CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN...

7/26/2019 CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC …

http://slidepdf.com/reader/full/chuan-hoa-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-malachite-green-va-leuco 1/94

LỜ I C Ả M Ơ N

LỜ I CẢM Ơ N

Tr ướ c tiên, em xin chân thành cảm ơ n tất cả quý thầy cô, những ngườ i đã

hết lòng truyền đạt cho em kiến thức quý báu và bổ ích trong những năm học vừa

qua. Xin cảm ơ n quý thầy cô Khoa Khoa học, những ngườ i đã đào tạo kiến thức

đại cươ ng cũng như chuyên ngành hết sức quan tr ọng và cần thiết để em có thể

hoàn thành tốt công việc cũng như có thể tiế p cận vớ i những kiến thức mớ i sau

này.

Xin chân thành cảm ơ n Cô LÊ BẢO NGỌC, thạc s ĩ Khoa Thủy Sản, cán

bộ hướ ng dẫn chính, ngườ i tr ực tiế p hướ ng dẫn cũng như tận tình chỉ bảo cho em

trong quá trình thực tậ p. Nhờ sự giúp đỡ của Cô, em mớ i có thể hoàn thành đượ cluận văn tốt nghiệ p một cách thuận lợ i. Chỉ làm việc vớ i Cô trong một thờ i gian

ngắn nhưng em đã học đượ c đức tính cẩn thận và tinh thần trách nhiệm cao trong

công việc, những đức tính r ất quan tr ọng đối vớ i một ngườ i làm công tác khoa

học.

Xin chân thành cảm ơ n Cô LÊ THỊ BẠCH, thạc s ĩ Khoa Khoa Học, cán

bộ hướ ng dẫn. Cô đã tận tình hỗ tr ợ về mặt lý thuyết, giúp em giải quyết những

khó khăn trong quá trình làm luận văn. Nhờ sự chỉ dẫn cũng như những tài liệuvà sự giúp đỡ nhiệt tình của Cô, em mớ i có thể vượ t qua những vướ n mắc, những

khó khăn trong quá trình tổng hợ p tài liệu và viết bài.

Xin chân thành cảm ơ n thầy NGUYỄ N VĂ N ĐẠT, giảng viên cố vấn học

tậ p, thầy đã quan tâm cũng như ủng hộ, giúp đỡ chúng em trong suốt thờ i gian

học tậ p cũng như trong thờ i gian chúng em làm luận văn.

Xin chân thành cảm ơ n Cô NGUYỄ N THỊ DIỆP CHI, Thầy LÊ THANH

PHƯỚC, nhờ vào giáo trình và những kiến thức mà quý thầy cô đã truyền đạt,em mớ i có thể nắm đượ c những lý thuyết nền tảng, phần lý thuyết không thể

thiếu về Sắc ký cũng như về Khối phổ giúp em hoàn chỉnh đề tài của mình.

Xin cảm ơ n sự giúp đỡ của quý thầy cô Bộ Môn Dinh Dưỡ ng và Chế Biến

Thủy Sản, cảm ơ n sự động viên, ủng hộ tinh thần cũng như sự quan tâm giúp đỡ

của các bạn lớ p Cử Nhân Hóa Khóa 29, các bạn lớ p Thủy Sản Khóa 29, những

ngườ i cùng làm việc vớ i tôi trong thờ i gian làm luận văn tại Khoa Thủy Sản.

Do hạn chế về kiế n thứ c cùng một số vấ n đề về trang thiế t bị nên đề tàikhông tránh khỏi sai sót, mong đượ c sự góp ý chân thành của thầ y cô cùng các

W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY



NH Ậ N XÉT C Ủ A CÁN BỘ H ƯỚ NG D Ẫ N

Trang ii

TR ƯỜ NG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA KHOA HỌC Độc lậ p - Tự do - Hạnh phúc

BỘ MÔN HOÁ ------

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HRƯ RỚ NG DẪN

1. Cán bộ hướ ng dẫn: Ths. LÊ BẢO NGỌC

Ths. LÊ THỊ BẠCH

2. Đề tài: “CHU Ẩ N HÓA PH ƯƠ NG PHÁP XÁC ĐỊ NH DƯ LƯỢ NG

MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN TRONG CÁC S Ả N PH Ẩ M TH Ủ Y S Ả N B Ằ NG LC-MS/MS”

3. Sinh viên thực hiện: ĐOÀN ĐỨ C BẢO

- MSSV: 2033425 - Lớ p: Cử nhân hóa học - Khóa 29

4. Nội dung nhận xét:

a. Nhận xét về hình thức LVTN:

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

b. Nhận xét về nội dung của LVTN:

Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế:

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................


WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



NH Ậ N XÉT C Ủ A CÁN BỘ H ƯỚ NG D Ẫ N

Trang iii

c. Nhận xét đối vớ i từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội

dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................d. K ết luận, đề nghị và điểm:

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

Cần Thơ , ngày tháng năm 2007

Cán bộ hướ ng dẫn





NH Ậ N XÉT C Ủ A CÁN BỘ PH Ả N BI Ệ N

Trang iv

TR ƯỜ NG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA KHOA HỌC Độc lậ p - Tự do - Hạnh phúc

BỘ MÔN HOÁ ------

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1. Cán bộ phản biện: Ths. NGUYỄN THỊ DIỆP CHI

2. Đề tài: “CHU Ẩ N HÓA PH ƯƠ NG PHÁP XÁC ĐỊ NH DƯ LƯỢ NG

MALACHITE GREEN VÀ LEUCOMALACHITE GREEN TRONG

CÁC S Ả N PH Ẩ M TH Ủ Y S Ả N B Ằ NG LC-MS/MS”

3. Sinh viên thực hiện: ĐOÀN ĐỨ C BẢO- MSSV: 2033425 - Lớ p: Cử nhân hóa học - Khóa 29

4. Nội dung nhận xét:

a. Nhận xét về hình thức LVTN:

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

b. Nhận xét về nội dung của LVTN:

Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế:

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

c. Nhận xét đối vớ i từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội

dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

.......................................................................................................................................





NH Ậ N XÉT C Ủ A CÁN BỘ PH Ả N BI Ệ N

Trang v

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

d. K ết luận, đề nghị và điểm:

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

.......................................................................................................................................

Cần Thơ , ngày tháng năm 2007.

Cán bộ phản biện





TÓM LƯỢ C

Trang vi

TÓM LƯỢ C

Đề tài “Chuẩ n hóa phươ ng pháp xác đị nh d ư l ượ ng Malachite Green (MG)

và Leuco Malachite Green (LMG) bằng S ắc ký l ỏng cao áp hi ệu năng cao ghépcặ p khố i phổ (LC-MS/MS)” đượ c tiến hành dựa trên phươ ng pháp tham chiếu:

“XÁC ĐỊ NH MALACHITE GREEN VÀ LEUCO-MALACHITE GREEN TRONG

MỘT SỐ SẢ N PHẨM THUỶ SẢ N BẰ NG SẮC KÝ LỎ NG CAO ÁP GHÉP CẶP

KHỐI PHỔ (LC/MS-MS)” đượ c tiến hành bở i nhóm các nhà khoa học Jeffrey M.

VADNe Riet, Cory J. Murphy, Johanna N. Pearce, Ross A. Potter và B. Garth

Burns.

Bằng hệ thống LC-MS/MS bao gồm thiết bị sắc k ỷ lỏng cao áp hiệu năng cao

AGILENT 1100 và thiết bị khối phổ API 3000 của phòng thí nghiệm Sắc ký, Bộ

Môn Dinh Dưỡ ng và Chế Biến Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, tr ườ ng Đại học Cần Thơ ,

dướ i sự hướ ng dẫn tr ực tiế p của Thạc s ĩ Lê Bảo Ngọc và sự hỗ tr ợ của Thạc s ĩ Lê

Thị Bạch, hai cán bộ hướ ng dẫn, sinh viên làm đề tài sẽ tiến hành chuẩn hóa phươ ng

pháp phân tích dư lượ ng Malachite Green và Leuco Malachite Green trong các sản

phẩm thủy sản dựa trên phươ ng pháp tham chiếu nêu trên.

Mẫu phân tích sau khi giải đông, đượ c tách chiết theo quy trình đượ c trình

bày trong đề tài. Xây dựng đườ ng chuẩn vớ i các nồng độ 0 ppb; 0,1 ppb; 0,5 ppb; 1 ppb; 2 ppb; 5 ppb; 10 ppb; 20 ppb; 50 ppb; 100 ppb, dựa vào các thông số thu đượ c

bằng thiết bị MS/MS API 3000 về diện tích peak để xây dựng đườ ng chuẩn, từ đó

tính độ thu hồi cũng như nồng độ chất cần phân tích có trong các mẫu phân tích.

Muốn có đượ c độ nhạy cao, thao tác đầu tiên là optimize hệ thống, ngh ĩ a là tìm các

thông số cơ bản của thiết bị như tốc độ dòng, điện thế của nguồn ion hóa, nhiệt độ

dòng khí Nitơ … đối vớ i hệ thống Khối phổ; tỷ lệ dung môi pha động (Gradient pha

động) qua cột tách đối vớ i hệ thống Sắc ký, khi các thông số này đảm bảo cho quá

trình phân tích có độ nhạy cao và ổn định thì quá trình tách chiết và phân tích mẫumớ i đượ c tiến hành. Có thể nói, optimize là quá trình chiếm nhiều thờ i gian nhất và

khó khăn nhất trong quá trình phân tích nói chung.

Đầu tiên, sinh viên thực hiện đề tài sẽ tiến hành chuẩn hóa phuơ ng pháp phân

tích dư lượ ng MG và LMG trong các sản phẩm thủy sản bằng hệ thống LC/MS/MS,

sau đó nếu thờ i gian và thiết bị cho phép sẽ tiế p tục chuẩn hóa phươ ng pháp phân





TÓM LƯỢ C

Trang vii

tích dư lượ ng MG và LMG bằng HPLC. Sau đó so sánh độ nhạy, giớ i hạn phát hiện,

lượ ng mẫu cần thiết của mỗi phươ ng pháp, từ đó có thể thấy đượ c những ưu điểm

của phươ ng pháp LC/MS/MS so vớ i phươ ng pháp HPLC. Đồng thờ i k ết quả thu

đượ c từ quá trình chuẩn hóa cũng đượ c so sánh vớ i các k ết quả của phươ ng pháp

tham chiếu do Tổ Chức AOAC xây dựng. K ết quả của đề tài sẽ là một tài liệu tham

khảo r ất có giá tr ị đối vớ i những nghiên cứu dư lượ ng MG, LMG nói riêng và các

loại thuốc kháng sinh nói chung của chúng ta sau này.





CH Ữ VI Ế T T Ắ T

Trang viii

NHỮ NG CHỮ VIẾT TẮT

Những chữ viết tắt sau đây đã đượ c sử dụng trong đề tài luận văn:

MG Malachite green

LMG Leucomalachite green

MW Molecular Weight

MF Chemical Formula

ppm Parts per million

ppb Parts per billion

μm Micrometer

ng Nanogram

JECFA Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives

IARC International Agency for Research on Cancer

FSA Food StADNards Agency

NTP National Toxicology Programme

AAS Atomic Absorption Spectroscopy

AES Atomic Emission Spectroscopy

HPLC High pressure Liquid chromatography

RP – HPLC Reversed-phase - High pressure Liquid chromatography

MS Mass spectrometry

LC-MS Liquid chromatography - Mass spectrometry

LC-MS-MS Liquid chromatography – TADNem Mass spectrometry

MP Mobile phase

API Atmospheric Pressure Ionization

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization

ESI Electrospray Ionization





CH Ữ VI Ế T T Ắ T

Trang ix

nanoESI Nanoelectrospray ionization

APCI Atmospheric pressure chemical ionization

MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization

DIOS Desorption/ionization on silicon

FAB Fast atom/ion bombardment

EI Electron ionization

CI Chemical ionization

HA Hydroxylamine.HCl

MeCN Acetonitrile

DEG Diethylene glycol

TSA p-toluen sulfonic acid monohydrate

TMPD N,N,N,N-tetramethyl-1,4-phenilenediamine dihydrochloride

Đệm:ACN Dung dịch đệm : Acetonitrile

DIW Nướ c cất





M Ụ C LỤ C

Trang x

MỤC LỤCPHẦ N MỞ ĐẦU. .................................................................................................................. 1

TUPHẦ N NỘI DUNGUT ................................................................................................................ 5TUCHƯƠ NG I. GIỚI THIỆU TỔ NG QUAN VỀ MALACHITE GREENUT............................... 5

TUI.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆ NUT................................................................................................ 5TU

I.2. CẤU TRÚC CỦA MALACHITE GREEN VÀ NHỮ NG CHẤT CHUYỂ N HÓAUT

... 6TUI.2.1. DẠ NG CÓ MÀU CỦA MALACHITE GREEN (MG-C) UT ................................... 7TUI.2.2. DẠ NG CARBINOL CỦA MALACHITE GREENUT ............................................. 8TUI.2.3. DẠ NG LEUCO – MALACHITE GREEN (LMG)UT .............................................. 8

TUI.3. TÍNH ĐỘC CỦA MALACHITE GREENUT .................................................................. 9TUI.4. CÁCH THỨ C GÂY ĐỘT BIẾ NUT ................................................................................. 9TUI.5. TỔ NG HỢP MGUT .......................................................................................................... 9TUI.6. TỔ NG HỢP LMGUT ..................................................................................................... 10

TUCHƯƠ NG II. TỔ CHỨ C QUỐC TẾ AOACUT....................................................................... 12TUCHƯƠ NG III. K Ỹ THUẬT PHÂN TÍCH HỢP CHẤT BẰ NG HPLCUT .............................. 13

TUIII.1. QUÁ TRÌNH SẮC KÝUT ........................................................................................... 13TU

III.2. K Ỹ THUẬT PHÂN TÍCH BẰ NG SẮC KÝ LỎ NG HIỆU NĂ NG CAOUT

.............. 14TUIII.2.1. NGUYÊN TẮC, CẤU TẠO CỦA HỆ THỐ NG HPLC:UT ................................. 15TUIII.2.2. Sắc ký hấ p phụ pha đảo (RP – HPLC) UT............................................................. 17

TUIII.3. QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH UT..................................................................................... 19TUIII.3.1. QUÁ TRÌNH TÁCH, CHIẾT LÀM SẠCH MẪUUT .......................................... 20TUIII.3.2. QUÁ TRÌNH SẮC KÝ TRÊN HỆ THỐ NG HPLCUT ........................................ 20TUIII.3.3. XỬ LÝ SỐ LIỆUUT ............................................................................................. 20

TUCHƯƠ NG IV. GIỚI THIỆU VỀ PHỔ KHỐI LƯỢ NGUT ...................................................... 21TUIV.1. CÁC BỘ PHẬ N CỦA PHỔ KHỐI LƯỢ NGUT ......................................................... 22

TUIV.1.1. NGUỒ N ION HÓAUT ......................................................................................... 22TUIV.1.2. BỘ PHẬ N PHÂN TÍCH KHỐI LƯỢ NGUT........................................................ 24

TU

CHƯƠ NG V. GIỚI THIỆU CÁC THIẾT BỊ CHÍNHUT

......................................................... 26TUV.1. HỆ THỐ NG HPLC AGILENT 1100 UT ....................................................................... 26TUV.2. HỆ THỐ NG API 3000 UT ............................................................................................. 27

TUCHƯƠ NG VI. CÁC PHƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢ NG MGUT ............................ 28TUVI.1. KHÁI QUÁT UT .......................................................................................................... 28TUVI.2. GIỚI THIỆU PHƯƠ NG PHÁP THAM CHIẾUUT .................................................... 32

TURPHẦ N THỰ C NGHIỆMUTR ..................................................................................................... 39TUCHƯƠ NG VII. CHUẨ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH DƯ LƯỢ NG MG VÀ LMGUT. 39

TUVII.1. NGUYÊN TẮCUT ......................................................Error! Bookmark not defined. TUVII.2. CÁC THÍ NGHIỆM ĐƯỢC TIẾ N HÀNHUT ........................................................... 40

TUVII.2.1. HIỆU CHỈ NH HỆ THỐ NG PHÂN TÍCHUT ..................................................... 41TU

VII.2.2. XÂY DỰ NG ĐƯỜ NG CHUẨ NUT

.................................................................... 56TUVII.2.3. THÊM CHUẨ N ĐỂ TÍNH HIỆU SUẤT THU HỒIUT ..................................... 69TUVII.2.4. THỰ C TẬP TÁCH CHIẾT MẪUUT ................................................................. 74

TUCHƯƠ NG VIII. K ẾT LUẬ N VÀ KIẾ N NGHỊ UT .................................................................. 78TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................................80





PH Ầ N M Ở ĐẦ U

Trang 1

PHẦN MỞ ĐẦU

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một quốc gia có khí hậu nhiệt đớ i, lượ ng mưa trung bình trên

năm r ất lớ n, độ ẩm cao, hệ động thực vật phong phú, đa dạng cùng một số lượ ng lớ n

các ao hồ, kênh r ạch. Vớ i tất cả các đặc điểm trên, Việt Nam có một tiềm năng r ất

lớ n trong l ĩ nh vực nuôi tr ồng thủy sản. Ý thức đượ c tiềm năng đó, Đảng và Nhà

nướ c ta đã quan tâm tạo mọi điều kiện để phát triển ngành thủy sản, mà định hướ ng

xuất khẩu ra nướ c ngoài là chủ yếu. Trong giai đoạn hiện nay xuất khẩu thủy sản

đang giữ một vai trò chủ đạo trong các mặt hàng xuất khẩu của nướ c ta, đem lạinguồn thu nhậ p ngoại tệ vô cùng lớ n, đóng góp đáng k ể vào công cuộc công nghiệ p

hóa hiện đại hóa đất nướ c. Kim ngạch xuất khẩu trong tháng 1 năm 2007 ướ c đạt 40

triệu USD, bằng 134,6% cùng k ỳ, đạt 6,2% k ế hoạch năm.

Vớ i sự kiện Việt Nam tr ở thành thành viên chính thức thứ 150 của tổ chức

Thươ ng mại thế giớ i (WTO) vào ngày 11 tháng 07 năm 2006, cơ hội cho ngành thủy

sản của Việt Nam có thể phát triển hơ n nữa là không cần bàn cải. Tuy nhiên, để

ngành xuất khẩu thủy sản có thể phát huy tối đa tiềm năng của mình, để nó có thể đem lại nguồn thu nhậ p cao về ngoại tệ, chúng ta cần nhắm vào những thị tr ườ ng

khó tính như Mỹ, Nhật, Canada và Châu Âu. Thách thức đầu tiên mà ngành xuất

khẩu thủy sản gặ p phải khi xâm nhậ p vào những thị tr ườ ng này ngoài “rào cản về

thuế quan” là “rào cản về k ỹ thuật”. Ngh ĩ a là muốn đượ c những thị tr ườ ng này chấ p

nhận, chúng ta phải đảm bảo đượ c chất lượ ng và tính an toàn của các mặt hàng xuất

khẩu. Điều mà họ chú tr ọng ngoài mẫu mã và chất lượ ng của sản phẩm, trên hết là

dư lượ ng các thuốc kháng sinh còn tồn đọng trong sản phẩm sau khi đã qua khâuchế biến và đóng gói. Vì còn thiếu hiểu biết cũng như kinh nghiệm về vấn đề này

mà các doanh nghiệ p xuất khẩu của chúng ta đã phải tr ả một giá đắt. Những tháng

cuối năm 2004, trên mườ i container cá da tr ơ n, cá rô phi và cá trê xuất khẩu sang thị

tr ườ ng Châu Âu của các doanh nghiệ p ở An Giang, Đồng Tháp…bị tr ả về do phát

hiện chất Malachite green – hóa chất có thể gây ung thư. Chỉ riêng trong năm 2005,






Trang 2

EU đã phát hiện 12 lô hàng về dư lượ ng Malachite Green. Tất cả các lô hàng bị phát

hiện có chứa hóa chất đều bị tr ả lại Việt Nam. Điều này đã gây ra những thiệt hại

lớ n cho các doanh nghiệ p xuất khẩu thủy sản nói riêng cũng như cho toàn bộ nền

kinh tế của nướ c ta nói chung. Các doanh nghiệ p có quy mô nhỏ, vốn ít đã không

thể đứng vững tr ướ c những tổn thất trên.(4-7) Mặt khác, hàm lượ ng cho phép của các loại thuốc kháng sinh trong các mặt

hàng thủy sản xuất khẩu này thườ ng khác nhau ở mỗi nướ c, nhất là giữa nướ c ta và

các nướ c có nền khoa học phát triển. Do những hạn chế về thiết bị phân tích cũng

như các k ỹ thuật phân tích mà một số lô hàng xuất khẩu mặc dù đã đượ c chúng ta

kiểm tra và xác định là không chứa dư lượ ng kháng sinh, đủ tiêu chuẩn xuất khẩu

nhưng khi sang Mỹ, Canada hay Nhật Bản, chúng lại chứa hàm lượ ng kháng sinh

vượ t mức cho phép.

Để khắc phục tình tr ạng đáng tiếc này, chúng ta phải xây dựng hoặc áp dụng

những quy trình phân tích chuẩn, đáng tin cậy mà k ết quả phân tích do chúng đem

lại phải đượ c các quốc gia có nền khoa học tiên tiến thừa nhận.

Vớ i những điều kiện về trang thiết bị cũng như trình độ phân tích hiện nay,

Việt Nam chưa thể xây dựng đượ c các quy trình phân tích chuẩn có độ tin cậy cao

như thế. Điều mà chúng ta có thể làm là dựa vào các quy trình phân tích chuẩn, sẵn

có do các quốc gia tiên tiến xây dựng và các thiết bị hiện đại do họ cung cấ p để xác

định dư lượ ng thuốc kháng sinh trong các mặt hàng xuất khẩu thủy sản, từ đó phát

hiện k ị p thờ i những lô hàng không đủ tiêu chuẩn nhằm bảo đảm sức khỏe cho ngườ i

tiêu dùng, giảm bớ t thiệt hại về mặt kinh tế cho các doanh nghiệ p xuất khẩu cũng

như chiếm đượ c sự tin tưở ng của các thị tr ườ ng khó tính.

Trong số các loại thuốc kháng sinh có dư lượ ng tồn đọng lớ n trong các mặt

hàng xuất khẩu thì Malachite Green (MG) là loại kháng sinh phổ biến nhất và bị các

quốc gia phát triển – các thị tr ườ ng chính của chúng ta, phản đối sử dụng trong nuôi

tr ồng thủy sản nhiều nhất. Để tìm hiểu về các phươ ng pháp phân tích Malachite

Green nhằm kiểm tra dư lượ ng của hóa chất này trong các sản phẩm thủy sản, dướ i

sự hướ ng dẫn của Thạc s ĩ Lê Bảo Ngọc và Thạc s ĩ Lê Thị Bạch, đề tài “Chuẩ n hóa

phươ ng pháp xác định d ư l ượ ng Malachite Green và Leuco Malachite Green trong






Trang 3

các sản phẩ m thủ y sản bằ ng S ắ c ký l ỏng cao áp hiệu năng cao ghép cặ p khố i phổ

(LC/MS-MS)” do sinh viên Đoàn Đức Bảo thực hiện đã đượ c tiến hành.

Mục đích của đề tài là dựa vào các quy trình phân tích dư lượ ng MG và LMG

chuẩn trong các sản phẩm thủy sản đượ c xây dựng bở i AOAC, nhóm nghiên cứu sẽ

chuẩn hóa quy trình phân tích này để có đượ c một phươ ng pháp phân tích có chấtlượ ng và độ tin cậy tươ ng đươ ng, đồng thờ i phù hợ p vớ i điều kiện về trang thiết bị

cũng như dụng cụ và hóa chất của phòng thí nghiệm Sắc ký, Bộ môn Dinh Dưỡ ng

và Chế Biến Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Tr ườ ng Đại học Cần Thơ , nơ i tiến hành đề

tài.

II. CÁC PHƯƠ NG PHÁP VÀ PHƯƠ NG TIỆN THỰ C HIỆN

1. Các phươ ng pháp Phươ ng pháp t ổ ng k ế t kinh nghiệm:

- Nhận đề tài.

- Sưu tầm và đọc tài liệu.

- Xây dựng cơ sở lý thuyết.

- Phân tích, hệ thống rút ra bài học kinh nghiệm.

- Viết bài. Phươ ng pháp thự c nghiệm:

- Chuẩn bị

+ Nhận đề tài và địa điểm tiến hành thực nghiệm.

+ Soạn lý thuyết và chuẩn bị phươ ng tiện, dụng cụ, hóa chất.

+ Dự đoán những vấn đề có thể xảy ra và khắc phục.

- Tiến hành thực nghiệm và viết bài.2. Phươ ng tiện thự c hiện

- Các tài liệu có liên quan.

- Các giáo trình thực tậ p.






Trang 4

- Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm, cùng một số phươ ng tiện khác có liên quan,

cần thiết có sẵn trong phòng thí nghiệm.

III. CÁC BƯỚ C THỰ C HIỆN ĐỀ TÀI

1. Nhận đề tài.

2. Sưu tầm tài liệu.

3. Nghiên cứu các tài liệu có liên quan.

4. Tiến hành thí nghiệm khảo sát.

5. So sánh k ết quả của các phươ ng pháp.

6. Rút ra k ết luận, tiến hành thực nghiệm.

7. Viết bài báo cáo.





PH Ầ N N Ộ I DUNG-MALACHITE GREEN

Trang 5

PHẦN NỘI DUNG

A. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

CHƯƠ NG I. GIỚ I THIỆU TỔNG QUAN VỀ MALACHITE GREEN

- Số CAS: [ HTU569-64-2UTH].

- Mã sản phẩm: J.T. Baker: P451.

- Khối lượ ng phân tử (MW): 364.911đvC.

- Công thức phân tử (MF): C23H25 N2Cl(

dạng chloride).

- Tên IUPAC: 4-[(4-dimethylaminophenyl)-

phenyl-methyl]-N,N-dimethyl-aniline).

I.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN

Malachite Green (MG) hay còn gọi là aniline green, basic green 4, diamond

green B, hoặc victoria green B, tên IUPAC: 4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-

methyl]-N,N-dimethyl-aniline) là một loại hoá chất có độc tính đượ c sử dụng như

một loại thuốc nhuộm. Khi pha loãng, nó có thể đượ c sử dụng như một loại thuốc

sát trùng hoặc thuốc kháng sinh, kháng nấm cho cá và tr ứng cá đang r ất đượ c quan

tâm hiện nay. Nó còn đượ c sử dụng như một loại thuốc nhuộm màu vi khuẩn trong

các phòng thí nghiệm. MG thườ ng ở dạng tinh thể màu xanh, trong suốt. Chất không

mùi, không vị. Tan trong nướ c, trong ancol, methanol, amyl alcol.

- Độ tan: 1/15 trong nướ c và 1/15 trong alcol.

- pH: dung dịch 1% có pH : 1.4

- Hấ p phụ ở bướ c sóng λBmaxB: 614, 618 nm.






Trang 6

Tan trong nướ c có màu xanh blue, ở pH<2 có màu vàng, pH=2: màu xanh,

pH=11.6: màu xanh blue, pH=14: không màu. Vì thế, Malachite green

hydrochloride còn đượ c xem như một hóa chất chỉ thị acid-base.

Malachite Green còn đượ c dùng làm thuốc thử để xác định phosphate trong

nướ c sông bằng phươ ng pháp so màu. (Theo tài liệu: NW Menzies ADN LC Bell,T ậ p san nghiên cứ u đấ t tr ồng ở Australia 26(3) 451 – 464).

Malachite green hydrochloride là một chất bền dướ i những điều kiện sử dụng

và cất tr ữ bình thườ ng, bị phân hủy bở i các chất oxi hóa mạnh.

Tuy nhiên, năm 1992 ở Canada, các nhà khoa học xác định r ằng Malachite

Green có thể ảnh hưở ng đến sức khoẻ của con ngườ i nếu chúng ta ăn phải cá bị

nhiễm loại hóa chất này. MG đã đượ c xế p vào nhóm các hoá chất nguy hiểm đến

sức khoẻ. Tuy nhiên do giá thành r ẻ, nó vẫn đượ c sử dụng ở những quốc gia khôngcó đạo luật cấm sử dụng hoá chất này.(8,9)

I.2. CẤU TRÚC CỦA MALACHITE GREEN VÀNHỮ NG CHẤT CHUYỂN HÓA

Từ cấu trúc của hợ p chất chúng ta có thể giải thích đượ c những tính chất sinh

học và hoá học của chúng. MG đượ c biết đến phổ biến ở dạng có màu mà chủ yếu là

thuốc nhuộm có màu xanh. Tuy nhiên khi đượ c hấ p thụ vào cơ thể, nó sẽ đượ c

chuyển đổi thành những dạng khác nhau nhưng có vai trò tươ ng đươ ng nhau.






Trang 7

I.2.1. DẠNG CÓ MÀU CỦA MALACHITE GREEN (MG-C)

UThông tin Hoá họcU

- Tên thông thườ ng: Malachite Green.

- Tên IUPAC: 4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-methyl]-N,N-dimethyl-

aniline).

- Công thức: C23H25 N2.

- Khối lượ ng phân tử: 329.46 đvC.

- Bướ c sóng hấ p thu cực đại: 614,425 η m.

- Dạng tồn tại: tinh thể r ắn màu xanh.

- Tính tan: đáng k ể (> 10%).

Dạng có màu của MG đượ c sử dụng để nhuộm giấy, tơ lụa, len. Tên gọi của

hoá chất này xuất phát từ màu xanh của chúng, và không có liên quan đến khoáng

Malachite (CuCO3.Cu(OH)2). Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã cho thấy,

những con chuột có lượ ng MG ở nồng độ 100 ppb tồn tại trong cơ thể quá 2 năm sẽ

xuất hiện các khối u gan.

MG đượ c sử dụng như một loại thuốc nhuộm sinh học, dùng nhuộm màu cho

các vi khuẩn trong các phòng thí nghiệm phân tích các mẫu tế bào và mô. Trong

phươ ng pháp nhuộm Gumnez, các thuốc nhuộm fuchsin dùng để nhuộm màu đỏ hoặc đỏ thẩm cho vi khuẩn, còn MG đượ c sử dụng để nhuộm màu xanh cho vi

khuẩn.






Trang 8

I.2.2. DẠNG CARBINOL CỦA MALACHITE GREEN

Trong dung dịch, dạng có màu của MG (MG-C) trao đổi từ từ vớ i các ion

OH- để tạo ra một dạng carbinol trung hoà và không có màu. Dạng này có thể hoà

tan chất béo tốt hơ n MG-C, nó có khả năng làm căng các màng tế bào nhanh hơ n,

giúp cho MG có thể xuyên qua màng tế bào một cách dễ dàng. Ngoài ra, khi vào tế

bào, nó sẽ tiến hành trao chất và chuyển thành dạng Leuco-Malachite Green (LMG).

I.2.3. DẠNG LEUCO – MALACHITE GREEN (LMG)

MG đượ c hấ p thụ vào cá và tr ứng cá thông qua đườ ng nướ c, sau đó nó tiến

hành trao đổi chất và chuyển thành dạng LMG, tích luỹ trong các bắ p cơ của cá.

Trong thực tế, LMG đượ c sử dụng để phát hiện các vết máu trong các cuộc

điều tra án mạng. Hemoglobin xúc tác phản ứng giữa LMG và H2O2, chuyển hoá

LMG không màu thành dạng MG có màu. Vì vậy, sự xuất hiện màu xanh của MG là

N

CH3

N CH3

CH3

H3C N

CH3

N CH3

CH3

H3C

Cl-

Reduction

Oxidation

- HCl

Malachite green (MG) Leucomalachite green (LMG)






Trang 9

bằng chứng cho thấy sự tồn tại của các vết máu tội phạm đã huỷ tr ướ c đó mà vớ i

mắt thườ ng chúng ta không thể nhận ra.(8.10,11)

I.3. TÍNH ĐỘC CỦA MALACHITE GREEN

U Liề u l ượ ng gây độcU: LD50: 80 mg/kg (Theo RTECS Number: BQ1180000).

Khi MG đượ c sử dụng như một loại thuốc kháng sinh và diệt trùng trong nuôi

thuỷ hải sản, các loài trên sẽ hấ p thu MG vào cơ thể qua đườ ng nướ c nhiễm MG, khi

vào trong cơ thể sinh vật, MG sẽ tham gia các phản ứng trao đổi và chuyển hoá

thành LMG không phân cực. Lượ ng LMG này sẽ đượ c tích tr ữ và tồn tại một thờ i

gian dài trong các bắ p cơ của cá. Thờ i gian tồn tại của LMG là 10 ngày trong khi

MG chỉ tồn tại trong thờ i gian 2,8 ngày.(9-11)

I.4. CÁCH THỨ C GÂY ĐỘT BIẾN

K ết quả của một số các nghiên cứu đã đưa ra giả thuyết những sản phẩm trao

đổi chất của MG và LMG như N-dimethyl có thể làm giảm hoạt động trao đổi chất

theo cách thức tươ ng tự như cách thức quan sát đượ c vớ i các axit amin thơ m gây

ung thư. Ngoài ra quá trình oxy hóa và ngay cả các phản ứng este hóa MG và LMG

cũng làm nảy sinh các hợ p chất gây phá hủy cấu trúc của ADN. Dựa vào các k ết quả phân tích đột biến, các nhà khoa học đã nhận thấy, chính sự hoạt động không hiệu

quả của các hệ thống hoạt hóa quá trình trao đổi chất do MG và LMG gây ra là

nguyên nhân gây nên những tổn hại cho ADN. (10,11)

I.5. TỔNG HỢ P MG

Thêm một lượ ng Buthyllitium (4,8 ml; trong 2,5 M Hexan) vào trong dung

dịch 4-Bromo-N,N-dimethylanilin (3,15 g; 10 mmol) trong 100 ml THF khô thông

qua một ống mao dẫn, ở nhiệt độ -780ºC trong môi tr ườ ng khí Argon. Phản ứng pha

tr ộn đượ c kích thích ở điều kiện nhiệt độ không đổi trong 2 giờ . Sau đó sử dụng

phễu nhỏ giọt để thêm vào từng giọt dung dịch 4-(dimethylamino) benzophenone

(4,5 g; 10 mmol). Hỗn hợ p đượ c làm ấm từ từ ở nhiệt độ phòng. Dừng phản ứng






Trang 10

bằng cách thêm H2O và lượ ng nướ c dư đượ c chiết vớ i ete. Dung dịch ete sau chiết

đượ c r ửa vớ i H2O và làm khô bằng MgSO4 khan. Sau khi cô quay ta thu đượ c 4,26

g bột nhão màu xanh chứa hỗn hợ p trung gian Carbinol. Phần cặn Carbinol đượ c

chuyển vào một bình thót cổ chứa 100 ml metanol và 1ml HCl. Dung dịch màu xanh

sáng chuyển thành dung dịch trung gian màu xanh thẫm nằm trên dung dịch acid.

Sau đó làm lạnh dung dịch, chuyển bột nhão vào môi tr ườ ng chân không để tạo ra

sự phân bố của khối bột nhão giữa H2O và ete.

Lớ p nướ c đượ c r ửa giải nhiều lần vớ i ete cho tớ i khi chạy TLC dung dịch

ete sau r ửa giải không phát hiện dấu vết của cặn hữu cơ . Lớ p dung dịch có màu xanh

đượ c cô đặc sau đó đượ c làm khô bằng máy ly tâm Speedvac. Cặn sau khi làm khô

tiế p tục đượ c làm tinh khiết bằng cách cho chạy qua cột sắc ký Silica sử dụng hỗn

hợ p Clorofrom: methanol tỷ lệ 9:1 làm pha động. Sau khi tổng hợ p ta thu đượ c 1,94

g MG (53%) dướ i dạng cặn màu xanh thẩm.

HÌNH 1: SƠ ĐỒ TỔNG HỢ P MG

I.6. TỔNG HỢ P LMG

MG (1,63 g; 4,8 mmol) đượ c xử lý vớ i N2H4.H2O (800 ml; 15,5 mmol) và

10% Pd/C (250 g) trong cồn tuyệt đối (150 ml), hỗn hợ p đượ c đun hoàn lưu. Dung






Trang 11

dịch màu xanh chuyển thành không màu sau khi đun hoàn lưu đượ c 10 phút.Tiế p tục

đun hoàn lưu trong 1 giờ sau đó làm lạnh dung dịch, lọc qua nền Celit chứa trong

phễu Bucher để đuổi hết chất xúc tác. Dịch lọc đượ c cô đặc và phân bố giữa H2O và

ete. Lớ p nướ c đượ c chiết vớ i ete vài lần, sau đó hỗn hợ p ete sau chiết đượ c r ửa lại

vớ i nướ c. Lớ p hữu cơ đượ c làm khan bằng MgSO4, lọc và ly tâm. Thu đượ c lớ p cặn,

lớ p cặn ở dạng dầu này đượ c cho vào một cột Silicat và đượ c giải hấ p vớ i dung dịch

Acetat:Hexan tỷ lệ 1:4. Phần thích hợ p đượ c thu thậ p, cô cạn và k ết tinh từ

etylacetat và hexan để thu đượ c 1,44 g (88%) LMG tinh khiết dướ i dạng r ắn màu

xanh ve.(11)







PH Ầ N N Ộ I DUNG-AOAC

Trang 12

CHƯƠ NG II. TỔ CHỨ C QUỐC TẾ AOAC

HÌNH 3: BIỂU TƯỢ NG CỦA TỔ CHỨ C AOAC Tổ chức AOAC là một hiệ p hội khoa học, một tổ chức của các nhà phân tích

Hóa Học. Tổ chức này thiết lậ p và xây dựng những phươ ng pháp chuẩn mực cho

phép chúng ta nhận đượ c những k ết quả phân tích đáng tin cậy từ những phân tích

khoa học. Hiện nay nhiều Quốc gia yêu cầu các công ty của họ phải sử dụng những

phươ ng pháp phân tích đượ c phát triển bở i AOAC.

AOAC đã tồn tại đượ c hơ n 120 năm. Tiền thân của nó là một tổ chức của

những nhà Hóa Học phân tích về phân bón thuộc Bộ Nông Nghiệ p Mỹ, họ muốn

xây dựng những phươ ng pháp thống nhất để phân tích phân bón. Dần dần, nó đượ c

phát triển thành một tổ chức quốc tế, một tổ chức của các nhà phân tích Hóa Học.

Cùng vớ i kiến thức, những thí nghiệm và chuyên môn cao của hơ n 2700 nhà

khoa học, nhà phân tích mà 1 phần 3 trong số đó có quốc tịch nằm ngoài nướ c Mỹ,

AOAC đã phát triển đượ c nhiều khả năng, những quy trình, những phươ ng pháp

cũng như những mô hình chuẩn xác góp phần hình thành hình ảnh và nhiệm vụ của

AOAC, mang lại những điều kiện thuận lợ i trong công việc của giớ i phân tích khoa

học trên toàn thế giớ i.

Theo những phươ ng pháp đượ c xây dựng bở i AOAC, các nhà phân tích có

thể đạt đượ c sự nhất trí cao trong việc tìm ra những phươ ng pháp cần thiết, thiết lậ pđượ c những tiêu chuẩn thực hiện và làm tăng tính hợ p lý của các phươ ng pháp phân

tích.(13)





PH Ầ N N Ộ I DUNG-K Ỹ THU Ậ T HPLC

Trang 13

CHƯƠ NG III. K Ỹ THUẬT PHÂN TÍCH HỢ P CHẤTBẰNG HPLC

Để xác định thành phần các chất có trong mẫu nghiên cứu ngườ i ta sử dụng

nhiều phươ ng pháp phân tích trong đó có sắc ký. Đượ c tìm thấy trong một thí

nghiệm của nhà hóa học ngườ i Nga, Michale Tvest , Sắc ký là một phươ ng pháp có

hiệu quả cao dùng để tách hỗn hợ p các chất.

Phươ ng pháp này đã hình thành và phát triển thành nhiều phươ ng pháp trong

đó có k ỹ thuật phân tích bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao. Thiết bị này đã hỗ

tr ợ cho quá trình tách và phân tích thành phần hợ p chất nhanh hơ n cũng như có độ

nhạy và hiệu quả cao, hiện đang đượ c áp dụng nhiều trong các l ĩ nh vực như dượ c

phẩm, môi tr ườ ng, thực phẩm…

III.1. QUÁ TRÌNH SẮC KÝ

Sự tách sắc ký dựa trên sự phân bố khác nhau của các hợ p phần khác nhau

trong hỗn hợ p giữa hai pha luôn tiế p xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha t ĩ nh

và một pha động.

Quá trình tách sắc ký bao gồm 3 giai đoạn:

1) Đưa hỗn hợ p chất cần phân tích vào pha t ĩ nh. Các chất cần phân tích sẽ đượ c

giữ trên pha t ĩ nh.

2) Cho pha động chạy qua pha t ĩ nh. Pha động sẽ kéo theo các chất di chuyển

trên pha t ĩ nh vớ i tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên

pha t ĩ nh tạo thành sắc đồ. Nếu tiế p tục cho pha động chạy qua thì các chất sẽ

đượ c kéo ra ngoài pha t ĩ nh.

3) Phát hiện các chất. Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không

màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại, detector đặt sau cột. Các detector

phát hiện tín hiệu và xuất hiện peak trên sắc đồ.






Trang 14

HÌNH 4: SƠ ĐỒ MINH HỌA QUÁ TRÌNH TÁCH CHẤT A VÀ B

HÌNH 5: SƠ ĐỒ MINH HỌA QUÁ TRÌNH TÁCH CHẤT A VÀ B DƯỚ I DẠNG PEAK

III.2. K Ỹ THUẬT PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝLỎNG HIỆU NĂNG CAO

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đờ i vào khoảng 20 năm tr ở lại

đây, nhưng ứng dụng của HPLC đã đi vào nhiều l ĩ nh vực của hóa học phân tích và

chiếm đến gần 70% tổng số các công trình nghiên cứu và ứng dụng về sắc ký. Sử

dụng pha động là chất lỏng, sự tách sắc ký đượ c tiến hành trên cột vớ i áp suất caocho phép hệ thống HPLC có hiệu quả tách cao và ổn định vớ i những hợ p chất khó

bay hơ i.

A

B

tB0 tB1 tB2 tB3 tB4 tB5

A+B

A

B

A

B

A

B

A

Dung dịch mẫu Pha động

detector






Trang 15

III.2.1. NGUYÊN TẮC, CẤU TẠO CỦA HỆ THỐNGHPLC:

HÌNH 6: SƠ ĐỒ HỆ THỐNG HPLC

Để thực hiện việc tách một hỗn hợ p chất bằng k ỹ thuật phân tích HPLC,

chúng ta phải có hệ thống trang bị về k ỹ thuật này. Hệ thống trang bị của HPLC đơ n

giản và đủ để làm việc đượ c theo k ỹ thuật HPLC bao gồm các bộ phận chính sau

đây:

1. Bơ m cao áp

Để bơ m pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký,

r ửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Bơ m này phải điều chỉnh

đượ c áp suất (0 – 400 bar), để tạo ra những tốc độ nhất định của

pha động qua cột tách phù hợ p cho quá trình sắc ký nằm trong

vùng 0.5 – 3 ml/phút.

2. Van bơ m mẫu

Để bơ m mẫu phân tích vào cột tách theo những lượ ng mẫu

nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký. Đó là các van 6

chiều có chứa vòng mẫu có thể tích 20, 50 hay 100μl. Van 6 chiều

chỉ có một vòng mẫu nhưng đối vớ i van 10 chiều thì có tớ i 3 vòng mẫu.






Trang 16

3. Cột tách

Là cột chứa pha t ĩ nh, trái tim của quá trình tách sắc ký,

nó là một yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một

hỗn hợ p chất mẫu. Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tùy

thuộc vào mức độ sắc ký. Nói chung, các cột tách phân tích

thườ ng có kích thướ c chiều dài từ 10 – 25 cm; đườ ng kính

trong từ 2 – 5 mm.

4. Bộ phận pha trộn pha động

Là thiết bị dùng để điều chỉnh chính xác tỷ lệ của các dòng

dung môi tr ướ c khi đượ c đẩy vào cột.

5. Trang bị phát hiện chất phân tích

Đây thườ ng là các Detector dựa theo các tính chất của chất phân tích, ví dụ:

- Detector hấ p thụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV–VIS.

- Detector phổ nguyên tử AES hay AAS.

- Detector phổ huỳnh quang.

- Detector điện hóa (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượ ng).

- Detector chiết suất.

- Detector đo độ dẫn nhiệt…

- Detector diode phát quang và diode mảng.

- Detector đo khối lượ ng (khối phổ: MS).






Trang 17

Tất nhiên, phải tùy theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợ p

để đạt đượ c độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như đo định lượ ng chúng.

Trong các loại trên, detector hấ p phụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS, hiện

nay đang đượ c dùng phổ biến nhất, bở i vì nó thích hợ p cho nhiều loại chất và lại

không đắt tiền.

6. Trang bị chỉ thị k ết quả

Ở đây có nhiều loại, nhưng đơ n giản và phổ biến nhất

là các máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dướ i dạng các

peak của các chất, r ồi đến bộ tích phân k ế (Intergrator), sau đó là

máy tính và máy in kèm theo để xử lý k ết quả và in k ết quả.

Đó là các bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống HPLC. Ngày nay, hệ thống HPLC còn có thêm bộ bơ m mẫu tự động và pha loãng mẫu, bộ

gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột tách sắc ký, máy tính và các phần mềm điều khiển

toàn bộ hệ thống để xử lý k ết quả tách, in k ết quả tách….

III.2.2. Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP – HPLC)

Bản chất chính của sự tách trong loại sắc ký này là dựa trên tính chất hấ p phụ

bề mặt của pha t ĩ nh. Cơ chế tách là cơ chế hấ p phụ. Vì thế, tất cả các tính chất độnghọc hấ p phụ của bề mặt pha t ĩ nh đều có ảnh hưở ng đến k ết quả của sự tách sắc ký

một hỗn hợ p chất mẫu.

U Pha t ĩ nhU:

Pha t ĩ nh của sắc ký hấ p phụ pha ngượ c (RP-HPLC) thườ ng là các silica đã

đượ c alkyl hóa. Nó đượ c điều chế từ các silica trung tính qua việc alkyl hóa các

nhóm -OH trên bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl –R của mạch cacbonthẳng (-C B2B, -C B8B,-CB18B) hay các gốc cacbon vòng, như nhân phenyl. Nên chất nhồi loại

này có bề mặt không phân cực hoặc r ất ít phân cực. Việc gắn các gốc alkyl vào phân

tử silica trung tính có thể tr ực tiế p, hay qua một nguyên tố trung gian oxygen. Chính

do bị mất các gốc OH, nên trên bề mặt của chất nhồi loại này là không phân cực hay

r ất ít phân cực. Nên nướ c không có Hypersil ảnh hưở ng đến bề mặt của nó. Về chất






Trang 18

nhồi loại này thì có ODS (-C18, Hãng ShADNow), Lichrosorb RP-8, và RP-18

(Hãng Meck),C-18 Corasil, Phenyl-Corasil (Hang Whatmann),…Các chất nhồi loại

này là pha t ĩ nh để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực và

có thể cho cả sắc ký cặ p ion. Dung môi cho pha t ĩ nh loại này là các chất hữu cơ

phân cực tan trong nướ c như: methanol, acetonitrile, hay hỗn hợ p của các chất nàyvớ i nhau hoặc vớ i nướ c theo tỷ lệ nhất định.

U Pha động:U

Pha động của sắc ký hấ p phụ pha ngượ c (RP-HPLC) thườ ng là hệ dung môi

phân cực, nó là những dung môi hữu cơ tan tốt trong nướ c. Trong r ất nhiều tr ườ ng

hợ p, nướ c lại là một thành phần chính của pha động. Tiêu biểu và đượ c dùng khá

phổ biến trong loại hệ pha ngượ c là các dung môi methanol, acetonitrile, hay hỗnhợ p của methanol vớ i nướ c, acetonitrile vớ i nướ c, hay có thêm các chất tạo phức,

chất điện ly, chất đệm pH,… Nói chung các dung môi để pha chế pha động cho hệ

pha ngượ c là nướ c cất, các alcol, các cetone có mạch carbon ngắn, một số acid hay

base hữu cơ , một vài amine hay aminoacid tan tốt trong nướ c.

Chính nhờ có đặc tính trên, cho nên hệ RP – HPLC đượ c sử dụng r ất phổ biến để

tách nhiều loại hỗn hợ p mẫu từ vô cơ đến hữu cơ , từ các chất không phân cực đến

phân cực và k ể cả chất có cấu tạo liên k ết ion như: việc tách các acid, base, các ion

kim loại trong sắc ký cặ p ion.

Trong hệ pha này, thành phần của pha động cũng ảnh hưở ng rõ r ệt đến k ết quả

tách sắc ký. Ở đây, ảnh hưở ng của thành phần pha động làm thay đổi thờ i gian lưu

của chất tan, độ phân giải của hệ pha và chiều cao của peak sắc ký.

Trong hệ RP – HPLC, so vớ i các chất hữu cơ , nướ c là một dung môi phân cực

hơ n. Do đó, sự thêm nướ c vào dung môi hữu cơ là để tạo ra một pha động phân cựchơ n dung môi hữu cơ nguyên một mình nó, mà lại kém phân cực hơ n nướ c. Ngh ĩ a là

pha động này có độ phân cực nằm giữa nướ c và dung môi hữu cơ đó. Ví dụ: thêm

nướ c vào methanol sẽ đượ c một pha động có độ phân cực lớ n hơ n methanol hay

ethanol, nhưng lại nhỏ hơ n nướ c. Tất nhiên độ phân cực lớ n hơ n bao nhiêu là phụ

thuộc vào hàm lượ ng nướ c đượ c thêm vào. Ngh ĩ a là ta tạo ra đượ c một pha động có






Trang 19

độ phân cực nằm giữa độ phân cực của hai dung môi đơ n ban đầu. Chính tính chất

này làm cho hệ pha RP – HPLC có tính linh động cao, tạo điều kiện tốt cho sự tách

sắc ký.

Ngoài các dung môi chính như đã nêu ở trên, trong thành phần pha động của

nhiều tr ườ ng hợ p tách vớ i hệ pha ngượ c, còn có thêm chất đệm pH để ổn định pH

cho quá trình sắc ký. Chất tạo phức để tạo ra sự r ửa giải chọn lọc và sự tách tốt hơ n.

Chất điện ly, chất tạo ion cặ p trong sắc ký cặ p ion, để tạo điều kiện cho một cơ chế

sắc ký xảy ra tốt.

U Phân bi ệt S ắc ký pha đảo (RP-HPLC) và sắc ký pha thườ ng (NP-HPLC):

U Pha thườ ng (NP-HPLC)

- Pha t ĩ nh phân cực, pha động ít hoặc

không phân cực.

- Nướ c không tan đượ c vào pha động,

phải bảo hoà pha động tr ướ c khi chạy

Sắc ký bằng nướ c.

- Khả năng phân cực của pha động là ổn

định.

- Không đượ c sử dụng phổ biến, khả

năng tách các hợ p chất phức tạ p kém.

- Trong quá trình Sắc ký, chất tan có độ

phân cực kém sẽ ra tr ướ c.

U

Pha đảo (RP-HPLC)

- Pha t ĩ nh kém phân cực, pha

động là hệ dung môi phân cực.

- Trong r ất nhiều tr ườ ng hợ p nướ c

là thành phần chính của pha

động.

- Khả năng phân cực của pha

động có thể thay đổi (từ phâncực đến không phân cực).

- Đượ c sử dụng phổ biến để tách

các hỗn hợ p mẫu từ r ất phân cực

đến không phân cực.

- Trong quá trình Sắc ký chất tan

kém phân cực sẽ ra sau.

III.3. QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH






Trang 20

III.3.1. QUÁ TRÌNH TÁCH, CHIẾT LÀM SẠCH MẪU

Là một quá trình tách chiết sơ bộ chất cần phân tích khi đưa vào hệ thống

HPLC, giúp cho mẫu sạch hơ n đồng thờ i làm tăng nồng độ chất cần phân tích. Quá

trình này chiếm tớ i 80% thờ i gian phân tích mẫu phụ thuộc hoàn toàn vào k ỹ năng

của ngườ i phân tích.

III.3.2. QUÁ TRÌNH SẮC KÝ TRÊN HỆ THỐNG HPLC

Sau khi mẫu đã đượ c làm sạch và tách sơ bộ, nhờ hệ thống van bơ m mẫu và

dòng dung môi pha động, mẫu sẽ đi vào cột tách. Ngườ i phân tích sẽ lựa chọn pha

động và pha t ĩ nh, detector phù hợ p vớ i bản chất vật lý, hóa học của chất cần phân

tích để cho quá trình tách cũng như sự phát hiện chất phân tích có hiệu quả cao.

III.3.3. XỬ LÝ SỐ LIỆU

Detector ghi nhận các tín hiệu tách và biểu diễn dướ i dạng peak sắc ký.

Trong một hệ thống pha động, pha t ĩ nh và tốc độ của pha động giống nhau, mỗi chất

phân tích có một thờ i gian di chuyển qua cột sắc ký nhất định. Khoảng thờ i gian này

đượ c gọi là khoảng thờ i gian lưu và tính từ lúc bơ m mẫu đến khi xuất hiện peak.

Việc phát hiện định tính chất phân tích dựa trên sự so sánh thờ i gian lưu của chất

phân tích vớ i thờ i gian lưu của chất chuẩn trong điều kiện sắc ký của một hệ pha.

Việc tính toán định lượ ng dựa vào chiều cao cũng như diện tích peak sắc ký.(1,14)





PH Ầ N N Ộ I DUNG-GI Ớ I THI Ệ U V Ề KH Ố I PH Ổ

Trang 21

CHƯƠ NG IV. GIỚ I THIỆU VỀ PHỔ KHỐI LƯỢ NGPhổ khối lượ ng đượ c mô tả giống như một thiết bị xác định khối lượ ng nhỏ

nhất trên thế giớ i, không chỉ vì kích thướ c của nó mà còn vì kích thướ c của những

vật thể mà nó cân – những phân tử. Hơ n một thậ p niên gần đây, k ỹ thuật phân tích phổ khối lượ ng đã tr ải qua những sự cải thiện về k ỹ thuật tuyệt vờ i cho phép nó có

thể ứng dụng trong các nghiên cứu về protein, peptide, cacbonhydrate, DNA, thuốc,

và những phân tử sinh học khác. Nhờ có những nguồn ion hóa như ESI (phun

electron), MALDI (ion hóa/giải hấ p bằng nền laser), phổ khối lượ ng đã tr ở thành

công cụ không thể thiếu trong l ĩ nh vực nghiên cứu các đại phân tử.

Phổ khối lượ ng xác định khối lượ ng của một phân tử bằng cách đo tỷ số khối

lượ ng trên điện tích (m/z) của những ion sinh ra từ phân tử đó. Những ion này đượ c phát sinh nhờ một trong hai con đườ ng: làm mất đi hoặc thêm vào một điện tích từ

những mảnh trung hòa. Những ion này đượ c t ĩ nh điện tr ực tiế p trong thiết bị phân

tích khối lượ ng nơ i mà chúng sẽ đượ c tách ra dựa theo tỷ số m/z và đượ c xác định.

K ết quả của quá trình ion hóa phân tử, tách ion và xác định ion là một phổ có thể

cung cấ p những thông tin về khối lượ ng cũng như về cấu trúc của phân tử. Một phổ

như thế có thể đượ c vẽ nhờ vào một máy đo khối lượ ng và một lăng kính đượ c miêu

tả trong hình R7R. Trong lăng kính, ánh sáng đượ c tách ra thành những sóng dài vànhững sóng dài này sau đó đượ c xác định bằng một đầu đọc, ví dụ như đầu đọc khả

kiến. Một cách tươ ng tự, ion phát sinh trong phổ khối lượ ng đượ c tách ra trong thiết

bị phân tích khối lượ ng, đượ c số hóa, đượ c xác định bằng một detector ion.

HÌNH R7R: CƠ CHẾ VẼ PHỔ

NGU N ION

THIẾT BỊ

DETECTOR

NGU N NH S NG

LĂNGK NH






Trang 22

IV.1. CÁC BỘ PHẬN CỦA PHỔ KHỐI LƯỢ NG

Bốn thành phần cơ bản của phổ khối lượ ng là: lỗ tiêm mẫu, nguồn ion hóa,

bộ phận phân tích khối lượ ng và detector xác định ion. Một vài phổ khối lượ ng có

sự k ết hợ p giữa thiết bị phân tích khối lượ ng và detector trong khi một số khác lại có

sự k ết hợ p giữa lỗ bơ m mẫu và nguồn ion hóa. Những phân tử giống nhau đượ c đưa

vào thiết bị phân tích thông qua lỗ bơ m mẫu. Sau khi vào trong thiết bị, phân tử mẫu

chuyển đổi thành ion trong nguồn ion hóa, sau đó đượ c t ĩ nh điện và đẩy tớ i thiết bị

phân tích khối lượ ng. Những ion này sẽ đượ c tách ra dựa theo tỷ số khối lượ ng trên

điện tích (m/z) của chúng ngay trong thiết bị phân tích khối lượ ng. Detector chuyển

đổi năng lượ ng ion thành những tín hiệu điện, và truyền qua một máy vi tính.

HÌNH R8R: THÀNH PHẦN CỦA MỘT KHỐI PHỔ

Chú ý r ằng nguồn ion hóa không nằm trong vùng chân không của thiết bị. Ví

dụ như, nguồn ion hóa của ESI và APCI đượ c đặt ở áp suất khí quyển.

IV.1.1. NGUỒN ION HÓA

Trong suốt thậ p niên 90 của thế k ỷ XX, ion hóa bằng điện (EI) là nguồn ion

hóa đầu tiên của phươ ng pháp phân tích khối lượ ng. Tuy nhiên, EI bị giớ i hạn ở

những phân tử sinh học và hóa học kích thướ c nhỏ và có vùng khối lượ ng nằm trong

vùng khối lượ ng của những hợ p chất sinh - hữu cơ phổ biến. Giớ i hạn này thúc đẩy

những nhà khoa học như John B. Fenn. Koichi Tanaka, Franz Hillenkamp, Michael

Karas, Graham Cooks, ADN Michael Barber nghiên cứu để tạo ra một k ỹ thuật phát

NGUỒN ION HÓA BỘ PHẬNTÁCH ION

DETECTORXÁC ĐỊNH

ION

LỖ TIÊMMẪU

VÙNG CHÂNKHÔNG

SỐ LIỆU






Trang 23

sinh ion mớ i, bao gồm bắn phá nhanh nguyên tử để tạo thành ion (FBA), giải hấ p và

ion hóa bằng nền lazer hỗ tr ợ (MALDI), ion hóa phun electron (ESI). Những k ỹ

thuật này đã tạo ra một cuộc cách mạng trong việc phân tích những đại phân tử.

Trong số chúng, MALDI và ESI là những phươ ng pháp thườ ng đượ c chọn để phân

tích các đại phân tử.

IV.1.1.1. K Ỹ THUẬT PHUN ION

K ỹ thuật phun điện không phải là một k ỹ thuật mớ i, gần đây nó đượ c quan

tâm tr ở lại nhờ vào những ứng dụng trong nghiên cứu các đại phân tử sinh học.

Những thí nghiệm phun điện đầu tiên đượ c tiến hành bở i Chapman trong nửa cuối

của thậ p niên 30 Thế k ỷ XX và đượ c Dole hoàn tất thực nghiệm để phát triển thành

k ỹ thuật phun electron trong phân tích phổ khối lượ ng vào những năm cuối của thậ pniên 60, Thế k ỷ XX. Dole cũng đã phát hiện ra những hiện tượ ng quan tr ọng về sự

tích nhiều điện tích của các phân tử. Vớ i sự nghiên cứu của Fenn những phát hiện

trên đã tr ở thành những lý thuyết nền tảng của k ỹ thuật phun electron trong phân

tích phổ khối lượ ng ngày nay, nó còn ứng dụng để nghiên cứu các phân tử sinh học

có kích thướ c lớ n.

U Nhữ ng thuận l ợ i và bấ t l ợ i của k ỹ thuật phun electron:U

UThuận lợ i:U

- Sử dụng đượ c vớ i khối lượ ng nằm trong giớ i hạn lên đến trên 70,000

DaRltonsR.

- Đạt độ nhạy cao đến fe RmRtomole (10-15) và có thể đạt đượ c độ nhạy thấ p đặc

tr ưng picomole (10-12).

- Là phươ ng pháp ion hoá dễ làm nhất, có thể tạo ra đượ c những hợ p chất

không cộng hoá tr ị trong pha khí một cách dễ dàng có thể thích ứng vớ i k ỹ

thuật sắc ký lỏng.

- Thích ứng dễ dàng vớ i hệ thống cặ p máy phân tích khối lượ ng sử dụng dụng

cụ bẫy ion hoặc dụng cụ bốn tứ cực.

- Hiện tượ ng tích nhiều điện tích cho phép phân tích đượ c những ion có khối

lượ ng lớ n bằng những dụng cụ có giớ i hạn m/z nhỏ.






Trang 24

- Không có hiện tượ ng nhiễu nền.

UHạn chế:U

- Sự hiện diện của các muối và các tác nhân chứa cặ p ion tự do giống như TFA

có thể làm giảm độ nhạy.

- Những hỗn hợ p phức có thể làm giảm độ nhạy.

- Sự phân tích hỗn hợ p cùng lúc có thể diễn ra không hoàn toàn.

- Hiện tượ ng tích nhiều điện tích có thể gây nhầm lẫn đặc biệt là khi phân tích

hỗn hợ p.

- Độ tinh khiết của mẫu là r ất quan tr ọng.

IV.1.2. BỘ PHẬN PHÂN TÍCH KHỐI LƯỢ NG UT

ứ cự

c:U

- Thiết bị tách ion Tứ cực đã đượ c sử dụng vớ i nguồn ion hóa EI từ những năm

50 của thế k ỷ XX và nó vẫn là thiết bị tách ion phổ biến nhất hiện nay. Thật

thú vị, ngườ i ta tìm thấy trong khả năng của thiết bị tách ion này những ứng

dụng mớ i có thể k ết hợ p vớ i nguồn ion hóa ESI và APCI. Tứ cực mang lại 3

điểm lợ i chính:

- Thứ nhất, chúng phù hợ p vớ i điều kiện áp suất cao.

- Thứ hai, tứ cực có vùng tín hiệu khối lượ ng có thể phân tích những mảnh có

tỷ số khối lượ ng lên đến 4000, điều này r ất có lợ i, bở i vì nguồn ion hóa phun

electron của các phân tử protein và các phân tử có khối lượ ng lớ n thườ ng tạo

ra những sự phân bố điện tích từ m/z 1000 đến 3500.

- Thiết bị tách ion tứ cực thườ ng là những dụng cụ có giá tươ ng đối thấ p.

U Ba t ứ cự c:U

HÌNH R9R: SƠ ĐỒ TÁCH ION CỦA HỆ THỐNG 3 TỨ CỰ C






Trang 25

Một sự liên k ết của ba tứ cực có thể đượ c sử dụng, còn gọi là hệ thống khối

phổ ba tứ cực.

Tứ cực đầu tiên (Q1) và tứ cực thứ ba (Q3) hoạt động như bộ phận lọc khối

lượ ng, và tứ cực thứ hai (Q2) đượ c sử dụng như một tế bào va chạm. Tế bào va

chạm này chỉ là một tứ cực RF (không phải bộ phận lọc khối lượ ng) sử dụng khíHeli (≈10-3 Torr, ≈3eV) đem lại sự phân tích chọn lọc những mảnh ion từ Q1. Sau

đó những mảnh này đượ c dẫn qua Q3, ở đây chúng có thể đượ c lọc và phân tích một

cách đầy đủ. (15-18)





PH Ầ N N Ộ I DUNG-TRANG THI Ế T B Ị

Trang 26

CHƯƠ NG V. GIỚ I THIỆU CÁC THIẾT BỊ CHÍNHV.1. HỆ THỐNG HPLC AGILENT 1100

HÌNH 1R0R: HỆ THỐNG HPLC AGILENT 1100

Hệ thống HPLC agilent bao gồm:

Bộ phận bơ m mẫu tự động G1313A Bộ phận ngăn cột G1316A

G1322A Degasser Agilent ALS Therm





PH Ầ N N Ộ I DUNG-TRANG THI Ế T B Ị

Trang 27

Hệ thống bơ m G1311A Agilent G1310A Isocratic Pump

G1315 DAD detector G1314A UV detector

V.2. HỆ THỐNG API 3000

HÌNH 1R1R: HỆ THỐNG API 3000 CỦA PHÒNG THÍ NGHIỆM SẮC KÝ

Hệ thống API 3000™ LC/MS/MS là một thiết bị phân tích ion ba tứ cực,

đượ c sử dụng trong các phân tích protein và peptide, những phân tử có khối lượ ng

nhỏ trong các nghiên cứu về dượ c phẩm…(18,19)

HÌNH 1R2R: MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ API 3000





GI Ớ I THI Ệ U CÁC PH ƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH

Trang 28

CHƯƠ NG VI. CÁC PHƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCHDƯ LƯỢ NG MALACHITE GREEN

VI.1. KHÁI QUÁT

Việc xác định chính xác MG trong thực phẩm là vô cùng cần thiết, nhằm bảovệ lợ i ích của cả ngườ i tiêu dùng lẫn các doanh nghiệ p xuất khẩu thủy sản. Vớ i sự ra

đờ i của k ỹ thuật Sắc ký lỏng cao áp hiệu năng cao (HPLC), nhà Hóa học Julie

Kowalski đã áp dụng phươ ng pháp này để xác định dư lượ ng MG và các hợ p chất

chuyển hóa cơ bản của nó, LMG vớ i hệ hấ p phụ pha ngượ c HPLC.

Dựa vào phươ ng pháp phân tích dư lượ ng MG và LMG do Julie Kowalski

xây dựng, nhiều phươ ng phá p phân tích khác nhau đã ra đờ i mà sự khác nhau của

chúng chủ yếu là do loại detector sử dụng.

Năm 2003, nhóm nghiên cứu gồm 2 nhà khoa học Aldert . A. Bergwerff và

Peter Scherpenisse đã đưa ra một phươ ng pháp phân tích dư lượ ng MG và hợ p chất

chuyển hóa LMG trong động vật thủy sinh bằng Sắc ký lỏng cao áp hiệu năng cao

(HPLC) sử dụng detector hấ p thu quang vùng khả kiến (Vis).

Do MG có cực đại hấ p phụ ở 620 nm và LMG hấ p phụ ở 265 nm, điều này

gây ra khó khăn trong việc quan sát cả hai trong phép đo hấ p phụ. Vì vậy, tr ướ c khi

xác định ở bướ c sóng 620 nm, dung môi r ửa giái đượ c dẫn qua một lò phản ứng oxy

hóa hậu cột chứa PbO2 và Celite vớ i tỷ lệ 3:1 về khối lượ ng để chuyển hóa LMG

không màu thành dạng MG có màu.

Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp này là 1 ppb cho cả MG và LMG. Trong

phươ ng pháp của mình, Aldert . A. Bergwerff và Peter Scherpenisse đã sử dụng lò

phản ứng hậu cột chứa PbO2 và celite để chuyển hóa LMG thành MG, điều này đòi

hỏi thể tích dung dịch phân tích, thể tích dung môi khá lớ n và những bướ c chuẩn bị mẫu phức tạ p.

Để khắc phục những hạn chế trên, nhóm nghiên cứu gồm

Wendy.C.ADNersen; Jose.E.Roybal; Sherr.B.Twrnipseed cũng đưa ra phươ ng pháp

xác định tổng dư lượ ng MG và LMG bằng HPLC-Vis, nhưng sử dụng sự oxy hóa tại

chổ để chuyển LMG thành MG: LMG đượ c chuyển hóa thành MG thông qua phản






Trang 29

ứng vớ i 2,3 dicloro-5,6-dicyano-1,4 benzoquinon (DDQ). Sử dụng phản ứng oxy

hóa tại chỗ LMG thành MG bằng DDQ đã loại tr ừ sự cần thiết phải sử dụng lò phản

ứng oxy hóa hậu cột, đồng ngh ĩ a vớ i việc loại bỏ những hạn chế do lò phản ứng này

đem lại. Nhóm nghiên cứu nhận thấy chỉ cần sử dụng 3 ml 0,001 M DDQ, thì 100%

LMG sẽ đượ c chuyển hóa thành MG.Phươ ng pháp này đòi hỏi quá trình oxy hóa LMG thành MG sau đó MG tổng

sẽ đượ c xác định bằng detector hấ p thụ ánh sáng vùng khả kiến phân tích ở bướ c

sóng 618 nm. Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp này cũng là 1 ppb.

Cả hai phươ ng pháp phân tích tổng dư lượ ng MG và LMG bằng HPLC-Vis

đều có một nhượ c điểm chủ yếu là chỉ có thể xác định tổng dư lượ ng MG và LMG,

không định lượ ng đượ c nồng độ riêng của từng chất trong dung dịch ban đầu. Hạn

chế này có thể đượ c khắc phục nếu chúng ta ghép thêm 1 detector phát phổ huỳnh

quang vào đườ ng dẫn dung môi r ửa giải thay cho lò phản ứng hậu cột, để phát hiện

ra LMG bở i sự kích thích sự phát xạ ở 265 nm và sự phát xạ ở 360 nm. Tuy nhiên

giải pháp này có sự hạn chế là vớ i 2 detector phát hiện thì hệ thống r ất cồng k ềnh và

tốn kém.

Năm 2004, nhóm nghiên cứu Luise Valle, Cecilia Diaz, Antonio.L Zanocio

và Pablo Richter đã phát triển phươ ng pháp xác định tổng dư lượ ng MG và LMG

lên một bướ c cao hơ n vớ i việc sử dụng HPLC-APCI-MS. Sơ đồ của hệ thống đượ c

giớ i thiệu như sau:

Sự sử dụng detector MS đã đem lại một k ết quả tuyệt vờ i: đẩy giớ i hạn phát

hiện tổng MG và LMG lên 0.15 ppb. Hiệu suất thu hồi của một mẫu thêm chuẩn vớ i

nồng độ 2 kg g / là 85% và 70% tươ ng ứng vớ i LMG và MG, độ sai số tươ ng đối là

1,3% và 3,1 %.

Cột LC APCI MS

Van bơ m mẫu

Pha động

Bơ m áp suất thườ ng






Trang 30

Phươ ng pháp phân tích do nhóm Luise Valle, Cecilia Diaz, Antonio.L

Zanocio và Pablo Richter đưa ra có hai ưu điểm so vớ i các phươ ng pháp đượ c giớ i

thiệu tr ướ c đó:

- Tăng giớ i hạn phát hiện lên đến 0,15 ppb.

- Định lượ ng đượ c cả MG và LMG trong mẫu phân tích.

Như vậy, vớ i việc sử dụng detector MS 1 tứ cực, nguồn ion hóa ở áp suất

thườ ng (APCI), nhóm nghiên cứu đã phát triển phươ ng pháp phân tích tổng dư

lượ ng MG lên một trình độ cao hơ n.

Sự phát triển vượ t bậc của các k ỹ thuật cũng như các thiết bị phân tích làm

cho các nướ c có nền khoa học phát triển ngày càng hạ thấ p giớ i hạn cho phép của

các loại thuốc kháng sinh, đặc biệt là MG trong thực phẩm. Ví dụ, giớ i hạn cho phép

của MG trong thực phẩm ở Canada đã xuống tớ i mức 0,5 ppb. Nó tạo ra 1 cuộc đua

không có điểm dừng giữa giớ i hạn phát hiện của các phươ ng pháp phân tích vớ i giớ i

hạn cho phép của các hóa chất trong thực phẩm.

Nhóm nghiên cứu gồm các nhà khoa học Jeffrey M. VADNe Riet, Cory J.

Murphy, Johanna N. Pearce, Ross A. Potter và B. Garth Burns đã tiến hành nghiên

cứu xác định dư lượ ng MG và LMG trong sản phẩm thủy sản bằng Sắc ký lỏng cao

áp hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC – LC/MS-MS), sử dụng nguồn ion hóa phun

ion (ESI) và bộ phận tách ion ba tứ cực (triquapole).

MG và hợ p chất chuyển hóa cơ bản của nó, LMG đượ c chiết từ những mẫu

đồng nhất. Sau quá trình chiết sử dụng dung dịch đệm McI1vaine và acetonitrile,

dịch chiết đượ c làm tinh khiết bở i một cột chiết pha r ắn (SPE) có gắn acid sulfonic.

Sau khi chuyển hóa LMG thành MG bở i lò phản ứng oxy hóa hậu cột chứa PbO2,

dung dịch r ửa giải đượ c phân tích bằng hệ thống detector MS-MS. Vớ i sơ đồ hệ

thống như sau:

Dịchchiết

Cột LC Lò oxy hóa hậu cột ESI MS/MS






Trang 31

Độ thu hồi trong khoảng 81% đối LMG và 98% đối vớ i MG cho những mẫu

đượ c thêm chuẩn 1 ng/g đối vớ i cả MG và LMG thu đượ c một cách dễ dàng khi sử

dụng phươ ng pháp trên.

Nhìn một cách tổng quát, phươ ng pháp phân tích dư lượ ng MG và LMG bằng

LC/ESI/MS-MS có khá nhiều ưu điểm so vớ i các phươ ng pháp khác:- Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp lên đến 0,1 ppb, giớ i hạn này thỏa mãn

tất cả các yêu cầu về dư lượ ng MG tối thiểu trong thực phẩm của tất cả các

quốc gia, ví dụ như các quốc gia Châu Âu là 2 ppb, Canada là 0,5 ppb.

- Thể tích mẫu cho mỗi lần phân tích r ất ít, chỉ khoảng 10 l .

- Độ thu hồi của các mẫu thêm chuẩn cao và ổn định.

- Khả năng phân tích nhanh, độ tin cậy cao.

- Phươ ng pháp phân tích đơ n giản.

- Có thể xác định đượ c cả nồng độ của MG, LMG trong mẫu phân tích ban

đầu.

- Không đòi hỏi quá trình chuẩn bị mẫu phức tạ p.

Vớ i tất cả những ưu điểm trên, phươ ng pháp này đã đượ c chúng tôi chọn làm

phươ ng pháp tham chiếu cho đề tài của mình. Tuy nhiên, do điều kiện về trang thiết

bị cũng như dụng cụ, hóa chất của phòng thí nghiệm Sắc ký, Bộ môn Dinh Dưỡ ng

và Chế Biến Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Tr ườ ng Đại Học Cần Thơ , chúng tôi không

thể nào áp dụng tr ực tiế p phươ ng pháp trên mà chỉ có thể chuẩn hóa phươ ng pháp

bằng những điều kiện hiện có, hy vọng vớ i những trang thiết bị đó, chúng tôi có thể

đưa ra đượ c một phươ ng pháp có độ nhạy và độ tin cậy tươ ng đươ ng vớ i phươ ng

pháp của Jeffrey M. VADNe Riet, Cory J. Murphy, Johanna N. Pearce, Ross A.

Potter và B. Garth Burns. Và biết đâu, vớ i sự nỗ lực của nhóm nghiên cứu cộng vớ i

1 chút may mắn, chúng tôi có thể chuẩn hóa đượ c một phươ ng pháp có giớ i hạn pháthiện cao hơ n cả giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp tham chiếu (LOD = 0,1 ppb đối

vớ i đườ ng chuẩn và LOD = 0,3 ppb đối vớ i các mẫu phân tích định lượ ng). Mọi khả

năng đều có thể xảy ra (20-23).






Trang 32

VI.2. GIỚ I THIỆU PHƯƠ NG PHÁP THAM CHIẾU

XÁC ĐỊNH MALACHITE GREEN VÀ LEUCO-MALACHITEGREEN TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM THUỶ SẢN BẰNG SẮC

KÝ LỎNG CAO ÁP GHÉP CẶP KHỐI PHỔ (LC/MS-MS)

UTÓM T Ắ T UPhươ ng pháp sắc ký lỏng ghép cặ p khối phổ (LS/MS-MS) đượ c phát triển để

xác định dư lượ ng MG và LMG trong một số loại mẫu. MG và sản phẩm trao đổi

chất của nó đượ c chiết từ những mẫu đồng nhất bằng dung dịch HClO B4B:MeCNR, Rvớ i

dung dịch đệm NH B4BOH: FA trong gradient nồng độ của MeCN. Dịch chiết đượ c ly

tâm và chia thành những phần bằng nhau, mỗi phần đượ c cô đặc và dẫn qua 1 cột

chiết pha r ắn liên k ết hóa học CB18B. Hỗn hợ p đượ c r ửa giải vớ i MeCN, sau đó làm

khô bằng cách cho bay hơ i, phần cặn đượ c hoà tan trong MeCN và pha loãng vớ i

nướ c cất, chuẩn bị cho quá trình phân tích.

Đườ ng cong chuẩn độ nối giữa các điểm phân tíchR có nồng độR từ 5 đến 500

pg đượ c tiêm vào tất cả các mẫu phân tích, vớ i hiệu suất thu hồi giớ i hạn từ 81% đối

vớ i LMG và 98% đối vớ i MG trong mẫu cá hồi ở nồng độ 1 ng/g.R

Giớ i hạn phát hiện là 0,1 ng/g cho cả MG và LMG (đườ ng chuẩn) thu đượ c

một cách dễ dàng khi sử dụng phươ ng pháp trên. Lỗi hệ thống, các yếu tố nhiễu vàhiệu suất thu hồi của mẫu thêm chuẩn đượ c so sánh vớ i các thông số tươ ng ứng thu

đượ c bở i những phươ ng pháp đã đượ c thiết lậ p. Phươ ng pháp trên đơ n giản, nhanh

chóng, và đặc biệt dùng để xác định dư lượ ng của MG và LMG trong nhiều loại

mẫu.

Việc kiểm tra dư lượ ng hoá chất dùng để tr ị bệnh tr ong các sản phẩm cá nuôi

là một phần thiết yếu của chươ ng trình “rào cản chất lượ ng” đượ c thiết lậ p bở i cơ

quan kiểm tra thực phẩm Canada. Những phươ ng pháp nhanh và nhạy phải thật sự kiểm tra đượ c dư lượ ng của những chất này và bảo vệ ngườ i tiêu dùng tránh khỏi

nguy cơ bị đột biến, tạo điều kiện thuận lợ i cho quá trình thươ ng mại. Phát triển một

k ỹ thuật kiểm tra phân tích vừa đơ n giản vừa nhanh chóng r ẻ tiền để định lượ ng cả

MG và LMG là một điều đang đượ c mong đợ i, vì cả hai hợ p chất trên có thể cùng

tồn tại trong cơ thể của những động vật vừa đượ c xử lý hoá chất.






Trang 33

Một số phươ ng pháp phổ biến khác có thể xác định MG và những hợ p chất

chuyển hoá của chúng. Đa số các phươ ng pháp phân tích đều sử dụng Sắc ký lỏng

cao áp ghép vớ i detector vùng khả kiến (LC/Vis) và lò oxy hoá hậu cột chứa PbOB2B.

Mặc dù những phươ ng pháp này cung cấ p độ nhạy thích hợ p (giớ i hạn phát hiện là

gần 0,5 ng/g) nhưng chúng không mạnh và thiếu độ tin cậy so vớ i k ỹ thuật phổ khốilượ nRgR (MS).

Đa số phươ ng pháp đều cần 1 cột chiết pha r ắn tươ ng đối dài dùng để làm

sạch gồm những pha cố định khác nhau. Mặc dù loại làm sạch này có thể khá ảnh

hưở ng, mất thờ i gian, đắt tiền và có thể có vấn đề khi sử dụng chất hấ p phụ của

nhiều nhà sản xuất khác nhau.

Mục đích của việc nghiên cứu là phát triển 1 phươ ng pháp nghiên cứu, phân

tích LC/MS thông thườ ng, hiệu quả cho việc xác định đồng thờ i dư lượ ng MG và

LMG trong một số loại mẫu ở giớ i hạn phát hiện bằng hoặc dướ i 0,5 ng/g như yêu

cầu của Canada. Phươ ng pháp đượ c giớ i thiệu ở đây sử dụng cặ p khối phổ MS/MS

để làm giảm sự cần thiết phải làm sạch mẫu và cung cấ p một phươ ng pháp chuyên

biệt, nhanh chóng, chi phí thấ p, nhạy và chính xác để xác định cả MG lẫn LMG.

UTHÍ NGHI Ệ M U

Dụng cụ

- LC column – Luna C18, 5 µm, 15 cm * 2 mm, reversed phase.

- LC system:

• Quaternary pump system.

• Autosampler.

• Column oven.

- Detector MS/MS.

- Tube rotator.

- SPE column – Strata C18-E (50 µm, 70 A), 500 mg/ 3 mL.

Tác chấ t

- Nướ c cất (DIW).

- Acetonitril (MeCN).

- HClO B4B 60%






Trang 34

- Dung dịch Acidic actonitril:

• 0,8 ml HClOB4B + MeCN = 1L- CH B2BClB2. B

- Formic acid (FA) 90%

-

Dung dịch NHB

3B

28 - 30%- Malachite Green (MG)

- Leuco-Malachite Green (LMG)

- Stock solution: 100 )/( mL g

• Hòa tan 10 mg MG và LMG trong bình định mức thể tích 100 ml và

pha loãng đến vạch bằng MeCN.

• Giữ trong bóng tối ở nhiệt độ 4ºC

• Bảo quản trong thờ i gian không quá 2 tuần.

- Mixed Standard: 2 )/( mL g

• Hút 2 ml chuẩn nguyên liệu vào bình định mức thể tích 100 ml, pha

loãng đến vạch bằng MeCN.

• Giữ trong bóng tối ở nhiệt độ 4ºC.


- Working standard : 100 )/( mL g η

• Hút 5 ml chuẩn tr ộn cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng đến

vạch bằng MeCN.



- LC mobile phase modifer:

• 40 mM NH B4BOH + 500 mM FA.

• Pha loãng 3 ml NH B3B 25% và 23 g dung dịch 90% FA đến thể tích 1L bằng nướ c cất.

- LC solvent A:

• 100 ml tác nhân cải biến pha động + 900 ml dung dịch (MeCN:HB2BO)

tỷ lệ (10:90).

- LC solvent B:






Trang 35


tỷ lệ (90:10).

Chuẩ n b ị mẫ u

Mẫu cá da tr ơ n như cá Hồi và cá Tr ầu đượ c sử dụng trong nghiên cứu này,

chúng đượ c lấy từ các quy trình nuôi thủy sản công nghiệ p đượ c Liên bang bảo đảmvề chất lượ ng. Tôm và Tilapia đượ c sử dụng là những sản phẩm nội địa, thu từ các

hoạt động kiểm tra mẫu thông thườ ng. Cá đượ c chuẩn bị theo phươ ng pháp AOAC

937,07 (11), đượ c giữ lạnh và gửi tớ i phòng thí nghiệm. Mẫu đượ c lột da, làm tan,

mô cơ đượ c tr ộn cho đến khi đồng nhất bằng máy gia công thức ăn. Mẫu tôm đượ c

bóc vỏ và tr ộn cho đến khi đồng nhất. Những loại mẫu khác như cá trê đượ c xử lý

tươ ng tự như trên. Mẫu đượ c bảo quản ở nhiệt độ -20ºC cho đến khi phân tích.

Quá trình chi ế t

- Cân chính xác 4 g mẫu đồng nhất cho vào ống ly tâm nhựa thể tích 50 ml.

- Thêm vào 16 ml HCLOB4B/MeCN và làm đồng nhất hỗn hợ p trong ống bằng

máy tr ộn.

- Pha loãng đến vạch 25 ml bằng CHB2BClB2B và tr ộn trong ống quay vớ i thờ i gian

10 phút.

- Ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 10 phút.

- Chuyển phần thể tích 10 ml của lớ p trên vào ống thủy tinh và làm bay hơ i

đến 2 ml bằng cách thổi khí N B2B ở nhiệt độ dướ i 45ºC.

- Đưa phần dịch chiết thu đượ c sau quá trình cô đặc qua 1 cột SPE đã đượ c làm

ẩm vớ i 2 ml MeCN và thu phần nướ c tháo vào ống.

- R ửa ống 2 lần vớ i 2 ml MeCN và cho qua cột, hòa lẫn vào dung môi r ửa giải.

Tốc độ dòng qua cột từ 2 đến 5 ml/phút.

- Làm bay hơ i hỗn hợ p dung môi đến khô bằng cách thổi khí NB

2B ở nhiệt độ

dướ i 45ºC.

- Hòa tan cặn trong 500 l MeCN và tr ộn trong máy tr ộn xoáy.

- Pha loãng dung dịch chiết vớ i 500 l nướ c cất, tr ộn và lọc qua 1 syringe có

đườ ng kính các lỗ là 0,2 m ; lọc tr ướ c khi phân tích.

Chuẩ n b ị chuẩ n nền






Trang 36

Dịch chiết mẫu tr ắng đượ c kiểm tra tr ướ c đó và xác định là mẫu tr ắng đượ c

chuẩn bị như trên. Ư u tiên sử dụng MeCN, thể tích chuẩn tr ộn, MeCN và nướ c cất

đượ c thêm vào phần chứa dư lượ ng. Chuẩn nền đượ c tr ộn trong máy tr ộn xoáy và

lọc tr ướ c khi phân tích.

Dãy chuẩ nThể tích của chuẩn làm việc, MeCN, và DIW để tạo nên dãy chuẩn đượ c trình bày

trong bảng dướ i đây:

MG-LMG

)/( mL g η

Thể tích

chuẩn làm

việc

( l )

Thể tích

của

MeCN

( l )

Thể tích

nướ c cất

( l )

0 0 500 5000,5 10 990 1000

2 20 480 500

10 100 400 500

50 500 0 500

U H Ệ TH Ố NG LC:U

Hệ thống LC đượ c làm cân bằng trong thờ i gian bằng hoặc hơ n 30 phút ở

nhiệt độ cột lò khoảng 35ºC sử dụng dung dịch B chảy vớ i vận tốc dòng 0,25ml/phút. Hệ thống đượ c giữ trong 1 phút vớ i dung môi B 30%, sau đó sử dụng dãy

gradient nồng độ của dung môi B từ 30% đến 100% trong thờ i gian 7 phút, 1 lần vớ i

dung dịch B 100% tốc độ dòng 0,4 ml/phút trong thờ i gian trên 3 phút.

- Hệ thống đượ c giữ trong 10 phút vớ i dung môi B nồng độ 100%, sau đó quay

lại sử dụng dung môi B nồng dộ 30% trong thờ i gian 1 phút.

Detector MS/MS đượ c đặt ở những điều kiện như sau:

• Ion mode ES+

• Capillary: 2,5 kV.

• Cone voltages: extractor 5.0 V

• RF lens 0,3 V.

• Source temperature 100ºC.






Trang 37

• Desolvation temperature 400ºC.

• NB2 Bcone gas flow 50 L/h.

• NB2B desolvation gas flow: 400 L/h.

• Argon collision gas presure: 3,78*10 P

-3P mbar.

Thông số của MS đượ c trình bày ở bảng sau:

RCOMPOUNDR RMASS TRANSITIONR

RCONE

VOLTAGE

(V)

RCOLLISION

ENERGY R(V)

329>313,4 60 40MG

329>165,3 50 70

331,0>239,4 35 35LMG

331,0>315,6 35 20

- Tiêm 1 phần thể tích 10 l mẫu, kiểm tra mẫu thêm và mẫu tr ắng. Xây dựng

1 đườ ng đồ thị đo độ cao peak ban đầu ứng vớ i lượ ng chuyển hóa thu đượ c

so sánh vớ i nồng độ của dung dịch tiêm.

- Tính nồng độ của MG và LMG trong dịch chiết bằng phép nội suy từ đườ ng

chuẩn. Sau đó từ tỷ số ion trong khoảng riêng biệt, giá tr ị ng/ml của MG hoặc

LMG trong khối lượ ng mẫu chiết và hệ số pha loãng để tính ra giá tr ị ng/g

trong mẫu.

UK ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN:U

MG và LMG đượ c tách ra khỏi nhau một cách dễ dàng và đượ c r ửa giải hoàn

toàn vớ i cột Luna CB18B (15 cm – 20 mm) trong thờ i gian dướ i 25 phút, sử dụng đườ ng

Gradient nồng độ của dung dịch B (từ 30 đến 100%) vớ i tốc độ dòng là 0,25

mL/phút. Đườ ng chuẩn hóa đượ c nối giữa các điểm có nồng độ từ 5 đến 500 pg

đượ c tiêm vào trong cột, tươ ng ứng vớ i nồng độ 0,5 và 30 ng/g trong mẫu. Hệ số

tươ ng quan của đườ ng chuẩn trong khoảng 0,999. Đườ ng cong chuẩn độ của MG và

LMG là r ất giống nhau. Sự bảo quản đườ ng chuẩn gặ p r ất nhiều khó khăn, chuẩn

làm việc bị thoái biến r ất nhanh và nên giữ trong tối, ở nhiệt độ 4 P

0PC, trong thờ i gian






Trang 38

không quá 2 tuần. Chuẩn nguyên liệu cũng đượ c bảo quản trong điều kiện tươ ng tự

vớ i thờ i gian không quá 2 tháng.

Giớ i hạn phát hiện (LOD) của cả MG và LMG trong chuẩn nền tr ắng dựa

trên thờ i gian lưu của hợ p chất là 0,1 ng/g. Giớ i hạn định lượ ng là 0,3 ng/g cho tất cả

các mẫu kiểm tra.





PH Ầ N TH Ự C NGHI Ệ M-CHU Ẩ N HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

Trang 39

RPHẦN THỰ C NGHIỆM

CHƯƠ NG VII. CHUẨN HÓA QUY TRÌNH PHÂNTÍCH DƯ LƯỢ NG MG VÀ LMG

Mục đích là dựa vào các phươ ng pháp phân tích tham chiếu đượ c trình bày ở

trên, xây dựng một phươ ng pháp phân tích phù hợ p vớ i trang thiết bị và những điều

kiện hiện có tại phòng thí nghiệm Sắc ký Khoa Thủy Sản để tiến hành những nghiên

cứu về Malachite Green nói riêng cũng như thuốc kháng sinh dùng trong nuôi tr ồng

thủy sản nói chung.

PHƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH MG VÀ LMG ĐƯỢ C

XÂY DỰ NG CHO PHÒNG PHÂN TÍCH SẮC KÝ- BỘ MÔN DINH DƯỠ NG KHOA THỦY SẢN, ĐẠI HỌCCẦN THƠ

VII.1. NGUYÊN TẮC

Mẫu cá sau khi đượ c rã đông, sẽ tiến hành spike chuẩn (tiêm chuẩn vào mẫu)

bao gồm cả MG và LMG ở những nồng độ đượ c chuẩn bị từ tr ướ c. Sau đó thực hiện

quy trình tách chiết mẫu bằng dung dịch HClOB

4B

:MeCN. Dịch chiết đượ c ly tâm vàchia thành những phần bằng nhau, mỗi phần đượ c cô đặc và dẫn qua 1 cột chiết pha

r ắn liên k ết hóa học CB18B. Hỗn hợ p đượ c r ửa giải vớ i MeCN, sau đó làm khô bằng

cách cho bay hơ i, phần cặn đượ c hoà tan trong MeCN và pha loãng vớ i nướ c cất,

chuẩn bị cho quá trình phân tích.

Do thờ i gian không cho phép, nên trong thí nghiệm này, sinh viên làm luận

văn chỉ có thể tiến hành tách chiết và tính hiệu suất thu hồi đối vớ i các mẫu đượ c

thêm chuẩn, k ết quả của thí nghiệm chủ yếu đượ c thể hiện ở k ết quả hiệu chỉnh hệ thống phân tích, k ết quả xác định giớ i hạn phát hiện của hệ thống, hiệu suất thu hồi

của phươ ng pháp cũng như đượ c thể hiện ở những hình phổ thu đượ c.






Trang 40

VII.2. CÁC THÍ NGHIỆM ĐƯỢ C TIẾN HÀNH

Dụng cụ - Cột Higgingn Analytical, Iic-USA Clipews C18 5 m 150 cm * 2,1 mm

P/N CS-1521-C185

S/N 127641

- LC system:

• Quaternary pump system.

• Autosampler.

• Column oven.

- Detector MS/MS.

- Tube rotator.

- SPE column – Strata C18-E (50 µm, 70 A), 500 mg/ 3 mL.

Tác chấ t

- Nướ c cất (DIW).

- Acetonitril (MeCN).

- HClO B4B 60%

- Dung dịch Acidic actonitril: 0,8 ml HClO B4B + MeCN = 1L

- CH

B

2B

ClB

2.B

- Formic acid (FA) 100%

- Dung dịch NH B3B 25%

- Malachite Green (MG)

- Leuco-Malachite Green (LMG)

- Stock solution: 100 )/( mL g

• Hòa tan 10 mg MG và LMG trong bình định mức thể tích 100 ml và

pha loãng đến vạch bằng MeCN.



- Working standard : 100 )/( mL g η






Trang 41

• Hút 5 ml chuẩn tr ộn cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng đến

vạch bằng MeCN.



- LC mobile phase modifer:

• 40 mM NH B4BOH + 500 mM FA.

• Pha loãng 3 ml NH B3B 25% và 23 g dung dịch 90% FA đến thể tích 1L

bằng nướ c cất.

- LC solvent A:


tỷ lệ (10:90).

- LC solvent B:


tỷ lệ (90:10).

VII.2.1. HIỆU CHỈNH HỆ THỐNG PHÂN TÍCHUMục đích của thao tác hiệu chỉnh hệ thống (Optimize hệ thống)U

Có thể nói đây là công việc khó khăn và mất nhiều thờ i gian nhất trong quá

trình tiến hành đề tài. Hệ thống LC-MS/MS (HỆ THỐ NG HPLC AGILENT 1100

và HỆ THỐ NG API 3000™ LC/MS/MS) là hệ thống phân tích Sắc ký vừa đượ c

trang bị cho Bộ môn Dinh Dưỡ ng Khoa Thủy Sản trong thờ i gian không lâu. Vì đây

là trang thiết bị thuộc loại hiện đại và tiên tiến nhất không chỉ đối vớ i nướ c ta mà ở

cả các quốc gia có nền khoa học phát triển, nên việc sử dụng thành thạo các trang

thiết bị này để đạt hiệu quả cao nhất mà chúng có thể đem lại là nằm ngoài khả năng

của chúng ta. Bên cạnh đó, phân tích dư lượ ng MG và LMG trong các sản phẩm

thủy sản lại là đề tài đầu tiên sử dụng hệ thống hiện đại này, vì thế không có các

thông số k ỹ thuật của chúng để cho chúng ta tham khảo như các quy trình phân tích

do AOAC xây dựng. Do đó, việc optimize hệ thống LC-MS/MS là một yêu cầu bắt

buộc không thể bỏ qua.






Trang 42

Tóm lại, mục đích để optimize hệ thống HPLC cũng như khối phổ MS/MS là

nhằm tìm ra các thông số k ỹ thuật của các trang thiết bị này để phát huy tối đa khả

năng mà chúng có thể đạt đượ c, đẩy giớ i hạn phát hiện cũng như độ nhạy khi phân

tích dư lượ ng MG và LMG lên mức tối đa.

UCách tiến hành hiệu chỉnh hệ thống:U

- UOptimize hệ thống MS/MS:

Nói một cách ngắn gọn, để optimize hệ thống MS/MS ta làm như sau:

• Tiêm chuẩn tr ực tiế p vào hệ thống để phân tích mà không cần phải qua

cột tách LC.

• Để cho hệ thống tự động chọn các thông số k ỹ thuật để tiến hành đo

phổ của các chuẩn.

• Sau khi hệ thống MS/MS hoàn tất quá trình đo phổ, ta thu đượ c một

bảng k ết quả thông báo về các thông số k ỹ thuật của hệ thống và độ

nhạy của quá trình phân tích tươ ng ứng vớ i các thông số k ỹ thuật ấy.

• Tiến hành hàng loạt các thí nghiệm đo phổ của các chất chuẩn cho đến

khi tìm đượ c một bộ các thông số k ỹ thuật của hệ thống MS/MS cho

độ nhạy cao nhất và ổn định nhất.

- UOptimize hệ thống HPLC:

Sau khi có đượ c bộ thông số k ỹ thuật thích hợ p nhất đối vớ i hệ thống

MS/MS, chúng ta sẽ tiến hành optimize hệ thống HPLC:

• Cho chuẩn qua cột tách LC.

• Để cho hệ thống HPLC tự động chọn chế độ phối tr ộn dung môi pha

động (Gradient pha động) để r ửa giải chất phân tích khỏi cột LC.

• Tiến hành hàng loạt các thí nghiệm r ửa giải chất chuẩn khỏi cột cho

đến khi tìm đượ c một Gradient pha động cho k ết quả phân tích tốtnhất.

Để quý thầy cô có thể hình dung đượ c công việc hiệu chỉnh hệ thống phân

tích, em xin đưa ra các bảng số liệu thu đượ c của 2 ngày làm việc (trong tổng số gần

2 tháng hiệu chỉnh hệ thống) để hiệu chỉnh hệ thống MS/MS phân tích LMG. Trung

bình 1 ngày, tiến hành khoảng 5 đến 10 thí nghiệm tiêm mẫu.






Trang 43

WEDNESDAY- Wednesday, May 09, 2007, 10:09 (BẢNG SỐ LIỆU NGUYÊN BẢN)

Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)

Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 8 peaks. Build final method using 2 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.863Initial Q1 ScanTarget Compound Mass(amu) Intensity(cps) (5 MCA Average)LeucoMG 330.859 107700

Parameter: DP Start: 1.0 Stop: 101.0 Step: 5.0

Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.859 80.0 76.0 139778

Parameter: FP Start: 50.0 Stop: 375.0 Step: 10.0






Final Q1 ScanTarget Compound Mass(amu) Intensity(cps) (5 MCA Average)LeucoMG 330.889 84360

Final Q1MI Method: LeucoMG_QOpt_FinalQ1MI_Pos.dam

Target Compound: LeucoMG

Initial Product Mass Initial Product Ion Intensity(cps) (26 MCA Sum)239.165 54000165.124 26000






Trang 44

316.158 19000223.188 17000152.085 15000153.212 13000194.363 11000180.145 10000

Parameter: CE Start: 5.0 Stop: 130.0 Step: 2.0

Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.889/152.085 50.0 125.0 1360330.889/153.212 50.0 105.0 1030330.889/165.124 50.0 93.0 2172330.889/180.145 50.0 91.0 1133330.889/194.363 50.0 61.0 2033330.889/223.188 50.0 73.0 4130330.889/239.165 50.0 47.0 15667330.889/316.158 50.0 31.0 6568

Parameter: CXP Start: 0.0 Stop: 55.0 Step: 2.0

Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.889/152.085 13.0 8.0 1563
















Trang 45





Optimal Product Ion Mass: 239.100 Optimal Product Ion Intensity: 13780 (điểm để sosánh giữ a các thí nghiệm hiệu chỉnh)

Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.

- Wednesday, May 09, 2007, 10:14 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Optimal Product Ion Mass: 239.100 Optimal Product Ion Intensity: 12110 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.

- Wednesday, May 09, 2007, 10:16 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)

Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.819Optimal Product Ion Mass: 239.100 Optimal Product Ion Intensity: 8290Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.


Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positive






Trang 46

Precursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolution

LeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.829Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 13660












Trang 47

Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.

Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.836Optimal Product Ion Mass: 313.100 Optimal Product Ion Intensity: 29020Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.










Trang 48


Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)

Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.849Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 11950Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.


Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.851Optimal Product Ion Mass: 239.300 Optimal Product Ion Intensity: 17580 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.


Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.861Optimal Product Ion Mass: 239.300 Optimal Product Ion Intensity: 69180






Trang 49


THURSDAY - Thursday, May 10, 2007, 10:31(BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)

Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.867

Optimal Product Ion Mass: 239.100 Optimal Product Ion Intensity: 34960 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.

- Thursday, May 10, 2007, 10:43 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.841Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 45780 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.

- Thursday, May 10, 2007, 10:54 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.640






Trang 50


- Thursday, May 10, 2007, 11:01 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative Optimization

MS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.829Optimal Product Ion Mass: 239.000 Optimal Product Ion Intensity: 48380Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.


- Thursday, May 10, 2007, 14:27 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.799Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 17340






Trang 51


- Thursday, May 10, 2007, 14:30 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positive

Precursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.805Optimal Product Ion Mass: 239.300 Optimal Product Ion Intensity: 27060 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.

- Thursday, May 10, 2007, 14:35 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)

Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolution

LeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.813Optimal Product Ion Mass: 239.200 Optimal Product Ion Intensity: 28810Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.

- Thursday, May 10, 2007, 15:49 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000






Trang 52

base peak ion mass: 330.856Optimal Product Ion Mass: 239.100 Optimal Product Ion Intensity: 113470 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.

-

Thursday, May 10, 2007, 15:58 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.813Optimal Product Ion Mass: 239.300 Optimal Product Ion Intensity: 124080 Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.


- Thursday, May 10, 2007, 16:18 (BẢNG SỐ LIỆU TRÍCH LỌC)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000






Trang 53

base peak ion mass: 330.836

Optimal Product Ion Mass: 239.100 Optimal Product Ion Intensity: 152600Final MRM Method: LeucoMG_QOpt_FinalMRM_Pos.damQuantitative optimization completed successfully.

- Thursday, May 10, 2007, 16:32 (BẢNG SỐ LIỆU NGUYÊN BẢN)Infusion Quantitative OptimizationMS/MS Analysis, positivePrecursor ion: Base Peak Ion, Search Range: 329.000 to 333.000 (amu)Product ion: Auto Select, Criteria:From the most intense: 2 peaks. Build final method using 1 most intense peaks.Exclude Product Ions within ± 10.000(amu) of Precursor Ion m/z.Min. mass for product ion: 100.000(amu). Threshold for product ion > 0.0(cps)Quad 1 Resolution: Unit resolution, Quad 3 Resolution: Unit resolutionLeucoMGFind base peak ion - Start Mass: 329.000 Stop Mass: 333.000 base peak ion mass: 330.827Initial Q1 ScanTarget Compound Mass(amu) Intensity(cps) (5 MCA Average)LeucoMG 330.818 1174660









Final Q1 ScanTarget Compound Mass(amu) Intensity(cps) (5 MCA Average)LeucoMG 330.809 1033720

Final Q1MI Method: LeucoMG_QOpt_FinalQ1MI_Pos.dam






Trang 54

Target Compound: LeucoMG

Initial Product Mass Initial Product Ion Intensity(cps) (26 MCA Sum)239.159 774000316.240 236000

Parameter: CE Start: 5.0 Stop: 130.0 Step: 2.0Masses(amu) Current Value New Value Intensity(cps)330.809/239.159 50.0 45.0 148793330.809/316.240 50.0 31.0 92210





Final Product Ion Mass(amu) Final Product Ion Intensity(cps) (10 MCA Average)239.000 183530316.400 114680


Đây là thí nghiệm có độ nhạy tốt nhất của hệ thống phân tích MS/MS đối vớ i

LMG, nhưng đây chỉ mớ i là thông số phân tích MS cho 1 mảnh của LMG (mảnh có

m/z là 239,000). Đối vớ i hệ thống MS/MS, ta phải tìm các thông số thích hợ p để

phân tích tất cả 4 mảnh ion đặc tr ưng, MG (2 mảnh: 328,8 và 165,2) và LMG (2

mảnh: 316,2 và 239). Sau đó mớ i tiến hành hiệu chỉnh hệ thống HPLC. Quả thật,

quá trình hiệu chỉnh hệ thống phân tích là quá trình tốn nhiều công sức và thờ i gian

nhất trong để tài, và k ết quả của quá trình này ảnh hưở ng lớ n nhất đến chất lượ ngcủa phươ ng pháp chuẩn hóa mà nhóm nghiên cứu xây dựng đượ c.

Cuối cùng, sau gần 2 tháng hiệu chỉnh hệ thống phân tích, nhóm nghiên cứu

đã tìm đượ c các thông số tươ ng đối phù hợ p. Thật ra, nhóm nghiên cứu phải miễn

cưỡ ng ngưng quá trình hiệu chỉnh hệ thống phân tích lại do thờ i gian không cho

phép tiến hành tiế p thí nghiệm này. Cần phải tiế p tục hiệu chỉnh nếu có điều kiện.






Trang 55

- UThông số k ỹ thuật của hệ thống sau khi tiến hành optimize:

• Hệ thống LC Agilent 1100 Agilent 1100 LC pumb method properties

- Pumb Model: Agilent 1100 Capillary Pumb

- Minimum pressure (psi): 0.0

- Maximum pressure (psi): 5801.0

- Dead Volume ( l ): 40.0

- Maximum Flow Ramp (ml/min2) 100.0

- Maximum Presure Ramp (psi/sec): 290

Gradient pha động:

Step

Total time

(min)

Flow

Rate( l /min) A (%) B (%)

0 0.00 250.00 70.0 30.0

1 1.00 250.00 50.0 50.0

2 2.00 250.00 30.0 70.0

3 4.00 250.00 30.0 70.0

4 8.00 250.00 0.0 100.0

5 10.00 250.00 0.0 100.06 11.00 250.00 70.0 30.0

- Left Compressibility: 50.0

- Right Compressibility: 50.0

- Left Dead Volume ( l ) 40.0

- Right Dead Volume ( l ) 40.0

- Left Stroke Volume ( l ) -1.0

- Right Stroke Volume ( l ) -1.0

- Left Solvent A1

- Right Solvent B1

Agilent 1100 Autosampler Properties

- Autosampler Model Agilent 1100 Autosampler






Trang 56

- Syringe Size ( l ) 100

- Injection volume ( l ) 10.00

- Draw speed ( l /min) 200.0

- Eject Speed ( l ) 200.0

- Needle Level (mm) 0.00

- Use Custom Injector Program No

Agilent 1100 Colum Oven Properties

- Left temperature ( P

0PC) 20.00

- Right Temperature (P

0PC) 20.00

- Temperature Tolenrance +/- ( P

0PC) 1.00

- Start Acquisition Tolenrance +/- ( P

0PC) 0.50

- Time table (Not use)

- Colume Switching Valve not installed

- Position for firt sample in the batch Not applicable

UThảo luận k ết quả:U

Quá trình hiệu chỉnh hệ thống phân tích đạt k ết quả tươ ng đối, nhưng thờ i

gian optimize vẫn chưa đủ. Vì đây là hệ thống mớ i đượ c sử dụng lần đầu tiên nên

việc tìm các thông số k ỹ thuật thích hợ p là điều bắt buộc, càng có nhiều thờ i gian thìk ết quả đạt đượ c càng tốt.

VII.2.2. XÂY DỰ NG ĐƯỜ NG CHUẨNMuốn tiến hành xác định nồng độ của chất cần phân tích trong các mẫu phân

tích, yêu cầu tr ướ c tiên là chúng ta phải xây dựng đượ c đườ ng chuẩn.

Hóa chất để xây dựng các dung dịch chuẩn bao gồm:

- Working standard: nồng độ 100 ppb

- Dung dịch MeCN

UCách xây dự ng đườ ng chuẩn:U

- Sử dụng phần mềm máy HPLC tính diện tích các peak MG, LMG, các MG,

LMG chuẩn.






Trang 57

- Xây dựng đườ ng chuẩn tuyến tính giữa tỉ số diện tích MG/MG chuẩn (hoặc

LMG/LMG chuẩn). Sử dụng đườ ng chuẩn thu đượ c tính nồng độ MG (hoặc

LMG) trong mẫu thêm chuẩn.

Dựa vào phươ ng trình cơ bản của phép đo A = K.C và một dãy mẫu chuẩn đầu

(ít nhất là ba mẫu đầu) có nồng độ biết tr ướ c C0, C1, C2, C3 ,C4, C6, C7, C8 ,C9 Saukhi đem phân tích, ta đo diện tích peak của phổ vạch hấ p thụ đượ c A0, A1, A2, A3,

A4B

BA5, A6, A7, A8, A9 để dựng một đườ ng chuẩn A = f(C). Sau đó dựa vào đườ ng

chuẩn này và giá tr ị Ax để xác định nồng độ Cx của chất cần phân tích trong mẫu đo

phổ, r ồi từ đó tính đượ c nồng độ của nó trong mẫu phân tích.

Dựa vào thao tác thêm chuẩn ở trên, ta có dãy chuẩn MG-LMG là: 0, 0.1, 0.5,

01, 02, 05, 10, 20, 50, 100 ppb và đem phân tích trên máy LC-MS/MS ta đượ c:

Nồng độ dãy chuẩn MG Diện tích peak đo đượ c

C0 = 0 ppb A0

C1B

B= 0,1 ppb A1

C2 = 0,5 ppb A2

C3 = 01 ppb AB3B

C4B

B= 02 ppb AB4B

C5 = 05 ppb A5

C6B

B= 10 ppb A6

C7 = 20 ppb A7

C8 = 50 ppb A8

C9B

B= 100 ppb A9






Trang 58

HÌNH 13: MINH HỌA ĐƯỜ NG CHUẨ N

Từ đó, dựa vào đườ ng chuẩn này và giá tr ị A BxB ta tính đượ c nồng độ (C BxB)B Bcủa

chất cần xác định trong mẫu phân tích.

UQui định đảm bảo độ tin cậy của thí nghiệm:U

- S/N ≥ 10.

- Đườ ng chuẩn có R P2P > 0,99.

- Diện tích các dịch mẫu kiểm soát không thay đổi đáng k ể ở các lần tiêm khác

nhau, độ chính xác ≥ 95 %.

UPha chất chuẩn (tươ ng tự cho cả chuẩn MG và chuẩn LMG):U

- Chuẩn có nồng độ 0 ppb:

• 0 µl working standard

• 1000 µl MeCN.

- Chuẩn có nồng độ 0,1 ppb:


• 999 µl MeCN.

- Chuẩn có nồng độ 0,5 ppb:


A

C1

y = ax + b

C2 C3 CB4 C5 C6 C7 Cx C9 C8

A0

A1

A2

A3

A4

A5

A6

A7

AX

A8

A9

C (ppb)

Diện tích peak






Trang 59

• 995 µl MeCN.



• 990 µl MeCN.



• 980 µl MeCN.



• 950 µl MeCN.



• 900 µl MeCN.



• 800 µl MeCN.


• 500 µl working standard• 500 µl MeCN.



• 0 µl MeCN.

Có thể tóm tắt quá trình pha các chuẩn bằng bảng sau:

MG-LMG

)/( mL g η

Thể tích working standard100 mL g /η

( l )

Thể tích của MeCN

( l )

0 0 1000

0,1 1 999






Trang 60

0,5 5 995

1 10 990

2 20 980

5 50 950

10 100 90020 200 800

50 500 500

100 1000 0

UPha dãy chuẩn:U

- Hóa chất để pha dãy chuẩn:

• Pool working standard (MG+LMG): nồng độ 100 ppb• Nướ c cất (DIW)

• Dung dịch MeCN

- Dãy chuẩn đượ c xây dựng là chuẩn Pool (chuẩn tr ộn) bao gồm cả MG và

LMG, có thể tóm tắt quá trình pha dãy chuẩn bằng bảng dướ i đây:

MG-LMG

)/( mL g η

Thể tích

pool

workingstandard

( l )

Thể tích

của

MeCN

( l )

Thể tích

nướ c cất( l )

0 0 500 500

0,1 1 499 500

0,5 5 495 500

1 10 490 500

2 20 480 5005 50 450 500

10 100 400 500

20 200 300 500

50 500 0 500

100 1000 0 0






Trang 61

Sau khi đã pha xong dãy chuẩn, ta tiến hành phân tích dãy chuẩn bằng hệ

thống LC-MS/MS.

- UThí nghiệm:

Phân tích các dung dịch chuẩn bằng LC-MS/MS vớ i pha động bao gồm:

LC solvent A:• 100 ml tác nhân cải biến pha động + 900 ml dung dịch (MeCN:HB2BO)

tỷ lệ (10:90).

LC solvent B:


tỷ lệ (90:10).

Vớ i Gradient pha động thu đượ c từ qúa trình optimize hệ thống.

Trong thí nghiệm này, nhóm nghiên cứu tiến hành 3 thí nghi ệm nhỏ. Mỗi thí

nghiệm sẽ tiến hành phân tích dãy chuẩn đượ c chuẩn bị giống như trên.






Trang 62

UĐườ ng chuẩn 1:U

UĐườ ng chuẩn của MG

Sau khi tiến hành phân tích các dung dịch chuẩn bằng hệ thống LC-MS/MS,

ta có bảng số liệu sau:

NỒNG ĐỘ(ppb)

DIỆN TÍCH PEAK CỦA MG

0 105,3995

0,1 322,4736

0,5 3099,7959

1 3789,2887

2 12749

5 46995

10 178140

20 78953

50 665680

100 166810

BẢNG DIỆN TÍCH PEAK CỦA MG-TN1

ĐƯỜNG CHUẨN CỦA MG

y = 3233,7x + 60741

R2 = 0,2617

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

0 20 40 60 80 100 120

NỒNG ĐỘ

D I Ệ N

T Í C H

P E A K






Trang 63

UĐườ ng chuẩn của LMG

NỒNG ĐỘ(ppb)

DIỆN TÍCH PEAK CỦA lMG

0 49,6171

0,1 28,9331

0,5 74,4237

1 157,0666

2 78,5305

5 350,2963

10 332,7762

20 649,6565

50 2097,8957

100 5813,09

BẢNG DIỆN TÍCH PEAK CỦA LMG-TN1

Qua 2 đườ ng chuẩn vừa xây dựng đượ c, ta thấy cả hai đườ ng chuẩn đều

không bảo đảm đượ c yêu cầu R 2>0,99. Có thể k ết luận thí nghiệm xây dựng đườ ng

chuẩn này không đạt yêu cầu.

ĐƯỜNG CHU

ẨN C

ỦA LMG

y = 55,204x - 77,926

R2 = 0,975

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 20 40 60 80 100 120

NỒNG ĐỘ

D I Ệ N

T Í C H

P R A K






Trang 64

Đườ ng chuẩn 2:

Đườ ng chuẩn của MG

Sau khi tiến hành phân tích các dung dịch chuẩn bằng hệ thống LC-MS/MS,

ta có bảng số liệu sau:

NỒNG ĐỘ(ppb)


0,1 702,8285

0,5 2153

1 1302

2 2179

10 6290

20 9775

50 103900

100 99765

BẢNG DIỆN TÍCH PEAK CỦA MG – TN2

ĐƯỜNG CHUẨN CỦA MG

y = 1165,7x + 1505,4

R2 = 0,8235

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

0 50 100 150NỒNG ĐỘ

D I Ệ N

T Í C H

P E A K






Trang 65

Đườ ng chuẩn của LMG:

NỒNG ĐỘ(ppb)

DIỆN TÍCH PEAK CỦA lMG

0,1 57,8672

0,5 33

1 25

2 56

10 298

20 407

50 333

100 920

BẢNG DIỆN TÍCH PEAK CỦA LMG – TN2

Quan sát hai đườ ng chuẩn xây dựng đượ c trong thí nghiệm 2 ta thấy cả hai

đườ ng chuẩn có R 2 <0,99. Như vậy theo yêu cầu bảo đảm độ tin cậy của thí nghiệm

(R 2>0,99) thì hai đườ ng chuẩn trên không đạt yêu cầu.

ĐƯỜNG CHUẨN CỦA LMGy = 8,0814x + 80,765

R2 = 0,8794

0

200

400

600

800

1000

0 20 40 60 80 100 120NỒNG ĐỘ

D I Ệ N

T Í C H

P E A

K






Trang 66

Đườ ng chuẩn 3:

Sau đây là đườ ng chuẩn tốt nhất mà nhóm nghiên cứu đã xây dựng đượ c:

Đườ ng chuẩn của Malachite Green:

Từ số liệu của quá trình phân tích các dung dịch chuẩn bằng LC-MS/MS. Ta

dùng Excel để vẽ đườ ng chuẩn của MG, (số liệu đượ c trình bày ở phần phụ lục).

NỒNG ĐỘ(ppb)


0 1170,4

0,1 5754,4194

0,5 8776,3037

1 1763,1

2 57,8667

5 7289,5

10 19046

20 27058

50 67256

100 124590

BẢNG DIỆN TÍCH PEAK CỦA CHUẨN MG – TN3

ĐƯỜ NG CHUẨN CỦA MG

y = 1228,8x + 3100,4 R

2 = 0,9931

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

0 50 100 NỒNG ĐỘ

DIỆN TÍCH PEAK






Trang 67

Quan sát đườ ng chuẩn của MG ta nhận thấy đườ ng chuẩn này đã thỏa mãn

yêu cầu về độ tin cậy, R 2 =0,9931. Như vậy ta có phươ ng trình đườ ng chuẩn của

MG là: Y = 1228,8x + 3100,4

Đườ ng chuẩn của Leuco Malachite Green:

Từ số liệu của quá trình phân tích các dung dịch chuẩn bằng LC-MS/MS. Tadùng Excel để vẽ đườ ng chuẩn của LMG, (số liệu đượ c trình bày ở phần phụ lục).

BẢNG DIỆN TÍCH PEAK CỦA LMG – TN3

NỒNG ĐỘ (ppb)

DIỆN TÍCH PEAK CỦA LMG(count)

0 0

0,1 8,2666

0,5 12,3999

1 20,665

2 28,9337

5 119,9042

10 10,333

20 593,2759

50 1648,5

100 3071,3

ppb

ĐƯỜNG CHUẨN CỦA LMG

y = 0,0315x + 1,5125

R2 = 0,9905

0

20

40

60

80

100

120

0 1.000 2.000 3.000 4.000 DIỆN TÍCH PEAK

NỒNG ĐỘ






Trang 68

Quan sát đườ ng chuẩn của LMG ta thấy đườ ng chuẩn này cũng thỏa mãn yêu

cầu R 2 > 0,99 (R 2 = 0,9905). Vậy phươ ng trình đườ ng chuẩn của LMG là:

Y = 0,0315x + 1,5125

Một số chú ý mà sinh viên làm đề tài rút ra đượ c trong quá trình xây dự ngđườ ng chuẩn:

- Các dụng cụ đượ c sử dụng trong quá trình pha các dung dịch chuẩn phải

đượ c r ửa sạch, ngâm HCl và tráng lại bằng nướ c cất. Nếu dụng cụ bẩn sẽ ảnh

hưở ng r ất lớ n đến độ sai số của đườ ng chuẩn.

- Hóa chất phải thật sự tinh khiết.

- Tiến trình pha chất chuẩn đến phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS phải đượ c

tiến hành liên tục tránh qúa trình thoái hóa chuẩn.- Cần chú ý đến việc thay đầu hút pipet sau mỗi lần hút dung dịch chuẩn vì

nồng độ của các chuẩn là khác nhau.

- Nếu điều kiện không cho phép, phải bảo quản chuẩn trong tủ lạnh ở nhiệt độ

thích hợ p.

- Thao tác phải chinh xác.

Các yếu tố ảnh hưở ng đến chất lượ ng của đườ ng chuẩn:

- Dụng cụ không đượ c r ửa sạch hoàn toàn, dẫn đến các dung dịch chuẩn bị

nhiễm tạ p chất.

- Trong quá trình hút hóa chất, sinh viên thực tậ p không đổi đầu hút pipet, làm

nồng độ của các dung dịch chuẩn bị sai lệch.

- Tiến trình pha dung dịch chuẩn để tiến hành phân tích bằng LC-MS/MS bị

gián đoạn do hệ thống hoạt động không ổn định, làm cho đườ ng chuẩn bị

thoái biến.

Thảo luận k ết quả:

- Đườ ng chuẩn tốt nhất mà nhóm nghiên cứu xây dựng đượ c có độ lệch chuẩn

tươ ng đối (R 2 = 0,9931 đối vớ i đườ ng chuẩn của MG và R 2 = 0,9905 đối vớ i

đườ ng chuẩn của LMG), như vậy so vớ i điều kiện bảo đảm tính an toàn của






Trang 69

thí nghiệm (R 2 > 0,99) thì hai đườ ng chuẩn này đạt tiêu chuẩn nhưng so vớ i

đườ ng chuẩn của phươ ng pháp do AOAC xây dựng thì chưa đạt (R 2 > 0,999).

- Bên cạnh đó, dựa vào đườ ng chuẩn xây dựng đượ c ta đưa ra k ết luận sau:

giớ i hạn phát hiện của trang thiết bị mà phòng thí nghiệm Sắc ký đang sử

dụng có độ nhạy r ất cao (LOD = 0,1 ppb).- Cần phải để cho hệ thống hoạt động ổn định hơ n nữa thì k ết quả phân tích

mớ i đượ c đảm bảo.

- Phổ LC-MS/MS của đườ ng chuẩn tốt nhất đượ c trình bày ở phần phụ lục,

những phổ này có độ nhạy khá cao và cho peak đẹ p. Đây là một biểu hiện tốt,

nó mang lại hy vọng có thể nâng cao chất lượ ng của phươ ng pháp phân tích

đẫn đến có thể xây dựng đượ c phươ ng pháp phân tích hiệu quả.

- Đườ ng chuẩn này sẽ đượ c sử dụng để tính hiệu suất thu hồi ở thí nghiệm tiế p

theo.

VII.2.3. THÊM CHUẨN ĐỂ TÍNH HIỆU SUẤT THU HỒI

a) Chuẩ n b ị mẫ u: Cá basa đượ c chuẩn bị theo phươ ng pháp AOAC 937,07 (11), đượ c giữ lạnh

và gửi tớ i phòng thí nghiệm. Mẫu đượ c lột da, làm tan, mô cơ đượ c tr ộn cho đến khiđồng nhất bằng máy gia công thức ăn. Mẫu đượ c bảo quản ở nhiệt độ -20ºC cho đến

khi phân tích.

b) Quá trình chi ế t:

- Cân chính xác 4 g mẫu đồng nhất cho vào ống ly tâm nhựa có thể tích 50 ml.

- Thêm vào 16 ml HCLOB4B/MeCN và làm đồng nhất hỗn hợ p trong ống bằng

máy tr ộn.

- Pha loãng đến vạch 25 ml bằng CHB2BClB2B và tr ộn trong ống quay 10 phút.

- Ly tâm ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 10 phút.

- Chuyển phần thể tích 10 ml của lớ p trên vào ống thủy tinh và làm bay hơ i

đến 2 ml bằng cách thổi khí N B2B ở nhiệt độ dướ i 45ºC.

- Đưa phần dịch chiết thu đượ c sau quá trình cô đặc qua 1 cột SPE đã đượ c làm

ẩm vớ i 2 ml MeCN và thu phần nướ c tháo vào ống.






Trang 70

- R ửa ống 2 lần vớ i 2 ml MeCN và cho qua cột, hòa lẫn vào dung môi r ửa giải.

- Tốc độ dòng qua cột từ 2 đến 5 ml/phút.

- Làm bay hơ i hỗn hợ p dung môi đến khô bằng cách thổi khí N B2B (t < 45ºC).

- Hòa tan cặn trong 500 l MeCN và tr ộn trong máy tr ộn xoáy.

- Pha loãng dung dịch chiết vớ i 500 l nướ c cất, tr ộn và lọc qua 1 syringe có

đườ ng kính lỗ 0,2 m , lọc tr ướ c khi phân tích.

Tóm t ắt quy trình chi ế t tách mẫ u

Chuẩn làm việc MG - LMG 100 mL g /η đượ c pha là chuẩn tr ộn bao gồm MG

nồng độ 100 mL g /η và LMG nồng độ 100 mL g /η .

c) Spike chuẩ n

Cân 4 g mẫu cá đã nghiền đồng nhất

Đo LC-MS/MS

-Làm khô bằng khí N2 ở nhiệt độ dướ i 45P

0PC

-Thêm 500 l MeCN, lắc xoáy-Thêm 500 l nướ c cất

-Tr ộn xoáy trong 10 phút-Ly tâm 1500 rpm trong 10 phút

-Làm khô bằng khí N2 -Nhiệt độ dướ i 45P

0PC

-Dung dịch còn dướ i 2ml

-Thêm 2 ml MeCN-Chuyển qua cột SPE-Tiế p tục thêm 2 ml MeCN qua cột-R ửa cột bằng 1 ml MeCN

ống nghiệm ly tâm 50 ml -16 ml HCLOB4B/MeCN-09 ml CHB2BClB2B

Chuyển 10 ml dung dịch nổi phía trên

ống nghiệm nhỏ

Tr ộn xoáy, lọc qua syringe có đườ ng kính lỗ 0,2 m






Trang 71

Mẫu sau khi làm nhuyễn, sẽ đượ c spike chuẩn (thêm chuẩn vào) tr ướ c khi

tách chiết để phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS. Thao tác thêm chuẩn vào mẫu

phân tích nhằm hai mục đích:

- Để phân tích dư lượ ng MG và LMG theo phươ ng pháp thêm chuẩn.

- Tính hiệu suất thu hồi để đánh giá phươ ng pháp đượ c xây dựng.

Spike chuẩn vào các mẫu theo bảng dướ i đây:

MẫuKhối lượ ng

(g)

Nồng độ chuẩn

spike( mL g /η )

Thể tích chuẩn

( l )

1 4,01 0,5 500

2 3,99 1 500

3 4,00 2 500

4 3,98 5 500

5 3,99 10 500

6 4,00 20 500

7 4,02 50 500

8 4,01 100 500

d)Tính toán hi ệu suấ t thu hồiTrong thí nghiệm tiêm chuẩn để tính hiệu suất thu hồi, nhóm nghiên cứu đã

tiến hành hai thí nghiệm nhỏ, mỗi thí nghiệm sẽ tính hiệu suất thu hồi của 8 mẫu

đượ c thêm chuẩn Pool (MG+LMG) vớ i các nồng độ đượ c nêu ở trên.

Thí nghiệm 1:

Ta có bảng sau (số liệu tính toán lấy từ phần Phụ lục)

NỒNG ĐỘ

BAN ĐẦU(ppb)

NỒNG ĐỘ THU

HỒI CỦA MG(ppb)

HIỆU

SUẤTTHUHỒI CỦAMG (%)

NỒNG ĐỘ THU

HỒI CỦA LMG(ppb)

HIỆU SUẤT THU HỒICỦA LMG (%)

0,5 Không phát hiện Không phát hiện

1 0,235 23,5 1,76 176

2 Không phát hiện 2,018 100,9

5 Không phát hiện 3,465 69,31






Trang 72

10 0,203 2,03 3,206 32,06

20 2,436 12,18 7,502 37,51

50 9,192 18,383 54,25 108,5

100 17,938 17,938 40,72 40,72


Qua bảng hiệu suất thu hồi trên ta rút ra các k ết luận sau:

- K ỹ thuật tách chiết còn hạn chế, thao tác không chính xác dẫn đến không phát

hiện chất chuẩn ở nồng độ 0,5 ppb.

- Giớ i hạn phát hiện của hệ thống phân tích đối vớ i các mẫu phân tích là 1 ppb,

giớ i hạn này là tươ ng đối cao, nhưng so vớ i giớ i hạn về hàm lượ ng của MG

trong thực phẩm của Canada (0,5 ppb) thì chưa đạt.

- Trong các mẫu thêm chuẩn có sự biến đổi từ MG sang LMG. Ở các mẫu

thêm chuẩn vớ i nồng độ 2ppb, 5 ppb và 50 ppb ta thấy hiệu suất thu hồi của

LMG r ất lớ n, vượ t khỏi 100%. Điều này có thể giải thích dựa vào sự chuyển

hóa từ MG sang LMG, xảy ra khi dung dịch chuẩn để quá lâu (quá trình phân

tích bị gián đoạn).- Tuy nhiên, phổ LC-MS/MS của các mẫu thêm chuẩn để tính hiệu suất thu hồi

có độ nhạy khá cao. Hạn chế của quá trình một phần là do hệ thống phân tích

hoạt động không ổn định, đây cũng là điều dễ hiểu, chúng ta chưa thể làm

chủ hoàn toàn hệ thống phân tích hiện đại nhất thế giớ i này. Tuy nhiên, hạn

chế này hoàn toàn có thể khắc phục đượ c, hy vọng trong khoảng thờ i gian

không xa hệ thống phân tích sẽ hoạt động ổn định và phát huy tối đa khả

năng phân tích của nó.






Trang 73

Thí nghiệm 2:

Thí nghiệm này cũng tiến hành tiêm chuẩn, chiết tách mẫu và tính hiệu suất

thu hồi đối vớ i 8 mẫu tr ắng. Quá trình chuẩn bị mẫu, chiết tách đượ c tiến hành giống

như thí nghiệm 1.

Spike chuẩn vào các mẫu theo bảng dướ i đây:

MẫuKhối lượ ng

(g)

Nồng độ chuẩn

spike( mL g /η )

Thể tích chuẩn

( l )

1 3,98 0,5 500

2 4,00 1 500

3 4,00 2 500

4 4,00 5 500

5 4,03 10 500

6 4,02 20 500

7 3,98 50 500

8 4,01 100 500

Ta có bảng tính hiệu suất thu hồi sau:

NỒNG ĐỘ BAN ĐẦU

(ppb)

NỒNG ĐỘ THUHỒI CỦA MG

(ppb)

HIỆUSUẤTTHU

HỒI CỦAMG (%)

NỒNG ĐỘ THUHỒI CỦA LMG

(ppb)

HIỆU SUẤT THU HỒI

CỦA LMG (%)

0,5 Không phát hiện Không phát hiện

1 0,287 28,7 0,21 21

2 0,432 21,6 0,743 37,15

5 1,336 26,72 1,784 35,68

10 0,225 22,5 2,698 26,98

20 3,951 19,755 4,564 22,82

50 11,236 22,472 10,669 21,338

100 30,584 30,584 21,369 21,369







Trang 74

Chuẩn có nồng độ 0,5 ppb vẫn không thể tách chiết thành công, nên không

thể tính hiệu suất thu hồi. Có thể do nồng độ quá nhỏ nên sinh viên thực tậ p chưa đủ

trình độ để tách chiết thành công chuẩn này.

Chuẩn có nồng độ 1 ppb đượ c chiết tách thành công nhưng hiệu suất thu hồi

quá thấ p, không đáp ứng đượ c yêu cầu của AOAC (hiệu suất thu hồi phải từ 70% tr ở

lên).

Hiệu suất thu hồi của các chuẩn còn lại vẫn thấ p, hạn chế này có thể do nhiều

nguyên nhân. Nhưng nguyên nhân cốt lõi vẫn là hệ thống phân tích hoạt động không

ổn định, cột LC quá tải do sử dụng phân tích quá nhiều chất và chạy quá nhiều

Gradient pha động. Bên cạnh đó, quá trình phân tích bị gián đoạn cũng ảnh hưở ng

không nhỏ đến hiệu suất thu hồi. Cần lậ p lại thí nghiệm nhiều lần hơ n nữa mớ i cóthể tìm ra những biện phá p nâng cao hiệu suất thu hồi.

VII.2.4. THỰ C TẬP TÁCH CHIẾT MẪU

Ngoài ra, sinh viên thực tậ p đã tiến hành chiết mẫu (20 mẫu, khối lượ ng

mỗi mẫu là 9 g, dùng để tiến hành 2 thí nghiệm tính hiệu suất thu hồi) theo phươ ng

pháp “Xác định dư lượ ng Malachite green và Leucomalachite green bằng sắc ký

lỏng (LC) vớ i sự oxi hóa Leucomalachite green bằng than hoạt tính” (Phươ ng phápIII, Luận văn của sinh viên Tr ần Thị Kim Giang, Cử Nhân Hóa khóa 28) (3).

- Nguyên tắc

MG và LMG đượ c ly trích khỏi sản phẩm thủy sản bằng dung dịch

acetonitrile. Dịch chiết sau đó đượ c thổi đến khô còn 0.5 ml ở 60°C (sử dụng khí

nitrogen). Định mức dịch chiết còn lại tớ i 2 ml bằng pha động (ở đây là

MeCN/H2O). Tiến hành oxi hóa dung dịch đó vớ i than hoạt tính. Cuối cùng, dung

dịch đượ c lọc qua đầu lọc 0,2 μm và đem phân tích.

- Quy trình phân tích

• Chuẩn bị than hoạt tính






Trang 75

Cân chính xác 1 g bột than mịn vào ống nghiệm ly tâm bằng nhựa có nắ p đậy

50 ml. Thêm vào ống nghiệm 40 ml acid nitrite 5M, r ồi lắc mạnh bằng máy vortex

khoảng 1 phút. Sau đó ly tâm 2000 vòng/phút (rpm) khoảng 5 phút, r ồi bỏ lớ p dung

dịch trong. Phần cặn còn lại đượ c r ửa 2 lần, lần lượ t vớ i 40 ml nướ c cất và 40 ml

dung dịch pha động bằng cách hòa tan phần cặn r ồi lắc mạnh, đem ly tâm 1500vòng/phút khoảng 5 phút. Sau đó bỏ lớ p dung dịch trong.

Cuối cùng hòa tan phần cặn còn lại vớ i 20 ml pha động, lắc mạnh. Những

chú ý khi chuẩn bị dung dịch than hoạt tính:

Khối lượ ng than hoạt tính phải đượ c cân một cách chính xác.

Dung dịch than hoạt tính này đượ c dùng ngay lậ p tức.

• Chuẫn bị mẫu:

Mẫu sử dụng giống như mẫu dùng trong phươ ng pháp chuẩn hóa quy trình

phân tích dư lượ ng MG và LMG cho phòng thí nghiệm Sắc ký, Bộ môn Dinh

Dưỡ ng, Khoa Thủy Sản.

Trong quá trình cân mẫu, cần phải chú ý những điểm sau:

Phải để mẫu rã đông hoàn toàn tr ướ c khi cân.

Phải lau lại dụng cụ lấy mẫu sau mỗi lần cân.

• Spike chuẩn:

Tr ướ c khi chiết tách, mẫu đượ c thêm chuẩn ở các nồng độ 0,1 ppb; 0,5 ppb;

01 ppb; 02 ppb; 05 ppb; 10 ppb; 20 ppb; 50 ppb; 100 ppb. Sau đó, tiến hành ly chiết

theo sơ đồ tách chiết dướ i đây:






Trang 76

Một số kinh nghiệm mà sinh viên thự c tập đã rút ra đượ c:

- Các dụng cụ liên quan đến quá trình chiết tách phải tuyệt đối sạch sẽ, r ửa

nướ c cất và sấy khô ở nhiệt độ vừa phải tr ướ c khi sử dụng.- Dụng cụ thổi khí Nitơ phải đượ c r ửa bằng nướ c cất tr ướ c khi sử dụng, tránh

tình tr ạng mẫu phân tích bị nhiễm tạ p chất.

- Tốc độ thổi khí vừa phải, tránh tình tr ạng thổi khí quá mạnh làm văng dung

dịch mẫu ra ngoài.

- Mẫu sau khi chiết tách xong thì đem phân tích ngay là tốt nhất.

- lắc mạnh 30 giây- l tâm 2000 r m tron 5 hút

xác thịt lấy 15 ml dịch trong ở trên chovào ống nghiệm thủy tinh có chia vạch

cho vào dung dịch 100 μldung dịch than đã xử lý

Đo LC-MS/MS

bỏ

định mức dung dịch còn lạitớ i 2 ml bằng pha động

thổi khô còn 0.5 ml ở 60P

oPC

(sử dụng khí nitrogen)

hút 25 l dung dịch trongcho qua đầu lọc 0.2 μm

ống nghiệml tâm 50 ml

Cân 9 g cá đã nghiền đồng nhất

Hỗn hợ p tách 2 lớ p

- lắc mạnh trong tối (3h, 60 rpm)- ly tâm 32000 rpm trong 5 phút

- 2 ml dichloromethan- 16 ml acetonitrile

- 1 ml perchloric acid 0.4M






Trang 77

- Nếu điều kiện không cho phép thì phải bảo quản trong tủ lạnh, thờ i gian bảo

quản không quá 2 tuần.

Do thờ i gian không cho phép, bên cạnh đó, thiết bị còn đượ c sử dụng để thực

hiện đề tài của sinh viên khác nên mặc dù đã chiết mẫu xong nhưng sinh viên thực

tậ p không thể tiến hành chạy sắc ký để xác định hiệu suất thu hồi của các mẫu thêmchuẩn. Do đó, việc ly trích này chỉ nhằm mục đích để cho sinh viên thực tậ p thành

thạo hơ n vớ i những thao tác chiết tách mẫu.


Quá trình chiết tươ ng đối tốt, ít xảy ra sai xót. Tuy nhiên do không thể tiến

hành phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS nên không thể đánh giá cụ thể. Theo dự

đoán của sinh viên thực tậ p, dù quá trình chiết tách tốt nhưng hiệu suất thu hồi của

thí nghiệm này vẫn không cao. Nguyên nhân là do phươ ng pháp này đã đượ c thực

hiện tr ướ c đó và cho hiệu suất trung bình quá thấ p: 1,522 % đối vớ i MG và không

tính đượ c hiệu suất thu hồi đối vớ i LMG. Phươ ng pháp này cần phải nghiên cứu

thêm.





K Ế T LU Ậ N-KI Ế N NGH Ị

Trang 78

CHƯƠ NG VIII. K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ MG và LMG đượ c tách ra khỏi nhau một cách dễ dàng và đượ c r ửa giải hoàn

toàn vớ i Cột Higgingn Analytical, Iic-USA Clipews C18 5 m (150 cm * 2,1 mm)

trong thờ i gian dướ i 25 phút, vớ i tốc độ dòng là 0,25 ml/phút. Đườ ng chuẩn đượ c

nối giữa các điểm có nồng độ từ 0,1 ppb đến 100 ppb. Hệ số tươ ng quan của đườ ng

chuẩn lớ n hơ n 0,99 và tỷ lệ của chất phân tích so vớ i nền lớ n hơ n 10. Sự bảo quản

đườ ng chuẩn gặ p r ất nhiều khó khăn, chuẩn làm việc bị thoái biến r ất nhanh, một số

nồng độ có sự chuyển hóa từ MG sang LMG nên ảnh hưở ng đến tính chính xác của

đườ ng chuẩn. Đườ ng chuẩn đượ c xây dựng bằng chuẩn tr ộn (bao gồm cả MG và

LMG) nên sự chuyển hóa này càng ảnh hưở ng đến đườ ng chuẩn. Bên cạnh đó, trang

thiết bị hoạt động không ổn định, đượ c sử dụng để phân tích nhiều loại thuốc khángsinh cùng một lúc đã làm gián đoạn tiến trình phân tích nên việc thoái hóa đườ ng

chuẩn là không thể tránh khỏi.

Giớ i hạn phát hiện của cả MG và LMG trong chuẩn nền tr ắng dựa trên thờ i

gian lưu của hợ p chất là 0,1 ng/g (thiết bị có thể phát hiện đượ c mẫu chuẩn có nồng

độ 0,1 ppb), điều này chứng tỏ hệ thống phân tích LC-MS/MS đượ c sử dụng là r ất

nhạy và có giớ i hạn phát hiện không thua kém giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp

tham chiếu. Giớ i hạn định lượ ng là 1 ng/g cho các mẫu thêm chuẩn để tính độ thuhồi. Hạn chế này có thể không phải tại hệ thống phân tích mà do hạn chế về k ỹ thuật

tách chiết của sinh viên thực tậ p hoặc mẫu tiêm chuẩn bị thoái hóa, vì vậy hạn chế

này là hoàn toàn có thể khắc phục. Tuy nhiên, những số liệu này thấ p hơ n so vớ i k ết

quả của hầu hết các phươ ng pháp sử dụng detector LC-Vis để phát hiện MG và

LMG. Sử dụng hệ thống phát hiện LC/MS cho giớ i hạn phát hiện trong khoảng 0,2

đến 0,7 ng/g đối vớ i mẫu tr ắng.

Những mẫu thêm chuẩn để tính độ thu hồi cho k ết quả không như ý muốn, có

thể nói là chưa đạt. Một số nồng độ không thể phát hiện sự có mặt của MG, bên

cạnh đó độ thu hồi của LMG lại vượ t quá 100% cho thấy đã có sự chuyển đổi từ

MG sang LMG trong các mẫu thêm chuẩn (mẫu thêm 1ppb, 2ppb và 50 ppb).





K Ế T LU Ậ N-KI Ế N NGH Ị

Trang 79

Trong phần thực nghiệm, do thờ i gian và hoạt động không ổn định của trang

thiết bị nên chúng tôi không thể lậ p lại số lần thí nghiệm như mong muốn (5 lần).

Như vậy, trong đề tài này nhóm làm luận văn chỉ mớ i hoàn tất xong giai đoạn kiểm

tra phươ ng pháp (kiểm tra về giớ i hạn phát hiện của trang thiết bị là chủ yếu). Việc

chuẩn hóa phươ ng pháp phân tích MG và LMG phù hợ p vớ i phòng thí nghiệm Sắcký, Bộ môn Dinh Dưỡ ng và Chế biến Thủy Sản, Khoa Thủy Sản đòi hỏi nhóm

nghiên cứu phải lặ p lại nhiều lần thí nghiệm để có thể tìm đượ c một phươ ng pháp

đáp ứng đượ c yêu cầu đã đặt ra.

Có thể nói nhóm nghiên cứu đã đi đúng hướ ng, vấn đề còn lại chỉ là thờ i

gian, và nếu có điều kiện về kinh tế, nếu có thể có riêng cột LC và khoảng thờ i gian

dành riêng cho việc chuẩn hóa phươ ng pháp phân tích dư lượ ng MG và LMG để

tránh tình tr ạng tiến trình thí nghiệm bị gián đoạn, dẫn đến đườ ng chuẩn bị thoái hóa

hoặc cột LC hoạt động không ổn định vì phải r ửa giải quá nhiều chất và chạy quá

nhiều chươ ng trình gradient pha động thì chúng tôi tin r ằng việc tìm ra phuơ ng pháp

phân tích như mong đợ i là hoàn toàn có thể.





TÀI LI Ệ U THAM KH Ả O

Trang 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO

(1). ThS. Nguyễ n Thị Diệ p Chi. Bộ môn Hóa – Khoa Khoa Học - Tr ườ ng Đại Học

Cần Thơ , năm 2005.

Bài giảng CÁC PHƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ

(2). TS. Lê Thanh Phướ c. Bộ môn Hóa – Khoa Khoa Học - Tr ườ ng Đại Học Cần

Thơ , năm 2005.

Bài giảng Ứ NG DỤ NG MỘT SỐ PHƯƠ NG PHÁP PHỔ NGHIÊN CỨ U CẤU

TRÚC PHÂN TỬ

(3). Sinh viên Tr ần Thị Kim Giang , Cử Nhân Hóa K28.

Đề tài “XÁC ĐỊ NH DƯ LƯỢ NG MALACHITE GREEN TRONG THỦY

SẢ N BẰ NG SẮC KÝ LỎ NG CAO ÁP GHÉP KHỐI PHỔ”

(4). www.baocantho.com.vn/vietnam/giaoduc/37008/ - 74k

(5). www.fistenet.gov.vn/Vietnamese/ KS_Duluong/2006/Kqksdl1-2006.htm - 58k

(6). www.soctrang.gov.vn/soctrang/ html/tintuc-detail1.asp?tn=tn&id=1166144

Xuất khẩu thủy sản: Lo đầu ra, quên đầu vào

(7). www.vienkinhte.hochiminhcity.gov.vn/xemtin.asp?idcha=2806&cap=3&i

Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam – Thực tr ạng và thách thức

(8). www.restek.com/aoi_fff_A003.asp - 29k

Malachite green ADN leucomalachite green COM statement COM/99/S1 (for COT) -

February 1999

(9). www.vietlinh.com.vn/dbase/VLTECHShowContent.asp?ID=80

Hiểm họa Malachite green

(10). HTen.wikipedia.org/wiki/Malachite_greenTH

(11). www.malachitegreen.tidalswan.com/






Trang 81

(12). HTCulp SJ TH. HTwww.ncbi.nlm.nih.govTH

“NTP technical report on the toxicity of malachite green choride ADN leuco

malachite green (CAS Nos. 569-64-2 ADN 129-73-7) administered in feed to

F334/N rats ADN B6C3F1 mice”

(13). en.wikiprdia.org/wiki/AOAC system(14). Phạm Hùng Việt, Nguyễ n Xuân Dũng , NXB KHKT Hà Nội, 1998

CÁC PHƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ

(15). en.wikipedia.org/wiki/Mass_spectrometer

(16). www.masspec.scripps.edu/MSHistory/mshisto.php

(17). www.spectroscopymag.com/spectroscopy

(18). HTwww.ietltd.com/inventoryTH

(19). www.pesciex.com

(20). Peter Scherpenisse ADN Aldert A. Bergwerff

“Determination of residuses of malachite green in finfish by liquid

chromatography tADNem mass spectrometry”

Analytica Chimica Acta, Volume 529, Issuse 1-2, 24 January 2005, page 173-

177. Department of Public Heath ADN Food Safety, Faculty of Veterinary

Medicine, Utrecht University, P.O. Box 80175, NL-3508 TD Utrecht, The

NetherlADNs.

(21). Luis Valle, Cecilia Diaz, Antonio L. Zanocco ADN Pablo Richter.

“Determination of the sum of malachite green in salmon muscle by liquid

chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry”

Journal of Chromatograph A, Volume 1057, Issues 1-2, 4 March 2005,

Pages 101-105, Mass Spectrometry: Innovation ADN Application , Part IV.

(22). Aldert A. Bergwerff ADN Peter Scherpenisse

“Determination of residues of malachite green in aquatic animals”

Journal of Chromatography B, Volume 788, Issues 2, 25 May 2003, Pages

351-359, Department of Public Health ADN Food Safety Faculty of Vererinary

Medicine, Utrecht University, P.O. Box 80.175, NL-3508 tD, Utrecht, The

NetherlADNs.






Trang 82

(23). Jeffrey M. VADNe Riet, Cory J. Murphy, Johanna N. Pearce, Ross A. Potter và

B. Garth Burns

“Determination of malachite green ADN Leucomalachite Green in a Variety of

Aquacultured Products by Liquid Chromatography with TADNem Mass

Spectrometry Detection”DRUGS, COSMETICS, FORENSIC SCIENCES, Canadian Food

Inspection Agency, Dartmouth Laboratory, PO Box 1060, Dartmouth.





PH Ụ LỤ C

PHẦN PHỤ LỤC

PHỔ LC-MS/MS CỦA ĐƯỜ NG CHUẨ N

PHỔ LC-MS/MS CỦA MẪU THÊM CHUẨ N TÍNH HIỆU SUẤT THU HỒI


CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN...

Documents

Transcript of CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MALACHITE GREEN VÀ LEUCO MALACHITE GREEN...