAATTTCTGGATCTTACAGGAAACTCTATTCGG 1200
GAACTAGGTACATATGGTTCCCTTGCACCACTACCAAACATCCAACATCTTCGTTTGGCT 1260
GATAATAAGATTACATCCTTAGAGGGCCTCGCTGGCTTTGCTGATAGTACGATCATACTT 1320
AATATTCAAAACAACAGGTTAACTAATTTAGAGGATGTATACATTGTTTTAGCTAAATTA 1380
ATGCACATTAAGCTTCTCTGGTATGGTAACAACTTCATAAAGTGGTGCACCGTTAACAAT 1440
AATATTTCAGTGCCAGCTGTGAACTATTTAAAGCTGCTTGAGCTAAGGAACATCGCCTTG 1500
CAGGTGATATGGGCACGGGGAGAGTGTTTGCATGTTTTTGAAAATCTTGGCAACCTTTTT 1560
AGTCTGGATTTAAGCTTGAACTCCCTGCAGGCTCTCCCAGATGGTATATTTAAAGGCCTC 1620
ATCTCTCTGGAAGAGATGAGATCTCCACTTCAACTTCCTCACATACCTCCAACCAGACAT 1680
TTTCCCAGAGACTCTCAAAACACTTCACCTCCCTTACAATTCCTGGCCTCTCCTGACCCA 1740
GCGGCTTTCCATTCTCTCAGCTGGATCAACCTGTATAGGAATCAATTCCACTGTGACTGC 1800
GGTCTGGAGGACTTTCTGACGTGGCTGAAAGGGACTAACGTGACTTTTCCTGACCCTGGC 1860
GTGAATGAATTTAGCTGTGAGTTTCCTTCAGATCTCCATGGCATCAGCCTGTTGAATTAC 1920
AGCTCAGTCATATCGTGTGAGGAGGATGACGAGAGGCTGGTTCAGGAGCTGAGGCTCTCG 1980
CTCTTCATCGGCTGCACAGCGCTCATCATCCTGACCATGGTCGGAACAATCGTTTTCGCT 2040
CGTCTCCGTGGATTCCTCTTCAAAGTTTACAAAAAGTTGACCGCCAGGATCCTTGAGGGC 2100
CCTAGGAGGGATCTTTCTGCTGGTGGGCCTCGGTACGACGCTTACTTATGCTTCAGCAAC 2160
AACGACTACAAGTGGGTAGAAACCGCCCTGTTGAACAGACTAGACTCTCAGTTCTCGGAG 2200
CGAAACGTCCTCCGCTGCTGCTTCGAGGTCAGAGACTTCATCCCAGGTGAAGATCACCTG 2280
TTCAATATCAGGGACGCCATATGGGGGAGCAGGAAGGCGGTTTGTATTGTGTCTAAAGAG 2340
TTCCTCAAGGACGGCTGGTGCCTGGAGGCCTTTACCCTGGCTCAGAGCAGGATGCTGGAG 2400
GAGCTCAGAGATGTTCTCATCATGGTGGTTGTGGGGAATGTCCCCCATTACAGACTGATG 2460
AAACATGAAGGCATTAGGACCTTTGCCCGGAAGAGGGAGTACCTGCAGTGGCCGGAGGAC 2520
ACACAGGATATTCAATGGTTCTATGAGAAGCTCATGTCCAAGATTCTTAAGGACAAAAAC 2580
GAACACCGCCAAAGATAACAATGGGGATATCACACTTGTAAATATGACAGTTGGAAC 2637
Figura 15: Secuencia nucleotídica del receptor TLR5M en salmón (Salmo salar) N° de
acceso HQ664667.1. Secuencia nucleotídica de 2637 pb., deducida y analizadas de las
secuenciaciones de los productos de los juegos de partidores A, B, C y D.
65
Una vez traducida la secuencia nucleotídica del receptor TLR5M, se obtuvo una secuencia
aminoacídica de 878 aminoácidos (marco de lectura en posición +1), la que se puede observar en
la Figura 16. La secuencia se analizó para encontrar las regiones características de los TLR:
fueron determinadas 8 LRR, una LRR-CT, la región transmembrana tipo I y el dominio TIR por
análisis con SMART, como muestra la Figura 16. También fueron analizados los residuos
consenso para LRR, LRR-CT y dominio TIR.
Para estudiar la similitud respecto a otras secuencias descritas, que poseen la secuencia
aminoacídica del TLR5M en salmón se realizaron dos alineamientos: Uno para corroborar que la
proteína posea similitud con la secuencia aminoacídica de trucha y también con la secuencia
aminoacídica descrita en humano para el receptor, obteniéndose con la secuencia de trucha un
91% de similitud y con la secuencia de humano un 38% de similitud. Este alineamiento se puede
observar en la Figura 17. El segundo Alineamiento múltiple se realizó para comparar la secuencia
de salmón con la secuencia descrita en otros: el pez dulce (Plecoclossus altivelis), el pez
lenguado japonés (Paralichthys olivaceus) y el pez cebra (Danio rerio) con un porcentaje de
similitud de 52%, 52%, y 46 % respectivamente. En la Figura 18 se puede observar el
alineamiento y sus regiones características.
66
A NH2-MMRNLILLAIFGEYLQVVKCTPKCPIYGSIAACTSQSLHQVPALPPYITIVYMRDNY
ISEINETSFSGLEGLTELDLSWQQVNGLIIRTNTFQRLENLAVLYLGYNTGLQIEPDAFV
GLSNLRALSLYRCDLTESILQGDYLRPLVSLETLDLYGNQVKRIQPALFFVNITDFHELN
VSLNQMEYICEEDLLGFQGKHFRLLKLNSLYLNSMTQYGFDWKRCGNPFRNMSMETLDLS
SNGFDVDKAKLFFNAIRGTKIHHLILEHSTMGKSFGFSNVKDPDRQTFEGLKNSSVKILD
LSKCFIFTLQYAVFSPLREVEDITIAQNKINQIDREAFFGLQNLQKLNLSHNLIGEIYSY
TFDKLPNILELDLSYNHIGALGYHAFKGLPNLQFLDLTGNSIRELGTYGSLAPLPNIQHL
RLADNKITSLEGLAGFADSTIILNIQNNRLTNLEDVYIVLAKLMHIKLLWYGNNFIKWCT
VNNNISVPAVNYLKLLELRNIALQVIWARGECLHVFENLGNLFSLDLSLNSLQALPDGIF
KGLISLEEMRSPLQLPHIPPTRHFPRDSQNTSPPLQFLASPDPAAFHSLSWINLYRNQFH
CDCGLEDFLTWLKGTNVTFPDPGVNEFSCEFPSDLHGISLLNYSSVISCEEDDERLVQEL
RLSLFIGCTALIILTMVGTIVFARLRGFLFKVYKKLTARILEGPRRDLSAGGPRYDAYLC
FSNNDYKWVETALLNRLDSQFSERNVLRCCFEVRDFIPGEDHLFNIRDAIWGSRKAVCIV
SKEFLKDGWCLEAFTLAQSRMLEELRDVLIMVVVGNVPHYRLMKHEGIRTFARKREYLQW
PEDTQDIQWFYEKLMSKILKDKKNTAKDNNGDITLVNMTVG-COOH
B
C
--XLXXLXLXXNXɵXXɵ
LRR1 LENLAVLYLGYNTGLQIEPDAFVG
LRR2 LVSLETLDLYGNQVKRIQPALFFV
LRR3 LREVEDITIAQNKINQIDREAFFG
LRR4 LQNLQKLNLSHNLIGEIYSYTFDK
LRR5 LPNILELDLSYNHIGALGYHAFKG
LRR6 LPNLQFLDLTGNSIRELGTYGSLA
LRR7 LPNIQHLRLADNKITSLEGLAGFA
LRR8 LGNLFSLDLSLNSLQALPDGIFKG
D
RYDAYLCFSNNDYKWVETALLNRLDSQFSERNVLRCCFEVRDFIPGEDHLFNIRDAI
Box1 Box2
WGSRKAVCIVSKEFLKDGWCLEAFTLAQSRMLEELRDVLIMVVVGNVPHYRLMKH
EGIRTFARKREYLQWPEDTQDIQWFYEKLMSKILKD
Box3
Figura 16: Análisis de la secuencia aminoacídica del receptor TLR5M. A: Secuencia de 878
aminoácidos del receptor TLR5M. En rojo las LRR, en naranjo LRR-CT, en azul la región
transmembrana y en verde dominio TIR, subrayado región con residuos (oscuro) consenso en
LRR-CT. B: Esquema SMART para TLR5M, indicando las LRR en rojo, LRR-CT en naranjo, en
azul región transmembrana y el dominio TIR en verde. C: Regiones conservadas en las LRR, en
amarillo residuos consensos. L: leucina o residuos hidrofóbico, X: cualquier aminoácido, N:
puede ser C, S o T, ɵ: cualquier residuos hidrofóbico. D: Box1, Box2, y Box3, residuos y
regiones consenso para el dominio TIR.
67
S.salar MMRNLILLAIFGEYLQVVKCTPKCPIYGSIAACTSQSLHQVPALPPYITIVYMRDNYISEINETSFSGLEGLTELDLSWQQVNGLIIRTNTFQRLENLAV 100
O.mykiss MMRNLILLAIFGEYLQVVKCNPKCPIYGSIAACTSQSLYQVPALPPYITILYMRDNYISEINETSFSGLEGLKELDLSWQQVNGLIIRTNTFQRLENLAV 100
H.sapines MGDHLDLLLGVVLMAGPVFGIPSCSFDGRIAFYRFCNLTQVPQVLNTTERLLLSFNYIRTVTASSFPFLEQLQLLELGSQYTP-LTIDKEAFRNLPNLRI 99
* :* ** . * *.*.: * ** .* *** : : : *** :. :**. ** * *:*. * . * * .::*:.* ** :
S.salar LYLGYNTGLQIEPDAFVGLSNLRALSLYRCDLTESILQGDYLRPLVSLETLDLYGNQVKRIQPALFFVNITDFHELNVSLNQMEYICEEDLLGFQGKHFR 200
O.mykiss LYLGYNTGLQIEPDAFVGLSNLRALSLYRCDLTESILQGDYLKPLVSLETLDLYGNQVKIIQPALFFVNMTDFQELNVSLNRMESICEEDLLGFQGKHFR 200
H.sapiens LDLGSSKIYFLHPDAFQGLFHLFELRLYFCGLSDAVLKDGYFRNLKALTRLDLSKNQIRSLYLHPSFGKLNSLKSIDFSSNQIFLVCEHELEPLQGKTLS 199
* ** .. :.**** ** :* * ** *.*::::*:..*:: * :* *** **:: : * ::..::.::.* *:: :**.:* :*** :
S.salar LLKLNSLYLNSMTQYGFDWKRCGNPFRNMSMETLDLSSNGFDVDKAKLFFNAIRGTKIHHLILEHSTMGKSFGFSNVKDPDRQTFEGLKNSSVKILDLSK 300
O.mykiss LLKLNSLYLYSMTQYGFDWKRCGNPFRNMSMETLDLSSNGFDVDKAKLFFNAIQGTKIHHLILEHSTMGKSFGFSNVKDPDRQTFEGLENSSVKILDLSK 300
H.sapines FFSLAANSLYSRVS--VDWGKCMNPFRNMVLEILDVSGNGWTVDITGNFSNAISKSQAFSLILAHHIMGAGFGFHNIKDPDQNTFAGLARSSVRHLDLSH 297
::.* : * * .. .** :* ****** :* **:*.**: ** : * *** :: . *** * ** .*** *:****::** ** .***: ****:
S.salar CFIFTLQYAVFSPLREVEDITIAQNKINQIDREAFFGLQNLQKLNLSHNLIGEIYSYTFDKLPNILELDLSYNHIGALGYHAFKGLPNLQFLDLTGNSIR 400
O.mukiss CFIFTLQYAVFSPLREVEDITIAQNKINQIDREAFFGLQNVQKLNLSHNLIGEIYSYTFDNLPNILELDISYNHIGALGYQAFKGLPNLQVLDLTGNSIR 400
H.sapiens GFVFSLNSRVFETLKDLKVLNLAYNKINKIADEAFYGLDNLQVLNLSYNLLGELYSSNFYGLPKVAYIDLQKNHIAIIQDQTFKFLEKLQTLDLRDNALT 397
*:*:*: **..*:::: :.:* ****:* ***:**:*:* ****:**:**:** .* **:: :*:. ***. : ::** * :** *** .*::
S.salar ELGTYGSLAPLPNIQHLRLADNKITSLEGLAGFADSTIILNIQNNRLTNLEDVYIVLAKLMHIKLLWYGNNFIKWCTVNNNISVPAVN-YLKLLELRNIA 500
O.mykiss GLGTYGSLAPLPNIQLLRLADNKITSLEGLSVFAPSTIILNVQNNRLTNLEDVYTVLAKLMHIEFLWYGNNFIKWCTLNNNISVPAVN-SLKLLELRNIA 500
H.sapiens ------TIHFIPSIPDIFLSGNKLVTLPKINLTAN---LIHLSENRLENLDILYFLLR-VPHLQILILNQNRFSSCSGDQ---TPSENPSLEQLFLGENM 487
:: :*.* : *:.**:.:* : * ::::.:*** **: :* :* : *:::* .:* :. *: :: .*: * *: * * :
S.salar LQVIWARGECLHVFENLGNLFSLDLSLNSLQALPDGIFKGLISLEEMRSPLQLPHIPPTRHFPRDSQNTSPPLQFLASPDPAAFHSLSWINLYRNQFHCD 599
O.mykiss LQMIWARGECMHVFQHLGKLLSLDLSFNSLQAPPDGIFKGLISLEEMDLHFNSLTYLKQDIFPESLKTVDLSYNFLASPDPEAFHSLSWINLYRNQFHCD 599
H.sapiens LQLAWETELCWDVFEGLSHLQVLYLNHNYLNSLPPGVFSHLTALRGLSLNSNRLTVLSHNDLPANLEILDISRNQLLAPNPDVFVSLSVLDITHNKFICE 584
**: * * .**: *.:* * *. * *:: * *:*. * :*. : : :* . : . . : * :*:* .* *** ::: :*:* *:
S.salar CGLEDFLTWLKGTNVTFPDPGVNEFSCEFPSDLHGISLLNYSSVISCEEDDERLVQELRLSLFIGCTALIILTMVGTIVFARLRGFLFKVYKKLTARILE 699
O.mykiss CGLEDFLTRLKGTNVTFPDPGVNEFSCEFPSDLHGISLLNFSSVISCEEDDERLVQELRLSLFIGCTALIILIMVGSIFFTRLRGFLFKVYKKLTARILE 699
H.sapiens CELSTFINWLNHTNVTIAGP-PADIYCVYPDSFSGVSLFSLS-TEGCDE--EEVLKSLKFSLFIVCTVTLTLFLMTILTVTKFRGFCFICYKTAQRLVFK 680
* *. *:. *: ****:..* :: * :*..: *:**:. * . .*:* *.:::.*::**** **. : * :: : .:::*** * **. :::
S.salar GPRRDLSAGGPRYDAYLCFSNNDYKWVETALLNRLDSQFSERNVLRCCFEVRDFIPGEDHLFNIRDAIWGSRKAVCIVSKEFLKDGWCLEAFTLAQSRML 799
O.mykiss GPRRDPSADGPRYDAYLCFSNNDYKWVETALLNRLDSQFAERNVLRCCFEVRDFIPGEDHLFNIRDAIWGSRKTVCIVSKGFLKDGWCLEAFTLAQSRML 799
H.sapiens DHPQGTEPDMYKYDAYLCFSSKDFTWVQNALLKHLDTQYSDQNRFNLCFEERDFVPGENRIANIQDAIWNSRKIVCLVSRHFLRDGWCLEAFSYAQGRCL 780
. :. ... :********.:*:.**:.***::**:*::::* :. *** ***:***::: **:****.*** **:**: **:********: **.* *
S.salar EELRDVLIMVVVGNVPHYRLMKHEGIRTFARKREYLQWPEDTQDIQWFYEKLMSKILKDKKNTAKDNNGDITLVNMTVG- 878
O.mykiss EELRDVLIMVVVGNVPHYRLMKHEGIRTFAQKREYLQWPEDTQDIQWFYEKLMSKILKDKKYTSKDNNRDITLVNMTVGT 879
H.sapiens SDLNSALIMVVVGSLSQYQLMKHQSIRGFVQKQQYLRWPEDLQDVGWFLHKLSQQILKKEKEKKKDNNIPLQTVATIS-- 858
.:*...*******.:.:*:****:.** *.:*::**:**** **: ** .** .:***.:* . **** : *
Figura 17: Alineamiento entre salmón, trucha y humano para TLR5M. En rosado se muestra
péptido señal. En rojo regiones LRR. En naranjo LRR-CT. En azul región transmembrana. En
verde dominio TIR. Análisis realizado por SMART. Salmón: S. salar, Trucha: O. mykiss
(GenBank NP_001118216.1), Humano: H. sapiens (GenBank AAI09119.1). (*) se encuentra el
mismo residuo,(:) se encuentran residuos similares (iguales características químicas), (.) se
encuentran residuos parecidos en tamaño y disposición espacial.
68
S.salar MMRNLILLAIFGEYLQVVK-----CTPKCPIYGSIAACTSQSLHQVP-ALPPYITIVYMRDNYISEINETSFSGLEGLTELDLSWQ-QVNGLIIRTNTFQ 94
O.mykiss MMRNLILLAIFGEYLQVVK-----CNPKCPIYGSIAACTSQSLYQVP-ALPPYITILYMRDNYISEINETSFSGLEGLKELDLSWQ-QVNGLIIRTNTFQ 94
P.altivelis MATKRRNVALLAVLVYLDAAISKECFLQVSLSETKAHCSGCLLREVPKLLPPSTTHLDISSNYILEVNATSFSGLWKLLELNLAWQ-QGEGLTIRSNTFL 99
P.olivaceus MWTLAPQLAFIGLYLQVTA-----CYPSCTLYGLVAACSSQGHYWVP-ALPPNITHLYLEMNYISEINSTALRPYEQLQELDLGMQSESVQLVIRNNAFS 94
D.rerio -MGYTFILILFGLCLNTEVVK---STSVCSVIGYNAICINRGLHQVP-ELPAHVNYVDLSLNSIAELNETSFSRLQDLQFLKVEQQ--TPGLVIRNNTFR 95
: ::. : . .: * * . ** **. . : : * * *:* *:: * *.: * * **.*:*
S.salar RLENLAVLYLGYNTGLQIEPDAFVGLSNLRALSLYRCDLTESILQGDYLRPLVSLETLDLYGNQVKRIQPALFFVNITDFHELNVSLNQMEYICEEDLLG 193
O.mykiss RLENLAVLYLGYNTGLQIEPDAFVGLSNLRALSLYRCDLTESILQGDYLKPLVSLETLDLYGNQVKIIQPALFFVNMTDFQELNVSLNRMESICEEDLLG 193
P.altivelis YLRDLRRLYLGNSLRLHLEPFAFVGLSNLRLLSMFKCGLNESVLEDRYLSPLVSLEILDLFANNVQRIRPAPFFANMMELKELNLTLNRMGRICETDLVH 199
P.olivaceus KQRKLIRLVLGNNIHLQLEPRAFVGLFRLQQLFLDHCTLNESILADNYLQPLFSLEMLDLLGNQIKRLQPGLFFSSLRKFTQLNLKLNPIKRLCEDDLVG 194
D.rerio GLSSLIILKLDYNQFLQLETGAFNGLANLELLTLTQCNLDGAVLSGNFFKPLTSLEMLVLRDNNIQKIQPASFFLNMRRFHVLDLTFNKVKSICEEDLLN 193
.* * *. . *::*. ** ** .*. * : :* * ::* . :: ** *** * * *::: ::*. ** .: : *::.:* : :** **:
S.salar FQGKHFRLLKLNSLYLNSMTQYGFDWKRCGNPFRNMSMETLDLSSNGFDVDKAKLFFNAIRGTKIHHLILEHS-TMGKSFGFSNVKDPDRQTFEGLKNSS 292
O.mykiss FQGKHFRLLKLNSLYLYSMTQYGFDWKRCGNPFRNMSMETLDLSSNGFDVDKAKLFFNAIQGTKIHHLILEHS-TMGKSFGFSNVKDPDRQTFEGLENSS 292
P.altivelis FKNKHFRLLDLKSVYLKDMNEEGFDWEVCGNPFRSMSFDTLDLSVNGFDINMLTRFFKAIEGSKISHLVVKH--GVGKGFSYNNFRDPDKRTYEGLRSSE 297
P.olivaceus FRGKYFTILNLNSNHLAKMYEGDFDEGSGGNPFRDMAFHTLDLSSNGFNVDQTRRFFKAIQGTPIAHLILSG--HIGRGFSYDNLPDPDESTFEGLSNSA 292
D.rerio FQGKHFTLLRLSSITLQDMNEYWLGWEKCGNPFRNSSITTLDLSGNGFKESMAKRFFDAIAGTKIQSLILSNSYNMGSSFGHTNFKDPDNFTFKGLEASG 293
*:.*:* :* *.* * .* : :. *****. :: ***** ***. . **.** *: * *::. :* .*.. *. ***. *::** *
S.salar VKILDLSKCFIFTLQYAVFSPLREVEDITIAQNKINQIDREAFFGLQN-LQKLNLSHNLIGEIYSYTFDKLPNILELDLSYNHIGALGYHAFKGLPNLQF 391
O.mykiss VKILDLSKCFIFTLQYAVFSPLREVEDITIAQNKINQIDREAFFGLQN-VQKLNLSHNLIGEIYSYTFDNLPNILELDISYNHIGALGYQAFKGLPNLQV 391
P.altivelis IKTLDLSNGHIFALQEEVFRPFGSAEEINLSYNTINQINAGAFRGLER-LATLNLSRNLLGEIHRHTFENLHSLSVLDLSYNNIGAFEHNALNGLLNLQG 396
P.olivaceus VNVFDLSKNFIFVLQRAIFSPLKTVVTIDISKNKINQIQRNAFNGLQGHLSILNLSSNLLGEIYSDTFANLKNLSALDLSYNHIGALGHQAFSDLPELRW 392
D.rerio VKTCDLSKSKIFALLKSVFSHFTDLEQLTLAQNEINKIDDDAFWGLTH-LLKLNLSQNFLGSIDSRMFENLDKLEVLDLSYNHIRALGDQSFLGLPNLRN 392
:: ***: **.* :* : : :: * **:*: ** ** : **** *::*.* * :* .: **:***:* *: ::: .* :*:
S.salar LDLTGNSIRELGTYGSLAPLPNIQHLRLADNKIT--SLEGLAGFADSTIILNIQNNRLTNLEDVYIVLAKLMHIKLLWYGNNFIKWCTVNNNISVPAVNY 489
O.mykiss LDLTGNSIRGLGTYGSLAPLPNIQLLRLADNKIT--SLEGLSVFAPSTIILNVQNNRLTNLEDVYTVLAKLMHIEFLWYGNNFIKWCTLNNNISVPAVNS 489
P.altivelis LDLRGNSIRIIP---TLSPLPKLLILRLDDNKIVPQSLPGIISLASNSLILNVQNNRLTNLEDVYTLLSNLQHLQMLQYGSNFIMWCTLNGNISIPVSNS 493
P.olivaceus LFLTGNSLRDLG---SPASLPNLDFLLLGDNKLK--SVHSIANLGMNSTHVDIRDNRLTNLDDFYSIVTDFKRLQNFFYSSNFIKGCTLSKNITIPYNNT 487
D.rerio LNLTGNAVESVH---TFAALPNLNKLYLGKNRIS--SVSSLPNIAHNLSTLDLEFNKLHALSDLYTILREFPQIENIFLQGNTFSSCYNQK--QIVLSDK 487
* * **::. : : :.**:: * * .*:: *: .: :. . :::. *:* *.*.* :: .: ::: : .* : * . : :
S.salar LKLLELRNIALQVIWARGECLHVFENLGNLFSLDLSLNSLQALPDGIFKGLISLEEMRSPLQLPHIPPTRHFPRDSQNTSPPLQFLASPDPAAFHSLSWI 589
O.mykiss LKLLELRNIALQMIWARGECMHVFQHLGKLLSLDLSFNSLQAPPDGIFKGLISLEEMDLHFNSLTYLKQDIFPESLKTVDLSYNFLASPDPEAFHSLSWI 589
P.altivelis LKVLDLERSSLQTIWAQGKCLDLFNNLSQLDILTLNHNSLQSLPQGIFKGLNSVTFIDLSFNLLTYLQPDIFPKSLVRVDLSYNVLAHPDPLALRSLRFI 593
P.olivaceus LRVLDLSDSSLQIIWAQGKCLDVFDHLNNLLGLSISSNSLTALPQGIFRGLSSIIELDLSTNSLTFLQPDVFPVSLNKLDLSNNFLAFPDPMTFQSLLFL 587
D.rerio LQLLHLGLSSMQLIWSEEKCLNVFADLHQLQQLSLTANGLQSLPKDIFKDLTSLFFLDLSFNSLKYLPTDVFPKSLQILNLDYNSIYSVDPNLFSTLGYL 585
*::*.* ::* **:. :*:.:* .* :* * :. *.* : *..**:.* *: : : ** . . : : ** : :* ::
S.salar NLYRNQFHCDCGLEDFLTWLKGTNVTFPDPGVNEFSCEFPSDLHGISLLNYSS-VISCEEDDERLVQELRLSLFIGCTALIILTMVGTIVFARLRGFLFK 688
O.mykiss NLYRNQFHCDCGLEDFLTRLKGTNVTFPDPGVNEFSCEFPSDLHGISLLNFSS-VISCEEDDERLVQELRLSLFIGCTALIILIMVGSIFFTRLRGFLFK 688
P.altivelis NLAGNLFYCDCNLVGFLTFLNTTNATFLSP-TEELRCEFPSQFHGTRLQELN--TEGCEADDEAQVRALKLSLFIVCTVFLVIIIAGAIAFAHLRGYLFN 690
P.olivaceus NLAENRFYCDCNLESFLQWLNVTNVTLLSP-AEGFRCEFPAALHNLPLLDYATIVEPCEKDDEMAVQDLKFALFIFSALLIITVTLSGVIYARLRGHIFV 686
D.rerio SLMNNDFRCDCDLKDFQTWLNQTNVTFVHS-IEDVTCASPEDQYMVPVVRSS--IQCEDEEEERRTEKLRLVLFISCTVLIILFTASTIVYISRRGVIFK 682
.* * * ***.* .* *: **.*: . : . * * : : : ::* .. *:: *** .: ::: . : : ** :*
S.salar VYKKLTARILEGPRRDLSAG---GPRYDAYLCFSNNDYKWVETALLNRLDSQFSERNVLRCCFEVRDFIPGEDHLFNIRDAIWGSRKAVCIVSKEFLKDG 785
O.mykiss VYKKLTARILEGPRRDPSAD---GPRYDAYLCFSNNDYKWVETALLNRLDSQFAERNVLRCCFEVRDFIPGEDHLFNIRDAIWGSRKTVCIVSKGFLKDG 785
P.altivelis LYKRVKGRILQGPPQEPATDPDADAPYDAFLCFSNHDYQWVETALLKRLDAQFSDDNVLRCCFEARDFLPGENHLSNIRDAVFASRMTVCVVSREFLRDG 790
P.olivaceus IYKKIVGRVLEGPKPTPTVE---EVQYDVFFCFSNSGYGWVEAALLKKLDNQFSEENVFHCCFEVRDFLPGEDHLSNIRDAIWGSRKTVCVISKEFLKDG 783
D.rerio MYKKLIGELVDEKREEPDPD---RFLYDVYLCFSSKDMKWVERALLKRLDSQFSEHNTLRCCFEERDFIPGEDHLTNMRSAIQNSRKTICVVSEHFLKDG 759
:**:: ..::: **.::***. . *** ***::** **:: *.::**** ***:***:** *:*.*: ** ::*::*. **:**
S.salar WCLEAFTLAQSRMLEELRDVLIMVVVGNVPHYRLMKHEGIRTFARKREYLQWPEDTQDIQWFYEKLMSKILKDK--KNTAKDN---------NGDITLVN 874
O.mykiss WCLEAFTLAQSRMLEELRDVLIMVVVGNVPHYRLMKHEGIRTFAQKREYLQWPEDTQDIQWFYEKLMSKILKDK--KYTSKDN---------NRDITLVN 874
P.altivelis WCLEAFSLAQGRMLEELRNMLIVVVAGKVPHYRLMRQQSIRTFIQKREYLRWPEDEQDLEWFYDRLISQILKN---RKEAKERPDADRNN--TVDVELEN 885
P.olivaceus WCLEAFTLAQTRMVEELTNVLILLVIGKVAHYQLMRYNAIRTFIQKREYLTWPEDPQDLEWFYERLISQILRNTKMKKFAEDKPQPARPQPQNEAIDLED 883
D.rerio WCLETFTLAQKRMQAELEDILVVLVVGNIPQYRLLKYKQVRSFIENRSYLVWPDDGQDLEWFYDQLLHKIRKDIKINQTTKETK--------REEANFNT 871
****:*:*** ** ** ::*:::* *::.:*:*:: : :*:* .:*.** **:* **::***::*: :* :: . ::: :
S.salar MTVG---- 878
O.mykiss MTVGT--- 879
P.altivelis VEVLEMCE 893
P.olivaceus IRAVAM-- 889
D.rerio NTAV---- 875
.
Figura 18: Alineamiento múltiple de TLR5M en peces. En rosado se destaca péptido señal. En
rojo secuencias LRR, en naranjo LRR-CT, en azul región transmembrana y en verde dominio
TIR. (*) se encuentra el mismo residuo, (:) residuos similares, (.) residuos parecidos en tamaño y
disposición espacial. Analizado por SMART. Salmó: S. salar, trucha O. mykiss (GenBank
NP_001118216.1), pez dulce: P. altivelis (GenBank BAI68383.1), lenguado japonés P. olivaceus
(GenBank BAJ16366.1) y pez cebra: D. rerio (GenBank NP_001124067.1).
69
4.1.4. Clonamiento TLR5S
Para amplificar la mayor parte posible de la región codificante del TLR5 soluble, TLR5S, se
utilizaron 2 juegos de partidores, juego A y juego B, utilizando como referencia la secuencia
publicada en el banco de datos para receptor TLR5S en trucha (GenBank NM_001124208), como
se muestra la Figura 19. Una vez obtenido los productos esperados de la reacción de PCR de cada
juego de partidores, se clonaron y se enviaron a secuenciar. Los tamaños esperados son para el
juego A un producto de aprox. 598 pb. y para el juego B un producto de aprox. 1741 pb., como
se muestra en la Figura 19.
Una vez analizada, estudiada y solapada las secuencias obtenidas de cada producto se dedujo una
secuencia nucleotídica, para el receptor TLR5S en salmón, de un tamaño de 1732 pb., la que se
puede observar en la Figura 20. La secuencia ya está publicada en NCBI con el número de acceso
HQ664668.1. La secuencia fue analizada por BLAST nucleotídico y se obtuvo un 95% de
identidad con la secuencia de trucha utilizada como referencia.
70
A
B
Figura 19: Ubicación de los partidores en la secuencia de trucha y producto de PCR para el
receptor TLR5S en salmón. A: Se observa una representación de la secuencia de cDNA del
TLR5 soluble (TLR5S) en trucha, con un tamaño de 2530 pb., indicando la ubicación de cada
partidor en la secuencia de trucha. En rojo el juego A de partidores, en azul juego B de partidores,
señalando el tamaño del producto esperado en cada caso. B. Fraccionamiento, en gel de agarosa
1%, de los productos obtenidos. A: juego A de partidores. B: juego B de partidores. En carril 1:
Estándar de tamaño molecular de 100 pb. En carril 2: 10 µL de cada producto de PCR juego A.
En carril 3: 10 µL de cada producto de PCR juego B.
71
TTCGTGGCAAACACTTTCGGTTGCTCAACTTGAACAGCGTCTATCTATATGGTATGACTC 60
AAAATGATTTTGACTGGAAACGATGTGGAAATCCCTTTAGGAACATGTCTATAGAGACAC 120
TTGACTTATCTTCCAATGGATTCAACGTGGACAAGGCTAAATTGTTTTTCAATGCAATCC 180
AAGGAATGAAAATTCACCATATTATTCTGAAACACAGCACCATGGGAAAATCATTTGGTT 240
TCAGCAATGTCAAAGACCCAAACAAGAAAACATTCAATGGCCTCAAGAATAGTGGCATCA 300
AGATTCTAGATTTTTCCAAATGCTTTATATTTGCTTTGCAATATGCAGTATTCAGTTCAC 360
TAAGAGGGGTAGAGGACATAACATTAGCCCAAAACAAAATTAATCAGATTGACAGGGGAG 420
CGTTTTGGGGTCTTGAAAATTTACAAAGGCTCAACCTGTCACACAATCTTATTGGGGAAA 480
TCTATTCTTACACATTTGACAATCTACCCAATATTTTAGAATTAGATTTATCTTACAATC 540
ATATTGGTGCATTGGGATATCAAGCATTTACAGGACTTCCAAACCTACAAATCCTGGATC 600
TTACAGGAAACTCTATTCGGCAACTAGGTACATATGGTTACCTTGCACCACTACCAAACC 660
TGCAACTTCTTCATTTGGCTGATAATAAGATCACATCCTTAGAGGGCCTCTTGGGCTTTG 720
CTAACAGTACTATCATACTGAATGTTCAAAACAACAGGTTAACTAATTTAGAGGATGTAT 780
ACATTGTGTTAGCTAAATTCATGCGCATTGAGCGTATCTGGTATGGTAACAACAACATTA 840
AGTGGTGCATCTTTAGCAATAATATTTCAGTGCCTGCTGTAACCTCTCTAAAGCTGCTGG 900
AGCTAAGGAACATCGCCCCTGCAGATTTTATGGGGACATGGAGGAGGTTTGGATGTTATT 960
TGAAATCTATCAAGCTTTTTAGTCTGGAATTTAAGCTTAACTCGCTGAGGGCTCTCCCAA 1020
ATGGCATATTCAAAGGTCTCGTCTCTCTGGAAGAGATGGATCTCAGCTTCAACTCTCTCA 1080
CATACCTCCAACCAGACATTTTCCCAGCGAGTCTCAAAACAGTTGACCTCTCTTACAATT 1140
TCCTCTCCTCTCCTGACCCAGCGGCTTTCAGGTCTCTCAGCTGGATCAACTTATATAGGG 1200
ATCGTTTCCACTGTGACGGTGGCCTGAAGGACTTTCTGACGTGGATGAACAGGACTAATG 1260
TGACTTTTCCAGACCCCGGTGTGGCTGAATTCAGCTGTGAGTTCCCCTTGGATCTCCATG 1320
GTGTCAGCCTGTTGAATTACAGCAAAGTCATAATGGAAAAGTACCCAAAACCATCTTTGA 1380
CAAAAATGTAAAACAAGACCATTAGAGTTTGGTATTACGTGTGTCATTTTCCATGCTATC 1440
TACTCTGTTTACGTTTGCTATTGGGAATCACATTTTATTTTGTTGCCTACAATATCCTGA 1500
CTGTCATATGGAATAACGTATGATATAAATACCTCATCAACACATCTTTAGTTTGTCACA 1560
CAGCGTAAAACAAATCAGCCAAAAGACAGTAAAAAGGTGTCTTCCAAAAGCATTATTTCC 1620
AAATGTTTGTATAAAGGAAAATACATATATATATTGTCATTCTGTGCGTTTTTCCGTTAT 1680
CTCACCACAAGACCCAATCCTTTGGGAAGTGTGAGCCCCTGTGGACTACTAA 1732
Figura 20: Secuencia nucleotídica del receptor TLR5S en salmón (Salmo salar) N° de acceso
HQ664668.1. Secuencia nucleotídica de 1732 pb., deducida y analizadas de las secuenciaciones
de los productos de los juegos de partidores A y B.
72
Una vez traducida la secuencia nucleotídica del receptor TLR5S, se obtuvo una secuencia de 462
aminoácidos (marco de lectura en posición +3), la que se puede observar en la Figura 21. La
secuencia se analizó para encontrar las regiones características de los TLR: LRR, LRRCT, región
transmembrana y dominio TIR. Fueron encontradas 8 LRR, una LRR-CT, la región
transmembrana tipo I y el dominio TIR por análisis con SMART, como muestra la Figura 21.
También fueron analizados los residuos consenso para LRR, LRR-CT y dominio TIR.
Para estudiar la similitud con respecto a otras secuencias descritas, que poseen la secuencia
aminoacídica del TLR5S en salmón se realizaron dos alineamientos: Uno para corroborar que la
proteína posea similitud con la secuencia aminoacídica de trucha, obteniéndose un 91% de
similitud. Este alineamiento se puede observar en la Figura 22. El segundo Alineamiento se
realizó para comparar la secuencia de salmón con la secuencia descrita en otros peces: para el pez
lenguado japonés (Paralichthys olivaceus), para el pez mero de pintas naranjas (Epinephelus
coioides) y para el pez gato (Ictalarius punctatus con un porcentaje de similitud de 48%, 46%, y
44 % respectivamente. En la Figura 23 se puede observar el alineamiento y sus regiones
características.
73
A NH2–RGKHFRLLNLNSVYLYGMTQNDFDWKRCGNPFRNMSIETLDLSSNGFNVD
KAKLFFNAIQGMKIHHIILKHSTMGKSFGFSNVKDPNKKTFNGLKNSGIKILD
FSKCFIFALQYAVFSSLRGVEDITLAQNKINQIDRGAFWGLENLQRLNLSHNL
IGEIYSYTFDNLPNILELDLSYNHIGALGYQAFTGLPNLQILDLTGNSIRQLG
TYGYLAPLPNLQLLHLADNKITSLEGLLGFANSTIILNVQNNRLTNLEDVYIV
LAKFMRIERIWYGNNNIKWCIFSNNISVPAVTSLKLLELRNIAPADFMGTWRR
FGCYLKSIKLFSLEFKLNSLRALPNGIFKGLVSLEEMDLSFNSLTYLQPDIFP
ASLKTVDLSYNFLSSPDPAAFRSLSWINLYRDRFHCDGGLKDFLTWMNRTNVT
FPDPGVAEFSCEFPLDLHGVSLLNYSKVIMEKYPKPSLTKM-COOH
B
C ----XLXXLXLXXNXɵXXɵ
LRR1 --LRGVEDITLAQNKINQIDRGAFWG
LRR2 --LENLQRLNLSHNLIGEIYSYTFDN
LRR3 --LPNILELDLSYNHIGALGYQAFTG
LRR4 --LPNLQILDLTGNSIRQLGTYGYLA
LRR5 --LPNLQLLHLADNKITSLEGLLGF
LRR6 LKSIKLFSLEFKLNSLRALPNGIFKG
LRR7 --LVSLEEMDLSFNSLTYLQPDIFPA
LRR8 ----SLKTVDLSYNFLSSPDPAAFRS
Figura 21: Análisis de la secuencia aminoacídica del receptor TLR5S. A: Secuencia de 462
aminoácidos del receptor TLR5S. B: esquema SMART para el receptor TLR5M. A y B se indica
en rojo secuencias LRR, en naranjo LRRCT, en azul región transmembrana y en verde dominio
TIR. C: residuos consenso en las LRR, en amarillo se muestran los residuos conservados, L:
leucina, X: cualquier aminoácidos, N: puede ser C, S o T, ɵ: cualquier residuos hidrofóbico.
74
S.salar ----------------------------------------------------------------------------------------------------
O.mykiss MSAHHFRGMMRNCILLVIFGVYLQVVKCTPRCPLYGYIAVCTNLSLYQVPALPPYITHVYMRDNYISEINETSFSGLEGLKELDLSWQRVNGLTIRTNTF 100
S.salar ----------------------------------------------------------------------------------------------------
O.mykiss QRLANLAVLYLGHNRGLKIEPGAFVGLSNLRTLSLYVCDLTESILQGDYLRPLVSLKTLDLYGNQVKRIQPSPFFVNMTDFQELNITLNQMESICEEDLL 200
S.salar --RGKHFRLLNLNSVYLYGMTQNDFDWKRCGNPFRNMSIETLDLSSNGFNVDKAKLFFNAIQGMKIHHIILKHSTMGKSFGFSNVKDPNKKTFNGLKNSG 98
O.mykiss GFCGKHFRLLKLNSVSLYGMTQNGFDWKRCGNPFRNMSIETLDLSSNGFNVDKAKLFFNAIQGTKIHHIILEHSTMGKSFGFSNFKDPNKKTFNGLKNSG 300
*******:**** *******.*************************************** *******:************.***************
S.salar IKILDFSKCFIFALQYAVFSSLRGVEDITLAQNKINQIDRGAFWGLENLQRLNLSHNLIGEIYSYTFDNLPNILELDLSYNHIGALGYQAFTGLPNLQIL 198
O.mykiss IKILDLSKCFIFALQYAVFSPLREVEDITLAQNKINQIDRGAFWGLENLQRLNLSHNLIGEIYSYTFDNLPNILELDLSYNHIGALGYQAFTGLPNLQIL 400
*****:**************.** ****************************************************************************
S.salar DLTGNSIRQLGTYGYLAPLPNLQLLHLADNKITSLEGLLGFANSTIILNVQNNRLTNLEDVYIVLAKFMRIERIWYGNNNIKWCIFSNNISVPAVTSLKL 298
O.mykiss DLTGNSIRQLGTYGYLAPLPNLQLLNLADNKITSLEGLLGFANSTIILNVQNNRLTNLEDVYIVLAKFMRIERIWYGNNNIKWCIFSSNISVPAVNSLKL 500
*************************:*************************************************************.*******.****
S.salar LELRNIAPADFMGTWRRFGCYLKSIKLFSLEFKLNSLRALPNGIFKGLVSLEEMDLSFNSLTYLQPDIFPASLKTVDLSYNFLSSPDPAAFRSLSWINLY 398
O.mykiss LELRNIALQILWGHGVCLDVFENLIKLFSLDLSFNSLRALPDGIFKGLVSLEEMDLSFNSLTYLQPDIFPASLKTVDLSYNFLSSPDPAAFSSLSWINLY 600
******* : * :. : : ******::.:*******:************************************************* ********
S.salar RDRFHCDGGLKDFLTWMNRTNVTFPDPGVAEFSCEFPLDLHGVSLLNYSKVIMEKYPKPSLTKM 462
O.mykiss RNRFHCDGGLKDFLTWMNRTNVTFPDPGVAEFSCEFPSDLHGVSLLNYSKVITEKYPKPSLTKI 664
*:*********************************** ************** **********:
Figura 22: Alineamiento entre salmón y trucha para TLR5S. En rosado se muestra péptido
señal. En rojo regiones LRR. En naranjo LRR-CT. En azul región transmembrana. En verde
dominio TIR. Análisis realizado por SMART. Salmón: S. salar, Trucha: O. mykiss (GenBank
NP_001117680.1). (*) se encuentra el mismo residuo,(:) se encuentran residuos similares (iguales
características químicas), (.) se encuentran residuos parecidos en tamaño y disposición espacial.
75
S.salar ----------------------------------------------------------------------------------------------------
O.mykiss MSAHHFRGMMRNCILLVIFGVYLQVVKCTPRCPLYGYIAVCTNLSLYQVPALPPYITHVYMRDNYISEINETSFSGLEGLKELDLSWQRVNGLTIRTNTF 100
P.olivaceus --------MWRLFLQLVTICVFLQMPACFPSCLIIGSVANCALKNLKSVPALPPHITHLFLEMNHIGEINSTSLSGLERLQQLDLGRQFVP-LLIRNNAF 91
E.coicoides --------MWTLGLQVAVICVFLQVPGCFPSCLIVNSVANCAYKNLRSVPPLPPHITHLYLEGNRISEINSNSLSGLKELQELDLGGQFVR-LMIRNNAF 91
I.punctatus -----MASGPSLILALLNLCICFLLAESTSKCFIKGDEAYCALKNLYTVPVLPPYIAYLDLTLNYISEIHEKSFYGLEALQILLIQQQEGR-LVLRNNAF 94
S.salar ----------------------------------------------------------------------------------------------------
O.mykiss QRLANLAVLYLGHNRGLKIEPGAFVGLSNLRTLSLYVCDLTESILQGDYLRPLVSLKTLDLYGNQVKRIQPSPFFVNMTDFQELNITLNQMESICEEDLL 200
P.olivaceus GRQSRLRKLMIDSNVGLRLEPEAFVGLSSLQKLDLGYCSLNESILKENFLQPLSSLETLDLFGNHIKRLQPSAFFANMSNLKDVNLKLNRIDRICESDLV 191
E.coicoides REQRHLRRLVLGGNVHLQLEPQAFVGLSSLQNLYLYHCSLQQSILEEDYLEPLTSLETLDLFGNKIKRLQPSMFFANMTNLKILNLKLNEIDKICESDLV 191
I.punctatus SGLSNLIRLDLAYNKDLQVDPGAFNGLFNLRVLNLTECKLNGSILSGDYLRPLVSLEQLSLSGNNIPKIRPASFFVNMSKLHIVDVSRNGIYSFCEEDLF 194
S.salar --RGKHFRLLNLNSVYLYGMTQNDFDWKRCGNPFRNMSIETLDLSSNGFNVDKAKLFFNAIQGMKIHHIILKH-STMGKSFGFSNVKDPNKKTFNGLKNS 97
O.mykiss GFCGKHFRLLKLNSVSLYGMTQNGFDWKRCGNPFRNMSIETLDLSSNGFNVDKAKLFFNAIQGTKIHHIILEH-STMGKSFGFSNFKDPNKKTFNGLKNS 299
P.olivaceus GFQGKHFKALNLDSVHLRAMFTDRFDWQECGNPFRGMSFQTLDLSHNGFNVNRLRQFLRAIEGTKISHLKLS--GHMGRSFSFKNLPDPDRSTFAGLRNS 289
E.coicoides GFQGKHFEVLNLDSVCLKTMFKKR-EWQKCGNPFRGMSFQTLDLSNNGLSVSKSKQLSTAIRGTKISNLKLSL-GLMGKGFSFNIYPDPDSSMFESLNDS 289
I.punctatus HFQGKHFTLLKLQDIKMTDMTPYWSGWNKCGNPFKNMSMTLLDLSQNGFSVDVAVLFFKAIRGTKIHTLILNHSGSMGKGVWYNNLKDPDQNTFTDLSES 294
**** *:*:.: : * *:.*****:.**: **** **:.*. : **.* ** : *. . **:.. :. **: . * .* :*
S.salar GIKILDFSKCFIFALQYAVFSSLRGVEDITLAQNKINQIDRGAFWGLEN-LQRLNLSHNLIGEIYSYTFDNLPNILELDLSYNHIGALGYQAFTGLPNLQ 196
O.mykiss GIKILDLSKCFIFALQYAVFSPLREVEDITLAQNKINQIDRGAFWGLEN-LQRLNLSHNLIGEIYSYTFDNLPNILELDLSYNHIGALGYQAFTGLPNLQ 398
P.olivaceus SVLTLDLSKSWIFALQQGVFSPLRDVVNIDVSQNRVNQINRNAFEGLQGHLASLNLSHNLLGEIYSHTFASLSNLRVLDLSYNHIGALGYGAFRGLPKLE 389
E.coicoides SVHTLDLSKNKIFALQEGVFSALKEVAIIDVSQNNVNQIHRNAFEGLQGHLQMLNLSHNLLGEIHSDTFASLTNLQVLDLSYNHIGVLGHDSFSELPKLK 389
I.punctatus GVKALDLSNARIFALRNSVFRHMPDLEEISLSANLINQIERDAFYGLDN-LRTLNLSHNLLDKIDSGTFKNVRSLETLDLSNNNIRILGSESFQGLPNLV 393
.: **:*: ****: .** : : * :: * :***.*.** **:. * *******:.:* * ** .: .: **** *:* ** :* **:*
S.salar ILDLTGNSIRQLGTYGYLAPLPNLQLLHLADNKITSLEG--LLGFANSTIILNVQNNRLTNLEDVYIVLAKFMRIERIWYGNNNIKWCIFSNNISVPAVT 294
O.mykiss ILDLTGNSIRQLGTYGYLAPLPNLQLLNLADNKITSLEG--LLGFANSTIILNVQNNRLTNLEDVYIVLAKFMRIERIWYGNNNIKWCIFSSNISVPAVN 486
P.olivaceus VLSLTGNALRELG---FPAALPRLDHLLLSDNRLIHSSVRSITEFAHNVVHLDIKDNRFINLANVYTFLTRLKRLQQLSYGGNSFRGCTLSAQV---GPN 486
E.coicoides VLNLTGNSLRDIG---FPALLPSLDYLLLSDNKLIDSPGRSIHRFAGDILHLDIRDNRLTNLGGVYTLVTLLDRLQHLSYGGNPIKWCNLGREVRFIDSN 486
I.punctatus HLSLSENSLQYVH---TLARLPQLKKLFLDSNKITSLYG--LPRQARNVTTIDLRNNRLRNAEDVYTILVEFPNIETIFLGGNVFSWCVLNAKYSVSPLN 488
*.*: *::: : * ** *. * * .*:: : * . :::::**: * .** .:. : .:: : *.* : * :. : .
S.salar SLKLLELRNIAPADFMGTWRRFGCYLKSIKLFSLEFKLNSLRALPNGIFKGLVSLEEMDLSFNSLTYLQPDIFPASLKTVDLSYNFLSSPDPAAFRSLSW 394
O.mykiss SLKLLELRNIALQILWGHGVCLDVFENLIKLFSLDLSFNSLRALPDGIFKGLVSLEEMDLSFNSLTYLQPDIFPASLKTVDLSYNFLSSPDPAAFSSLSW 596
P.olivaceus DLQVLDLHRSSLQSVWAQGECLNLFDKLGRVIDINLSLNALRSLPQGIFKGLTSVVQMDLSSNSLTYLRPDVLPRTLEVLDLSNNFIASPDPDAFRSLRL 583
E.coicoides NVTTLDLHGSSLQSVWSQWTCLDLFDNFGHVITLNLSHNALQSLPRGIFKGLTSVVEMDLSSNSLTYLQPDVLPKSLKVLDLSNNFIASPDPDAFRSLSS 586
I.punctatus KVQFLDLHMTGLQNLWLQGRCLDMFDHLHQLQTLLLQQNMIHSLPKDIFKGLTSLNTLDLSFNSLTYIPNDIFPRSLRILKLAHNHLGSVDPQAFSTLTT 588
.: *:*: . . :. : : :: : :. * :::** .*****.*: :*** *****: *::* :*. :.*: *.:.* ** ** :*
S.salar INLYRDRFHCDGGLKDFLTWMNRTNVTFPDPGVAEFSCEFPLDLHGVSLLNYSKVIMEKYPKPSLTKM 462
O.mykiss INLYRNRFHCDGGLKDFLTWMNRTNVTFPDPGVAEFSCEFPSDLHGVSLLNYSKVITEKYPKPSLTKI 664
P.olivaceus LDLKMNRFHCDVDLKSFVTWLNKTNVTFLSP-VQELRCEFPSRFNKVPLLNYIAQVTQE--------- 641
E.coicoides LDLNMNRFHCDANLKSFLNWVTNTTVTLLTP-VKELKCEFPSDFYNVPLLRFSDDITQQ--------- 644
I.punctatus LELFGNRFLCDCTLRDFQRWLSQTNVKMFTP-AGKLTCAYPEQQRGKSLLHAALCKDKKY-------- 647
::* :** ** *:.* *:..*.*.: * . :: * :* .**. ::
Figura 23: Alineamiento múltiple de TLR5S en peces. En rosado se destaca péptido señal. En
rojo secuencias LRR y en naranjo LRR-CT (*) se encuentra el mismo residuo, (:) residuos
similares, (.) residuos parecidos en tamaño y disposición espacial. Analizado por SMART.
Salmón: S. salar. Trucha: O. mykiss (GenBank NP_001117680.1). Pez gato: I. punctatus
(GenBank NP_001187158.1). Lenguado japonés: P. olivaceus (GenBank BAJ16368.1). Pez mero
de pintas naranjas: E. coioides (GenBank ACV04459.1).
76
4.2. Desarrollo de sueros policlonales
4.2.1. Determinación de péptidos para la inmunización
Para la detección de los receptores TLR1, TLR22 y TLR5 en salmón, se desarrollaron sueros
policlonales a partir de la inmunización de conejos. Para ello, se analizaron las secuencias
aminoacídicas, correspondientes a cada receptor, buscando las regiones con mayor hidrofilicidad.
Estas regiones representarían eventuales buenos epítopes para la unión de un anticuerpo.
Las secuencias utilizadas corresponden a secuencias aminoacídicas deducidas desde las
secuencias nucleotídica de cada receptor. Se analizó sólo la secuencia aminoacídica
correspondiente a la parte extracelular de los receptores, donde se encuentran las LRR, para
permitir la unión de anticuerpos en células no permeabilizadas. Para el receptor TLR5 se utilizó
la secuencia correspondiente al TLR5S, el cual posee una alta identidad con la región extracelular
del TLR5M, de esta manera podría reconocer ambos receptores. El tipo de análisis realizado es
de Hoop-Woods (Hoop y Woods, 1981), que permite predecir regiones antigénicas potenciales a
través de una gráfica donde la abscisa corresponde al N° de aminoácido en la proteína (de amino
a carboxilo) y el eje de las ordenadas entrega valores asignados al nivel de hidrofilicidad para las
distintas regiones de la proteína, donde los valores mayor a 0 son hidrofílicos y probables de estar
expuestos en la superficie de una proteína en su forma nativa. Un requisito para los péptidos es
que deben contener al menos un residuo de Lisina (Lys), para que aporte su grupo ε-amino a la
reacción de crosslinking con hemocianina. Los péptidos elegidos fueron sintetizados y utilizados
para la inmunización de los conejos. En las Figuras 24, 25 y 26 se pueden observar los gráficos
de hidrofilicidad para cada receptor: TLR1, TLR22 y TLR5 respectivamente.
77
A
B
Figura 24: Péptido elegido y su ubicación en la representación del TLR1. A: gráfico de
hidrofílicidad destacando en rojo zona elegida para la realización del péptido para TLR1,
indicando también la secuencia elegida. B: Esquema del receptor TLR1, basado en el modelo
entregado por SWISS MODEL. En negro se representa la región extracelular del receptor
indicando en rojo la ubicación el péptido elegido, el bloque negro representa la región
transmembrana y en morado se representa el dominio intracelular, TIR.
78
A
B
Figura 25: Péptido elegido y su ubicación en la representación del TLR22. A: gráfico de
hidrofilicidad destacando en verde zona elegida para la realización del péptido para TLR22,
indicando también la secuencia elegida. B: Esquema del receptor TLR22, basado en el modelo
entregado por SWISS MODEL. En negro se representa la región extracelular del receptor
indicando en verde la ubicación el péptido elegido, el bloque negro representa la región
transmembrana y en rosado se representa el dominio intracelular, TIR.
79
A
Figura 26: Péptido elegido y su ubicación en la representación del TLR5. A: gráfico de
hidrofilicidad destacando en amarillo zona elegida para la realización del péptido para TLR5,
indicando también la secuencia elegida. B y C: Basados en el modelo entregado por SWISS
MODEL. B: Esquema del receptor TLR5S, en negro se representa el receptor soluble indicando
en amarillo la ubicación el péptido elegido. C: En negro se representa la región extracelular del
receptor indicando en amarillo la ubicación el péptido elegido, el bloque negro representa la
región transmembrana y en rosado claro se representa el dominio intracelular, TIR.
80
Para poder ubicar el péptido en el receptor, se realizó un modelamiento utilizando la herramienta
informática SWISS-MODEL. Para el receptor TLR1 se obtuvieron dos modelos para su
secuencia: el primero corresponde a la región extracelular, la cual posee un 63,48% de identidad
con la estructura descrita por Jin et al. (2007) para el heterodímero TLR1-TLR2 en humano, y el
segundo corresponde al dominio TIR, el cual tiene un 17,18% de identidad con el dominio TIR
humano descrito por Xu et al. (2000). Para el receptor TLR22 también se obtuvieron dos modelos
a partir de la secuencia: el primero corresponde a la región extracelular, el cual posee un 22% de
identidad con la estructura descrita por Bell et al. (2005) para el receptor TLR3 humano y el
segundo corresponde al dominio TIR el cual tiene un 40,98% de identidad con el dominio TIR
humano descrito por Xu et al. (2000). Para el receptor TLR5M también fueron obtenidos dos
modelos: el primero corresponde a la región extracelular, posee un 21,64% de identidad con la
estructura descrita por Bell et al. (2005) para el receptor TLR3 humano y el segundo corresponde
al dominio TIR el cual tiene un 23,27% de identidad con el dominio TIR humano descrito por Xu
et al. (2000). Para el receptor TLR5S fue obtenido un modelo representativo para su secuencia
que corresponde a la región extracelular, la cual posee un 15,30% de identidad con la estructura
descrita por Bell et al. (2005) para el receptor TLR3 humano. En la Figuras 24, 25 y 26 se puede
observar una representación de cada receptor y la ubicación del péptido diseñado para cada uno
de ellos.
81
4.2.2. Evaluación de los sueros obtenidos
Luego del periodo de inmunización de los conejos (3 meses), se obtuvieron los sueros inmunes y
estos fueron evaluados para determinar su titulo a través de ensayos de dot-blot, lo que muestra la
Figura 27. El suero anti TLR1 presentó una reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) hasta la
dilución 1:1000 con 4 µg de péptido sin conjugar; no se detecta reacción con BSA y el suero pre-
inmune presenta una baja reacción con proteínas de membrana de SHK-1. El suero anti TLR22
presentó buena reacción Ag-Ac hasta la dilución 1:500 con 4 µg de péptido sin conjugar; no se
detecta reacción con BSA ni en el suero pre-inmune. Finalmente, el suero anti TLR5 presentó
buena reacción Ag-Ac hasta la dilución 1:5000 con 4 µg de péptido sin conjugar; sin detectar
reacción con BSA, el suero pre-inmune presenta una muy baja reacción con las proteínas de
membrana de SHK-1. Posteriormente se realizó un ensayo de Western-blot a partir de un extracto
de proteínas membrana de riñón medio y branquia, para determinar la masa aproximada de las
proteínas detectadas por los anticuerpos y así confirmar si estas correspondían a los receptores en
estudio, lo que se muestra en la Figura 28. Lo primero fue estudiar el tamaño de la proteína
completa según lo descrito en trucha para cada receptor. Para ello se utilizó la herramienta
bioinformática “Compute pI/Mw” de Expasy, analizándose las secuencias para los receptores
TLR1 (GenBank NP_001159573.1), TLR22 (GenBank NP_001117891.1), TLR5M (GenBank
NP_ 001118216.1) y para TLR5S (GenBank NP_001117680.1), esto debido a que no se obtuvo
toda la secuencia de la proteína en salmón. Los tamaños aproximados son: para el receptor TLR1
90 kDa, para el receptor TLR22 110 kDa, para el receptor TLR5M 100 kDa y para el TLR5S 75
kDa. Debido a que los ensayos de western blot fueron realizados con proteínas de membrana no
se evaluó TLR5S.
82
Figura 27: Ensayo de Dot-Blot para la titulación de los sueros inmunes anti TLR1, TLR22,
y TLR5. Se utilizaron las diluciones 1:100, 1:500, 1:1000 y 1:5000 y como control suero pre-
inmune 1:500. Fueron evaluados con 0,5 , 1 y 5 µg/µL de proteínas de membrana de cabeza de
riñón (RHM) , de SHK-1 (SHK1M), y de proteínas totales de cabeza de riñón (RHT), también con
4 µ de péptido sin conjugar (s/c) y con 2 µg de BSA. A: suero anti-TLR1, B: suero anti-TLR22 y
C: suero anti-TLR5.
83
Figura 28: Western-Blot de proteínas de membrana de órganos de Salmo salar para la
detección de TLR1, TLR22 y TLR5. Se evaluaron los sueros inmunes y pre-inmunes para la
inmunodetección, previamente separados por SDS.PAGE 12%. La dilución utilizada en ambos
sueros fue de 1:250. Se cargaron 20 µg de proteína de membrana de Riñón medio para TLR1 y
TLR5 y Branquia para TLR22. A: Suero inmune para TLR1, B: suero pre inmune para TLR1. C:
suero inmune para TLR22, D: suero pre-inmune para TLR22. E: suero inmune TLR5, F: suero
pre-inmune TLR5. En cuadrado se muestra la banda de la proteína esperada.
84
En todos los ensayo de Western-Blot realizados se observa una banda que podría corresponder a
la esperada para cada receptor, pero también se observan otras bandas. Debido a esto se
realizaron ensayos de Western-Blot utilizando el suero pre-inmune del conejo correspondiente a
cada receptor, de esta manera se puede evaluar la presencia de anticuerpos creados con
anterioridad a la inmunización por el conejo.
4.3. Cinéticas de expresión utilizando RT-qPCR
Para evaluar la expresión de los receptores TLR5M, TLR5S, TLR22 y TLR1 frente a la infección
causada por Piscirickettsia salmonis se realizó una cinética a distintos tiempos (0,5 h, 1 h, 2 h, 4
h, 8 h, 12 h, 1 día, 2 días, 3 días, 7 días) y se analizó la expresión de ellos por RT-qPCR. También
se realizaron otras cinéticas de expresión, a los tiempos 2 h, 16 h y 1 día, infectando las células
con: i) proteínas totales de P. salmonis; ii) P. salmonis inactivada con formaldehido y; iii) LPS.
De esta manera se pudo evaluar la expresión de los distintos genes en estudio frente a los mismos
patrones moleculares expuestos de distintas maneras. Junto con analizar los receptores en estudio
se evaluó el receptor TLR9, la proteína Myd88 y la citoquina IL-1β, todos involucrados en la
respuesta inmune del pez frente a una infección bacteriana.
Las distintas cinéticas se realizaron de la siguiente manera: Cada tiempo en estudio se evaluó con
un n=3, una vez transcurrido el tiempo correspondiente se procedió a obtener las células en
estudio y extraer el RNA de ellas, una vez extraído el RNA fue tratado con DNAsa para asegurar
que no exista contaminación con DNA genómico y posteriormente se sintetizó a cDNA. Este
cDNA se cuantificó y comprobó su integridad por PCR convencional, amplificando β-actina (ya
que los partidores diseñados para β-actina posee un intron entre los partidores), los productos de
PCR obtenidos de la cinética de expresión con P. salmonis viva se muestran en la Figura 29, se
puede observar que las muestras se encuentran libre de DNA genómico.
85
Figura 29: PCR convencional a β-actina de cDNA de cinética de expresión con P. salmonis
viva. Gel de agarosa al 1%, producto esperado para cDNA es de aprox. 400 pb. y para DNA
genómico es de aprox. 2500 pb. Control corresponde a tiempo 0, sin infección. G: DNA
genómico de salmón. Los cDNA de las otras cinéticas también se comprobaron de esta forma,
obteniendo todas las cinéticas este resultado.
86
El análisis de la expresión de los distintos genes a estudiar se realizó mediante PCR tiempo real.
Para ello fue necesario diseñar partidores para cada uno de los genes a estudiar (se ve en material
y métodos) los que fueron verificados por RT-qPCR que sólo se obtuviera un producto para cada
uno de ellos y la ausencia de dimerización de los partidores, en la Figura 30 se muestra el gráfico
de curva de disociación del producto de PCR de cada juego de partidores, en donde la ordenada
corresponde a fluorescencia (emitida por el producto) y en la abscisa a la T° de melting de cada
producto, donde se puede observar sólo un pick de amplificación a una T° de melting lo que
corresponde a que sólo se obtiene un producto de PCR y al mismo tiempo se observa que el
control no presenta pick de fluorescencia lo que corrobora la ausencia de dimerización de los
partidores. En la Figura 31 se puede observar el ensayo de cinética de expresión con células
infectadas con P. salmonis viva para cada juego de partidores, utilizando como templado todas
las muestras a evaluar, se muestra como ejemplo sólo esta cinética ya que en las otras cinéticas
estudiadas ocurre lo mismo.
Una vez realizados los ensayos de RT-qPCR para todas las muestras (en triplicado) de cada
cinética se revisó cada curva de disociación obtenida y se corroboró que la T° de melting
corresponda al producto esperado para cada juego de partidores.
Las T° de melting aproximadas que se obtuvieron para cada gen son: EF-1a 87°C, β-actina 85°C,
TLR5S 81°C, TLR1 83°C, TLR5M 85°C, TLR9 87°C, TLR22 82°C, IL-1β 83°C, Myd88 84°C.
87
Figura 30: Curva de disociación para cada juego de partidores. En azul se muestra el pick de
cada producto de PCR. En rojo el control de la reacción. A: partidores para EF-1a, B: partidores
para β-actina, C: partidores para TLR5S, D: partidores para TLR1, E: partidores para TLR5M, F:
partidores para TLR9, G: partidores para TLR22, H: partidores para IL-1β, I: partidores para
Myd88.
88
Figura 31: Curvas de disociación utilizando los templados de la cinética de expresión con P.
salmonis viva. A: partidores para EF-1a, B: partidores para β-actina, C: partidores para TLR5S,
D: partidores para TLR1, E: partidores para TLR5M, F: partidores para TLR9, G: partidores para
TLR22, H: partidores para IL-1β, I: partidores para Myd88.
89
Como normalizador para los ensayos de cinética en RT-qPCR se analizaron dos: β-actina y EF-
1a. Se decidió utilizar EF-1a debido a que presenta valores menores de Ct que β-actina. En la
Figura 32 se muestran los gráficos de amplificación para los dos genes normalizadores
estudiados, se muestra como ejemplo lo que ocurre con los templados de la cinética de expresión
con P. salmonis viva, debido a que en las otras cinéticas ocurre lo mismo. En ellos se demuestra
que la amplificación del producto de PCR comienza en un ciclo mucho menor utilizando los
juegos de partidores para EF-1a al compararlo con el juego de partidores para β-actina.
90
Figura 32: Curvas de amplificación para los genes normalizadores, β-actina y EF-1a. El eje
de las ordenadas corresponde a Fluorescencia y el eje de las abscisas corresponde a los ciclos de
amplificación.
91
4.3.1. Evaluación de la cinética de expresión de TLR
La evaluación se realizó utilizando la formula descrita en material y métodos, de esta manera se
cuantificó la expresión relativa de cada gen estudiado. Una vez obtenido el resultado de la
fórmula, se calculó la media de la expresión relativa en los n de los controles de cada cinética,
esta media se utilizó como expresión basal de cada gen estudiado y equivale en el gráfico de
cinética de expresión a: 1 de razón de expresión, en el eje de las ordenadas. De esta manera se
puede calcular la relación entre la media de la expresión relativa de cada tiempo con la media
calculada para los controles y así poder observar si aumenta o disminuye la expresión al
compararla con el control, esto se realizó para todas las muestras de las cinéticas.
En el caso de TLR5S, las cinéticas de expresión con células infectadas con P. salmonis inactivada
y estimuladas con LPS no se observó amplificación del producto esperado en los controles
utilizados, por lo que se cuantificó la expresión relativa, con la fórmula de material y métodos, de
TLR5S en estas cinéticas. Sus gráficos de expresión corresponden en el eje de las ordenadas a
expresión relativa y en el eje de las abscisas al tiempo.
En el caso de TLR22 las cinéticas de expresión con células infectadas con P. salmonis inactivada
y proteínas totales de P. salmonis no se observó amplificación de los productos esperados en las
muestras de cDNA por lo que se concluyó que no hay expresión de este receptor. Para las
cinéticas de expresión con células estimuladas con LPS en los controles utilizados no se observó
amplificación de los productos esperados, por lo que se cuantificó la expresión relativa de
TLR22, su gráfico de expresión corresponde en el eje de las ordenadas a expresión relativa y en
el eje de las abscisas al tiempo.
92
La evaluación realizada a los receptores en estudio, junto con el receptor TLR9, IL-1β y Myd88
se realizó analizando de forma independiente cada cinética, debido a que la presentación de los
patrones moleculares en cada una de ellas es de manera diferente.
4.3.1.1. Evaluación de TLR5M (gráficas se pueden observar en la Figura 33)
Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: A las 0,5 hora y 1 hora se ve un
leve aumento de expresión de 0,4 veces con respecto al control. Entre los tiempos estudiados 2
horas y 12 horas disminuye su expresión, hasta 0,7 veces con respecto al control, lo que se
recupera al día de infección donde se ve un aumento de 0,2 veces con respecto al control. En los
días 2, 3 y 7 disminuye su expresión cerca de 0,8 veces con respecto al control.
Cinética de expresión con células infectadas con Proteínas Totales de P. salmonis: Se ve un
aumento de expresión en los tiempos estudiados de infección observándose un pick de expresión
de 1,5 veces con respecto al control a las 16 horas.
Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis Inactivada: Disminuye la
expresión durante todos los tiempos estudiados observándose una mayor disminución, de 0,6
veces con respecto al control, al día (24 horas) de infección.
Cinética de expresión con células estimuladas con LPS: Disminuye su expresión durante todos
los tiempos estudiados, 2 horas, 16 horas y 24 horas, en 0,8 veces con respecto al control.
4.3.1.2. Evaluación a TLR5S (gráficas se pueden observar en la Figura 34)
Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: A las 0,5 horas, 1 y 2 horas
disminuye su expresión observándose un pick de disminución de 0,8 veces con respecto al
control a las 0,5 horas. A la 4 hora se observa un aumento de 0,8 veces con respecto al control.
93
TLR5M
Figura 33: Cinéticas de expresión del receptor TLR5M. A: Cinética de expresión con células
infectadas con P. salmonis viva. B: Cinética de expresión con células infectadas con Proteínas
totales de P. salmonis. C: Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis
inactivada. D: Cinética de expresión con células estimuladas con LPS. Control: tiempo 0 para
cada cinética; h: hora; d: día. Línea negra representación de la expresión del control en cada
cinética. Cambio de color en cada cinética corresponde a un aumento con respecto al control.
P. salmonis viva Proteínas totales de P. salmonis
P. salmonis inactivada LPS
94
TLR5S
Figura 34: Cinéticas de expresión del receptor TLR5S. A: Cinética de expresión con células
infectadas con P. salmonis viva. B: Cinética de expresión con células infectadas con Proteínas
totales de P. salmonis. C: Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis
inactivada. D: Cinética de expresión con células estimuladas con LPS. Control: tiempo 0 para
cada cinética; h: hora; d: día. Línea negra representación de la expresión del control en cada
cinética. Cambio de color en cada cinética corresponde a un aumento con respecto al control.
P. salmonis viva Proteínas totales de P. salmonis
P. salmonis inactivada LPS
95
Luego disminuye su expresión durante los tiempos restantes estudiados, observándose un pick de
disminución de 0,9 veces con respecto al control a las 8 horas.
Cinética de expresión con células infectadas con proteínas totales de P. salmonis: Se
mantiene la expresión con respecto al control a las 2 horas y se ve un aumento entre las 16 horas
y 1 día (24 horas) de infección de 3 y 2 veces, con respecto al control, respectivamente.
Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis inactivada: No hay expresión
del receptor hasta el día (24 horas) de infección donde se observa una expresión relativa de 0,001
con respecto al control.
Cinética de expresión con células estimuladas con LPS: No hay expresión del receptor en
control, entre los tiempos estudiados de 2 horas, 16 horas y 1 día de infección hay expresión
relativa del receptor de 0,00007, 0,00004 y 0,0007, con respecto al control, respectivamente.
4.3.1.3. Evaluación de TLR1 (gráficas se pueden observar en la Figura 35)
Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: Disminuye su expresión a las
0,5 hora cerca de 0,7 veces con respecto al control. Comienza a aumentar por sobre el control
desde 1 hora hasta la 4 hora de infección con un pick de expresión de 1,5 veces con respecto al
control a las 2 horas de infección. Entre las 8 y 12 hora disminuye su expresión con respecto al
control en 0,7 y 0,4 veces respectivamente. Al día de infección se ve un aumento de expresión de
1,2 veces con respecto al control. En los tiempos: 2 día y 3 día se mantiene la expresión con
respecto al control. Al 7 día se ve una disminución de 0,8 veces con respecto al control.
Cinética de expresión con células infectadas con proteínas totales de P. salmonis: Se ve un
aumento de expresión en todos los tiempos estudiados: 2 horas, 16 horas y 1 día de 3, 15 y 30
veces, con respecto al control, respectivamente.
96
TLR1
Figura 35: Cinéticas de expresión del receptor TLR1. A: Cinética de expresión con células
infectadas con P. salmonis viva. B: Cinética de expresión con células infectadas con Proteínas
totales de P. salmonis. C: Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis
inactivada. D: Cinética de expresión con células estimuladas con LPS. Control: tiempo 0 para
cada cinética; h: hora; d: día. Línea negra representación de la expresión del control en cada
cinética. Cambio de color en cada cinética corresponde a un aumento con respecto al control.
P. salmonis viva Proteínas totales de P. salmonis
P. salmonis inactivada LPS
97
Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis inactivada: Disminuye la
expresión durante todos los tiempos de estudio: 2 horas, 16 horas y 1 día de 0,8, 0,85 y 0,7 veces,
con respecto al control, respectivamente.
Cinética de expresión con células estimuladas con LPS: Disminuye la expresión casi total del
receptor durante todos los tiempos estudiados, 2 horas, 16 horas y 1 día (24 horas) con respecto al
control.
4.3.1.4. Evaluación de TLR22 (gráficas se pueden observar en la Figura 36)
Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: Comienza a aumentar la
expresión con respecto al control a las 0,5 horas de 0,1 veces. A 1 y 2 horas se ve un aumento de
expresión de 0,3 veces con respecto al control. Se mantiene la expresión al igual que el control a
las 4 y 8 horas estudiadas, observándose a las 12 horas una disminución de 0,5 veces con respecto
al control. Al día de infección se ve un aumento de 0,6 veces con respecto al control el que
disminuye por bajo el control en los tiempos estudiados restantes, 2, 3 y 7 días de infección, de
0,4, 0,5 y 0,7 veces, con respecto al control, respectivamente.
Cinética de expresión con células infectadas con proteínas totales de P. salmonis: No hay
expresión del receptor en control, entre las 2 y 16 horas de infección hay expresión del receptor
de 0,0001 y 0,00028 respectivamente. Al día (24 horas) no hay expresión al igual que en el
control.
4.3.1.5. Evaluación a TLR9 (gráficas se pueden observar en la Figura 37)
Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: Comienza disminuyendo de
expresión 0,7 veces con respecto al control a las 0,5 horas y luego aumenta 1,5 veces con
98
TLR22
Figura 36: Cinéticas de expresión del receptor TLR22. A: Cinética de expresión con células
infectadas con P. salmonis viva. B: Cinética de expresión con células estimuladas con LPS.
Control: tiempo 0 para cada cinética; h: hora; d: día. Línea negra representación de la expresión
del control en cada cinética. Cambio de color en cada cinética corresponde a un aumento con
respecto al control. En el caso de las cinéticas con P. salmonis inactivada y proteínas totales de P.
salmonis no se observó amplificación del producto esperado en las muestras de cDNA.
P.salmonis viva LPS
99
TLR9
Figura 37: Cinéticas de expresión del receptor TLR9. A: Cinética de expresión con células
infectadas con P. salmonis viva. B: Cinética de expresión con células infectadas con Proteínas
totales de P. salmonis. C: Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis
inactivada. D: Cinética de expresión con células estimuladas con LPS. Control: tiempo 0 para
cada cinética; h: hora; d: día. Línea negra representación de la expresión del control en cada
cinética. Cambio de color en cada cinética corresponde a un aumento con respecto al control.
P. salmonis viva Proteínas totales de P. salmonis
P. salmonis inactivada LPS
100
respecto al control a 1 hora de infección. En los tiempos 2 y 4 horas mantiene expresión al igual
que el control. A la 8 hora aumenta 1,3 veces con respecto al control, en los tiempos 12 horas, 1,
2, 3 y 7 días disminuye de expresión por debajo del control observándose un pick de disminución
a las 12 horas de 0,8 veces con respecto al control.
Cinética de expresión con células infectadas con proteínas totales de P. salmonis: Se ve un
aumento de expresión durante todos los tiempos estudiados, 2, 16 horas y 1 día (24 horas) de 2.5,
7 y 4 veces, con respecto al control, respectivamente.
Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis inactivada: Disminuye la
expresión a las 2 horas en 0,6 veces con respecto al control. En los tiempos 16 horas y 1 día (24
horas) desaparece casi totalmente la expresión del receptor.
Cinética de expresión con células estimuladas con LPS: Disminuye la expresión durante todos
los tiempos estudiados, 2, 16 horas y 1 día de 0,7, 0,4 y 0,3 veces, con respecto al control,
respectivamente.
En general al analizar la expresión de los TLR en las cinéticas estudiadas, existe una variación de
la expresión de ellos, esto debido a que la forma de exposición de los diversos PAMPs que
presenta P. salmonis puede variar de una forma positiva o negativa en la expresión de los TLR.
4.3.1.6. Evaluación de IL-1β (gráficas se pueden observar en la Figura 38)
Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: Aumenta la expresión durante
todos los tiempos estudiados, 2, 12 horas y 1 día en 1,5, 6 y 1 veces, con respecto al control,
respectivamente.
101
IL-1β
Figura 38: Cinéticas de expresión del receptor IL-1β. A: Cinética de expresión con células
infectadas con P. salmonis viva. B: Cinética de expresión con células infectadas con Proteínas
totales de P. salmonis. C: Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis
inactivada. D: Cinética de expresión con células estimuladas con LPS. Control: tiempo 0 para
cada cinética; h: hora; d: día. Línea negra representación de la expresión del control en cada
cinética. Cambio de color en cada cinética corresponde a un aumento con respecto al control.
P. salmonis viva Proteínas totales de P. salmonis
P. salmonis inactivada LPS
102
Cinética de expresión con células infectadas con proteínas totales de P. salmonis: Se
mantiene la expresión a las 2 horas con respecto al control y aumenta en los tiempos 12 horas y 1
día de infección en 12 y 8 veces, con respecto al control, respectivamente.
Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis inactivada: Disminuye la
expresión en los tiempos 2 y 16 horas en 0,8 y 0,6 veces, con respecto al control,
respectivamente. Se ve un aumento al día de infección de 0,8 veces con respecto al control.
Cinética de expresión con células estimuladas con LPS: Aumenta su expresión 1,5 veces con
respecto al control a las 2 horas. En el tiempo 16 horas aumenta 0,3 veces con respecto al control.
Al día de infección disminuye su expresión 0,6 veces con respecto al control.
4.1.3.7. Evaluación de Myd88 (gráficas se pueden observar en la Figura 39)
Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis: Aumenta la expresión a las 2
horas en 0,8 veces con respecto al control. En los tiempos 12 horas y 1 día mantiene expresión
con respecto al control.
Cinética de expresión con células infectadas con proteínas totales de P. salmonis: Se
mantiene la expresión a las 2 horas con respecto al control. A los tiempos 16 horas y 1 día
aumenta su expresión 0,5 y 0,3 veces, con respecto al control, respectivamente.
Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis inactivada: Disminuye la
expresión en todos los tiempos estudiados. A las 2 y 16 horas disminuye 0,7 veces con respecto al
control. Al día de infección disminuye 0,3 veces con respecto al control.
Cinética de expresión con células estimuladas con LPS: Disminuye la expresión en todos los
tiempos estudiados, 2, 16 horas y 1 día en 0,6, 0,4 y 0,8 veces, con respecto al control,
respectivamente.
103
Myd88
Figura 39: Cinéticas de expresión del receptor Myd88. A: Cinética de expresión con células
infectadas con P. salmonis viva. B: Cinética de expresión con células infectadas con Proteínas
totales de P. salmonis. C: Cinética de expresión con células infectadas con P. salmonis
inactivada. D: Cinética de expresión con células estimuladas con LPS. Control: tiempo 0 para
cada cinética; h: hora; d: día. Línea negra representación de la expresión del control en cada
cinética. Cambio de color en cada cinética corresponde a un aumento con respecto al control.
P. salmonis viva Proteínas totales de P. salmonis
P. salmonis inactivada LPS
104
5. DISCUSIÓN
5.1. Clonamiento y caracterización de TLR1, TLR22, TLR5M y TLR5S
Los TLR son de gran importancia en el sistema inmune de vertebrados e invertebrados (Imler et
al., 2004). Cumplen variadas funciones como: detectar la presencia de algún patógeno en el
organismo hospedero y desencadenar una respuesta inmune innata, además de activar y guiar la
respuesta inmune adaptativa contra ellos (Moreno et al., 2003). Los TLR forman parte de los
RRPs, receptores que reconocen PAMPs (Randon-Barragan, 2009). A cada TLR se le ha
atribuido uno o varios PAMPs como ligandos de reconocimiento (Tabla I), estos PAMPs son
característicos de los patógenos y así, mediante cascadas de señalización, se desencadena una
respuesta contra el patógeno en particular (Kumar et al., 2009).
Por esta razón es de gran interés el estudio de estos receptores en peces teleósteos y así poder
comprender de una mejor manera como es el funcionamiento del sistema inmune en ellos. En
Salmo salar, hasta el momento del inicio de la tesis, no se encontraba secuenciado el mRNA de
los receptores para TLR1, TLR5 de membrana y soluble y TLR22, por lo que fueron
seleccionados para ser clonados y secuenciados como parte de esta tesis. Todas las secuencias
aminoacídicas obtenidas, las que fueron deducidas de la secuencia nucleotídica del clonamiento
de cada receptor, presentan las regiones y dominios característicos de los TLR. Todas son
proteínas transmembrana tipo I, presentan en su región extracelular LRRs y también LRRCT; y
presentan en su región intracelular el dominio TIR (Akira et al., 2006), importante en
desencadenar la cascada de señalización en respuesta a algún patógeno. A su vez cada LRR
encontrada contiene la secuencia consenso descrita por Bell et al. (2003) que contienen todos los
TLR. También el dominio TIR contiene las secuencias consenso para Box1, Box2 y Box3
105
descritas por Slack et al. (2000). En conjunto todas estas características encontradas, en las
secuencias aminoacídicas deducidas, nos dice que corresponderían a TLR y podrían ser
funcionalmente activos.
5.1.1. TLR1
El receptor TLR1 forma un heterodímero con TLR2, en mamíferos. Este receptor es importante
debido a que reconoce lipopéptidos de la pared bacteriana, además en conjunto con TLR2
reconocen distintos PAMPs de bacterias gram negativas y gram positivas (Kumar et al., 2009).
Este receptor fue clonado y secuenciado en salmón del Atlántico, obteniéndose gran parte de la
región codificante de su mRNA. La secuencia nucleotídica obtenida presenta una alta identidad
(96%) con trucha, especie que forma parte de los peces salmonídeos y que además fue utilizada
como referencia para la creación de partidores que permitieron el clonamiento. También se
observa una alta identidad a nivel de secuencia aminoacídica (93%) con trucha y una homología
en la posición aminoacídica en donde se encuentran los dominios y regiones características de los
TLR (Figura 7 resultados).
5.1.2. TLR22
El receptor TLR22 es específico de peces, hasta el momento su rol y PAMPs que reconoce son
poco conocidos (Rebl et al., 2010). Se ha descrito que reconoce dsRNA (Matsuo et al., 2008), y
también se ha reportado que aumenta su expresión en ensayos de infección con Aeromona
salmonicida y Mycobacterium cheloni, por lo que se piensa que podría estar involucrado en el
reconocimiento de diversos patógenos acuáticos (Rebl et al., 2010). Este receptor fue clonado y
secuenciado en salmón del Atlántico, obteniéndose gran parte de la región codificante de su
mRNA. La secuencia nucleotídica obtenida presenta una alta identidad (93%) con trucha.
106
También se observa una alta identidad a nivel de secuencia aminoacídica (88%) con trucha y una
homología en la posición aminoacídica en donde se encuentran los dominios y regiones
características de los TLR (Figura 12 resultados). Se observan 2 gaps de 4 aminoácidos cada uno,
con respecto a la secuencia de trucha, en las posiciones: aminoácido 232 y aminoácido 823. Este
receptor, en el comienzo de la tesis, se pensó que correspondía a TLR2 debido a que en la Base
de datos de NCBI aparecía con el nombre de TLRII (Rebl et al., 2007). Una vez obtenida la
secuencia se comprobó por homología de secuencia que correspondía al receptor TLR22.
5.1.3. TLR5 de Membrana
El receptor TLR5M se ha descrito que reconoce flagelina, proteína característica del flagelo
bacteriano, TLR5M se encuentra en peces teleósteos y en humanos (Tsujita et al., 2004). Este
receptor fue clonado y secuenciado en salmón del Atlántico, obteniéndose gran parte de la región
codificante de su mRNA. La secuencia nucleotídica obtenida presenta una alta identidad (96%)
con trucha. También se observa una alta identidad a nivel de secuencia aminoacídica (91%) con
trucha y una homología en los dominios y regiones características de los TLR (Figura 17
resultados).
5.1.4. TLR5 soluble
TLR5S se ha descrito que reconoce flagelina, además trabaja en conjunto con TLR5M en activar
la respuesta una vez que se ha detectado flagelina en el hospedero (Tsujita et al., 2004). TLR5S
lo expresan los peces teleósteos, en humanos no se encuentra (Rebl et al., 2010). Este receptor
fue clonado y secuenciado en salmón del Atlántico, obteniéndose gran parte de la región
codificante de su mRNA. La secuencia nucleotídica obtenida presenta una alta identidad (95%)
con trucha. También se observa una alta identidad a nivel de secuencia aminoacídica (91%) con
107
trucha y una homología en los dominios y regiones características de los TLR (Figura 22
resultados). Una vez obtenida la secuencia nucleotídica, al estudiarla por BLAST, se comprobó
que correspondía a TLR5 soluble y que esta secuencia ya se encontraba descrita en salmón del
Atlántico, con el nombre “Toll like Leucine rich repeat” (Tsoi et al., 2006).
5.2. Anticuerpos
Para los TLR en estudio se diseñaron péptidos para generar anticuerpos en conejo y así poder
utilizarlos como herramientas para analizar la expresión proteica de estos receptores. Al evaluar
los anticuerpos generados por los péptidos para cada TLR, se obtuvieron las bandas esperadas
para cada uno, la que no se encontraba presente en el suero pre-inmune de cada conejo. Para
TLR1 se obtuvo una banda de 90 kDa. Para TLR22 se obtuvo una banda de 110 kDa y para
TLR5 una banda de 100 kDa (Figura 28 resultados). Es importante seguir con el estudio de los
anticuerpos, para ello, resultaría primordial realizar una pre-absorción de los anticuerpos con una
mezcla de proteínas de órganos donde no se expresen estos receptores en particular, de manera de
depletar anticuerpos inespecíficos y lograr limpiar la reacción de bandas inespecíficas. Esto
motivado porque en algunos de ellos se pudo observar bandas inespecíficas que no correspondían
al tamaño esperado y por tanto al antígeno que se deseaba pesquizar. Además para poder estudiar
la presencia de TLR5 soluble, es necesario estudiarlo a nivel sanguíneo en condiciones de peces
sanos y desafiados o que hayan estado sometidos a alguna infección por una bacteria que
contenga flagelina. Todo esto es de vital importancia por cuanto hasta ahora sólo se han
reportado análisis de expresión a nivel de RT-qPCR en diferentes formas y bajo diferentes
estímulos, pero sin lograr pesquisar hasta ahora la proteína en sí (Tsujita et al., 2006; Matsuo et
al., 2008; Palti et al., 2010). Con esta herramienta es posible esclarecer los órganos de síntesis de
108
cada TLR, ya que hasta el momento estos estudios sólo se han realizado en base a la expresión de
mRNA en órganos de peces. En el desarrollo de la tesis se priorizó los ensayos de cinéticas,
quedando esta parte pendiente para trabajos posteriores.
5.3. Cinéticas de expresión
La investigación de las formas de TLR en peces puede abrir puertas y estrategias terapéuticas
para la profilaxis humana y animal. Adicionalmente, el entendimiento de la función de los TLR
en peces y sus especificidades de patógenos puede guiar al desarrollo de mejores
inmunoestimulantes para el uso en acuicultura comercial, así como agonistas para el control y
prevención de enfermedades (Randon-Barragan, 2009).
5.3.1. Elección de normalizador
Los estudios de las cinéticas se realizaron mediante RT-qPCR por lo que resulta primordial una
buena elección del normalizador a utilizar. Se estudiaron dos normalizadores para realizar las
cinéticas de expresión, β-actina y EF-1a. β-actina es una de las principales proteínas del
citoesqueleto de la célula, posee importantes funciones en el andamiaje, forma y movilidad de la
célula eucariótica además de ser una de las proteínas más abundantes (Hennessey et al., 1993).
EF-1a sigla que corresponde al Factor de Elongación Eucariótico 1A (alpha) juega un papel
importante en la traducción por catalizar la unión aminoacil-tRNA al sitio aceptor del ribosoma
además de otras funciones y constituye de 1-3% de las proteínas citoplasmáticas de la célula
(Olsvik et al., 2005). Ambos fueron probados, utilizando como muestra la cinética con P.
salmonis viva, para comparar los Ct de cada uno de ellos. Para poder compararlos, este estudio se
basó en el razonamiento de Peña et al. que en el año 2010 descubrieron que los valores de Ct
entre 16.17 y 24.99 indican niveles de expresión en un rango dinámico. Al compararlos, EF-1a
109
tiene Ct dentro de estos valores, en cambio β-actina tiene valores mucho más altos (Figura 32
resultados). Además los autores Peña et al. (2010), Jorgensen et al. (2006) y Olsvik et al. (2005)
hacen referencia que como gen normalizador EF-1a los Ct son más estables, y no existe mayor
diferencia entre los Ct de las muestras a estudiar, así como tampoco hay variación en el tiempo de
ellos, en comparación con β-actina. Por estas razones se utilizó como gen normalizador EF-1a.
5.3.2. Evaluación de Cinéticas por receptor
La expresión de los TLR no es estática, sino más bien modulada en respuesta a patógenos, a una
variedad de citoquinas o estrés ambiental (Akira et al., 2006). El estudio de las cinéticas de
expresión se basó principalmente en la infección causada por Piscirickettsia salmonis en salmón
del Atlántico. P. salmonis al ser un patógeno bacteriano posee diversos PAMPs que pueden ser
reconocidos por los TLR que se describieron en esta tesis. Como por ejemplo: P. salmonis es una
bacteria gram negativa (Fryer et al., 2003), que posee en su membrana lípidos, proteínas e
hidratos de carbono (que podrían reconocidos por TLR1 y TLR22), además se ha descrito que
posee algunos tipos de flagelina en su membrana (Wilhelm et al., 2006) los que podrían ser
reconocidos por TLR5 de membrana y TLR5 soluble.
Además del estudio de P. salmonis, se estudió la infección con LPS, componente de las bacterias
gram negativas (Sepulcre et al., 2009), para poder evaluar el comportamiento de los distintos
marcadores en estudio y aportar de esta manera al estudio del reconocimiento de LPS en peces.
En el desarrollo de la tesis se realizaron 4 cinéticas de expresión. Las cinéticas realizadas
utilizaron como elemento de infección a: P. salmonis viva, proteínas totales de P. salmonis, P.
salmonis inactivada con formaldehido y LPS. En todas las cinéticas se evaluó: la expresión de
TLR5M, TLR5S, TLR1, TLR22, TLR9, IL-1β y Myd88 por RT-qPCR. La idea de estudiar IL-1β
110
y Myd88 es para poder visualizar como es el comportamiento de la cascada de señalización en
respuesta al reconocimiento de los ligandos por sus respectivos TLR. Myd88 es una de las cinco
proteínas adaptadoras al dominio TIR, y es utilizada por todos los TLR menos TLR3. Al
activarse desencadena una cascada de señalización que finaliza con la activación del factor de
transcripción NF-ƙB (Kumar et al., 2009), el cual dentro de los genes que activa se encuentra IL-
1β. Esta interleuquina es el mediador central de la respuesta inmune y respuesta inflamatoria, e
inicia una variedad de funciones, como activación de macrófagos y expresión de otras citoquinas
(Bjornsdottir et al., 2009). Además se agregó la evaluación de TLR9, receptor que reconoce CpG
DNA no metilado, característico en el genoma de las bacterias (Akira et al., 2006). Las cinéticas
se realizaron con el fin de evaluar la expresión de los mRNA de los distintos marcadores, en
presencia de diversas formas de presentación de P. salmonis (P. salmonis viva; P. salmonis
inactivada con formaldehido y Proteínas totales de P. salmonis) además de evaluar lo que ocurre
con la infección de LPS, el cual es un activador prototipo del sistema inmune (Aderem et al.,
2000).
5.3.2.1. Cinéticas de expresión de TLR5M
El ligando de TLR5 es flagelina, componente principal del flagelo bacteriano (Akira et al., 2006).
La cinética de expresión con P. salmonis viva presentó un aumento de expresión en las primera
horas (de 0,5 veces por sobre el control) y luego cae su expresión. Esto se podría explicar debido
a que P. salmonis a pesar de ser inmóvil y sin flagelo, posee flagelina en su membrana la que es
reconocida por TLR5M (Tsujita et al., 2004).En cambio se ve un aumento de expresión en la
cinética realizada con Proteínas totales de P. salmonis, de cerca de 1,5 veces por sobre el control.
111
Lo que se explica a que flagelina se encuentra mucho más libre y puede interactuar de una mejor
manera con el receptor.
La cinéticas con P. salmonis inactivada, en todo los tiempos estudiados disminuye su expresión
bajo el control, lo que podría deberse a que la metodología de inactivación (formaldehido)
provoca que esta proteína pueda quedar oculta en la membrana y menos accesible a unirse al
receptor, producto de la fijación por el formaldehido.
La cinética frente a LPS también disminuye su expresión bajo el control, en todos los tiempos
estudiados. Esto es debido a que LPS no es ligando para TLR5 (Tsujita et al., 2004).
5.3.2.2. Cinéticas de expresión de TLR5S
TLR5S genera una curva de retroalimentación positiva en respuesta a flagelina en células TLR5
positivas (Randon-Barragan, 2009), además puede ser requerido por el pez para amplificar la
respuesta inflamatoria generada por TLR5 de membrana (Tsujita et al., 2004). En la cinética de
expresión con P. salmonis viva sólo se observa un aumento a las 4 horas (de 1 vez por sobre el
control), en los demás tiempos la expresión es bajo el control. Esto se corrobora con el estudio
realizado por Tsujita et al., en el año 2004, quienes describen un aumento de la expresión de
TLR5 en trucha a las 4 horas, después de la estimulación con Vibrio anguillarum (bacteria gran
negativa flagelada) y que se mantiene hasta 12 horas post-infección. Los mismos autores
reportaron que TLR5S en trucha sólo se expresa en hígado, por lo que su ensayo fue realizado en
línea celular de hígado de trucha, RTH-149. La diferencia de expresión en el ensayo con salmón
del Atlántico puede deberse a que la línea utilizada fue SHK-1, línea que proviene de cabeza de
riñón del salmón del Atlántico.
112
En la cinética de expresión con Proteínas totales de P. salmonis, existe un gran aumento de
expresión a las 16 horas y 1 día de infección post-infección (aprox. 3 veces por sobre el control).
Lo que se explica a que flagelina está mucho más accesible a ser detectada. Al igual que el
ensayo con P. salmonis viva se observa una respuesta tardía, esto podría ser debido a que primero
flagelina debe ser reconocida por la célula, mediante TLR5M, para que exista un aumento de
expresión de TLR5S (Tsujita et al., 2004). Este dato es importante para una posible creación de
vacuna contra P. salmonis, ya que su expresión es amplificada a través del tiempo, además de ser
una especie de citoquina que alarma al organismo hospedero de la presencia de una infección
causada por una bacteria que contiene flagelina (Tsujita et al., 2006).
En la cinética de expresión con P. salmonis inactivada, no existe expresión del receptor en
control y en los tiempos de la cinética estudiados esta es muy baja. Al igual que TLR5M esto
puede deberse a que la metodología de inactivación ocultó a flagelina.
En la cinética de expresión con LPS, no existe expresión del receptor en control pero en los
tiempos estudiados es muy baja. Al igual que TLR5M puede deberse a que LPS no es ligando
para el TLR5S (Tsujita et al., 2004).
5.3.2.3. Cinéticas de expresión de TLR1
TLR1 en peces, aún no se ha descubierto cual es su ligando (Palti, 2011), en mamíferos se ha
reportado que forma un heterodímero con TLR2, y que reconocen peptidoglican y lipoproteínas
de origen bacteriano (Palti et al., 2010). P. salmonis podría poseer algún PAMPs que TLR1
reconozca como lípidos, proteínas e hidratos de carbono que se encuentran en su membrana. En
la cinética de expresión con P. salmonis viva se observó un aumento bifásico de la expresión, a
113
las 2 horas y 1 día. Debido a este aumento de expresión, P. salmonis podría poseer algún ligando
que TLR1 reconozca.
En la cinética de expresión con Proteínas totales de P. salmonis. Se ve un gran aumento durante
toda la cinética, logrando aumentar más de 30 veces con respecto al control. Esto también podría
corroborar la idea que P. salmonis posee un ligando para TLR1.
En la cinética con P. salmonis inactivada, la expresión se encuentra por bajo el control. Al igual
que los receptores anteriores, podría ocurrir que la metodología de la inactivación ocultó el
ligando y ya no es accesible al receptor.
Las cinéticas con LPS también la expresión se encuentra por bajo el control. Lo que podría
descartar que el ligando para TLR1 fuera LPS.
5.3.2.4. Cinéticas de expresión de TLR22
TLR22 es un receptor específico de peces, en humanos se encuentra como pseudogen (Rebl et
al., 2010). Se ha reportado, en pez cebra, que existe una modulación positiva de la expresión de
TLR22 frente a patógenos acuáticos como Aeromona salmonicida, Mycobaterium marinum (Rebl
et al., 2010). Además en lenguado japonés, peptidoglican y dsRNA inducen un aumento de la
expresión de TLR22 (Rebl et al., 2007; Matsuo et al., 2008). Por estas razones se piensa TLR22
reconoce diversos ligandos de patógenos acuáticos, ya sean virus o bacteria. En la cinética con P.
salmonis viva, existe un aumento leve en forma bifásica, y en general mantiene su expresión
hasta llegar a 1 día de infección donde baja la expresión, con respecto al control. Se ha reportado
que la estimulación declina con la infección (Rebl et al., 2007). Esto podría deberse a que P.
114
salmonis, al igual que para TLR1, presenta algún ligando para TLR22 aún no identificado en
peces.
En la cinética con LPS, no existe expresión en control, pero si a las 2 y 16 horas, pero es muy
baja la expresión. Podría explicarse a que LPS no es ligando para TLR22.
Las cinéticas con Proteínas totales de P. salmonis y P. salmonis inactivada no se encontró
expresión del receptor, incluido en control.
5.3.2.5. Cinéticas de expresión de TLR9
TLR9 se encuentra en endosomas dentro de la célula y reconoce como ligando CpG-DNA no
metilado, los motivos CpG no metilados son abundante en el genoma bacteriano (Akira et al.,
2006). En la cinética con P. salmonis viva, existe un aumento en las primeras horas post-
infección, con respecto al control. Este comportamiento puede deberse a que la bacteria en
primera instancia es fagocitada, donde las condiciones ácidas y reductoras degradan la doble
hebra de DNA en múltiples motivos de CpG que subsecuentemente interactúa con TLR9 (Akira
et al., 2006). También se ha reportado en lenguado japonés que TLR9 aumenta su expresión
después de una infección con Edwardsiella tarda, bacteria gram negativa y en pes cebra también
aumenta su expresión frente a una infección con Mycobacterium marinum (Rebl et al., 2010).
En la cinética con proteínas totales de P. salmonis, se ve un aumento de expresión durante toda la
cinética, de aprox. 7 veces con respecto al control. Esto se explica porque la metodología
utilizada para la extracción de proteínas totales, en ningún momento se trató con DNAsa por lo
que el genoma parcialmente degradado de la bacteria quedó en la solución, por lo tanto
secuencias CpG no metiladas quedaron accesibles (a la solución se le midió su relación 260/280
115
=1,410 y concentración de DNA 1,257µg/µL). Además se ha reportado que existe una inducción
de la expresión de TLR9 en leucocitos de salmón del Atlántico después del desafío con CpG
(Skajaeveland et al., 2008).
En la cinética con P. salmonis inactivada, la expresión disminuye bajo el control. La inactivación
de la bacteria impide que el genoma sea tratado en endosomas y expuesto a TLR9.
En la cinética con LPS, la expresión también disminuye bajo el control. Esto porque LPS no es
ligando para TLR9 (Randon-Barragan, 2009).
5.3.2.6. Cinéticas de expresión de IL-1β
IL-1β es una citoquina de respuesta inflamatoria, la que se encuentra descrita en especies
salmonídeas (Ingerslev et al., 2010). En la cinética con P. salmonis viva, se ve un aumento de
expresión durante toda la cinética, con un pick de 7 veces por sobre el control. Como se observó
en la mayoría de las cinéticas anteriores, existe la activación de distintos TLR, lo que
desencadena una cascada de señalización que finaliza con la activación de distintas citoquinas,
como IL-1β. Ingerslev et al. (2010) reportaron ensayos in vivo en salmón del Atlántico, en los
cuales IL-1β presenta una estimulación de su expresión al 7 día post-infección.
En la cinética con proteínas totales de P. salmonis, existe un aumento de expresión de hasta 12
veces por sobre el control. Esto debido a que los ligandos se encuentran más “libres” y expuestos
para poder interactuar con sus respectivos TLR y se ejerce una respuesta inmune mayor. Este
dato es importante para una posible creación de vacunas contra P. salmonis.
En la cinética de expresión con P. salmonis inactivada, se observa una estimulación tardía de la
expresión. Esto debido a que la inactivación con formaldehido oculta los ligandos de los TLR.
116
En la cinética de expresión con LPS, existe un aumento a las 2 horas y luego disminuye. Esto
podría ser indicio de que existe algún RRP que reconoce LPS y genera una respuesta inmune. Lo
que podría comprobar que el reconocimiento de LPS es distinto en los peces que en mamíferos
(Rebl et al., 2010). Idea que se basa en que la mayoría de los peces carece de TLR4 y en ningún
pez se ha descrito la presencia de MD-2 y CD14. TLR4 se ha descrito en mamíferos por
reconocer LPS utilizando como molécula adaptadora para este reconocimiento a MD-2 y CD14
(Sepulcre et al., 2009).
5.3.2.7. Cinéticas de expresión de Myd88
Myd88 es una de las cinco proteínas adaptadoras que se encuentran a cargo de desencadenar la
respuesta inmune una vez que TLR han reconocido su ligando (O´neill et al., 2007). Además,
hasta el momento, es la única proteína adaptadora descrita en salmón del Atlántico (Skjæveland
et al., 2009). En las cinéticas con P. salmonis viva y proteínas totales de P. salmonis se mantiene
su expresión, con respecto al control. Aumentando levemente en el inicio de la infección, en
aprox. 0,5 veces con respecto al control. Esto podría relacionarse a que su expresión permanece
constante, independiente del aumento de expresión de los TLR.
En cambio en las cinéticas con P. salmonis inactivada y LPS existe una regulación negativa de la
expresión, pero nunca llegando a cero expresión. Importante porque sigue existiendo activación
de la respuesta inmune, por medio de esta vía.
117
5.3.3. Evaluación de Cinéticas por desafíos de infección
5.3.3.1. Infección causada por P. salmonis viva
En general se observa una modulación de la expresión de los distintos marcadores estudiados. Lo
que podría concluir que P. salmonis posee la capacidad de modular la expresión de los TLR en su
beneficio, lo que se apoya con el hecho de que P. salmonis puede vivir y replicarse dentro de la
célula del hospedero, por lo tanto podría evadir la respuesta inmune contra ella (McCarthy et al.,
2008). En particular el hecho de que TLR5M y TLR5S no exista una gran expresión de ellos en
esta cinética, podría ser debido a las razones anteriores, porque en general se pensaría que por
poseer flagelina en su membrana, la infección con P. salmonis causaría una gran activación de
ellos, en particular de TLR5. La modulación de la expresión diferencial de los TLR estudiados se
apoya con el hecho de que las células del sistema inmune usan múltiples TLR para detectar varias
características de un patógeno simultáneamente (Underhill et al., 2002), productos microbiales
pueden también inducir otros TLR más de los específicos para su propio reconocimiento
(Randon-Barragan, 2009).
5.3.3.2. Infección causada por proteínas totales de P. salmonis
En general todos los marcadores evaluados, menos TLR22, se ve un aumento de la expresión de
ellos. Al observar este resultado se podría concluir que esta forma de exposición de P. salmonis
podría ayudar en la creación de un adyuvante efectivo contra P. salmonis, ya que se ven
activados varios TLR, lo que sería importante en activar y modular una respuesta adaptativa en el
hospedero (Seya et al., 2006). Esta forma de exposición de la bacteria lograría que los ligandos
estén más libres de poder interactuar con sus respectivos TLR y desencadenarían una respuesta
inmune apropiada. Además se observo TLR5S e IL-1β se encuentran aumentadas, pensando en
118
que son las posibles respuestas humorales que se verían en el organismo hospedero. También
sería importante evaluar otras citoquinas, como IL-12, que es importante en activar la respuesta
por linfocitos Th1 (Pasare et al., 2004).
5.3.3.3. Infección causada por P. salmonis inactivada
En general todos los marcadores estudiados, su expresión disminuyo o fue nula, con respecto al
control. Lo que concluye que esta forma de inactivación no es buena para generar una respuesta
inmune, al menos vía TLR. Podría explicarse porque la bacteria queda fija y oculta, y los
ligandos no pueden interactuar con sus TLR y de esta manera no habría activación de la respuesta
inmune contra ella.
5.3.3.4. Estimulación causada por LPS
En general en la mayoría de los genes evaluados, menos IL-1β, se ve una disminución de
expresión en comparación con el control. En cambio para IL-1β se ve un aumento durante las
primeras horas de infección. Esto concluye que ninguno de los TLR evaluados presenta como
ligando a LPS, pero que sí existiría algún otro RRP que lo reconozca y que ejercería una
respuesta inmune contra él (Rebl et al., 2010).
Es importante recordar que este estudio se realizó en cultivo celular, por lo tanto las interacciones
entre distintos tipos celulares y compuestos humorales no son posibles. Por lo que es necesario el
estudio en cultivo primario y luego en el organismo (in vivo) para comprobar que el
comportamiento de los TLR concuerda con el estudio realizado in vitro. Además se podrían
agregar mayores factores para poder comprender el comportamiento del sistema inmune más
global frente a la infección con P. salmonis.
119
Basándose en los resultados obtenidos, podemos concluir que:
Existe RNA mensajero para los receptores tipo Toll, TLR1, TLR22, TLR5 de membrana
y TLR5 soluble en salmón del Atlántico. Todas las proteínas resultantes poseen las
características estructurales propias de los receptores tipo Toll descritos hasta ahora.
Se desarrollaron sueros inmunes policlonales que detectan proteínas cuyas masas
corresponden a los receptores estudiados.
P. salmonis logra modular la expresión de los receptores estudiados y de TLR9, Myd88 e
IL-1β, importantes en las cascadas de señalización de TLR. Lo que puede representar una
forma de cómo esta bacteria logra evitar la respuesta inmune en peces y causar
mortalidades altísimas en los cultivos de salmón del Atlántico en Chile.
El estudio de Proteínas totales de P. salmonis, indicó que esta podría ser una certera forma
de exposición de P. salmonis para una posible vacuna contra ella.
120
6. REFERENCIAS
Abdelsadik, A. y Trad, A. (2011). Toll like receptors on the fork roads between innate and
adaptative immunity. Hum. Immuno. En prensa.
Aderem, A. y Ulevitch, R. (2000). Toll-like receptors in the induction of the innate immune
response. Nature. 406, 782-787.
Akira, S., Uematsu S. y Takeuchi, O. (2006). Pathogen recognition and innate immunity. Cell.
124, 783-801.
Alvarez-Pellitero P. (2008). Fish immunity and parasite infections: from innate immunity to
immunoprophylactic prospects. Vet. Immuno. and Immunopat. 126, 171-198.
Bautista, C. y Mosqueda, J. (2005). Papel de los receptores tipo toll en la inmunidad innata y su
implicación en medicina veterinaria. Vet. Mex. 36, 453-468.
Bell, J., Mullen, G., Leifer, C., Mazzoni, A., Davies, D. y Segal D. (2003). Leucine-rich repeats
and pathogen recognition in Toll-like receptors. TRENDS in Immunol. 24, 528-533.
Bell, J., Botos, I., Hall, P., Askins, J., Shiloach, J., Segal, D. y Davies, D. (2005). The molecular
structure of the Toll-like receptor 3 ligand-binding domain. PNAS. 102, 10976-10980.
Birkbeck, T., Rennie, S., Hunter, D., Laidler, A. y Wadsworth, S. (2004). Infectivity of a Scottish
isolate of Piscirickettsia salmonis for Atlantic salmon Salmo salar and immune response of
salmon to this agent. Disease of Aquatic Organism. 60, 97-103.
121
Bjornsdottir, B., Fast, M., Sperker, S., Brown, L. y Gudmundsdottir, B. (2009). Effects of
Moritella viscosa antigens on pro-inflammatory gene expression in an Atlantic salmon (Salmo
salar Linnaeus) cell line (SHK-1). Fish and Shellfish Immunology. 26, 858-863.
Boltaña, S., Roher, N., Goetz, F. y McKenzie, S. (2011), PAMPs, PRRs and the genomics of
gram negative bacterial recognition in fish. Dev. Comp. Immunol. En prensa.
Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities
of protein utilizing the principle of protein dye binding. Analytical Biochemestry. 72, 248-254.
Brody, J. y Scott, K. (2004). Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA
electrophoresis. Biotechniques. 36, 214-216.
Chomczynski, P. y Sacchi, N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chlotoform extraction. Analytical Biochemestry.162, 156-159.
Collado, V., Porras, R., Cutuli, M. y Gómez-Lucia, E. (2008). El sistema inmune innato I: sus
mecanismos. RCCV. 2, 1-16.
Ellis, A. (1999). Immunity to bacteria in fish. Fish and Shellfish Immunology. 9, 291-308.
Fryer, J. y Hedrick, R. (2003). Piscirickettsia salmonis: a gram negative intracellular bacterial
pathogen of fish. Journal of fish Deseases. 26, 251-262.
Hannessey, E., Drummond, D. y Sparrow, J.(1993). Molecular genetics of actin function.
Biochem. J. 282, 657-671.
Hoop, T. y Woods, K. (1981). Prediction of protein antigenic determinants from aminoacid
sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78, 3824-3828.
122
Ingerslev, H., Lunder, T. y Nielsen, M. (2010). Inflammatory and regenerative responses in
salmonids following mechanicals tissue damage and natural infection. Fish and Shellfish
Immunology. 29, 440-450.
Imler, J. y Zheng, L. (2004). Biology of Toll receptors: lessons from insects and mammals.
Journal of Leukocyte Biology. 75, 18-26.
Janeway, C. y Medzhitov, R. (2002). Innate Immune Recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197-
216.
Janssens, S. y Beyaert, R. (2003). Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical
Microbiology Reviews. 16, 637-646.
Jault, C., Pichon, L., Chluba, J.(2004). Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in
Danio rerio. Molecular Immunology. 40, 759-771.
Jin, M., Kim, S., Heo, J., Lee, M., Kim, H., Paik, S., Lee, H. y Lee, J. (2007). Crystal structure of
the TLR1-TLR2 heterodimer induced by binding of a tri-acylated-lipopeptide. Cell. 130, 1071-
1082.
Jorgensen, S., Kleveland, E., Grimholt, U. y Gjoen, T. (2006). Validation of reference genes for
Real-Time polymerase chain reaction studies in Atlantic salmon. Marine Biotechnology. 8, 398-
408.
Kawai, T. y Akira, S. (2010). The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:
update of toll like receptors. Nature Immunology. 11, 375-384.
123
Kumar, H., Kawai, T. y Akira S. (2009). Toll-like receptors and innate immunity. BBRC. 388,
621-625.
Laemli, V. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.
Leal, J. y Woywood, D. (2007) Piscirickettsiosis en Chile: advances y perspectivas para su
control. Salmo-ciencia. 34-42.
Lockhart, K., Gahlawat S., Soto-Mosquera, D., Bowden, T., Ellis, A. (2004) IPNV carrier
Atlantic salmon growers do not express Mx mRNA and poly I:C-induced Mx response does not
cure the carrier estate. Fish and Shellfish immunology. 17, 347-352.
McCarthy, Ú., Bron, J., Brown, L., Pourahmad, F., Bricknell, I., Thompson, K., Adams, A. y
Ellis, A. (2008). Survival and replication of Piscirickettsia salmonis in rainbow trout head kidney
macrophages. Fish and shellfish immunology. 25, 477-484.
Magnadóttir, B. (2006). Innate immunity of fish (overview). Fish and Shellfish Immunology. 20,
137-151.
Manavalan, B., Basith, S. y Choi, S. (2011). Similar structures but different roles-an update
perspective on TLR structures. Frontiers in physiology. 2, 1-13.
Matsuo, A., Oshiumi, H., Tsujita, T., Mitani, H., Kasai, H., Yoshimizu, M., Matsumoto, M. y
Seya T. (2008). Teleost TLR22 recognizes RNA duplex to induce IFN and protect cells for
birnaviruses. J. Immunol. 181, 3474-3485.
124
Matsushima, N., Tanaka, T., Enkhbayar, P., Mikami, T., Taga, M., Yamada, K. y Koruki, Y.
(2007). Comparative sequence analysis of leucine-rich repeats (LRRs) within vertebrate toll like
receptors. BMC Genomics. 8, 124-144
Medzhitov, R. (2001). Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews. 1, 95-104.
Mezhitov, R. y Janeway, C. (2000). Innate immune recognition: mechanism and pathways.
Immuno. Reviews. 173, 89-97.
Moreno, C. y Sánchez-Ibarrola, A. (2003). Receptores tipo toll: bases moleculares de la relación
entre respuestas innatas y adaptativas del sistema inmunitario. Rev. Med. Uni. 3, 29-33.
Olsvik, P., Lie, K., Jordal, A., Nilsen, T. y Hordvik, I. (2005). Evaluation of potential reference
genes in real-time RT-PCR studies of Atlantic salmon. BMC Molecular Biology. 6, 1-9.
O´neill, L. y Bowie, A. (2007). The family of five: TIR-domain-containing adaptors in Toll like
receptor signalling. Nature Reviews. 7, 353-364.
Palti Y. (2011) Toll-like receptors in bony fish: From genomics to functions. Dev. Com.
Immunol. En Prensa.
Palti, Y., Rodriguez, M., Gahr, S., Purcell, M., Rexroad III, C. y Wiens, G. (2010). Identification,
characterization and genetic mapping of TLR1 loci in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish
and Shellfish Immunology. 28, 918-926.
Pancer, Z. y Cooper, M. (2006). The evolution of adaptative immunity. Annu. Rev. Immunol. 24,
497-518.
125
Pasare, C. y Medzhitov, R. (2004). Toll-like receptors: linking innate and adaptative immunity.
Microbes and infection. 6, 1382-1387.
Peña, A., Bols, N. y Marshall, S. (2010). An evaluation of potential reference genes for stability
of expression in two salmonid cell lines after infection with either Piscirickettsia salmonis and
IPNV. BMC Research notes. 3, 1-9.
Purcell, M., Smith, K., Aderem, A., Hood, L., Winton, J. y Roach, J. (2006). Conservation of
toll-like receptor signaling pathways in teleost fish. Comp. Biochem. and physio. Part D1, 77-88.
Randelli, E., Buonocore, F. y Scapigliati, G. (2008). Cell markers and determinants in fish
immunology. Fish and Shellfish Immu. 25, 326-340.
Randon-Barragan (2009). Receptores similares a toll en peces: el inicio de la divergencia. InVet.
11, 15-30.
Rebl, A., Siegl, E., Köllner, B., Fischer, B. y Seyfert, H. (2007). Characterization of twin toll like
receptors from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Evolutionary relationship and induced
expression by Aeromonas salmonicida salmonicida. Developmental and Comparative
Immunology. 31, 499-510.
Rebl, A., Goldammer, T. y Seyfert, H. (2010). Toll-like receptors signaling in bony fish. Veter.
Immuno. and Immunopath. 134, 139-150.
Rubio-Godoy, M. (2010). Inmunología de los peces óseos. Revisión. Rev. Mex. Cienc. Pecu.1,
47-57.
126
Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.
Procedings National Academy of Science USA. 74, 5463-5467.
Skjæveland, I., Iliev, D., Zou, J., Jørgensen, T. y Jørgensen, J. (2008). A TLR9 homolog that is
up-regulated by IFN-γ in Atlantic salmon (Salmo salar). Developmental and Comparative
Immunology.32, 603-607.
Slack, J., Schooley, K., Bonnert, T., Mitcham, J., Qwarnstrom, E., Sims, J. y Dower, S. (2000).
Identification of two major sites in the type I Interleukin-1 receptor cytoplasmic region
responsible for coupling to pro-imflammatory signaling pathways. The journal of Biologycal
Chemestry. 275, 4670-4678.
Sepulcre, M., Alcaraz-Pérez, F., López-Muñoz, A., Roca, F., Meseguer, J., Cayuela, M. y
Mulero, V. (2009). Evolution of Lipopolisaccharide (LPS) recognition and signaling: Fish TLR4
does not recognize LPS and negatively regulates NF-ƙB activation. The J. of Immunology. 182,
1836-1845.
Seya, T., Akasawa, T., Tsujita, T. y Matsumoto, M. (2006). Role of toll-like receptors in adjuvant
–aumented immune therapies. eCAM 3, 31-38.
Takano, T., Hwang, S., Kondo, H., Hirono, I., Aoki, T. y Sano, M. (2010). Evidence of
Molecular Toll-like receptors mechanism in teleosts. Fish Pathology. 45, 1-16.
Takeda, K. y Akira, S. (2005). Toll-like receptors in innate immunity. International Immunology.
17, 1-14.
Tripathy, P. y Aggarwal, A. (2006). NF-ƙB transcription factor: a key player in the generation of
immune response. Current Sciencie. 90, 519-531.
127
Tsoi, S., Park, K., Kay, H., O´Brien, T., Podor, E., Sun, G., Douglas, S., Brown, L. y Johnson, S.
(2006). Identification of a transcript encoding a soluble form of toll-like receptor 5 (TLR5) in
Atlantic salmon during Aeromonas salmonicida infection. Veter. Immunol. and Immunopathol.
109, 183-187.
Tsujita, T., Tsukada, H., Nakao, M., Oshiumi, H., Matsumoto, M. y Seya, T. (2004). Sensing
bacterial flagellin by membrane and soluble orthologs of toll-like receptor 5 in rainbow trout
(Onchorhynchus mikiss). The journal of biological chemistry. 47, 48588-48597.
Tsujita, T., Ishii, A., Tsukada, H., Matsumoto, M., Che, F. y Seya, T. (2006). Fish soluble Toll-
like receptor (TLR)5 amplifies human TLR5 response via physical binding to flagellin. Vaccine.
24, 2193-2199.
Toranzo, A., Magariños, B. y Romalde, J. (2005). A review of the main bacterial fish diseases in
mariculture systems. Aquaculture. 246, 37-61.
Underhill, D. y Ozinsky, A. (2002). Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.
Current Opinion in Immunology. 14, 103-110.
Wilhelm, V., Miquel, A., Burzio, L., Rosemblatt, M., Engel, E., Valenzuela, S., Parada, G. y
Valenzuela, P. (2006). A vaccine against the salmonid pathogen Piscirickettsia salmonis based on
recombinant proteins. Vaccine. 24, 5083-5091.
Xu, Y., Tao, X., Shen, B., Horng, T., Medzhitov, R., Manley, J. y Tong, L. (2000). Structural
basis for signal transduction by the Toll/Interleukin 1 receptor domain. Nature. 408, 111-115.
Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Gutiérrez-de Frías, C. y Cortés, A. (2006). Ontogeny of the
immune system of fish. Fish and Shellfish Immu. 20, 126-136.