Nguyễn Quang Huy

Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Phạm Thành Hổ TS. Phan Thị Phương Trang

Cac hệ thông biêu hiện trong nâm men

I. Giới thiệu chung

• 　 Sinh vât eukaryote đơn bào• 　 1.000 loài men đã được tìm thấy và miêu tả• 　 Ngành Nấm túi (Ascomycota), ngành Nấm đảm

(Basidiomycota).• Sinh lý học: Vi sinh vât hiếu khí bắt buộc hoặc ky khí

không bắt buộc• Sinh sản: vô tính bằng mọc chồi hay hữu tính bằng tạo

nang bào tử• 　 Ưng dung:- Quá trình phân hủy glucose :

C6H12O6 →2C2H5OH + 2CO2

Sản xuất rượu vang, bánh mì và bia (Saccharomyces cerevisiae)- Đối tượng mô hình nghiên cứu sinhvât eukaryote- Sản xuất các protein đơn bào và protein tái tổ hợp: hepatitis

B, urate oxidase, glucagon, GM-CSF, hirudin, insulin, interleukin, albumin, và TNF…

http://www.diwinetaste.com/dwt/en2007016.php

http://www.azurebio.com/formulation.html

Hệ thông phân loại :• Giới: Nấm• Ngành: Ascomycota• Ngành phu: Saccharomycotina• Lớp: Saccharomycetes• Bộ: Saccharomycetales• Họ: Saccharomycetaceae• Giống: Pichia• Loài: Pichia pastorisĐặc điêm:• sống ở 30-32oC• pH= 3-7. • biến dưỡng methanol, glucose, sorbitol, glycerol... và cần nhiều oxy trong quá

trình biến dưỡng các nguồn Cacbon.

http://bioinformatics.psb.ugent.be/genomes/

I. Giới thiệu chung nâm men Pichia pastoris

II. Đặc điêm hệ thông biêu hiện Pichia pastoris

1. Chung biêu hiện

Bắt nguồn từ chủng NRRL-Y 11430 (Northern Regional Research Laboratories, Peoria, III), gồm hai gen mã hóa enzyme alcohol oxidase (AOX) là AOX1 và AOX2

• Kiểu hình Mut+: phát triển tốt trên môi trường có methanol giống chủng hoang dại (GS115 (his4) hoặc SMD1168 (pep4∆ his4))

• Kiểu hình MutS: gen AOX1 bị khuyết và thay bằng gen ARG4 ở S.cerevisae (chủng KM71 (aox1∆ ::ARG4 his4 arg4)).

• Kiểu hình Mut-: bị đột biến ở cả 2 gen AOX (chủng MC100-3 (his4 arg4 aox1∆::SARG4 aox2∆::Phis4)).

các chủng đột biến khuyết protease : proteinase A (PEP4) và proteinase B (PRB1) như: SMD1163 (his4 pep4 prb1), SMD1165 (his4 prb1), hoặc SMD1168 (his4 pep4)...

2. Vector biêu hiện

•Trình tự pUC ori cần thiết cho sự duy trì và sao chép plasmid trong tế bào E. coli.•AOX1 có trình tự 5’promoter và trình tự cần thiết cho sự kết thúc phiên mã 3’AOX1 TT.•vùng MCS cần thiết cho sự chèn gen muc tiêu•Trình tự gen ble, là gen kháng kháng sinh zeocin•Vị trí enzyme cắt giới hạn của SacI, PmeI, BstXI: giúp plasmid sát nhâp vào bộ gen Pichia ở locus AOX1.

Promoter AOX2 Promoter GAP Promoter FLD1

- mã hóa alcohol oxidase nhưng hoạt tính giảm khoảng 10-20 lần so với AOX1

-promoter mạnh được cảm ứng bằng glucose không thích hợp để sản xuất các protein có độc tính với P. pastoris.

-promoter mạnh và có chất cảm ứng đa dạng: methanol, methylaminethích hợp cho việc biểu hiện linh động protein tái tổ hợp ở mức độ cao.

3. Cac gen marker

Gen Chức năng

•His4 (histidinol

dehydrogenase gene)

•AGR4 (argininosuccinate

lyase gene)

•Geneticin G418

•gene Sh ble (375bp)

(zeocin resistance gene)

•Ampicilline gene

•Kháng geneticin

•Kháng zeocin

•Kháng

Ampicilline

Gen trong con

đường sinh tổng

hợp

4.Cơ chế sat nhập vector vào bộ gene P. pastoris

4.1. Sat nhập chèn gen

A

B

4. Cơ chế sat nhập vector vào bộ gene P. pastoris

4.2. Sat nhập thay thế

1. Cắt vector bằng enzyme cắt hạn chế2. Biến nạp vào P. pastoris: gen AOX1 của chủng chủ sẽ bị loại bỏ và thay vào đó là cassette biểu hiện và gen marker.3. Sàng lọc gen trên môi trường tối thiểu có methanol hoặc glucose

5. Sự biến đổi sau dịch mã

a. Glycosyl hóa protein ở vị trí N: - Chuyển nhóm oligosaccharide vào vị trí asparagine của protein- Phân nhánh nhiều và mang nhiều mannoseb. Glycosyl hóa ở vị trí O: - Tạo liên kết cộng hóa trị giữa monosaccharide với Serine hoặc Threonine- Chỉ mang khoảng 5 phân tử mannose Không quyết định sự gấp cuộn, tính tan, ảnh hưởng đến sự đáp ứng miễn dịch của protein ngoại lai

6. Sự tiết protein ngoại lai

Dễ nuôi cấy mât độ cao với thành phần môi trường xác định

Khả năng tiết protein mạnh và cơ chế điều hòa nghiêm ngặt

Có hệ thống biến đổi sau dịch mã Sản phẩm thu được ở dạng gấp cuộn có hoạt tính Loại methionine đầu mạch làm tăng độ bền protein và

giảm tính kháng nguyên

Ưu điêm cua Pichia pastoris so với cac hệ thông biêu hiện khac

Nhược điêm cua Pichia pastoris so với cac hệ thông biêu hiện khac

Nghiên cứu khắc phục những nhược điêm cũng như phat huy cac ưu điêm cua hệ thông này.

- chất cảm ứng methanol dễ cháy nổ và có thể gây mù mắt yêu cầu độ an toàn cao cho ki thuât viên trong quá trình lên men công nghiệp

- protein ngoại lai được tiết ra ngoài dễ bị phân giải bởi các protease

- thời gian biểu hiện dài có thể làm một số protein tái tổ hợp kết tu do tính ky nước cao hay các tương tác phân tử

Sản xuất sinh khối và protein đơn bào

Cảm ơn thầy cô, anh chị và các bạn đã lắng nghe