Chapter II Flavonoid

8/8/2019 Chapter II Flavonoid

1/32

BAB 2TINJAUAN PUSTAKA2.1. Tumbuhan Jengkol2.1.1. Morfologi Tumbuhan JengkolTumbuhan Jengkol atau lebih dikenal dengan tumbuhan Jering adalah termasuk dalam Famili Fabaceae (suku biji-bijian). Tumbuhan kulit buah jengkol atau Jering dengannama latinnya yaitu (Pithecellobium lobatum Benth.) dengan sinonimya yaitu A.Jiringa, Pithecollobioum jiringa dan Archindendron pauciflorum adalah tumbuhankhas di wilayah Asia Tenggara. Jengkol merupakan salah satu tumbuhan denganukuran pohon yang tinggi yaitu 20 m , tegak bulat berkayu, licin, percabangansimpodial, cokelat kotor. Bentuk majemuk, lonjong, berhadapan , panjang 10 - 20cm,lebar 5 - 15 cm, tepi rata, ujung runcing, pangkal membulat, pertulangan menyirip,tangkai panjang 0,5 1 cm, warna hijau tua. Struktur majemuk, berbentuk sepertitandan, diujung dan ketiak daun, tangkai bulat, panjang 3 cm , berwarna ungukulitnya, bentuk buah menyerupai kelopak mangkok, benang sari kuning, putik

silindris, kuning mahkota lonjong, putih kekuningan. Bulat pipih berwarna cokleatkehitaman, berkeping dua dan berakar tunggang. Pohon Jengkol sangat bermanfaatdalam konservasi air disuatu tempat hal ini dikarenakan ukuran pohonnya yang sangattinggi.2.1.2. Klasifikasi Ilmiah Jengkol adalah sebagai berikut :Kingdom : PlantaeSubkingdom : TracheobiontaDivisi : Magnoliophyta (berbunga)Kelas : Magnoliopsida (dikotil)Ordo : FabalesFamili : Mimosaceae (polong-polongan)Genus : PithecollobiumSpesies : Pithecollobium lobatum (Benth.) (Steenis, V., 2005)


2/32

2.1.3. Manfaat kulit buah tumbuhan JengkolSalah satu tumbuhan yang digunakan sebagai tumbuhan obat adalah kulit buahtumbuhan Jengkol (Pithecollobium lobatum Benth.). Bagian dari Jengkol yangdigunakan adalah kulit buahnya yang dapat dimanfaatkan sebagai obat diabetes (guladarah).(id.wikipedia.org/wiki/Jering) dan dapat digunakan sebagai herbisida alamiuntuk menekan pertumbuhan gulma yang mengganggu pertanian.

(http://bdpunib.org/bdp/abstrak/2005/budinur.html)2.2. Senyawa Flavonoida2.2.1. PendahuluanIstilah senyawa fenol meliputi aneka ragam senyawa yang berasal dari tumbuhan,yang mempunyai ciri sama yaitu cincin aromatik yang mengandung satu atau duapenyulih (pengganti) hidroksil. Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam airkarena umumnya mereka sering kali berikatan dengan gula sebagai glikosida, danbiasanya terdapat vakuola sel (membran sel).Beberapa ribu senyawa fenol alam telah diketahui strukturnya. Flavonoida

merupakan golongan terbesar, tetapi fenol monosiklik sederhana, fenilpropanoida,dankuinon fenolik juga tertdapat dalam jumlah besar. Beberapa golongan bahan polimerpenting alam tumbuhan lignin, melanin, dan tanin adalah senyawa polifenol dankadang-kadang satuan fenolik dijumpai pada protein, alkaloida, dan diantaraterpenoida. Peranan beberapa golongan senyawa fenol sudah diketahui (misalnyalignin sebagai bahan pembangun dinding sel, antosianin sebagai pigmen bunga),sedangkan peranan senyawa yang termasuk golongan lain masih merupakan hasildugaan belaka. Flavonol. Misalnya, tampaknya penting pada pengaturan pengendaliantumbuh pada tanaman kacang, Pisum sativum. Pengaruhnya yang merugikan terhadapkebiasaan makan serangga telah menunjukkan bahawa flavonoida mungkinmerupakan faktor pertahanan alam.


3/32

Bagi biokimiawan tumbuhan, senyawa fenol tumbuhan dapat menimbulkangangguan besar karena kemampuannya membentuk kompleks dengan protein melaluiikatan hidrogen. Bila kandungan sel tumbuhan bercampur dan membran menjadirusak selama proses isolasi, senyawa fenol cepat sekali membentuk kompleks denganprotein. Akibatnya, sering terjadi hambatan terhadap kerja enzim pada ekstraktumbuhan kasar. Sebaliknya, fenol sendiri sangat peka terhadap oksidasi enzim danmungkin hilang pada proses isolasi akibat kerja enzim fenolase yang terdapat dalamtumbuhan. Ekstraksi senyawa fenol-tumbuhan dengan etanol mendidih biasanyamencegah terjadinya oksidasi enzim, dan prosedur ini seharusnya dilakukan secara rutin.Cara klasik untuk mendeteksi senyawa fenol sederhana ialah denganmenambahkan larutan besi (III) klorida 1% dalam air atau etanol kepada larutancuplikan, yang menimbulkan warna hijau, merah, ungu, biru, atau hitam yang kuat.

Cara ini, yang dimodifikasi dengan menggunakan campuran segar larutan besi (III) klorida 1% dalam air dan kalium heksasianoferat (III) 1%, masih tetap digunakansecara umum untuk mendeteksi senyawa fenol pada kromatogram kertas. Tetapi,kebanyakan senyawa fenol (terutama flavonoida) dapat dideteksi pada kromatogramberdasarkan warnanya atau fluoresensinya dibawah lampu UV, warnanya diperkuatatau berubah bila diuapi amonia. Pigmen fenolik berwarna dan warnanya ini dapatterlihat jadi, mudah disimak (dipantau) selama proses isolasi danpemurnian.(Harborne, 1987)

Senyawa-senyawa flavonoida adalah senyawa-senyawa polifenol yangmempunyai 15 atom karbon, terdiri dari dua cincin benzene yang dihubungkanmenjadi satu oleh rantai linier yang terdiri dari tiga atom karbon. Senyawa-senyawaflavonoida adalah senyawa 1,3 diaril propana, senyawa isoflavonoida adalah 1,1 diarilpropana. Istilah flavonoida deiberikan pada suatu golongan besar senyawa yangberasal dari kelompok senyawa yang paling umum, yaitu senyawa flavon; suatujembatan oksigen terdapat diantara cincin A dalam kedudukan orto, dan atom karbonbenzil yang terletak disebelah cincin B. Senyawa heterosiklik ini, pada tingkatoksidasi yang berbeda terdapat dalam kebanyakan tumbuhan. Flavon adalah bentuk


4/32

yang mempunyai cincin C dengan tingkat oksidasi paling rendah dan dianggapsebagai struktur induk dalam nomenklatur kelompok senyawa-senyawa ini. (Manitto, 1981)Semua varian falvonoida saling berkaitan karena alur biosintesis yang sama,yang memasukkan substrat dari alur sikimat dan alur asetat-malonat (Hahlbrock &Grisebach, 1975; Wong, 1976), flavonoida pertama dihasilkan segera setelah kedua alur itu bertemu. Sekarang, flavonoid yang dianggap pertama kali terbentuk padabiosintesis ialah khalkon (Hahlbrock, 1980), dan semua bentuk lain diturunkandarinya melalui berbagai alur. Modifikasi flavonoida pengurangan) hidroksilasi;metilasi gugus hidroksil atau inti flavonoida; isoprenilasi gugus hidroksil atau

intiflavonoida; metilenasi gugus orto- dihidroksil; dimerisasi (pembentukanbiflavonoida); pembentukan bisulfate; danyang terpenting, glikosilasi gugus hidroksil (pembentukan flavonoida O-glikosida)atau inti flavonoida (pembentukan flavonoida C-glikosida). (Markham, 1988)

2.2.2. Struktur dasar Senyawa FlavonoidaSenyawa flavonoida adalah senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua intifenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Struktur dasar flavonoida dapatdigambarkan sebagai berikut :O7OACB8656'5'4'3'2'1'2191043(8a)(4a)


5/32

Kerangka dasar senyawa flavonoidaCincin A adalah karakteristik phloroglusinol atau bentuk rosorsinol tersubstitusi.CCCAB

Namun sering terhidroksilasi lebih lanjut :HOOC3AC6(B)

HOOC3OHAC6(B)Cincin B adalah karakteristik 4-,3,4-,3,4,5- terhidroksilasi(Sastrohamidjojo, 1996)OCH3OC3OCH3H3COH3COC6 (B)ARRRC3C6(A)BR = R' =H, R' = OHR = H, R' = R" = OHR = R' = R" = OH(juga, R = R' =

R"= H)

HOOC3AC6(B)HOOH

2.2.3. Klasifikasi Senyawa Flavonoid

Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan pita serapan yang kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak,umumnya dalam tumbuhan terikat pada gula yang disebut dengan glikosida.(Harborne, 1996). Pada flavonoida O-glikosida, suatu gugus hidroksil flavonoida(atau


6/32

lebih) terikat pada satu gula (lebih) dengan ikatan yang tahan asam. Glukosamerupakan gula yang paling umum terlibat dan gula lain yang sering juga terdapat adalah galaktosa, ramnosa, silosa, arabinosa, dan rutinosa. Waktu yang diperlukanuntuk memutuskan suatu gula dari suatu flavonoida O-glikosida dengan hidrolisisasam ditentukan oleh sifat gula tersebut.Pada flavonoida C-glikosida, gula terikat pada atom karbon flavonoida dandalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzene dengan suatu ikatankarbon-karbon yang tahan asam. Gula yang terikat pada atom C hanya ditemukanpada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti flavonoida, misalnya pada orientin. (Markham,1988).Flavonoid memiliki dua cincin benzene yang dipisahkan oleh sebuah unitpropane dan diturunkan dari senyawa flavone. Secara umum merupakan golongansenyawa yang mudah larut dalam air. Kebanyakan senyawa terkonjugasi yang padaumumnya berwarna cerah. Secara umum dapat dijumpai pada tumbuhan sebagai

glikosidanya yang meiliki struktur yang rumit. Perbedaan kelas antara golongansenyawa flavonoida ini adalah adanya tambahan oksigen yang terikat pada cincinheterosiklik dan gugus hidroksil. Senyawa yang termasuk dalam golongan tersebutadalah katekin, leukoantosianidin, flavanone, flavanonol, flavone, antosianidin, flavonol, khalkone, aurone, dan isoflavone. Struktur antara katekin danleukoantoasianidin memiliki struktur yang mirip dan jarang dijumpai bentukglikosidanya. Dan akan mengalami polimerisasi membentuk tanin yang terkandungpada daun teh.

Flavanon dan flavanonol jarang dijumpai dalam bentuk glikosidanya. Flavondan flavonol secara luas terdistribusi sebagai senyawa fenolik. Antosianin adalahpigmen tumbuhan yang secara umum berwarna merah dan jarang dijumpai berwarnabiru pada suatu bunga. Dan dapat dihasilkan sebanyak 30% dari bunga kering. Dapatdijumpai sebagai glikosida. Khalkone termasuk butein, dengan cincin furan ditemukandalam senyawa flavonoid, meskipun hal ini sering digunakan sebagai titik pengkontrol


7/32

untuk pH. Auron merupakan pigmen berwarna kuning emas yang secara umumdijumpai pada bunga. (Kaufman,P. 1999).Isoflavone yang lebih dikenal sebagai 3- phenylkromon Dapat diketahui adasekitar 35 jenis isoflavone yang dikenal, yang mana contoh umumnya sebagai berikut:Daidzein, Genistein, Tianlancuayin. Isoflavone dapat mengalami degradasi dengan danya penambahan basa sehingga menghasilkan Desoxybenzoin dan asam formiatselanjutnya Desoxybenzoin terpisah dan mengalami fusi (penggabungan dua intiringan menjadi inti yang lebih berat molekulnya) basa dan metilasi. Isoflavone banyakdigunakan sebagai estrogenic, insectidal, dan sebagai anti jamur, beberapa darisenyawa itu adalah berpotensi dihasilkan dari racun ikan. (Raphael,I. 1991)Menurut Robinson (1955), flavonoid dapat dikelompokkan berdasarkan keragamanpada rantai C3 yaitu :1. FlavonolFlavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida, dan aglikon

flavonol yang umum yaitu kamferol, kuersetin, dan mirisetin yang berkhasiat sebagaiantioksidan dan antiimflamasi. Flavonol lain yang terdapat di alam bebas kebanyakanmerupakan variasi struktur sederhana dari flavonol. Larutan flavonol dalam suasanabasa dioksidasi oleh udara tetapi begitu cepat sehingga penggunaan basa padapengerjaannya masih dapat dilakukan.Struktur FlavonolOOOHHH


8/32

2. FlavonFlavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat gugusan 3-hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan kromatografi, serta reaksiwarnaya. Flavon terdapat juga sebagai glikosidanya lebih sedikit daripada jenisglikosida pada flavonol. Flavon yang paling umum dijumpai adalah epigenin danluteolin. Luteolin merupakan zat warna yang pertama kali dipakai Eropa. Jenis yangpaling umum adalah 7-glikosida dan terdapat juga flavon yang terikat pada gulamelalui ikatan karbon-karbon. Contohnya luteolin 8-C-glikosida. Flavon dianggapsebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa flavonoid.Struktur Flavon3. IsoflavonIsoflavon merupakan isomer flavon, tetapi jumlahnya sangat sedikit dan sebagaifitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan sebagaipertahanan terhadap serangan penyakit. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinyatidak khas dengan pereaksi warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein)

memberikan warna biru muda cemerlang dengan sinar UV bila diuapi ammonia, tetapi kebanyakan yang lain tampak sebagai bercak lembayung yang pudar dengan ammoniaberubah menjadi cokelat.78OO65109121'2'6'5'4'3'43


9/32

Struktur Isoflavon4. FlavanonFlavanon terdistribusi luas di alam. Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga.Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah jeruk; dua glikosida yang paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapatdalam buah anggur dan jeruk.OO

Struktur Flavanon5. FlavanonolSenyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jikadibandingkan dengan flavonoid lain. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karenakonsentrasinya rendah dan tidak berwarna.

Struktur FlavanonolOOOOOH


10/32

6. KatekinKatekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu.Senyawa ini mudah diperoleh dalam jumlah besar dari ekstrak kental Uncaria gambirdan daun teh kering yang mengandung kira-kira 30% senyawa ini. Katekin berkhasiat sebagaiantioksidan.

Struktur Katekin7. LeukoantosianidinLeukoantosianidin merupakan senyawa tidak berwarna, terutama terdapat padatumbuhan berkayu. Senyawa ini jarang terdapat glikosida, contohnya melaksidin,apiferol.OHOHOOHHOHOOOHOHHO

Struktur Leukoantosianidin8. Antosianin

Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan paling tersebar luas dalamtumbuhan. Pigmen yang berwarna kuat dan larut dalam air ini adalah penyebabhampir semua warna merah jambu, merah marak, ungu,. dan biru dalam daun, bunga,dan buah pada tumbuhan tingkat tinggi. Secara kimia semua antosianin merupakanturunan suatu struktur aromatik tunggal yaitu sianidin, dan semuanya terbentuk dari


11/32

pigmen sianidin ini dengan penambahan atau pengurangan gugus hidroksil ataudengan metilasi atau glikosilasi.

Struktur Antosianin9. KhalkonKhalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna cokelat kuat dengan sinar UVbila dikromatografi kertas. Aglikon flvon dapat dibedakan dari glikosidanya, karenahanya pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada kromatografi kertas dalam pengembang air. (Harborne, 1996).Struktur Khalkon10. AuronAuron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan briofita. Dalam larutan basa senyawa ini berwarna merah ros dan tampak pada kromatografikertas berupa bercak kuning, dengan sinar ultraviolet warna kuning kuat berubah

menjadi merah jingga bila diberi uap amonia. (Robinson, 1995)OOHO

Struktur AuronOOHC


12/32

Menurut Harborne (1996), dikenal sekitar sepuluh kelas flavonoida dimanasemua flavonoida, menurut strukturnya, merupakan turunan senyawa induk flavon dansemuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama yakni :

GolonganFlavonoida

Penyebaran

Ciri Khas

AntosianinProantosianidinFlavonolFlavonGlikoflavonBiflavonil

Khalkon dan AuronFlavanonIsoflavon

Pigmen bunga merah marak, danbiru juga dalam daun dan jaringanlain.Terutama tidak berwarna dalamtumbuhan berkayu.Terutama ko-pigmen tidakberwarna dalam bunga sianik danasianik; tersebar luas dalam daun.Seperti flavonolSeperti flavonolTidak berwarna; hampirseluruhnya terbatas padagimnospermae(tumb.berbijiterbuka)-Kadang-kadang terdapat jugadalam jaringan lain.Tidak berwarna; dalam daun danbuah (terutama dalam Citrus) tidakberwarna; sering kali akar; hanyaterdapat dalam satu suku,Leguminosae(tumb. Kacang-kacangan).

Larut dalam air, . maks 515-545nm, bergerak dengan BAA padakertas.Menghasilkan antosianidin(warna dapat diekstraksi denganamil alkohol) bila jaringandipanaskan dalam HCl 2Mselama setengah jam.Setelah hidrolisis, berupa bercakkuning murup pada kromatogramForestal bila disinari dengan sinarUV; maksimal spektrum pada


13/32

330-350.Setelah hidrolisis, berupa bercakcokelat redup pada kromatogramForestal maksimal spektrum pada330-350 nm.Mengandung gula yang terikatmelalui ikatan C-C; bergerakdengan pengembang air, tidakseperti flavon biasa.Pada kromatogram BAA berupabercak redup dengan Rf tinggi.Dengan ammonia berwarnamerah; maksimal spektrum 370-410 nm.Berwarna merah kuat denganMgHCl kadang-kadang sangatpahit.Bergerak pada kertas denganpengembang air, tak ada uji

warna yang khas.


14/32

2.2.4. Metoda Isolasi Senyawa FlavonoidaIsolasi konstituen flavonoida dari tumbuhan akar serabut Glyccyrrhiza glabra padaisolasi ini yang diisolasi adalah senyawa licoagrodin dan turunannya. Pada dasarnyaekstrak methanol akar serabut tumbuhan G. glabra yang dipartisi antara air dan etilasetat.Ekstrak etil asetat diteruskan untuk dipisahkan dengan menggunkankromatografi kolom dengan menggunakan silika gel dan selanjutkan dimurnikandengan menggunakan Fase-Normal HPLC untuk menghasilkan 5 jenis flavonoidabaru, licoagrodin, licoagrokalkone B, licoagrokalkone C, licoagrokalkone D ,licoagroaurone dan 4 flavonoid yang dikenal lainnya ialah licoakalkone C. Lapisanair dilanjutkan untuk dianalisa dengan kromatografi kolom Daion HP-20, yang dielusidengan menggunakan methanol. Eluate methanol dievaporasi vakum untukmenghasilkan sebuah fraksi glikosida. Fraksi tersebut akan dianalisa dengankromatografi kolom ODS. (Yoshikawa,T.2000).

2.2.5. Sifat Kelarutan FlavonoidaAglikon Flavonoida adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Tetapi harus diingat,bila dibiarkan dalam larutan basa, dan di samping itu terdapat oksigen, banyak yangterurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih(terganti),atausuatu gula, flavonoida merupakan senyawa polar, dan seperti kata pepatah lamamengatakan suatu golongan akan melarutkan golongannya sendiri makaumumnya flavonoida larut cukupan dalam pelarut polar seperti etanol (EtOH),methanol(MeOH), butanol(BuOH), aseton, dimetilsulfoksida(DMSO),dimetilformamida(DMF), air, dan lain-lain. Adanya gula yang terikat pada flavonoida(bentuk yang umum ditemukan) cenderung menyebabkan flavonoida lebih mudahlarut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut diatas dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar sepertiisoflavon, flavanon, dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebihmudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform.


15/32

2.3. Teknik PemisahanTujuan dari teknik pemisahan adalah untuk memisahkan komponen yang akanditentukan berad dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen-komponenlainnya. Ada 2 jenis teknik pemisahan :1. Pemisahan KimiaPemisahan ini berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifatfisikakomponen dalam campuran yang akan dipisahkan.2. Pemisahan FisikaPemisahan ini berdasarkan pada perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-sifatfisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam suatu golongan.(Muldja, 1995).2.4. KromatografiKromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akandipisahkan terdistribusikan antara 2 fase, satu dari fase-fase ini membentuk lapisanstasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang

merembes lewat.Fase stasioner mungkin suatu zat padat atau suatu cairan dan fase yangbergerak mungkin suatu cairan atau suatu fase gas. Cara-cara kromatografi dapatdigolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fase diam, yang dapat berupa zat padat atauzat cair. Jika fase diam berupa zat padat disebut kromatografi serapan, jika berupa zatcair atau gas maka ada empat macam system kromatografi yaitu :1. Fase gerak cair-fase diam padat (kromatografi serapan)a. Kromatografi Lapis Tipisb. Kromatografi Penukar Ion2. Fase gerak gas-fase diam padat, yakni kromatografi gas padat3. Fase gerak cair-fase diam cair (kromatografi partisi), yakni kromatografikertas4. Fase gerak gas-fase diam zat cair, yakni :a. Kromatografi Gas-Cairb. Kromatografi Kolom Kapiler


16/32

Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa senyawa-senyawa yang dipisahkan terdistribusi diantara fase gerak dan fase diam dalamperbandingan yang sangat berbeda-beda dari suatu senyawa terhadap senyawa yanglain. (Sastrohamidjojo, 1991).2.4.1. Kromatografi Lapis TipisTeknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Egon Stahl denganmenghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan lapisan tipis.KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat juga merupakan kromatografipartisi karena bahan penyerap telah dilapisi air dari udara. Sistem ini segera popularkarena memberikan banyak keuntungan, misalnya peralatan yang diperlukan sedikit, murah, sederhana, waktu, analisis cepat dan daya pisah cukup baik. (Sudjadi, 1986)2.4.1.1 Pembuatan Lapisan TipisDalam pembuatan lapisan tipis digunkan plat-plat kaca yang memiliki ukuran 20 x5cm atau 20 x 20 cm, dan ukuran ini dianggap standart . Plat ini dicuci terlebih dah

uludengan air dan detergen kemudian dikeringkan dengan aseton. Selanjutnya membuatpenyerap menjadi bubur dengan air, biasanya dalam perbandingan x gram penyerapdan 2x ml air. Bubur diaduk dengan baik dan dibentangkan di atas plat kaca denganberbagai cara. Tebal standart adalah 250 mikron. Lapisan-lapisan yang lebih tebal(0,5 2,0 mm) digunakan untuk pemisahan-pemisahan yang sifatnya besar, denganmenggunakan penyerap hingga 250 mg untuk plat dengan ukuran 20 x 20 cm. Salahsatu keukaran dengan lapisan tebal ialah adanya tendensi mengelupas bilakering.(Sastrohamidjojo, 1985)Beberapa contoh penyerap yang digunakan untuk pemisahan dalamkromatografi lapis tipis adalah sebagai berikut :


17/32

1. Silika gelAda beberapa jenis silika gel, yaitu :a. Silika gel GSilika gel G adalah silika gel yang mengandung 13 % kalsium sulfat sebagaiperekat. Jenis silika gel ini biasanya mengandung ion logam, terutama ion besi.Kandungan ion besi dapat dihilangkan dengan mengembangkan plat TLC silika gel Gdengan sstem pelarut metanol : asam HCl pekat 9 : 1.b. Silika gel HPerbedaan silika gel G dan silika gel H ialah, bahwa silika gel H tidakmenngandung perekat kalsium sulfat. Silika gel H dipakai untuk pemisahan yangbersifat spesifik, terutama lipida netral.c. Silika gel PFJenis silika gel ini diketemukan belakangan, yang dibuat sedemikian rupasehingga senyawa-senyawa organik terikat pada plat ini dapat mengadakanfluoresensi. Oleh karena itu visualisasinya dapat dikerjakan dengan menempatkanplatyang telah dikembangkan di dalam ruangan gelap atau dengan sinar ultra violet yang

bergelombang pendek.2. AluminaPenggunaan alumina dalam TLC, yang semula diperkenalkan oleh peneliti dariCekoslowakia, tidak sesering silika gel. Sebenarnya alumina netral mempunyaikemampuan untuk memisahkan bermacam-macam senyawa, seperti terpena, alkaloid,steroid, dan senyawa-senyawa alisklik, alifatik, serta aromatik. Sebagai zat perekatalumina tidak mengandung zat perekat, memepunyai sifat alkalis dan dapatdigunakan baik tanpa maupun dengan aktivasi.


18/32

3. KieselguhrKieselguhr merupakan adsorben yang lebih lemah dari silika gel dan alumina,oleh karena itu lebih cocok untuk memisahkan senyawa-senyawa polar. (Adnan, M.,1997)Nilai utama KLT pada penelitian flavonoid ialah sebagai cara analisis cepatyang memerlukan bahan sangat sedikit. Menurut Markham, KLT memiliki perananpenting dalam metoda pemisahan dan isolasi yaitu :a. Mencari pelarut untuk kromatografi kolomb. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolomc. Menyigi arah atau perkembangan reaksi seperti hidrolisis atau metilasid. Identifikasi flavonoida secara ko-kromatografie. Isolasi flavonoida murni skala kecil.2.4.2. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom atau tabung merupakan salah satu jenis pemisahan denganmenggunakan prinsip aliran zat cair (pelarut) yang dipengaruhi oleh gaya tarik bumi

(gravitasi bumi) atau dikenal dengan sistem bertekanan rendah biasanya terbuat darikaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengaturaliran pelarut.(Gritter, 1991) . Pada isolasi flavonoida sebaiknya digunakan kolomskala besar karena hal ini dapat meningkatkan proses pemisahan yang baik. Padadasarnya cara ini meliputi penempatan campuran flavonoida (berupa larutan) di ataskolom yang berisi serbuk penyerap (seperti selulose, silika, atau poliamida),dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang cocok.Kolom yang digunakan umumnya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan keranpada salah satu ujung, dan ukurannya sedemikian rupa sehingga nisbah garis tengahterhadap panjang kolom dalam rentang 1:10 sampai 1:30. Kemasan kolom harusdipilih dari jenis yang dipasarkan khusus untuk kromatografi kolom karena ukuran partikel penting. Jika ukuran partikel terlalu kecil, laju aliran pengelusi mungkinterlalu lambat, sedangkan bila terlalu besar, mungkin pemisahan komponen secara


19/32

kromatografi tidak baik. Kemasan niaga biasanya dalam ukuran 100-300mesh.(Markham, 1988)2.4.2.1. Pengisian KolomPengisian kolom harus dikerjakan dengan seragam.Setelah adsorbendimasukkan dapat diseragamkan kepadatannya dalam kolom dengan menggunakanvibrator atau dengan plunger (pemadat). Selain itu dapat juga dikerjakan denganmemasukkan adsorben dalam bentuk larutan (slurry) dan partikelnya dibiarkanmengendap. Pengisian kolom yang tidak seragam akan menghasilkan rongga-ronggadi tengah-tengah kolom. Cara untuk mengatasi masalah ini adalah denganmengadakan back fushing , sehingga terjadi pengadukan, yang seterusnya dibiarkan lagi mengendap. Pada bagian bawah (dasar) dan atas dari isian kolom diberi wol kaca(glass wool) atau sintered glass disc untuk menyangga isian. Bila kolom telah diberibahan isian, permukaan cairan tidak boleh dibiarkan turun dibawah permukaan bahanisian bagian atas, karena akan memberikan peluang masuknya gelembung udara

masuk ke kolom. (Adnan,M., 1997)2.4.2.2. Memilih Kemasan KolomKemasan kolom yang tersedia sangatlah banyak dan senarai di bawah memberikanpedoman mengenai pemakaian dan cirri sejumlah jenis kemasan yang berguna.

. Selulosa

Pemakaian selulosa serupa dengan kertas, yaitu ideal untuk memisahkanglikosida yang satu dengan yang lain, atau memisahkan glikosida dari aglikon,serta untuk memisahkan aglikon yang kurang polar. Kapasitasnya rendah.

. Silika

Bahan ini paling berguna untuk memisahkan aglikon yang kurang polar,misalnya isoflavon, flavanon, metal flavon, dan flavanol. Kapasitaspertengahan.


20/32

. Poliamida

Bahan ini cocok untuk memisahkan semua flavonoid, meski juga ideal untukmemisahkan glikosida. Merupakan pelengkap untuk KKt karena melibatkanpenyerap dan pengembang yang berlainan. Sebelum dipakai harus dicucidengan MeOH dan H2O agar poliamida yang larut tidak mencemari semuafraksi. Kapasitas tinggi.

. Gel sephadex (deret G)

Bahan ini dirancang untuk memisahkan campuran, terutama berdasarkan padaukuran molekul (bila digunkan pelarut air); molekul besar terlebih dahulu.Sephadex berguna untuk memisahkan poliglikosida yang berbeda bobotmolekulnya. Kapasitasnya lebih besar karena ukurannya lebih teratur.2.4.3. Kromatografi Preparatif

Salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan yang palingmurah dan memakai peralatan yang paling dasar ialah kromatografi lapis titpispreparatif (KLTP). Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan alam dalam jumlahgram, sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram. KLTP bersama-samadengan kromatografi kolom terbuka, masih dijumpai dalam sebagian besar publikasi mengenai isolasi bahan alam, terutama dari laboratorium yang tidak dilengkapidengan cara pemisahan modern. Akan tetapi, seperti yang akan diterangkan kemudian,tertdapat banyak masalah pada KLTP.

. Penyerap

Dalam KLTP digunakan ketebalan adsorbent yang paling sering dipakai yaitu0,5-2 mm. ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm.Peneyerap yang paling umum ialah silika gel dan dipakai untuk pemisahancampuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil.

. Penotolan Cuplikan


21/32

Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada plat KLTP.Pelarut yang baik ialah pelarut atsiri/organik (heksana, diklorometana, etilasetat), karena jika pelarut kurang atsiri maka akan terjadi pelebaran pita.Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10%.

. Pemilihan Fase Gerak

Pilihan pelarut ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan memakaiKLT analitik. Karena ukuran partikel penyerap kira-kira sama, pelarut yangdipakai pada plat KLT dapat dipakai langsung pada KLTP. Pengembanganpelat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampungbeberapa plat.

. Isolasi senyawa yang sudah terpisah

Kebanyakan penyerap KLTP mengandung indikator fluoresensi yangmembantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yangdipisahkan menyerap sinar UV. Akan tetapi, beberapa indikator menimbulkanmasalah yaitu bereaksi dengan asam kadang-kadang bahakan dengan asamasetat.Untuk senyawa yang tidak menyerap sinar UV, ada beberapa pilihan :a). Menyemprot dengan air (misalnya saponin)b). Menutup pelat dengan sepotong kaca menyemprot salah satu sisi denganpereaksi semprotc). Menambahkan senyawa pembanding. (Hostettman,K.,1995)2.4.4. Harga Rf ( Retension factor)Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baikdikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi warna. Lazimnya identifikasimenggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat biladibandingkan pada kertas.


22/32

Dapat didefenisikan sbb :Harga Rf =Faktor-faktor yang memepengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapis tipis yangjuga mempengaruhi harga Rf :1). Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan2). Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya3). Tebal keraataan dari lapisan penyerap4). Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa gerak5). Derajat kejenuhan dari uap6). Jumlah cuplikan yang digunakan7). Suhu8). Kesetimbangan9). Teknik percobaan (Sastrohamidjojo, 1985)2.4.5. EkstraksiEkstraksi dapat dilakukan pada bahan tumbuhan yang akan diisolasi. Umumnya kitaperlu membunuh jaringan tumbuhan untuk mencegah terjadinya oksidasi enzim atauhidrolisis. Mencelupkan jaringan daun segar atau bunga, bila perlu dipotong-poto

ng,.Kedalam etanol mendidih adalah salah satu cara yang baik untuk mencapai tujuan.Selanjutnya, bahan dapat dimaserasi dalam suatu pelumat, lalu disaring. Bilamengisolasi senyawa dari jaringan hijau, keberhasilan ekstraksi dengan alkoholberkaitan langsung dengan seberapa jauh klorofil tertarik oleh pelarut itu. Bila

ampasjaringan, pada ekstraksi ulang, sama sekali tak berwarna hijau lagi, dapat dianggapsemua senyawa berbobot molekul rendah telah terekstraksi. (Harborne, 1987)


23/32

2.5. Teknik SpektroskopiTeknik spektroskopi adalah salah satu teknik analisis kimia-fisika yang mengamatitentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik. Ada dua macaminstrumen pada teknik spektroskopi yaitu spektrometer dan spektrofotometer.Instrumen yang memakai monokromator celah tetap pada bidang fokus disebutsebagai\ spektrometer. Apabila spektrometer tersebut dilengkapi dengan detektoryang bersifat fotoelektrik maka disebut spektrofotometer. (Muldja, 1955)Informasi Spektroskopi Inframerah menunjukkan tipe-tipe dari adanya gugusfungsi dalam suatu molekul dan Resonansi Magnetik Inti yang memberikan informasi tentang bilangan dari setiap tipe dari atom hidrogen dan juga memberikan informasiyang menyatakan tentang lingkungan dari setiap tipe dari atom hidrogen.Kombinasinya dan data yang ada kadang-kadang menentukan struktur yang lengkapdari molekulnya yang tidak diketahui. (Pavia, 1979)2.5.1. Spektroskopi Ultra Violet-Visible

Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang danintensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel. Sinarultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikanelectron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektroskopi UV-Visbiasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks di dalam larutan.Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan sinar tampakberada pada panjang gelombang 400-800 nm. (Dachriyanus, 2004)

Spektrum flavonoida bisanya ditentukan dalam larutan dengan pelarutmethanol (MeOH, AR atau yang setara) atau etanol (EtOH), meski perlu diingatbahwa spektrum yang dihasilkan dalam etanol kurang memuaskan. Spektrum khasterdiri atas dua maksimal pada rentang 240 285 nm (pita II) dan 300-550 nm (pita

I).Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksimal tersebut memebrikan informasi


24/32

yang berharga mengenai sifat flavonoida dan pola oksigenasinya. Ciri khas spektrumtersebut ialah kekuatan nisbi yang rendah pada pita I dalam dihidroflavon,dihidroflavonol, dan isoflavon serta kedudukan pita I pada spektrum khalkon, auron,dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang tinggi.Tabel Rentangan serapan spektrum UV-tampak flavonoida

Pita II (nm)

Pita I (nm)

Jenis flavonoida

250-280250-280250-280245-275

275-295230-270(kekuatan rendah)230-270(kekuatan rendah)270-280

310-350330-360350-385310-330 bahu kira-kira320 puncak300-330 bahu340-390380-430465-560

FlavonFlavonol (3-OH tersubstitusi)Flavonol(3-OH bebas)IsoflavonIsoflavon (5-deoksi-6,7-deoksigenasi)Flavanon dan dihidroflavanolKhalkonAuronAntosianidin dan antosianin

(Markham, 1988)Dibawah ini daftar beberapa pengaruh substituent untuk senyawa aromatik. Hal ini dapat menjadi catatan bahwa ion phenoxide (-O-), yang dapat dijunpai dalam larutanbasa senyawa fenol, dimana dapat menyerap panjang gelombang yang lebih panjangdari pada senyawa induk fenol (-OH). Secara umum menyumbangkan elektron dansubstituent pasangan sunyi (lone pair) yang dapat menyebabkan pergeseran kimiaberwarna merah dan penyerapan yang lebih tinggi. Senyawa kompleks memilikipergeseran kimia yang meningkat saat ada sejumlah lebih substituent yang terikat


25/32

.


26/32

Tabel. Absorbsi max untuk beberapa monosubstitusi benzene Ph-R (methanol :air)

R

. maksimum (nm)

-H

204 254

-CH3

207 261

-Cl

210 264

-OH

211 270

-OCH3

217 269

-CO2-

224 271

-COOH

230 280

-NH2

230 280

-O-

235 287

(Kealey,D. 2002)Absorbsi radiasi UV oleh senyawa aromatik yang terdiri dari cincin benzene terpadubergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang dengan bertambah banyaknyacincin itu karena bertambahnya konjugasi dan membesarnya stabilisasi-resonansi darikeadaan eksitasi. Daerah yang paling berguna dari spektrum UV adalah daerah denganpanjang gelombang di atas 200 nm. Dalam absorbsi yang ditimbulkan oleh senyawaaromatik dihasilkan warna dalam spektrum tampak. Warna merupakan hasil dari suatuperangkat kompleks (dari) respons faali maupun psikologis terhadap panjanggelombang cahaya antara 400-750 nm, yang jatuh pada selaput jala.Tabel. Warna dalam spektrum tampak


27/32

. maks (nm)

Warna

Warna komplementer(substraksi)

400-424

Ungu

Hijau-kuning

424-491

Biru

Kuning

491-570Hijau

Merah

570-585

Kuning

Biru

585-647

Jingga

Hijau-biru

647-700

Merah

Hijau

(Fessenden,F. 1986)


28/32

Tabel Pita absorbsi UV dari flavonoidaNo. Jenis Flavonoida Struktur Umum Pita II Pita I1. Flavon 240-285 304-35078OO65109121'2'6'5'4'3'43

2. Flavonol 240-285 352-3903. Flavanon 270-295 300-3504. Dihidroflavonol 270-295 300-3205. Khalkon 220-270 340-3906. Auron 220-270 370-4307. Antosianidin 270-280 465-550(Sujata,V., 2005)

OOOHOOOOOHR2R1OOOHCOOH


29/32


30/32

4. Daerah sidik jari finger print , 1.500 700 cm-1Beberapa frekuensi gugusan (group frequency) juga bisa ditemukan di daerah sidik jari ini : C-O-C (vibrasi regang) dalam eter, ester kira-kira 1.200 cm-1 dan vibrasiregang C-Cl pada 700 800 cm-1. Pada bilangan gelombang dibawah 1.200 cm-1terdapat puncak-puncak serapan beberapa gugusan anorganik seperti : sulfat, fosfat,nitrat dan karbonat.b. Vibrasi kerangka suatu molekul (skeletal vibrations)Vibrasi kerangka terletak di derah spektrum lebih dari 1.500 cm-1. Kelompik-kelompok vibrasi di daerah spektrum kecil dari 1.500 cm-1 adalah :a. Vibrasi regang (stretching) ikatan ganda yang tidak mengandung atom Cb. Vibrasi regang ikatan tunggalc. Vibrasi-vibrasi lentur (bending) (Noerdin, 1985)2.5.3. Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)Spektrometri Magnetik Inti (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) merupakan

alat yang berguna pada penentuan struktur molekul organik. Teknik ini memberikan informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam. Struktur NMR memberikaninformasi mengenai lingkungan kimia atom hidrogen, jumlah atom hidrogen dalamsetiap lingkungan dan struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atomhydrogen.(Cresswell,1982)Pergeseran kimia adalah pengukuran medan dalam keadaan bebas. Semuaproton-proton dalam satu molekul yang ada dalam lingkungan kimia yang serupakadang-kadang menunjukkan pergeseran kimia yang sama. Setiap senyawamemberikan penaikan menjadi puncak absorbsi tunggal dalam spektrumNMR.(Bernasconi,1995)

Senyawa yang paling lazim dan paling berguna dipakai sebagai acuan adalahtetrametilsilana (TMS). Senyawa ini mempunyai beberapa kelebihan; lamban secara


31/32

kimia, isotop magnet, serta larut dalam kebanyakan pelarut organik; TMS meberikanpuncak serapan tajam tunggal serta menyerap pada medan lebih tinggi daripada semuaproton organik. (Silverstein, 1974).Pada spektormetri NMR integrasi sangat penting. Harga integrasimenunjukkan daerah atau luas puncak dari tiap-tiap proton. Sedangkan luas daerah atau luas puncak tersebut sesuai dengan jumlah proton. Dengan demikianperbandingan tiap integrasi proton sama dengan perbandingan jumlah proton dalammolekul. (Muldja, 1955)Di dalam medan magnet, perputaran elektron-elektron valensi dari protonmenghasilkan medan magnet yang melawan medan magnet yang digunakan. Hinggasetiap proton dalam molekul dilindungi dari medan magnet yang digunakan danbahwa besarnya perlindungan ini tergantung pada kerapatan elektron yangmengelilingnya. Makin besar kerapatan elektron yang mengelilingi inti, maka makinbesar pula medan yang dihasilkan yang melawan medan yang digunakan. Akibat

secara keseluruhan adalah inti/proton merasakan adanya pengurangan medan yangmengenainya. (Sastrohamdijojo, 1991)SiCH3CH3CH3H3C


32/32

Chapter II Flavonoid

Documents

Transcript of Chapter II Flavonoid