BSc Biochemie 4.Semester VL Proteinchemie Proteasen · KATALYTISCHE TRIADE Numbering: bovine...
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LERNZIELE
2
• Klassifizierung der Proteasen
• Katalytische Mechanismen
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PROTEASEN SIND HYDROLASEN
3
Peptidbindung Stabil durch Doppelbindungscharakter Halbwertszeit Hydrolyse > 10 Jahre
Proteasen katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen
(Proteolyse)
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BEDEUTUNG VON PROTEASEN
4
Verdauungsenzyme, Spaltung von Proteinen: Chymotrypsin, Trypsin, Pepsin Biosynthese von Enzymen, Peptidhormonen: inaktive Vorläufer werden gespalten Signaltransduktion: inaktive Vorstufen Abbau von Proteinen in der Zelle: falsch gefaltet, alt, -> gezielter Abbau Immunsystem: Präsentation von bakt./vir. Fragmenten Abbau, Aktivierungskaskade Gerinngungssystem: Proteasekaskaden
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5
KLASSIFIZIERUNG VON PROTEASEN
Sechs Unterklassen (MEROPS-Datenbank) Serinproteasen Threoninproteasen (described first in 1995) Cysteinproteasen (auch “Thiolproteasen”) Aspartatproteasen Glutamatproteasen (described first in 2004) Metalloproteasen alle spalten Peptidbindungen, Unterschiede in: Struktur Katalysemechanismus meist lösliche Proteine, aber auch membranständige Proteasen bekannt
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MEROPS
6
Datenbank aller proteolytischer Enzyme, ihrer Substrate und Inhibitoren
X12.345
S, C, T, A, G, M, U
Clan
42 Clans e.g. clan PA
Chymotrypsin type peptidase Common ancestor
Similar fold
Family
176 families e.g. family S1
Chymotrypsin A type peptidase
Sequence
1816 proteases e.g. trypsin 1
S01.151
Primary structure
Tertiary structure
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PROTEASEN HABEN UNTERSCHIEDLICHE
STRUKTUREN
7
Beispiele
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ZWEI PRINZIPIELL UNTERSCHIEDLICHE
MECHANISMEN
8 Boris Turk, Nature Reviews, 2006, 5, 785
kovalent Säure-Base
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UNTERSCHIEDLICHE SUBSTRATE
9
Cathepsin L Cathepsin H Cathepsin X
Peptid-Substrat
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SERINPROTEASEN
10
6 Unterklassen (MEROPS-Datenbank)
Serinproteasen
Threoninproteasen
Cysteinproteasen
Aspartatproteasen
Glutamatproteasen
Metalloproteasen
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SERINPROTEASEN
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Serinproteasen – Trypsin, Chymotrypsin, Thrombin, Elastase, ....
First structures • bovine Chymotrypsin, 1967 David Blow • bovine Trypsin, Stroud & Dickerson • porcine Elastase, Shotton & Watson
-> Asp...His...Ser-Triade • untereinander mit H-Brücken stabilisiert • Asp nicht Lösungsmittel-zugänglich
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KATALYTISCHE TRIADE
12 Numbering: bovine chymotrypsinogen
Die katalytische Triade kann von unterschiedlichen Strukturen gebildet werden!
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SPEZIFITÄT DURCH SPEZIFITÄTSTASCHE
– DIVERGENTE EVOLUTION
13
Gegenwart bestimmter Aminosäureseitenketten in der Substrat-bindenden Grube -> Substratspezifität der Serinproteasen Chymotrypsin Platz für große hydrophobe Reste Trypsins negativ geladenes Asp -> basische Seitenketten (Arg, Lys), Elastase -> Grube ist durch sperrige Val- und Thr-Reste „verbaut“ -> spaltet Proteine bevorzugt an Aminosäuren mit kleinen Seitenketten.
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Konver
gente
Evolution
14
D-H-S H-D-S S-D-H D-H-S H-D-S S-D-H
D-H-S H-D-S S-D-H
D-H-S H-D-S S-D-H
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SERINPROTEASEN: S1-FAMILIE,
CHYMOTRYPSIN
15
Clan PA
≈
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SERINPROTEASEN: S8-FAMILIE,
SUBTILISIN
16
Clan SB
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SERINPROTEASEN: S10 FAMILIE,
CARBOXYPEPTIDASE Y
17
Clan SC
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CHYMOTRYPSIN
18
Topologie
Struktur weist zwei antiparallele β-Fass-Strukturen auf
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SUBTILISIN
19
andere Struktur
aber
identische
katalytische Triade
Topologie
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VORAUSSETZUNGEN
20
Chymotrypsin
Substrat in der Bindungstasche
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SERIN-PROTEASE
22
Kovalente Katalyse – 2 Schritte
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„CHARGE-RELAY“ SYSTEM
23
Asp102 Elektrostatische
Katalyse
His57 Säure/Base
Katalyse
Ser195 Kovalente Katalyse
electrons
protons
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TETRAEDRISCHER ÜBERGANGSZUSTAND
24
Nukleophile OH-Gruppe des Ser greift zu spaltendes Amid an Serin wird mit Hilfe eines Imidazols deprotoniert -> thermodynamisch ungünstig, nur möglich, da stabilisiert von deprotoniertem Asparaginsäurerest
2.Protonübergang von His57 auf Substrat bildet Amin – Gruppe ; Säurekatalyse
durch Wasserstoffbrücken
stark stabilisiert
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ACYL-ENZYM-ZWISCHENPRODUKT
25
Freisetzung der Amin-Gruppe, die durch Wasser ersetzt wird
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WIEDERHERSTELLUNG DES AKTIVEN
ENZYMS
26
Tetraedrischer
Übergangszustand
Aktives Enzym
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STABILISIERUNG DES
ÜBERGANGSZUSTANDES
27
sp2
trigonal planar
sp3
tetraedrisches Intermediat
2 x neue H-Brücken
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STABILISIERUNG DES
ÜBERGANGSZUSTANDES
28
Low Barrier Hydrogen Bond Energy 40-80 kJ
pKa < 2-3 units D A H D A H
Normale Wasserstoffbrücke Energy 12-30 kJ
pKaA ~ pKaD
In the complex enzyme-substrate
In the complex enzyme-tetrahedral intermediate
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Einrichtungsname 29
ELASTASE
pH 5
pankreatische Elastase (Schwein) Substrat 7-mer YPFVEPI Struktur des Acyl-Enzyms
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ELASTASE
30
pankreatische Elastase (Schwein) Substrat 7-mer YPFVEPI
pH 9
Struktur des zweiten tetrahedrischen Übergangszustands
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NACHWEIS FUER
SERINPROTEASEN
31
-> durch aktives Ser
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ACTEYLCHOLINESTERASE
(SERINPROTEASE) INHIBITOREN I
32
Nervengift Nowitschok
2018, S. und J. Skripal
-> sind Nervengifte
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ACTEYLCHOLINESTERASE
(SERINPROTEASE) INHIBITOREN II
33
Parathion (Synonym E 605) „Rattengift, Insektizid“
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SERINPROTEASE-INHIBITOREN
34
Trypsin inhibitor:
Chloromethylketone sind stark alkylierende Agenzien
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THREONINPROTEASEN
35
6 Unterklassen (MEROPS-Datenbank)
Serinproteasen
Threoninproteasen
Cysteinproteasen
Aspartatproteasen
Glutamatproteasen
Metalloproteasen
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DAS PROTEASOM I
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Family T01, clan PB
-> Molekulare Schredder für
abzubauende Proteinketten
20S - 670 kDa Catalytic subunit
19S - “Cap” Regulatory subunit
http://en.wikipedia.org/wiki/Proteasome
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Einrichtungsname
DAS PROTEASOM II
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• multimere Proteine -> 28 Untereinheiten
• Zylinderinneres -> katalytische Zentren mehrerer Enzyme
• Von Ubiquitin angeliefertes Protein wird in Oktapeptide
zerschnitten
• Ubiquitine werden nicht abgebaut
Voet Voet Pratt. Fundamentals of Biochemistry – Fig. 21-4
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CYSTEINPROTEASEN
39
6 Unterklassen (MEROPS-Datenbank)
Serinproteasen
Threoninproteasen
Cysteinproteasen
Aspartatproteasen
Glutamatproteasen
Metalloproteasen
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CYSTEINPROTEASEN (THIOLPROTEASEN)
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Katalytische Dyade (Cys-His)
oder Triade (Cys-His-Asn/Asp/Gln/Glu)
Cathepsin B, family C1
Papain Beispiele:
Papain
Cathepsine
Caspase
Endopeptidasen
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CYSTEINPROTEASEN- AKTIVES ZENTRUM
41
Triade: Cys-His-Asn Dyade: Cys-His
C1-Papain-Familie C14-Caspase-Familie
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CYSTEINPROTEASEN- BEISPIELE
42
Papain C01.001 Fleischzartmacher Verdauungshilfe Bier-Klärung
Caspases - C14: Apoptose
Cathepsine – C01 Zell turnover
TEV – C04.004: Pflanzenpathogen Tobacco Etch Virus protease
Processing of recombinant proteins
-Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly-
-Gln-Ser-
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pH-ABHÄNGIGKEIT
43
pH-Abhängigkeit der Papain-Aktivität
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KATALYTISCHER MECHANISMUS
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tetraedrischer Übergangszustand
N der Peptidbindung säurekatalytisch durch
His abgespalten
Intermediat wird durch H2O nukleophil am partiell positiv geladenen C1-Atom angegriffen
Thioestherbindung zwischen Enzym und und dem Rest der Peptidkette: Acylenzym
tetraedrischer Übergangszustand
Peptid mit neuer Carboxylgruppe abgespalten verbleibendes Proton von H2O protoniert freie Cys Seitenkette zum Thiol
Nukleophiler Angriff des Thiolates an C1-Atom der Peptidbindung
Cystein wird basenkatalytisch durch His aktiviert: Proton der Thiolgruppe wird auf Stickstoff des His übertragen
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Einrichtungsname
ASPARTATPROTEASEN
45
6 Unterklassen (MEROPS-Datenbank)
Serinproteasen
Threoninproteasen
Cysteinproteasen
Aspartatproteasen
Glutamatproteasen
Metalloproteasen
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Einrichtungsname
ASPARTATPROTEASEN
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Enzym Spaltstelle Funktion
Pepsin Phe-Phe, Phe-Tyr, etc. Verdauung
Renin Leu-Val Blutdrucksteigerung
Cathepsin D Phe-Phe, Leu-Leu, etc. Gewebeabbau
Chymosin Phe-Met Milchgerinnung
HIV-Protease Phe-Pro Virusreplikation
zwei saure Aminosäuren im katalyischen Zentrum: Asp
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Einrichtungsname
ASPARTATPROTEASEN-MECHANISMUS
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• Einstufige Proteolyse • Säure/Basen Katalyse • Nukleophilie des Wassers
Tetrahedral intermediate
Substrate Hydrolyzed products
HN
O
OH
H
O
-O
O
O
HAsp Asp
Asp Asp
O
O-
O
-O
O
O
H Asp Asp
HN
OO
H H
O
O
H
N
H
H
O H
O
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Einrichtungsname
ASPARTATPROTEASEN - BEISPIELE
48
Pepsin
HIV-Protease
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Einrichtungsname
METALLOPROTEASEN
51
6 Unterklassen (MEROPS-Datenbank)
Serinproteasen
Threoninproteasen
Cysteinproteasen
Aspartatproteasen
Glutamatproteasen
Metalloproteasen
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Einrichtungsname
METALLOPROTEASEN
52
Enzym spaltet
zwischen
Funktion
Thermolysin X-Ala,
X-Val,
X-Ile
bakterielle Protease
Carboxypeptidase X-Tyr,
X-Phe
Verdauung
ACE Phe-His,
Phe-Leu,
Pro-Phe
wandelt Angiotensin I in
das blutdrucksteigernde
Angiotensin II um
NEP 24.11 Phe-Leu,
Cys-Phe
multifunktionell
(spaltet u.a. Enkephalin)
ECE Trp-Val wandelt Big-Endothelin
in blutdrucksteigerndes
Endothelin um
Collagenase Gly-Leu,
Gly-Ile
Gewebeumbau
Stromelysin Gly-Leu,
Gly-Ile
Gewebeumbau
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DAS HEXXH MOTIV
53
Enzym Position Aminosäuren
Thermolysin 142 - 146 His Glu Leu Tyr His
NEP 24.11 583 - 587 His Glu Ile Thr His
ECE 590 - 594 His Glu Leu Thr His
Astacin 92 - 96 His Glu Leu Met His
Collagenase 201 - 205 His Glu Phe Gly His
Stromelysin 201 - 205 His Glu Ile Gly His
Hisn und Hisn+4 binden Zn2+
Glun+1 polarisiert ein Wassermolekül
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AKTIVES ZENTRUM VON THERMOLYSIN
54 Thermolysin 142 -
146
His Glu Leu Tyr His
Ca2+
Zn2+
PDB 3DNZ
http://chemwiki.ucdavis.edu/Biological_Chemistry/Catalysts/Metalloproteases
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THERMOLYSIN
55
His 142Glu 143
tetraedrischerÜbergangszustand
Glu 166
His 146
His 231
His 142
Glu 143
Glu 166
His 146
His 231
H2
+
His 142Glu 143
Glu 166
His 146
His 231
H2
O
O
NH
O
O
O
N
O
O
H
O
O
N
O
O
H
Zn2+
H
O
H
Zn2+
Zn2+
Metalloendopeptidase
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
METALLOPROTEASEN
56
56
Angiotensin
-konvertierendes Enzym (ACE): M2-Subfamilie
Thermolysin:
M4-Subfamilie Matrixmetalloprotease
1: M10-Subfamilie
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
CARBOXYPEPTIDASE A
– EINE METALLO-EXOPEPTIDASE
57
NH
N
N
NH
Zn2+
OO
His 196
His 69
Glu 72Glu 270
O OO
H
H
PDB 1YME
Carboxypeptidase A: Verdauungsenzym, das carboxylendständige Peptidbindungen in Polypeptidketten spaltet
Titel der Präsentation | Untertitel
Einrichtungsname
TAKE HOME
59
• Kovalente vs. Säure-Base-Katalyse
• Tetrahedrischer Übergangszustand
• Katalytische Triade der Serinproteasen
• Proteasom als Threoninprotease
• Aktives Zentrum der Cysteinproteasen
(Triade, Dyade)
• Aspartatproteasen und Metalloproteasen
– Wasser als Nukleophil