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Hépatite C Virus & Marqueurs
Stéphane Chevaliez
Centre Na)onal de Référence des Hépa)tes Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955 Hôpital Henri Mondor
Université Paris-‐Est Créteil
• Découvert par Houghton en 1989
• 1ère cause d’hépa)te chronique et de cirrhose en
Europe et en Amérique du Nord
• 1ère indica)on de transplanta)on hépa)que dans les
pays industrialisés
Afdhal, NH. 2004; Sem Liv Dis, 24(Supp 2): 3-‐8
Hépatite C : virus et marqueurs
Virus de l’Hépatite C
Virus de l’Hépatite C
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
Phylogénie de la région codant la protéine NS5B
Hépatite C : virus et marqueurs
Adapted from Simmonds et al., 1999; 2001.
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
• Hôte naturel : Homme
• Tropisme : Hépatocyte
Virus de l’Hépatite C Hépatite C : virus et marqueurs
Organisation Structurale Hépatite C : virus et marqueurs
Organisation Génomique des Flaviviridae
Hépatite C : virus et marqueurs
0 1800 3600 5400 7200 9000 10800
C 4A
p7
NS5B NS5A NS4B NS3 NS2 E2 E1 5’UTR 3’UTR
Hepa//s C virus
Npro
C E1 E2 E0 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B 4A
p7 5’UTR 3’UTR
Pes/virus
C prM
E NS1 2A 2B NS3 NS5 NS4A 4B Cap 5’UTR 3’UTR
Yellow fever virus
Organisation Génomique Hépatite C : virus et marqueurs
Popescu and Dubuisson, Bio. Cell 2010, 102(1): 63-‐74.
Protéines structurales Protéines non structurales
Hépatite C : virus et marqueurs
Bartenschlager et al, Trends Microbiol, in press.
Organisation Génomique
IRES et Traduction Hépatite C : virus et marqueurs
From Department of Structural Biology, Stanford University Medical School, USA.
Réseaux d’Interactions Hépatite C : virus et marqueurs
Park et al, BMC BioinformaTcs 2010, 11(Suppl 1): S23.
Protéine de Capside Hépatite C : virus et marqueurs
Boulant et al, J Virol 2005, 79(17): 11353-‐11365.
Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-‐27.
VHC G1b
Capside et Lipides Hépatite C : virus et marqueurs
Bartenschalger et al., Tends Microbiol, in press.
Interaction entre la Capside et DGAT-1
Hépatite C : virus et marqueurs
Herker et al., Nat Med 2010, 16(11): 1295-‐1298.
*Diacylglycérol diacyltransférase-1
Glycoprotéine E2 Hépatite C : virus et marqueurs
• Hétérodimère avec E1 • Régions hypervariables
– HVR1 – HVR2 – igVR
• Rôles – HVR2 et igVR indispensables au “folding“ E1-E2 – Étapes précoces (interaction avec CD81, peptide de fusion)
Krey et al., PLoS Pathog. 2010, 6(2): e1000762; McCaffrey et al., J Gen Virol 2011, 92: 112-‐121.
Étape Précoce : Entrée du VHC
Popescu et al., Bio Cell 2010, 102: 63-‐74.
Hépatite C : virus et marqueurs
HVR1
Région HVR1 (27 amino-acides) Ø 80% de divergence nucléotidique entre génotypes Ø Epitope majeur de neutralisation
Timm et al., World J Gastroenterol 2007; 13(36)4808-‐4817.
Hépatite C : virus et marqueurs
Transmission du VHC Hépatite C : virus et marqueurs
6a_33 2b_JFH1 Patient 1 (7/04)
5a_SA13 1b_HVR3812
S5 (7/05) Patient 3 (7/05) Patient 3 (9/05) Patient 2 (7/04) Patient 2 (9/04) Patient 3 (7/04) S4 (6/05) S3 (6/05) S2 (6/05) Patient 3 (01/05) S1 (6/05)
1a_HCT27X5 2a_Q2B
3a_CB 1a_HCT18X5
Patient 6 1b_AWV2C33
Patient 8 Patient 4
Patient 7 4a_ED43
0.2
100
Surfaces inertes
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-‐633.
Patients VHC chroniques Séroconversion VHC
Analyse Phylogénique
Région HVR1 (81 nt) CLUSTALX DNADist (PHYLIP 3.5) Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2) Neighbor-Joining Bootstraping : 1000 replicates NJPlot
Hépatite C : virus et marqueurs
Protéine p7 Hépatite C : virus et marqueurs
• Viroporine dont la structure 3D a été
récemment déterminée par
ME
• Rôle(s) in vivo ?
• Cible thérapeu)que poten)elle
Luik et al., Proc Natl Acad Sci 2009, 4;106(31): 12712-‐6; Griffin S, Proc Natl Acad Sci 2009, 106(31): 12567-‐68.
Activité Antivirale du BIT225 Hépatite C : virus et marqueurs
• IC50 de 314 nM dans le modèle du BVDV
• Ac)vité synergique
Luscombe et al., AnTviral Res 2010 May;86(2):144-‐53.
Protéine NS2 Hépatite C : virus et marqueurs
• NS2 (région N-‐ter) – Rôle dans l’organisaTon de
la formaTon des
nucléocapsides
• NS2pro (région C-‐ter)
Jirasko et al., PLoS pathog 2010 Dec 16;6(12): e1001233; Ivo et al., Nature 2006, 442: 831-‐835.
Protéine NS3-4A Hépatite C : virus et marqueurs
Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-‐731.
Inhibition de la Production d’IFN par NS3
Hépatite C : Nouvelles Hepatite C : virus et marqueurs
Protéase NS3 Hépatite C : virus et marqueurs
Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-‐731.
Etudes de Phase III Présentées à l’AASLD™ 2010
• SPRINT-‐2 • RESPOND-‐2
• ADVANCE • ILLUMINATE • REALIZE
BOCEPREVIR (BOC)
TELAPREVIR (TVR)
Hépatite C : virus et marqueurs
SPRINT-2—BOC + PegIFN + RBV chez des Patients Naïfs de Génotype 1 : Design de l’Etude
Suivi PR Lead-‐in PR + placebo
Suivi PR Lead-‐in PR + boceprevir
48 PR n = 363
S4 S28 S48 S72
Suivi
Suivi S24
PR Lead-‐in PR + boceprevir
P/R + placebo
ARN-‐VHC indétectable à S8-‐24
ARN-‐VHC détectable à S8-‐24 BOC/TGR n = 368
BOC/PR48 n = 366
*BOC 800 mg q8h; pegIFN alfa-‐2b 1,5 µg/kg/s; RBV 600-‐1400 mg/j adaptée au poids.
Hépatite C : virus et marqueurs
Poordad F, et al. N Engl J Med. 2011;364:1195-1206.
SPRINT-2—BOC + PegIFN + RBV chez des Patients Naïfs de Génotype 1 : Caractéristiques des Patients
Cohorte 1 (caucasiens) [n=938]
PR48 n=311
BOC/RGT n=316
BOC/PR48 n=311
Sexe masculin [n(%)] 171 (55) 198 (63) 187 (60)
Age (années) [moyenne] 48 49 49
IMC (kg/m2) [moyenne (±DS)] 27 (±5) 28 (±5) 27 (±5)
ARN du VHC >400,000 UI/mL [n(%)] 286 (92) 287 (91) 289 (93)
Type/sous-type du VHC [n(%)]*
1a 186 (60) 196 (62) 196 (63)
1b 112 (36) 110 (35) 102 (33)
Fibrose sévère/Cirrhose (METAVIR F3/F4) [n(%)]
22 (7) 25 (8) 37 (12)
*La déterminaTon du type et du sous-‐type a été réalisée par séquençage d’une porTon de la région NS5B codant l’ARNpol (méthode de référence)
Hépatite C : virus et marqueurs
Poordad F, et al. N Engl J Med. 2011;364:1195-1206.
SPRINT-2—BOC + PegIFN + RBV chez des Patients Naïfs de Génotype 1 : RVS et Taux de Rechute
Prop
or)o
n de
pa)
ents (%
)
p <0,0001
p <0,0001
Taux de rechute Taux de RVS
Hépatite C : virus et marqueurs
125/311 37/311 213/311 21/232 211/316 18/230
Poordad F, et al. N Engl J Med. 2011;364:1195-1206.
ADVANCE—TVR + PegIFN + RBV chez des Patients Naïfs de Génotype 1 : Design de l’Etude
S8 S24 S48 S72
*TVR 750 mg q8h; pegIFN alfa-‐2a 180 µg/s; RBV 1000-‐1200 mg/j adaptée au poids. eRVR : réponse virologique rapide étendue (ARN indétectable à S4 et à S12)
TVR + PR
Pbo + PR
T8PR (n = 364) PR
PR
Placebo + P/R PR PR48
(n = 361)
PR TVR + PR PR
T12PR (n = 363)
eRVR+
S12 S36
Suivi
Suivi
Suivi
Suivi
eRVR+
Suivi
eRVR-‐
Hépatite C : virus et marqueurs
Jacobson IM, et al. N Engl J Med. 2011;364:2405-2416.
ADVANCE—TVR + PegIFN + RBV chez des Patients Naïfs de Génotype 1 : Caractéristiques des Patients
T12PR (n = 363) T8PR (n = 364) PR (n = 361) Sexe masculin [n (%)] 214 (59) 211 (58) 211 (58) Origine ethnique
Caucasiens [n (%)] 325 (90) 315 (87) 318 (88) Afro-Américains 26 (7) 40 (11) 28 (8) Hispaniques 35 (10) 44 (12) 38 (11)
Âge (années) [médiane (intervalle)] 49 (19-69) 49 (19-68) 49 (18-69) IMC (kg/m2) [médiane (intervalle)] 26 (18-47) 26 (17-46) 26 (17-48) ARN du VHC > 800 000 UI/ml* [n (%)] 281 (77) 279 (77) 279 (77) Type/sous-type du VHC** [n (%)]
1a 213 (59) 210 (58) 208 (58) 1b 149 (41) 151 (41) 151 (42) 1 non sous-typable 1 (< 1) 3 (1) 2 (1)
Stade de fibrose, n (%) Fibrose en ponts 52 (14) 59 (16) 52 (14) Cirrhose 21 (6) 26 (7) 21 (6)
*La charge virale (ARN du VHC, UI/ml) a été déterminée par PCR en temps réel (TaqMan® Roche), avec une limite de quanTficaTon de 25 UI/mL **La déterminaTon du génotype viral a été réalisée par hybridaTon inverse, INNO-‐LiPA v1.0
Hépatite C : virus et marqueurs
Jacobson IM, et al. N Engl J Med. 2011;364:2405-2416.
ADVANCE—TVR + PegIFN + RBV chez des Patients Naïfs de Génotype 1 : RVS et Taux de Rechute
Hépatite C : virus et marqueurs
Prop
or)o
n de
pa)
ents (%
)
p <0,0001
p <0,0001 Taux de RVS
265/363 27/314 243/364 28/295 158/361 64/229
Taux de rechute
Jacobson IM, et al. N Engl J Med. 2011;364:2405-2416.
RESPOND-2—BOC + PegIFN + RBV chez des Patients en échec Thérapeutique de G1 : Design de l’Etude
Suivi PR Lead-‐in PR + placebo
Suivi PR Lead-‐in PR + boceprevir
PR48 n = 80
S4 S28 S48 S72
Suivi
Suivi S24
PR Lead-‐in PR + boceprevir S32
PR + placebo
ARN-‐VHC indétectable à S8
ARN-‐VHC détectable à S8 BOC/TGR n = 162
BOC/PR48 n = 162
*BOC 800 mg q8h; pegIFN alfa-‐2b 1,5 µg/kg/s; RBV 600-‐1400 mg/j adaptée au poids.
Hépatite C : virus et marqueurs
Bacon BR, et al. N Engl J Med. 2011;364:1207-1217.
RESPOND-2—BOC + PegIFN + RBV chez des Patients en échec Thérapeutique de G1 : RVS en Fonction de la Réponse Antérieure à la Bithérapie Pégylée
Hépatite C : virus et marqueurs
Prop
or)o
n de
pa)
ents (%
)
17/80 8/25 95/162 17/111 107/161 14/121 17/80 95/162 107/161 2/29 23/57 30/58 15/51 72/105 77/103
(TGR)
Bacon BR, et al. N Engl J Med. 2011;364:1207-1217.
REALIZE—TVR + PegIFN + RBV chez des Patients en Echec Thérapeutique de G1 : Design de l’Etude
Suivi PR + placebo 48 PR n = 130
*TVR 750 mg q8h; pegIFN alfa-‐2a 180 µg/s; RBV 1000-‐1200 mg/j adaptée au poids.
PR
Suivi PR + TVR n = 260 PR (Ll) PR
Suivi PR (LI) PR n = 260
S4 S16 S48 S72 S8 S12
PR + TVR
Hépatite C : virus et marqueurs
Zeuzem S, et al. N Engl J Med. 2011;364:2417-2428.
REALIZE—TVR + PegIFN + RBV chez des Patients en Echec Thérapeutique de G1 : RVS en Fonction de la Réponse Antérieure à la Bithérapie Pégylée
Hépatite C : virus et marqueurs
Prop
or)o
n de
pa)
ents (%
)
*p <0,0001 contre PR48
17/80 8/25 95/162 17/111 107/161 14/121 2/37 21/72 25/75 4/27 26/48 26/48 16/68 124/141 121/145
* *
* *
* *
Zeuzem S, et al. N Engl J Med. 2011;364:2417-2428.
TMC435 Administré en Monothérapie chez des Patients de Génotype 2, 3, 4, 5 et 6
Manns et al., AASLD 2010, Abstract 82.
J7 J3
Diminu)
on m
oyen
ne de l’A
RN
du VHC
(Log UI/mL)
Hépatite C : virus et marqueurs
Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-‐943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-‐13039; Ago et al., Srructure Fold Des 1999, 7: 1417-‐1426.
Protéine NS5B: RdRp Nouvelles Hépatite C : virus et marqueurs
RéplicaTon
– Modèle du poliovirus . Virus à ARN monocaténaire de polarité posiTve
De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-‐18
Réplication Virale Hépatite C : virus et marqueurs
Variabilité Génétique • Erreurs au cours de la réplica)on
– Fréquentes • 10-‐4-‐10-‐4 mutaTons par nucléoTde copié au cours de la réplicaTon du VHC
– Spontanées – Au hasard
• Absence d’ac)vité exonucléasique 3’⇒5’ ("proofreading") – AccumulaTon de mutaTons
• A l’origine de : – La diversificaTon des types et des sous-‐types – La distribuTon en quasi-‐espèces
Hépatite C : virus et marqueurs
Diversification des Génotypes
Simmonds et al., Hepatology 2005, 42(4):962-‐73.
Hépatite C : virus et marqueurs
1a,
Adapted from Fang J., et al. J. Clin Liver Dis. 1997.
Distribution des Génotypes Hépatite C : virus et marqueurs
Distribution en Quasi-espèce Hépatite C : virus et marqueurs
Domingo, E. Cell 1978, 13 (4):735-744.
Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse StaTon, New Jersey, USA
Cibles des Molécules Antivirales Hépatite C : virus et marqueurs
Site A (Thumb/finger)ps) (JTK-‐109)
Mutants: 495, 496, 499
Site B (Thumb) HCV-‐371
Mutants: 419, 423, 482
Site C (Palm) (A-‐837093)
Mutants: 411, 414, 448
Site Ac)f (R7128)
Mutants: 282
Site D (Palm) (HCV796)
Mutants: 316
A
B C
D
E
Site E (Finger, hypothe)cal) GS-‐9190
Mutants: 445,448,452
0
1
2
3
4
5
6
7
-‐15 -‐10 -‐5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Days
HCV RN
A (Log IU
/mL)
TMA + + + + -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ + +
LOQ (20 IU/mL)
MK-‐0608 at 1mg.kg-‐1 orally
-‐ 4,6 -‐ 4,1
wt S282R/T/I wt S282
Activité Antivirale du MK-0608 Hépatite C : virus et marqueurs
Cycle Viral Hépatite C : virus et marqueurs
Adapted from Lindenbach and Rice, Nature (2005), 436: 933-‐938.
"Membranous Web"
Huh7 naïves
Huh7 infectées (réplicon)
Gosert et al., J Virol 2003, 77(9): 5487-5492.
Quasi-espèces virales: exemple du VHC
Hépatite C Stratégie Diagnostique &
Suivi Virologique
Stéphane Chevaliez
Centre Na)onal de Référence des Hépa)tes Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955 Hôpital Henri Mondor
Université Paris-‐Est Créteil
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Marqueurs indirects AnTcorps anT-‐VHC totaux
Marqueurs directs Ag de capside (AgC)
ARN VHC
Génotype VHC
Profil de résistance
Marqueurs Virologiques
Tests Sérologiques
• Détec)on et quan)fica)on de l’an)gène de capside (AgC)
• Tests “Combo” – DétecTon simultanée de l’AgC et des anTcorps anT-‐VHC
• Détec)on of des an)corps an)-‐VHC par EIA de 3ème généra)on
Diagnostic de l’infection par le VHC
Antigène de Capside : un Marqueur de la Réplication
Bouvier-‐Alias et al., Hepatology 2002, 36(1): 211-‐218.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
r = 0.92; p < 0.0001
Intérêts Cliniques de la Quantification de l’AgC
• Diagnos)c de l’infec)on – Trousses commerciales – Facile à uTliser, automaTsé, peu coûteux (20% par rapport à une charge virale VHC)
• Décision de traiter et suivi de l’efficacité des traitements an)viraux – QuanTtaTf (≤20,000 fmol/L*) – AlternaTve aux techniques de détecTon-‐quanTficaTon de l’ARN du VHC
Diagnostic de l’infection par le VHC
Performances Analytiques de la Trousse Architect (Abbott)
• Spécificité – 99,2% à 100%
• Sensibilité – ≤10 fmol/L (i.e ~ 500 to 3 000 UI/mL d’ARN VHC) – Tous les génotypes (excepté génotype 2)
• Intervalle de quan)fica)on – 10 à 20 000 fmol/L (≤ 7,8 Log10 UI/mL d’ARN VHC)
• Stable à 37°C pendant 96 heures
Ross et al., J Clin Micribiol 2010, 48(4): 1161-8; Mederacke et al., J Clin Virol 2009, 46(3): 210-5; Miedouge et al., J Clin Virol 2010, 48(1):18-21.
Diagnostic de l’infection par le VHC
Trousse Architect : Monitorage des Cinétiques Virales
RVR (G1b) RVS (G1b)
Rechuteur (G1b) Non-‐répondeur (G1a)
Ross et al., J Clin Microbiol 2010, 48(4): 1161-8.
Core Ag RNA
Diagnostic de l’infection par le VHC
Performances de la Trousse Architect chez les Patients Hémodialysés
Mediouge et al., J Clin Virol 2010 May;48(1):18-21
n=90 r=0,9041; p<0,0001
Diagnostic de l’infection par le VHC
Test “Combo“ (AgC/Anti-VHC)
• Diagnos)c de l’infec)on par le VHC – Trousses commerciales – Faciles à uTliser, automaTsés – DiminuTon de la fenêtre sérologique d’environ 20-‐30 jours
– Moins sensibles que les tests de 3ème généraTon pour la détecTon des anTcorps anT-‐VHC
Diagnostic de l’infection par le VHC
Détection des Anticorps Anti-VHC
• Diagnos)c de l’infec)on par le VHC – Trousses commerciales – Faciles à uTliser, automaTsées – A l’aide d’un test de 3ème généraTon
. ADVIA Centaur (Siemens)
. VITROS ECi (Ortho-‐Clinical DiagnosTc)
. AXSYM HCV 3.0 (Abbo{)
. Cobas Elecsys Modular HCV (Roche)
. INNOTEST HCV Ab IV (InnogeneTcs)
. Monolisa anT-‐HCV Plus version 2 (Bio-‐Rad)
Diagnostic de l’infection par le VHC
Tests Virologiques Moléculaires
Détermina)on du Génotype
Quel est le génotype du VHC ?
Détec)on de la résistance
Quel type de VHC est présent ?
Est-‐ce que le VHC est présent et en quelle quan)té ?
Tests Qualita)fs-‐Quan)ta)fs
Diagnostic de l’infection par le VHC
Avantages Techniques de la PCR en Temps Réel
- Diminu)on du risque de contamina)on
- Améliora)on de la sensibilité
- Augmenta)on de l’intervalle de quan)fica)on linéaire
- Améliora)on précision et reproduc)bilité
- Augmenta)on de débit à travers l’automa)sa)on
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intervalles de Quantification Stratégie diagnostique & suivi virologique
10 102 103 104 105 106 107 108
*in development
Cobas Amplicor HCV Monitor v2.0
SuperQuant
LCx HCV RNA Assay
Versant HCV RNA 3.0 (bDNA)
Cobas TaqMan HCV v1.0 (Roche)
RealTime™ HCV (Abbov)
Artus HCV QS-‐RGQ (Qiagen)*
Cobas TaqMan HCV v2.0 (Roche)*
Versant HCV RNA 1.0 (kPCR, Siemens)*
Plates-formes CAP-CTM96 (ROCHE)
kPCR (SIEMENS)
m2000SP-m2000RT (ABBOTT)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Remplace les techniques qualita)ves de détec)on de l’ARN du VHC
• Quan)fie l’ensemble des charges virales observées en pra)que clinique – Charges virales élevées avant traitement – Faibles charges virales au cours du traitement
• Surveille efficacement les ciné)ques virales afin d’évaluer l’efficacité virologique du traitement
Applications et Bénéfices de la PCR en Temps Réel
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Quantification ARN du VHC (CTM, Roche)
Chevaliez et al., 2007; Hepatology, 46(1): 22-‐31.
HCV RNA level in Versant HCV 3.0 Assay bDNA (Log10 IU/mL)
Genotype 1 (n=29)
Genotype 2 (n=27)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 4 (n=30)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=2)
r = 0.889; p < 0.0001
8
7
6
5
4
3 8 7 6 5 4 3
HCV RN
A level in CA
P/CT
M48 (Log
10 IU
/mL)
80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 |.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........| F_7157 (4a): TAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTTGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATCGCCGG Patient 1 (4h): ...........................A.....................................A...................T............... Patient 2 (4l): ...........................A.....................................A...................T............... 190 200 210 220 230 240 250 260 270 .........|.........|......-...|.........| .........|.........|.........|.........| .........|........ F_7157 (4a): GATGACCGGGTCCTTTCTTGGATTAA-CCCGCTCAATGCCCGGAAATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCC Patient 1 (4h): ......................A.T.A.......................................................................... Patient 2 (4l): .......................C..-.......................................................C.......T.......... 280 290 300 310 320 330 340 |.........|.........|.........|.........|.........|.........|. F_7157 (4a): TTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACC Patient 1 (4h): ............................................................. Patient 2 (4l): .............................................................
Chevaliez et al., 2008; Hepatology, 49(4): 1397-‐1398.
(Log10 IU/mL) CAP/CTM96 m2000SP/m2000RT Versant 3.0
Patient 1 (4h) <1.08 5.4 5.0
Patient 2 (4l) <1.08 6.0 5.7
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Absence de Détection de l’ARN Viral de patients Fortement Virémiques Infectés par un Génotype 4
Quantification de Transcrits d’ARN Sauvages ou Mutés en Position 145 et/ou 165
Chevaliez et al., Hepatology, 2009, 50(5): 1681.
HCV 5’NC sequence
Measured HCV RNA levels (Log10 IU/mL)
Real-‐)me PCR assays bDNA assay
CTM m2000 Versant 3.0
Wild-‐type (G145 and A165) 5.73±0.13 6.05±0.10 6.43±0.01
Single mutant (G145A and A165) 4.02±0.13 6.00±0.11 6.69±0.02
Single mutant (G145 and A165T) 4.28±0.35 5.88±0.20 6.30±0.02
Double mutant (G145A and A165T) <1.08* 5.95±0.25 6.60±0.18
*Target not detected
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Quantification de l’ARN du VHC (CTM v2.0, Roche)
Vermehren et al., 2011; J Clin Microbiol, 49(9): 3309-3315.
10,000 cp/mL (input)
WT G1 A165T G145A+A165T A142G+G145A+A165T
Mean )ter (Log10 cp/mL)
G4
Diagnostic de l’infection par le VHC
Vermehren et al., 2011; J Clin Microbiol, 49(9): 3309-3315.
10,000 cp/mL (input)
WT G1 A165T G145A+A165T A142G+G145A+A165T
Mean )ter (Log10 cp/mL)
G4
Diagnostic de l’infection par le VHC
Quantification de l’ARN du VHC (CTM v2.0, Roche)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Quantification ARN du VHC (m2000, Abbott)
Chevaliez et al., J Clin Microbiol, 2009,47(6):1726-‐32.
r = 0.972; p < 0.0001
8
7
6
5
4
3 8 7 6 5 4 3
HCV RN
A level in m2000
SP/m
2000
RT (Log
10 IU
/mL)
HCV RNA level in Versant HCV 3.0 Assay bDNA (Log10 IU/mL)
Genotype 1 (n=55)
Genotype 2 (n=21)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 4 (n=24)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=3)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Quantification ARN du VHC (kPCR, Siemens)
David Sherman., Molecular Symposium, September 2007 (source: Siemens Medical SoluTons DiagnosTcs).
132 clinical samples
LLOD & LOQ : Laquelle Utiliser pour Prédire la RVS ?
0
1
2
4
6
8
0 Temps
Charge vira
le VHC
(Log
10 UI/mL)
Détectable/ quan)fiable
RVS
Indétectable LLOD Détectable/non quan)fiable
Traitement An)viral
LOQ
Rendu des Résultats
Quantifiable (toute valeurs > LOQ)
Détectable non quantifiable
(LLOD<ARN <LOQ)
Indétectable (ARN<LLOD)
Harrington et al., Hepatology 2011, sous-presse.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
PCR en Temps Réel en Pratique
• En pra)que clinique, la quan)fica)on de l’ARN du VHC doit être réalisée à l’aide d’une technique de PCR en temps réel – Expression des résultats en UI/mL – LOD=LLOQ de l’ordre de 10 à 15 UI/mL
• La quan)fica)on de l’ARN du VHC doit être réalisée avant le début du traitement et aux semaines 4, (8), 12, 24, en fin de traitement et 24 semaines après l’arrêt du traitement
• Pour un pa)ent donné, le monitorage de la charge virale doit être réalisé avec la même technique de PCR en temps réel
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Génotypes du VHC
Simmonds et al. Hepatology 2005.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Répartition des Génotypes Stratégie diagnostique & suivi virologique
1a,
Adapted from Fang J., et al. J. Clin Liver Dis., 1997.
Détermination du Génotype
• Méthodes moléculaires (genotyping) – Analyse de la séquence après séquençage direct – HybridaTon inverse des produits d’amplificaTon sur des supports solides comportant des sondes génotype spécifique : Line Probe Assay (INNO-‐LiPA HCV, InnogeneTcs)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes génotype spécifique
• Méthodes sérologiques (“serotyping”) – ELISA compéTTf
Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-‐29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-‐204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin Microbiol; 36: 1461-‐3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-‐15.
• Méthodes moléculaires (genotyping) – Analyse de la séquence après séquençage direct – HybridaTon inverse des produits d’amplificaTon sur des supports solides comportant des sondes génotype spécifique : Line Probe Assay (INNO-‐LiPA HCV, InnogeneTcs)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes génotype spécifique
• Méthodes sérologiques (“serotyping”) – ELISA compéTTf
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du Génotype
Analyse Phylogénique après Séquençage Direct
Région NS5B (286 nt) CLUSTALX DNADist (PHYLIP 3.5) Matrice de distance: Kimura 2-‐parameter (Ts/Tv=2) Neighbor-‐Joining Bootstraping : 1000 replicates NJPlot
5aSA13 2aHCJ6
Pa)ent 49 6aEUHK2 3aNLZ1
Pa)ent 62 4aED43 1hFrSSD98
1h98CM1357 1h98CM1521
1cHCG9 1cSR031 1cKhaja1 1aHCV1
1aHCVH 1aHCJ1
1jQC2 1jQC89 1kQC68
1kQC82 1eM4541N
1eCAM1078 1eQC172
1g1382 1g2152
1gEG024 1lM5186N 1l98CM1427 1l98CM1457
1fFR2 Pa)ent 59 Pa)ent 46 Pa)ent 54 Pa)ent 2 Pa)ent 28 Pa)ent 64 Pa)ent 16 Pa)ent 36 Pa)ent 18 Pa)ent 17 Pa)ent 8 Pa)ent 7
1bHCJ4 1bHCVBK
1bHCP01 Pa)ent 40 1iFR16
1iQC77 1iQC181 Pa)ent 48 Pa)ent 60 Pa)ent 52
Pa)ent 26 1dFR17
1dHC1N16 1dBA107 1mGUI17 1mGUI11 1mGUI24
0.05
59 99
96
34 100
72
100
98
43
Génotype 2
Génotype 4 Génotype 3
Génotype 1
Génotype 6
Génotype 2 Génotype 5
Génotype 1, sous-‐type b
Génotype 3, sous-‐type a
Génotype 1, sous-‐type i
Génotype 1, sous-‐type ?
100
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Versant® HCV Genotype 2.0 Assay (INNO-LiPA)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêt de la Détermination du Sous-Type (1a vs 1b) ?
- Modeste différence d’efficacité de la trithérapie
- Profils de résistance différents en cas d’échec de la trithérapie
- Pas d’influence sur la décision thérapeu)que
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêt du Sous-Type dans la Résistance au Telaprevir
Subtype 1a Subtype 1b
Subs)tu)ons in pa)ents who failed to achieve an SVR
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Impact du Sous-Type sur la Barrière Génétique à la Résistance
HCV-‐1a prototype ...PAGHAVGIFFRAAVCTRGVAKAVDFIP... HCV-‐1b prototype ...-‐S-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐V-‐...
HCV-‐1a AGAèAAA (R155K) AGAèACA (R155T)
HCV-‐1b CGAèAAA (R155K) CGAèACA (R155T)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêt de la Détermination du Sous-Type (1a vs 1b) ?
- Modeste différence d’efficacité de la trithérapie
- Profils de résistance différents en cas d’échec de la trithérapie
- Pas d’influence sur la décision thérapeu)que
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêt de la Détermination du Sous-Type (1a vs 1b) ?
- OUI . Dans les essais cliniques afin de correctement straTfier l’efficacité des DAAs et d’interpréter les profils de résistance
- NON
. En praTque clinique car le sous-‐type n’a pas d’influence sur la décision thérapeuTque
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Résumé
• Détermina)on du génotype (sous-‐type) VHC – La déterminaTon du génotype sur la seule région 5’NC doit être proscrite
– La 2nde généraTon de Line Probe Assay qui uTlise des sondes dirigées contre la région core en plus de la région 5’NC est la meilleure méthode perme{ant de disTnguer les sous-‐types 1a et 1b
EASL CPG., J Hepatol. 2011 Aug;55(2):245-64.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
rs12979860
En amont du géne de l’IL28B, codant l’IFN-λ3
Ge et al., Nature 2009; 461: 399-‐401.
IL28B “Single Nucleotide Polymorphism” (SNP)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Rép
onse
viro
logi
que
sout
enue
(%)
Thompson et al., Gastroenterology 2010; 139(1): 120-‐129.
Bithérapie Standard : RVS en Fonction du Génotype IL28B
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Caucasians (n=1171)
African-Americans (n=300)
Hispanics (n=116)
Combined (n=1587)
CC
CT
TT CC
CT
TTCC
CT
TT
51% 37%
12
49%
14 37%
48% 29% 22%
- En pratique clinique, SNPs en amont du gène de l’IL28B (rs12979860 et rs8099917) sont les facteurs prédictifs les plus robustes de la RVS à la bithérapie
- Cependant, leur valeur prédictive à l’échelon individuel n’est pas suffisante pour la prise en compte dans les décisions thérapeutiques
- La détermination du génotype IL28B en association à d’autre paramètres, comme la réponse virologique à S4, pourrait être utile pour adapter le traitement, éventuellement des patients sous triple combinaison
Ge et al., Nature 2009; 461: 399-‐401; Tanaka et al., Nat Genet 2009; 41(10): 1105-‐9; Afdhal et al, Hepatology in press.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Résumé
Intérêts des Tests Virologiques en Thérapeutique
Consensus conference: treatment of hepaTTs C; 2002, Gastroenterol Clin Biol, 26(2): B303-‐20
• Décision de traiter
• Op)misa)on du schéma thérapeu)que
• Etude de la réponse virologique au traitement
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Le Génotype du VHC Détermine l’Approche du Traitement VHC
• Génotypes 2/3, 4, (5/6) – MainTen de la bithérapie pégylée (pegIFN/RBV)
• Génotype 1 – OpTon thérapeuTque possible : inhibiteur de protéase en associaTon à l’interféron pégylé et la ribavirine
– Boceprevir (Victrelis®) et Telaprevir (Incivo®) approuvés depuis mai 2011 par la FDA et respecTvement en juillet et septembre 2011 par l’EMA
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Réponses au Traitement en Fonction des Cinétiques Virales
Stratégie diagnostique & suivi virologique
0 4 8 12 Weeks
RVR Slow VR
EVR
SOC
2
Detec)on cut-‐off (10-‐15 IU/mL) -‐6
-‐5
-‐4
-‐3
-‐2
-‐1
0
+1
HCV RN
A redu
c)on
from
ba
selin
e (Log
10 IU
/mL)
Diminu)on ≥ 2 Log
Definitions of Virological Responses Response Defini/on
SVR HCV RNA undetectable 24 weeks a�er the end of treatment
RVR HCV RNA undetectable at week 4
EVR HCV RNA undetectable at week 12
DVR >2 Log10 IU/mL drop but detectable HCV RNA at week 12
Null response Less than 2 Log10 IU/mL in HCV RNA from baseline at week 12
ParTal response >2 Log10 IU/mL decrease in HCV RNA from baseline at week 12 but sTll detectable at weeks 12 and 24
Viral breakthrough HCV RNA detectable at any Tme during treatment a�er virological response
Relapse HCV RNA detectable a�er withdrawal treatment in paTent who was undetectable at the end of treatment
New response categories with protease inhibitor-‐based therapy
eRVR with BOC HCV RNA undetectable at weeks 8 and 24
eRVR with TVR HCV RNA undetectable at weeks 4 and 12
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Monitoring of Treatment Responses
S4 S24 S48 S72 S36 S12 S8
BOC/PR
TVR/PR
PR
Stratégie diagnostique & suivi virologique
RVR in Patients Receiving PegIFN plus Ribavirin • Undetectable HCV RNA at Wk 4 of therapy
• Achieving RVR is highly predic)ve of SVR – Independent of genotype and treatment regimen – RVR achieved by 15% to 20% of paTents with genotype 1; 66% with genotypes 2/3
• Pa)ents who achieve RVR may be able to shorten therapy
Ferenci P, et al. J Hepatol. 2005;43:425-433; Shiffman ML, et al. N Engl J Med. 2007;357:124-134; Jensen DM, et al. Hepatology. 2006;43:954-960. Ghany MG, et al. Hepatology. 2009;49:1335-1374; Moreno et al., J Hepatol 2010; 52: 25-31.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Higher Rates of SVR in Genotype 2/3 Patients Who Achieved an RVR with 24 vs 16 Weeks
Diago et al., Hepatology 2010 Jun;51(6):1897-903.
SVR (%
)
16 weeks 24 weeks
p<0.001 p<0.001
375/458 368/405 197/243 115/212 181/215 174/193
p=0.13
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Diago et al., Hepatology 2010 Jun;51(6):1897-903.
SVR (%
)
16 weeks 24 weeks
p=0.20
111/122 95/100
*HCV RNA level <400,000 IU/mL
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Higher Rates of SVR in Genotype 2/3 Patients Who Achieved an RVR with 24 vs 16 Weeks
HCV-‐2/3 RNA quan)fica)on
SOC Response-‐Guided Therapy Ribavirin (1000-‐1400 mg.d-‐1)
Decrease < 2 Log Decrease ≥ 2 Log HCV RNA detectable
Stop an)viral treatment
Decrease ≥ 2 Log HCV RNA undetectable
Con)nue Rx un)l W48
RNA quan)fica)on at W4
RNA quan)fica)on at W12
HCV RNA undetectable
HCV RNA detectable
24 weeks of therapy
1In paTents with a low viral load at baseline (<400,000 IU/mL); Marginally less effecTve due to higher rates of relapse in genotype 3 with high HCV RNA leval
Consider 12-‐16 weeks of therapy1
EASL CPG., J Hepatol. 2011 Aug;55(2):245-64.
Benefits of Response-Guided Therapy • Reduce unnecessary exposure to drugs
– By shortening therapy in paTents likely to achieve SVR without requiring the full duraTon
– By terminaTng therapy early in paTents unlikely to achieve SVR
• May iden)fy pa)ents who do not need a protease inhibitor – Due to high likelihood of SVR with pegIFN plus ribavirin alone
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Peginterferon and ribavirin (SOC)
Shorter SOC Treatment Duration in Genotype 1 Patients with RVR
Prop
or)o
ns of p
a)en
ts (%
)
48 weeks 24 weeks
Pa/ents with RVR Pa/ents without RVR
Jensen DM, et al. Hepatology. 2006;43:954-960.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Shorter Treatment Duration in Genotype 1 Patients with RVR
• A recent meta-‐analysis suggested that – In paTents infected with HCV genotype 1 with an RVR, 24 weeks of therapy with SOC should be considered only in subjects with low baseline viral loads
– The opTmal cut-‐off defining low baseline HCV RNA level (400,000-‐800,000 IU/mL) is not clearly defined
Moreno et al., J Hepatol 2010; 52: 25-31.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
HCV-‐1 RNA quan)fica)on
SOC Response-‐Guided Therapy Ribavirin (1000-‐1400 mg.d-‐1)
Decrease < 2 Log Decrease ≥ 2 Log HCV RNA detectable
Stop an)viral treatment
Con)nue Rx un)l W24
If HCV RNA undetetectable
Con)nue Rx Un)l W72
Decrease ≥ 2 Log HCV RNA undetectable
Con)nue Rx un)l W48
RNA quan)fica)on at W4
RNA quan)fica)on at W12
HCV RNA undetectable
HCV RNA detectable
Consider 24 weeks of therapy1
1In paTents with a low viral load at baseline (<400,000 IU/mL); 2In paTents with a low viral load at baseline (400,000-‐600,000 IU/mL) EASL CPG., J Hepatol. 2011 Aug;55(2):245-64.
Triple combina/on of Peginterferon, ribavirin and a protease inhibitor (BOC or TVR)
Pa/ents Naïfs
Higher SVR Rates in Patients Achieving an RVR
SVR (%
)
SPRINT-‐2 ADVANCE
Jacobson et al., N Engl J Med. 2011, 364:2405-2416; Poordad et al., N Engl J Med. 2011, 364:1195-1206. .
Stratégie diagnostique & suivi virologique
RVR : An Early Guide to Success
• Pa)ents who achieve an RVR have a very high chance of achieving an SVR
• This applies to pegIFN and ribavirin with or without a protease inhibitor
But • With a protease inhibitor, many more pa)ents achieve an RVR – Defined as Wk 4 of triple therapy (i.e, Wk 8 of the treatment course in paTents receiving BOC)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Boceprevir Regimens
W0 W4 W8 W12 W24 W28 W36 W48
Boceprevir
HCV RNA undetectable at W8
PR
PR HCV RNA detectable at W8
W0 W4 W12 W24 W48
BOC + PR PR
Boceprevir
Treatment-‐naïve pa)ents without
cirrhosis
BOC + PR
BOC + PR
Boceprevir. European Medicines Agency.
Cirrho)c pa)ents, poor-‐IFN
responders (<1 Log at W4) and null responders
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Futility Rules
• Different for BOC and TVR – If HCV RNA is ≥ 100 IU/mL at Wk 12, all 3 medicaTons should be disconTnued
– If HCV RNA is confirmed detectable at Wk 24, all 3 medicaTons should be disconTnued
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Telaprevir Regimens
cirrho)c treatment-‐naïve
pa)ents
Treatment-‐naïve pa)ents
without cirrhosis
W4 W24 W48
Follow-‐up
Follow-‐up TVR + PR
PR
HCV RNA undetectable at W4-‐12
HCV RNA detectable at W12 and/or W24 but ≤1000 IU/mL
W72
PR
W36 W12
Follow-‐up PR TVR + PR
Telaprevir. European Medicines Agency.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Different for TVR and BOC – If HCV RNA is > 1000 IU/mL at Wk 4 or 12, all 3 medicaTons should be disconTnued
– If HCV RNA is confirmed detectable at Wk 24, pegIFN/RBV should be disconTnued
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Futility Rules
Triple combina/on of Peginterferon, ribavirin and a protease inhibitor (BOC or TVR)
Pa/ents en Echec d’un Traitement Antérieur par Bithérapie Pégylée
Higher SVR Rates in Patients Achieving an RVR (i.e, At Week 8)
SVR (%
)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Higher SVR Rates in Relapsers Achieving an RVR (i.e, at Week 4)
SVR (%
)
Par/al responders Relapsers
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Boceprevir Regimens
W0 W4 W8 W12 W24 W28 W36 W48
Boceprevir
HCV RNA undetectable at W8
PR
PR HCV RNA detectable at W8
W4 W0 W12 W24 W36 W48
BOC + PR PR PR
W0 W4 W12 W24 W48
BOC + PR PR
Boceprevir
Treatment-‐experienced
pa)ents without cirrhosis, except null responders*
Cirrho)c pa)ents, poor-‐IFN
responders (<1 Log at W4) and null responders
Treatment-‐naïve pa)ents without
cirrhosis
BOC + PR
BOC + PR
Boceprevir
Boceprevir. European Medicines Agency. *FDA recommends RGT in relapsers and parTal responders
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Differ for BOC and TVR – If HCV RNA is ≥ 100 IU/mL at Wk 12, all 3 medicaTons should be disconTnued
– If HCV RNA is confirmed detectable at Wk 24, all 3 medicaTons should be disconTnued
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Futility Rules
Telaprevir Regimens
Par)al and null responders and
cirrho)c treatment-‐naïve
pa)ents
Treatment-‐naïve pa)ents
without cirrhosis and relapsers
W4 W24 W48
Follow-‐up
Follow-‐up TVR + PR
PR
HCV RNA undetectable at W4-‐12
HCV RNA detectable at W12 and/or W24 but ≤1000 IU/mL
W72
PR
W36 W12
Follow-‐up PR TVR + PR
Telaprevir. European Medicines Agency.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Differ for TVR and BOC – If HCV RNA is > 1000 IU/mL at Wk 4 or 12, all 3 medicaTons should be disconTnued
– If HCV RNA is confirmed detectable at Wk 24, pegIFN/RBV should be disconTnued
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Futility Rules
Response-Guided Therapy
• Boceprevir – RGT recommended for non-‐cirrhoTc treatment-‐naive paTents – Different recommendaTons from FDA vs EMA for previous relapsers or non responders – For previous null responders treated with BOC, fixed duraTon 48-‐week course of therapy recommended – For treatment-‐naive paTents with < 1 Log reducTon in HCV RNA a�er the lead-‐in phase, consideraTon should be given to 4-‐plus-‐44 wks regimen rather than RGT – CirrhoTc paTents should receive a fixed duraTon 48-‐week course of therapy
• Telaprevir – RGT recommended for treatment-‐naive paTents and previous relapsers – All previous parTal or null responders and cirrhoTc paTents should receive a fixed-‐duraTon 48-‐week course of therapy
Stratégie diagnostique & suivi virologique