Chapitre I : Le sang et l’hématopoïèse
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Chapitre I : Le sang et l’hématopoïèse
1- Caractères physiques du sang
• Un tissu liquide.
• Plus dense que l’eau.
• Visqueux
• Rouge clair (oxygéné) et rouge foncé (perd son oxygène)
• Température (37°C).
• goût légèrement salé.
• Le volume total (environ 5 litres).
2- Hématopoïèse et cellules souches myéloïdes
L'hématopoïèse : la fabrication des cellules sanguines. Localisation de l'hématopoïèse : dans la moelle osseuse.
• De la naissance jusqu’à 5 ans : dans tous les os. • Après 5 ans : les os plats (crâne, sternum, côtes, vertèbres et os du bassin) et même les
épiphyses des os long.
Cellules souches hématopoïétique (CSH):
Os long
Épiphyse
L’hématopoïèse
Épiphyse
Cellule souche lymphoïde Cellule souche Myéloïde
Auto-renouvellement
CSH
LB LT NK Plaquettes Granulocytes Monocytes Érythrocytes
3- Les organes hématopoïétiques
Organes lymphoïdes primaires : La Moelle osseuse : myélopoïèse et lymphopoïèse B. Thymus : Lymphopoïèse T (les cellules souches lymphoïdes sont dans la moelle osseuse).
Organes lymphoïdes secondaires : passage et accumulation des cellules immunitaire. Ganglions, rate, amygdales, intestin.
3-1- Moelle osseuse :
Deux types : - Moelle osseuse rouge : lieu de l’hématopoïèse. - Moelle osseuse jaune : la moelle adipeuse.
Les cellules hématopoïétiques : L'hématopoïèse comporte 4 compartiments: Les cellules souches Les progéniteurs Les précurseurs Les cellules matures
Compartiments des cellules hématopoïétiques
3-2- Thymus :
• Les LT immatures de grandes tailles (lymphoblastes) qui produisent des cellules de plus petite taille (thymocytes) qui migrent vers le cortex profond, certains dégénèrent et sont phagocytés par les macrophages.
• Les thymocytes restants migrent vers la médulla et subissent des sélections par les cellules dendritiques, cela conduit à la maturation.
• Les corpuscules de Hassal correspondent à des cellules épithéliales dégénératives.
3-3- Rate :
La rate est constituée de : • La pulpe rouge : lieu de l’élimination des hématies vieillis et altérés • La pulpe blanche : le composant immunitaire de la rate (LB, LT, Macrophage)
La rate produit la réponse immunitaire contre les antigènes véhiculés par le sang. Remarque : le centre germinatif est une structure spécialisée se formant suite à l'activation des lymphocytes B par leur antigène.
Organisation cellulaire du thymus humain
Cellule épithéliale du cortex
Thymocyte
Cellule épithéliale de la médulla
Cellule dendritique
Macrophage
Capsule
Septum
Epithélium sous-
capsulaire
Jonction cortico-
médullaire
Corpuscule de Hassal
Cortex
Médulla
Lymphoblaste
3-4- Les ganglions lymphatiques :
Produit la réponse immunitaire contre les antigènes véhiculés par la lymphe.
Le cortex : • Le cortex externe contient des follicules lymphoïdes riches LB et des sinus
lymphatiques. • Le cortex profond héberge des LTh qui interagissent avec les LB pour produire une
réponse immunitaire. La médulla :
• Les sinusoïdes médullaires. • Des cordons médullaires contenant cordon des macrophages et des plasmocytes.
Les plasmocytes, migrent du cortex vers les sinus médullaires pour sécréter leurs immunoglobulines directement sans quitter le ganglion.
La rate
3-5- Les tissus lymphoïdes associés aux muqueuses :
Les tissus lymphoïdes associés aux muqueuses (MALT) sont les tissus lymphoïdes secondaires collectant les antigènes provenant du tractus respiratoire, gastro-intestinal et uro-génital (GALT et BALT). Exemple : (La plaque de Peyer) : présent dans la muqueuse intestinale de l’iléon. Une plaque de Peyer est formée des composants suivants : (1) l'épithélium de surface : constitué de cellules M (intercalées entre les entérocytes), spécialisées dans le transport des antigènes. Les cellules M peuvent introduire des LB et des monocytes qui, eux, peuvent internaliser des antigènes au sein du cytoplasme de la cellule M. (2) Les follicules lymphoïdes : riches en LB, chaque follicule est composé d’un centre germinatif et d’une zone de manteau. (3) Le dôme : sépare les follicules de l'épithélium superficiel et contient de nombreuses cellules présentatrices de l’antigène (macrophages). (4) Les lymphocytes T sont distribués entre les follicules.
Epithélium de surface
Sinus sous-capsulaire
Capsule (tissu
conjonctif)
Un ganglion lymphatique
Plaque de Peyer
Cordon médullaire
Chapitre II : Erythropoïèse et Erythrocytes
1- Définition de l’érythropoïèse :
Renouvellement des globules rouges afin de compenser leurs pertes.
2- Les divers stades de la formation des érythrocytes :
• CSH CS myéloïde CFU-GEMM.
CFU-GEMM BFU-E (Burst Forming Unit – erythroid) CFU-E.
• Différenciation des CFU-E en proérythroblastes
• Les proérythroblastes subissent 4 mitoses successives donnent naissance en 5 à 7 jours
aux réticulocytes qui évoluent en GR matures en 3 jours.
Proérythroblaste
Erythroblastes basophiles I
Erythroblastes basophiles II
Erythroblaste polychromatophiles
Erythroblastes acidophiles
16 Réticulocytes
3- Régulation de l'érythropoïèse :
3-1- Régulation positive :
a) Eléments nécessaires à l'érythropoïèse :
- Fer : est essentiel à la synthèse de l'hémoglobine
- Acides aminés : nécessaire à la synthèse de la globine et l’hème (synthèse de la
protéine d’hémoglobine)
- Les Vitamines : la vitamine B12 et les folates (vitamine B9): rôles principalement
liés à la synthèse d’ADN
- Autres substances nécessaires :
� Cuivre: favorise l’absorption intestinale du Fer, et la libération du fer par
les macrophages
� Vitamine B6: coenzyme d’ALA-synthétase synthèse l’ALA (acide
delta amino-lévulinique) indispensable à la synthèse de l’hème
� Vitamine C: facilite l’absorption intestinale du fer
b) Facteurs de croissance (FC) :
- L'érythropoïétine (EPO) : Hormone glycoprotéique (FC majeur de
l'érythropoïèse).
EPO permet la différentiation et la prolifération des BFU-E tardifs en CFU-E.
Mais surtout permet cette différenciation : CFU-E PE EB.
Molécule d’hémoglobine
- Autre cytokines :
* Interleukine 3
* GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor).
* SCF (Stem Cell Factor).
* Interleukine 9.
* Interleukine 11.
3-2- Régulation négative : Pour éviter une trop forte production de globules rouges,
l’érythropoïèse doit être régulée de façon négative comme suit :
� Cytokines inhibitrices: TNF alpha et interféron gamma libérés par les macrophages
ont une action négative sur la prolifération des CFU-E et des proérythroblastes.
� La sécrétion de l’EPO diminue.
� Caspase : enzyme provoquant l’apoptose des cellules qui forment les érythrocytes.
4- Aspects morphologiques :
1. Proérythroblaste :
� Cellule arrondie
� Taille = 20-25 µm de diamètre
� Rapport nucléo cytoplasmique élevé
� Noyau = rond ; chromatine fine et nucléoles nets
� Cytoplasme = intensément basophile
2. Erythroblaste basophile :
� Taille : 14-18 µm
� Noyau rond
� La chromatine se condense
� Le cytoplasme reste basophile
3. Erythroblaste polychromatophile :
� Taille : 12-15 µm
� Noyau rond dont la chromatine se condense plus
nettement
� Le cytoplasme devient gris (superposition du bleu
de l’ARN et de l’orangé de l’hémoglobine)
4. Erythroblaste acidophile :
� Petite cellule (8-10 µm)
� Petit noyau rond et dense
� Cytoplasme qui a presque la couleur d’une hématie
5. Réticulocyte: Expulsion du noyau de l'érythroblaste
acidophile.
De taille et de volume un peu supérieurs à ceux du GR
(8 µm de diamètre), il possède des ribosomes et des
mitochondries.
5- L’érythrocyte :
Le globule rouge, encore appelé hématie ou érythrocyte est la cellule sanguine la plus
abondante. Elle est ainsi appelée à cause de la couleur rouge-rosé qu'elle prend à la coloration
de May Grunwald Giemsa (MGG), au microscope optique. Cette coloration est due à son
contenu en hémoglobine.
5-1- Morphologie : disque biconcave, 7 µm de diamètre et 2 µm d’épaisseur. Cellule
dépourvue de noyau et d’organites.
Physiologiquement, les hématies d'un frottis sanguin sont de même taille, de même forme et
de même couleur.
5-2- Pathologie :
Les plus importantes sont :
Anisocytose : hématies de diamètres différents.
Anisochromie: hématies de colorations différentes.
Poïkilocytose : hématies de formes différentes.
Dacryocyte : (encore appelé "hématie en larme"
ou "en poire") hématie à extrémité allongée ou
effilée.
Corps de Howell-Jolly : granule sphérique de
1µm de diamètre environ, coloré en violet foncé
au MGG, correspondant à un fragment de
chromosome isolé lors de la mitose.
Anneau de Cabot : persistance anormale de fibres
du fuseau mitotique dans une hématie, sous forme
d'un fil rouge ou violet au MGG, en cercle ou en
huit.
6- Biochimie des constituants érythrocytaires :
Trois éléments : la membrane, les enzymes, et l'hémoglobine.
6-1- la membrane : * Lipides = 42%.
* Glucides = 8%.
* Protéines = 50%.
6-2- Métabolisme et enzymes érythrocytaires : plusieurs enzymes du stock érythrocytaire
interviennent dans ces réaction.
6-2-1- Métabolisme énergétique :
La voie principale (glycolyse) : transformation du glucose en pyruvate. Les molécules
générées : l'ATP et le NADH, H+, 90 % du glucose est catabolisé par cette voie.
La voie accessoire (cycle des pentoses phosphates) : assure 10 % du catabolisme du
glucose, régénère du NADPH, H+.
6-2-2- Système d’oxydoréduction :
Le glutathion : tripeptide formé d'acide glutamique, de cystéine et de glycine
Le glutathion réduit permet la détoxication des peroxydes (R-O-O-R', ex : H2O2) et donc
protège contre l'oxydation de l’hémoglobine.
2 GSH + peroxyde GSSG + peroxyde réduit.
6-3- l’hémoglobine : 6-3-1- Fonction : transport d’O2 et du CO2, et des échanges gazeux au niveau des tissus et du
poumon.
6-3-2- Structure : partie protéique (4 chaînes de globine) et une partie non protéique ou
groupement prosthétique (4 molécules d'hème) :
• L'hème : protoporphyrine comportant Fe2+
(fer ferreux).
Ponctuations basophiles et érythroblastémie :
Ponctuations basophiles (pb) : fines granulations bleutées au MGG,
dispersées dans le cytoplasme des hématies, de taille et de forme
hétérogènes, correspondant à une précipitation nucléotidique.
Erythroblaste circulant (ec) : présence anormale d'érythroblastes dans le
sang, le plus souvent acidophile ou polychromatophile.
Glutathion
• La globine : Chaque molécule d'Hb est formée de 4 sous-unités identiques deux à deux
: 2 chaînes α, et 2 chaînes β.
6-3-3- Biosynthèse :
Début : proérythroblaste et fin : réticulocyte.
1- Formation d'acide delta amino-lévulinique (ALA).
2- Formation de la protoporphyrine : suite de réactions.
3- Incorporation du fer.
6-3-4- Méthodes d’études : en plus de l’hémoglobine normale, il existe des Hb anormales,
exemples : HbS, HbC, HbE.
Il y a plusieurs méthodes qui permettent la différenciation des différentes hémoglobines
(normale ou anormale), les plus courantes :
• Electrophorèse
• Chromatographie
6-3-5- hémoglobines anormales : Les gènes de globine peuvent être le siège d'anomalies
moléculaires. On distingue deux grands groupes d'anomalies :
• Anomalie de structure, exemple de la drépanocytose : anémie à cellules falciformes.
• Un déficit de synthèse des chaînes de globine, exemple des thalassémies.
Protoporphyrine L’hème
Succinyl ─ CoA Glycine ALA
ALA synthase
CO2
+
CoA─SH
Ferrochélatase
Fe++
2H+
Séparation et
caractérisation des
molécules
Cycle de Krebs
7- Le métabolisme du fer :
7-1- Absorption digestive :
Alimentation : Apport de 10 à 15 mg / jour.
L'absorption par l'intestin ne dépasse pas 10 à 15% de ce contenu, seulement 2 à 4 mg/jour
absorbé sous forme de Fe++
.
Mécanisme : Réduction du Fe+++
(alimentaire) en Fe++
par une ferriréductase dans les
microvillosités de l’intestin grêle.
Transport du Fe++
par transporteur transmembranaire DMT1 (pôle apical de l'entérocyte).
Export du Fe++
par la ferroportine (pôle baso-latéral de l'entérocyte).
Oxydation du Fe++
en Fe+++
par la ferroxydase.
7-2- Transport :
2 Fe+++
sont liés à une molécule appelée : transferrine, qui amène le fer à la moelle osseuse.
8- Hémolyse :
L'hémolyse est le phénomène irréversible par lequel les globules rouges sont détruits et
libèrent leur contenu hémoglobinique.
8-1- Hémolyse physiologique :
Il s'agit d'un phénomène qui touche les hématies à la fin de leur vie dont la durée moyenne est
de 120 jours.
8-2- Hémolyse pathologique :
Elle peut être due à deux mécanismes principaux:
• Soit une anomalie du globule rouge : hémolyses corpusculaires ou globulaires
- Anomalie de la membrane.
- Anomalie de l'hémoglobine
- Déficit enzymatique
• Une agression extrinsèque des hématies : hémolyses extra corpusculaires
9- Les anémies :
9-1- Définition :
C’est une diminution du nombre des globules rouges, plus exactement, elle se caractérise par
la baisse du taux de l’hémoglobine du sang circulant par rapport à des valeurs normales.
9-2- Classification : Elles peuvent être classées également selon leurs caractéristiques sur la numération
globulaire :
• anémie arégénérative : les réticulocytes ne sont plus produits ce qui signe une anémie
centrale.
• anémie hypochrome : la teneur des hématies en hémoglobine (Teneur corpusculaire
moyenne en hémoglobine) est inférieure à la norme, par carence en fer par exemple.
• anémie macrocytaire : la taille des hématies (Volume globulaire moyen) est supérieure
à la norme, par carence en vitamine B12 ou en folates par exemple.
• anémie microcytaire : la taille des hématies (Volume globulaire moyen) est inférieure
à la norme, par carence en fer par exemple.
9-3- physiopathologie :
3.1. Origine centrale : insuffisance de production médullaire
Ce sont des anémies arégénératives; le taux des réticulocytes diminue, ou nous avons des
cellules effondrés.
Elles révèlent un trouble de la production des GR, en raison de:
− Diminution de la synthèse de l’Hb (carence en fer) ou de l'ADN (carence en folates ou en
B12)
− Diminution de la synthèse de l’Epo
− Atteintes des progéniteurs des GR, ou de la cellule souche
− Envahissement médullaire par une hémopathie maligne, un cancer ou une infection
3.2. Origine périphérique : raccourcissement de la durée de séjour des hématies dans la
circulation.
Ces anémies sont régénératives: la moelle est hyperproductive afin de compenser la perte des
globules rouges. Les réticulocytes sont élevés. Toutefois, un délai de 2 à 3 jours est nécessaire
avant que les réticulocytes ne soient déversés dans la circulation. Ces anémies relèvent de 2
entités :
− Les hémorragies
− L’hyperhémolyse pathologique.
Fiche TD n°1 Immunologie-Hématologie
Université Hassiba Benbouali de Chlef
Faculté SNV
Département de biologie
L3 Microbiologie
Les prélèvements en hématologie et transfusion sanguine
Analyses de la quantité et la qualité des éléments du sang : érythrocytes, leucocytes,
plaquettes, hémoglobine, vitesse de sédimentation, coagulation…etc.
1- Prélèvement du sang en hématologie :
1-1- Conditions du prélèvement :
Prélèvement effectué sur le sujet reposé, de préférence à jeûne (la période doit être supérieure
à 12 h).
Port des gants obligatoire.
1-2- Conditions de conservation et de transport :
Conserver les prélèvements à la température ambiante et les amener le plus rapidement
possible au laboratoire.
1-3- Principaux anticoagulants utilisés en Hématologie :
1-4- Mode opératoire
- Se munir d'une seringue au volume correspondant aux analyses qu’on veut faire.
- Le prélèvement se réalise au pli du coude, Aux avant-bras et sur la face dorsale de la
main. Pour faire saillir la veine, faire serrer le poing par le patient.
On cherche le site de ponction dans l’ordre suivant : 1, 2, 3.
Coagulation FNS
Vitesse de sédimentation
(VS)
- Garrotter le bras du patient. Déterminer le point de pénétration de l’aiguille par
palpation. Toujours désinfecter après palpation.
Le délai entre la pose du garrot et le prélèvement ne doit pas excéder 1 minute. La pose
prolongée d’un garrot peut fausser le résultat de certaines analyses.
- Désinfecter la zone cutanée.
- Lorsque le sang est prélevé retirer la seringue est remplir les tubes immédiatement.
- Remuer soigneusement ceux contenant l'anticoagulant: agitation par retournement 8 à
10 fois.
- Identifier immédiatement les tubes.
2- Modalités du prélèvement du sang en transfusion sanguine :
Une transfusion sanguine est une opération consistant à injecter, par perfusion intraveineuse,
du sang ou des dérivés sanguins.
Qui peut donner le sang ?
- Toute personne en bonne santé,
- Agée de 18 à 65 ans,
- Qui a un poids et une taille suffisants,
- Ne présentant pas de risque de maladies transmissibles par le sang
Le prélèvement :
Un médecin ou une infirmière place une aiguille stérile et à usage unique dans une veine du
pli du coude. Lors du prélèvement, la poche sera étiquetée et des échantillons seront recueillis
afin d’effectuer des analyses en laboratoire.
Pli du coude
Avant bras
Face dorsale de la main
1
2
3
1
Fiche TD n°2 Immunologie-Hématologie
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L3 Microbiologie
L’hémogramme
I- Définitions :
L’hémogramme ou Numérations-Formule Sanguine (NFS) englobe:
1) Numérations: GR (ou érythrocytes ou hématies), GB (ou leucocytes), Plaquettes (ou
Thrombocytes). (nb de cellules/mm3)
2) Valeurs et constantes:
-érythrocytaires:
� Taux Hémoglobine sanguin Hb : exprimé en g/dl (Dosage spectrophotométrique à 540
nm).
� Hématocrite Hte : Mesure du volume occupé par les globules rouges dans un échantillon
de sang par rapport au volume de celui-ci, exprimé en pourcentage.
Hte% = (Vol. globulaire / Vol. sanguin total) x100
� Volume Globulaire Moyen VGM : désigne le volume moyen, la taille de chaque globule
rouge, calculée par le rapport entre l’hématocrite et le nombre d’hématies, exprimé en fL
(femtolitre) (10−15
litre), fL = µm3.
VGM (L) = Hématocrite (nombre compris entre 0 et 1) / Nombre de Globules Rouges
par litre conversion en femtolitre.
� Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb CCMH : concentration moyenne en
hémoglobine contenu dans 100 ml d’hématie (hémoglobine divisée par hématocrite),
exprimée en g/100 ml.
CCMH = Hémoglobine (g/dl) / Hématocrite (L.L-1
).
� Taux Corpusculaire Moyen en Hb TCMH : poids moyen d’hémoglobine contenu dans
une hématie, exprimé en pg (picogramme) (10-12
g)
TCMH = Hémoglobine (g/L) / Nombre de Globules Rouges par litre conversion
en picogramme.
2
-plaquettaires:
� Thrombocrite THT
� Volume Plaquettaire Moyen VPM
II- Indications de l’hémogramme : 1) Des signes évoquant une diminution ou augmentation d’une ou plusieurs lignées
sanguines
2) Atteinte de l’état général (exemple : anorexie)
3) Certaines situations précises (exemple : grossesse)
III- Valeurs normales :
GR Homme 4,5 à 6 .10
6 /mm
3
Femme 3,8 à 5,5 .106 /mm
3
Hématocrite Homme 40 à 54 %
Femme 37 à 47 %
Hémoglobine Homme 13 à 17 g/100ml
Femme 12 à 16 g/100ml
VGM 82 à 98 fl
CCMH 32 à 36 g/100ml
TCMH 27 à 32 pg
Plaquettes 150 000 à 450 000 /mm3
GB 5000 à 10 000 /mm3
Granulocyte neutrophile 1500 à 7000 /mm3
Granulocyte éosinophile 0 à 400 /mm3
Granulocyte basophile 0 à 100 /mm3
Lymphocyte 1500 à 4000 /mm3
Monocyte 200 à 800 /mm3
Même signification que celles des globules
rouges, sauf qu’ils sont spécifiques pour les
plaquettes.
Uni
L3 Microbiologie
TP n° 01 : n
1) But de la manipulation
Numération des globules rouges
2) Principe
Le principe de la numération d
comptage des cellules.
Lecomptage est réalisé sous
d'unecuvette microscopique de
(cellule de Malassez).
3) La cellule de Malassez
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Département de biologie
: numération manuelle des hématie
lation
rouges et blancs contenus dans 1mm3 de sang.
tion des hématieset leucocytes est basé sur la dilu
sous microscope en utilisant une cellule de n
ue de 1 mm3 de volume et dont le fond est qu
lassez :
Cellule de Malassez
Quadriallage de la cellule de Malassez
ématies
la dilution du sang et le
de numération dotée
est quadrillé en carrés
La gravure d'une lame de Malassez se compose d'un certain nombre de traits, délimitant en
fait, 100 rectangles, dont certains sont subdivisés en 20 petits carreaux.
Longueur = 0,25 mm
Largeur = 0,20 mm
Profondeur = 0,20 mm
Le volume total de la cellule est de 1 mm3(2,5 × 2 × 0,20)
Le quadrillage est donc constitué de 10 bandes verticales de 0,25 mm de large et de 10 bandes
horizontales de 0,20 mm de large formant ainsi 100 rectangles, on ne comptera les cellules
que dans 10 des 25 rectangles non contigus pris au hasard dans la cellule.
Pour réaliser le remplissage de la cellule, il faut :
• Humidifier les glissières latérales sur lesquelles va reposer la lamelle
• Déposer la lamelle sur les rebords, celle-ci doit adhérer par un "effet ventouses"
• Placer l'extrémité de la pipette sur la partie 2 contre la lamelle et délivrer par capillarité le
liquide en évitant tout débordement vers les rigoles.
4) Les pipettes de POTAIN :
La grande pipette est marquée 101 au-dessus de la boule, elle sert au comptage des hématies
dont le nombre est très grand. On dilue donc 1 partie de sang pour 100 parties de solution de
HAYEM ou d’eau physiologique (NaCl à 0.9%).
La petite est marquée 11 elle sert à diluer le sang au 1/10ème
avec la solution de LAZARUS qui
détruit les hématies et colore les globules blancs.
5) Mode opératoire
a- Dilution du sang :
Plonger la pipette (101 ou 11) qui doit être propre et sèche dans une goutte de sang. Aspirer
jusqu'au trait 1, essuyer la pointe à l’aide de papier hygiénique puis diluer avec les solutions
de HAYEM, d’eau physiologique ou de LAZARUS :
• Globules rouges : aspirer jusqu'au repère 101 la solution de HAYEM ou d’eau
physiologique.
• Globules blancs : aspirer jusqu'au trait 11 la solution de LAZARUS.
Maintenir la pipette horizontalement et la faire rouler entre les doigts. La petite boule à
l'intérieur assurera le mélange.
b- Comptage :
Bien nettoyer la cellule avant de l'utiliser, prendre la pipette de POTAIN et soufflez pour
rejeter les premières gouttes contenues dans la tige.
Déposer alors une goutte du mélange sur la zone quadrillée de la cellule recouverte d'une
lamelle en évitant les bulles d'air. Disposer sous le microscope au grossissement de 400 fois et
compter les cellules.
• Globules rouges
Compter le nombre d'hématies dans 10 rectangles et faire la moyenne - les rectangles seront
choisis au hasard.
C1 + C2 + C3 + ……. + C10
Moyenne MH =
10
Le nombre d'hématies NH = MH × 100 × 100 (hématies / mm3)
1mm3 = 100 rectangles, dilution du sang 100.
• Globules blancs Leur nombre étant plus réduit on comptera sur les rectangles constitués de 20 petits carrés -
on choisira 5 rectangles au hasard.
C1 + C2 + C3 + C4 + C5
Moyenne M =
5
Nombre de Globules blancs N = M × 100 × 10 (leucocytes / mm3)
1mm3 = 100 grands carrés, dilution du sang 10 fois.
Comparer les résultats de plusieurs échantillons de sang
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L3 Microbiologie-Parasitologie
TP n° 02 : détermination des taux d’hémoglobine et d’hématocrite
I- l’hémoglobine (Hb)
1) But de la manipulation
Détermination de la valeur de l’hémoglobine.
2) Principe
Le sang est dilué dans le réactif de DRABKIN (dissoudre dans 1 litre d’eau distillée 200 mg
de Ferricyanure de K, 50 mg de Cyanure de K et 140 mg de PO4H2K), l’Hb (Fe++) est oxydée
par le Ferricyanure de K en méthémoglobine (Fe+++).
La méthémoglobine ainsi formée se combine avec le cyanure de K pour former un complexe
(la cyanméthémoglobine) qui a un fort pouvoir d’absorption lumineuse à 540 nm.
L’absorbance de la solution est mesurée par le spectrophotomètre à 540 nm en considérant la
solution de Drabkin comme blanc. Les résultats sont exprimés en g/dl.
3) Méthode - Mettez 4 ml de la solution de Drabkin dans un tube.
- Prenez 20 µl de notre échantillon de sang avec une pipette, puis nettoyez bien sa partie
terminale et la verser dans le tube contenant le diluant (solution de Drabkin)
(dilution=1/200).
- Bien agiter et laisser le mélange reposer 5 à 10 minutes (réaction des deux solutions).
- Lire l’absorbance par spectrophotomètre à 540 nm.
4) Calcul
Absorption de l’échantillon
Hb (g/dl) = -------------------------------------X concentration du blanc
Absorption du blanc
5) Précautions à prendre :
- Bien agiter le sang avant manipulation.
- Attention au moment de l’utilisation du cyanure de K.
6) Valeurs normales :
• Homme adulte: 13-17 g/dl
• Femme adulte: 12- 16 g/dl
• Enfant: 11-14 g/dl.
• Nouveau né: 13.0-20 g/dl
II- l’hématocrite :
1) But de la manipulation
Détermination de la valeur de l’hématocrite.
2) Principe :
L’hématocrite représente le volume occupé par les hématies dans un volume de sang total
connu.
La détermination se fait en séparant les hématies du plasma par centrifugation du sang dans
des conditions standardisées de durée et de vitesse.
3) Matériel : -Prélèvement sanguin : sang capillaire ou sang veineux prélevé sur EDTA
-Tube hématocrite : tube capillaire de 75 mm de long et de 1mm de diamètre ouvert aux deux
extrémités
-Centrifugeuse : présente un plateau spécial et peut tourner à 10 000 tours/min
4) Technique :
-Plonger une extrémité du tube dans le sang veineux homogénéisé (ou dans une goutte du
sang capillaire)
-Laisser le sang monter par capillarité, arrêter le remplissage à environ 1cm de l’autre
extrémité
-Essuyer l’extérieur du tube avec un papier imprégné d’éthanol
-fermer l’extrémité libre avec la pâte à sceller
-Placer le tube sur le plateau, l’extrémité scellée vers la périphérie
-Centrifuger 3min à 10 000 tours/min
-Lire sur un abaque permettant de ramener la hauteur totale du sang à 100%
Calculer la valeur de l'hématocrite suivant la relation :
H (en%) = (Niveau du culot) / (Hauteur globale) x 100