BİR BİYOREAKTÖRDE GLİKOZ DERİŞİMİ KONTROLU Zeynep...

BİR BİYOREAKTÖRDE GLİKOZ DERİŞİMİ KONTROLU

Zeynep YILMAZER

Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı

Haziran 2009

ANKARA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ


Zeynep YILMAZER

KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

ANKARA

2009

Her Hakkı Saklıdır

TEZ ONAYI

Zeynep YILMAZER tarafından hazırlanan “ Bir Biyoreaktörde Glikoz Derişimi Kontrolu ” adlı tez çalışması --/--/2009 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği/oy çokluğu ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir.

Danışman : Doç. Dr. Bülent AKAY

,

Jüri Üyeleri :

Başkan: Doç. Dr. Bülent AKAY

Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü

Üye : Prof. Dr. Hale HAPOĞLU

Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü

Üye : Doç. Dr. Ayla ALTINTEN

Gazi Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü

Yukarıdaki sonucu onaylarım.

Prof.Dr.Orhan ATAKOL

Enstitü Müdürü

i

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi


Zeynep YILMAZER

Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü

Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı

Danışman: Doç. Dr. Bülent AKAY

Bu çalışmada, havalı koşullarda Saccharomyces cerevisiae çoğaltılan kesikli ve yarı-kesikli bir biyoreaktörün çoğalma ortamının glikoz derişiminin dinamik analizi ve kontrolü gerçekleştirilmiştir. Biyoreaktörde maksimum mikroorganizma çoğalmasını sağlamak için pH, sıcaklık, DO, karıştırma hızı ve substrat derişimi gibi parametrelerin optimum değerlerinde işletilmesi gerekmektedir. Ekmek mayası üretim prosesinde kontrol edilmesi gereken en önemli parametrelerden biri de substrat derişimidir. Substrat derişiminin fazla olması, mikroorganizma çoğalmasının inhibe olmasına neden olmaktadır. Biyotepkime ortamında, karbon kaynağı olarak kullanılan substratın bulunmaması veya az olması mikroorganizma derişiminin düşük olmasına, fazla olması ise mikroorganizma çoğalmasını inhibe ederek mikroorganizma derişiminin düşük olmasına neden olmaktadır. Bu nedenle, çalışmada substrat olarak kullanılan glikoz kontrol edilen değişken, ayarlanabilen değişken olarak da glikoz akış hızı seçilmiştir. Bu tez kapsamında, kontrol çalışmalarından önce kesikli tepkime kaplarında başlangıç substrat derişiminin mikroorganizma çoğalmasına etkisi incelenmiş ve 20 g/L glikoz derişiminde maksimum çoğalmanın gerçekleştiği görülmüştür. Kontrol çalışmalarında kullanılacak olan 5L çalışma hacmine sahip biyoreaktörün dinamik davranışı incelenmiş ve sistem tanımlama yöntemi ile biyoreaktörü en iyi tanımlayan model elde edilmiştir. Sistem tanımlama ve kontrol algoritmasında biyoreaktör modeli olarak Auto Regressive Moving Average with eXogenous (ARMAX) kullanılmıştır. ARMAX Model parametreleri Yinelemeli En Küçük Kareler Metodu (YEKK) kullanılarak hesaplanmıştır ve sistemin üçüncü mertebeden modele uyduğu bulunmuştur. Elde edilen model parametreleri, MATLAB programlama dilinde yazılan Genelleştirilmiş Minimum Varyans (GMV) kontrol algoritmasında kullanılarak farklı set noktası değişimleri için teorik glikoz kontrolü başarıyla gerçekleştirilmiştir. Ayrıca prosesin birinci mertebeden ölü zamanlı modeli oluşturularak ve MATLAB paket programı kullanılarak farklı sabit set noktalarında PID kontrolü gerçekleştirilmiştir. Haziran 2009, 142 sayfa Anahtar Kelimeler: Ekmek Mayası, Glikoz Derişim Kontrolü, Genelleştirilmiş Minimum Varyans Kontrol, Sistem Tanımlama

ii

ABSTRACT

Master Thesis

GLUCOSE CONCENTRATION CONTROL IN A BIOREAKTOR

Zeynep YILMAZER

Ankara University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering

Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Bülent AKAY

In this work, glucose concentration of batch and fed-batch bioreactor in which Saccharomyces cerevisiae growth at aerobic conditions was dynamic analysed and controled. In the bioreactor to reach the maximum growth rate, the parameters like pH, temprature, dissolved oxygen concentration, mixing rate and substrate concentration’s optimum values has to be found. In baker’s yeast production the most important controlled parameter is substrate concentration. High substrate concentrations may inhibate the microorganism growth. In bioreaction, if the substrate which is used as carbon source does not exist or not enough microorganism concentration will be low. If it is high it causes the microorganism concentration to be low by inhibitating the microorganism growth. For this reason glucose used as substrate is chosen as controlled variable and glucose flow rate as the manipulated variable. In this study, before the control applications the effect of initial substrate concentration on microorganism growth in a batch reactor is investigated and maximum growth was observed in 20 g/L glucose concentration. Dynamic behaviour of the bioreactor used in control applications which has 5L of working volume was analised and by system identification method the best model that determines the bioreactor was obtained. Auto Regressive Moving Average with eXogenous (ARMAX) was used as bioreactor model in system identification and control algorithm. In this study ARMAX Model parameters were evaluated by Recursive Least Square Method (RLSM) and the system was estimated as third degree model. Model parameters obtained, is used in generalised minimum variance control which was written in MATLAB and for different set point variances theoric glucose control was performed successfully. In addition to this PID control on different constant set points was performed by generating first order dead time model of the process and using MATLAB.

June 2009, 142 pages Keywords: Baker’s Yeast, Glucose Concentration Control, Generalised Minimum Variance Control, System Identification

iii

ÖNSÖZ VE TEŞEKKÜR

Yüksek lisansıma başladığım, çalışmak istediğim konuda dahi kararsız olduğum

günlerde tavsiye ve yol göstermeleriyle proses kontrol dünyasına adım atmamı sağlayan

ve sonuna yaklaştığım çalışmalarım süresince yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen,

karşılaştığım sorunlarda bilgi ve deneyimleriyle bana çözüm yolları bulan danışmanım

değerli hocam sayın Doç. Dr. Bülent AKAY’a (Ank. Üni. Kim. Müh.) teşekkürü bir

borç bilirim.

Bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım çalışmalarımın her aşamasında varlıklarını

hissettiğim değerli hocalarım Prof. Dr. Mustafa ALPBAZ (Ank. Üni. Kim. Müh.) ve

Prof. Dr. Hale HAPOĞLU’na (Ank. Üni. Kim. Müh.) teşekkür ederim.

Bitmek tükenmek bilmeyen pozitif enerjisi, yüzünden eksik olmayan gülümsemesi ve

sonsuz sabrıyla çalışmalarım süresince gece gündüz demeden her an yanımda olan,

bilime ve bilgiye ulaşmamda yol gösteren, bütün öğrencilerine olduğu gibi bana da

anne şefkati ile yaklaşarak en sıkıntılı anlarımda bile beni rahatlatan canım hocam Dr.

Suna ERTUNÇ’a (Ank. Üni. Kim. Müh.) ve Havva BOYACIOĞLU’na sonsuz

teşekkür ederim.

Tüm içtenlikleri ve huzur veren sevgileriyle her anlamda yanımda olan Berçem

ELDELEKLİOĞLU ve Emrah DÜZOL’a ve tüm arkadaşlarıma teşekkür ederim.

Benim için dünyayı anlamlı kılan, çalışmalarım süresince maddi manevi desteklerini

esirgemeyen, başarılarımla mutlu olup, üzüldüğümde hüzünlenen şu an bu aşamaya

gelmiş olmamda büyük emekleri olan Canım Babam, Annem, Ablam ve tüm aileme

minnettarım, sizleri seviyorum.

Zeynep YILMAZER

Ankara, Haziran 2009

iv

İÇİNDEKİLER

ÖZET. ................................................................................................................................ i

ABSTRACT ....................................................................................................................... ii

ÖNSÖZ VE TEŞEKKÜR ................................................................................................. iii

SİMGELER DİZİNİ ......................................................................................................... viii

ŞEKİLLER DİZİNİ .......................................................................................................... xi

ÇİZELGELER DİZİNİ .................................................................................................... xv

1. GİRİŞ ............................................................................................................................. 1

2. KAYNAK ARAŞTIRMASI ......................................................................................... 5

3. KURAMSAL TEMELLER .......................................................................................... 11

3.1 Mikroorganizmaların Sınıflandırılması .................................................................... 11

3.2 Mayanın Tarihçesi ...................................................................................................... 11

3.3 Maya Hücresi .............................................................................................................. 12

3.4 Ekmek Mayası. ............................................................................................................ 13

3.4.1 Maya gelişimini düzenleyici etkiler. ....................................................................... 15

3.4.2 Maya aktivitesini etkileyen etkenler ....................................................................... 16

3.4.2.1 Besin maddelerinin etkisi. .................................................................................... 16

3.4.2.2 Sıcaklığın etkisi. ..................................................................................................... 17

3.4.2.3 Oksijen etkisi. ........................................................................................................ 17

3.4.2.4 pH etkisi. ................................................................................................................ 18

3.4.2.5 Metabolizma ürünlerinin etkisi. .......................................................................... 18

3.5 Biyoreaktörler ............................................................................................................. 18

3.5.1 Biyoreaktör işletim türleri ...................................................................................... 19

3.6 Proses Gözleme ve Kontrol ........................................................................................ 20

3.6.1 pH kontrol ................................................................................................................. 20

3.6.2 Çözünmüş oksijen derişiminin kontrolü ................................................................ 20

3.6.3 Sıcaklık kontrol ........................................................................................................ 21

3.6.4 Basınç kontrolü ........................................................................................................ 21

3.6.5 Köpük kontrolü ........................................................................................................ 22

3.6.6 Substrat derişiminin kontrolü. ............................................................................... 22

3.6.6.1 Solunum oranı (‘Respirartory Quotient’, RQ ). ................................................ 23

v

3.7 Sistem Tanımlama. ..................................................................................................... 23

3.7.1 Modelleme. ................................................................................................................ 24

3.7.2 Sistem tanımlamanın uygulanması ........................................................................ 26

3.7.2.1 Sistem tanımlama için kullanılan parametrik yöntemler. ................................ 26

3.7.2.2 Sistem Tanımlamada Kullanılan Sinyaller ......................................................... 27

3.7.2.3 Sistem Modelleri .................................................................................................... 28

3.7.2.3.1 Sinyal modelleri. ................................................................................................. 28

3.7.2.3.2 Model parametrelerinin hesaplanması. ........................................................... 32

3.7.2.3.2.1 En küçük kareler yöntemi (EKK). ................................................................ 32

3.7.2.3.2.2 Yinelemeli en küçük kareler yöntemi (YEKK). ........................................... 35

3.8 Filtreleme. .................................................................................................................... 40

3.9 Çeşitli Proseslerin Kontrolü. ...................................................................................... 42

3.9.1 Kontrol yöntemleri. .................................................................................................. 42

3.9.1.1 Biyoreaktörde substrat derişiminin genelleştirilmiş minimum. .......................

varyans (GMV) yöntemi ile kontrolü. ................................................................ 43

3.9.1.1.1 GMV yöntemi ..................................................................................................... 43

3.9.1.1.2 Sistem modeli. ..................................................................................................... 45

3.9.1.1.3 Pseudo Random Binary Sequence (PRBS) etki. .............................................. 47

3.9.1.2 Ticari yazılımlar. ................................................................................................... 48

4. MATERYAL ve YÖNTEM ......................................................................................... 50

4.1 Mikroorganizma Çoğaltılması. .................................................................................. 50

4.2 Besi Ortamları. ............................................................................................................ 50

4.2.1 Katı besi ortamı. ....................................................................................................... 51

4.2.2 Sıvı besi ortamı ......................................................................................................... 52

4.3 Deney Sistemi .............................................................................................................. 52

4.3.1 Biyoreaktörde on-line ölçülen değişkenler. ........................................................... 55

4.3.2 Glikoz kontrolü. ....................................................................................................... 55

4.4 Deney Yöntemi. ........................................................................................................... 56

4.4.1 Optimum biyoreaktör işletim parametreleri. ........................................................ 57

4.4.2 Kalibrasyon çalışmaları. .......................................................................................... 57

4.4.3 Mayada canlı hücre sayımı. .................................................................................... 57

4.4.4 Yatışkın koşulun belirlenmesi. ................................................................................ 58

vi

4.4.5 Dinamik deneyler. .................................................................................................... 58

5. ARAŞTIRMA BULGULARI. ...................................................................................... 59

5.1 Optimum biyoreaktör işletim parametreleri. ........................................................... 59

5.1.1 Başlangıç substrat (glikoz) derişiminin mikroorganizma. ...................................

çoğalmasına etkisi. ................................................................................................... 59

5.2 Kalibrasyon Çalışmaları. ........................................................................................... 61

5.2.1 pH probu kalibrasyonu. .......................................................................................... 62

5.2.2 Pompa kalibrasyonları. ........................................................................................... 62

5.2.3 CO2 probu kalibrasyonu. ........................................................................................ 64

5.2.4 Glikoz ölçer cihazının kalibrasyonu. ...................................................................... 64

5.2.5 Etanol ölçer cihazının kalibrasyonu. ...................................................................... 67

5.3 Biyoreaktörde Dinamik Çalışmalar. ......................................................................... 68

5.3.1 Açık hat biyoreaktör işletimi. ................................................................................. 68

5.3.2 Yarı kesikli deney. .................................................................................................... 72

5.3.3 Yatışkın koşulun belirlenmesi. ................................................................................ 75

5.3.4 Dinamik analiz. ........................................................................................................ 76

5.3.4.1 Basamak etki durumunda (altında) girdi-çıktı ilişkisi. ..................................... 76

5.3.4.2 Proses özelliklerinin belirlenmesi. ....................................................................... 77

5.3.5 Sistemin matematiksel modelinin belirlenmesi. .................................................... 78

5.3.6 Sistemin parametrik modelinin belirlenmesi. ....................................................... 84

5.3.6.1 Kovaryans matrisin başlangıç değerinin etkisi. ................................................. 84

5.3.6.2 Unutma çarpanının etkisi. .................................................................................... 87

5.3.6.3 Parametrik modelin mertebesinin belirlenmesi. ................................................ 88

5.4 Biyoreaktörde Kontrol Çalışmaları. ......................................................................... 89

5.4.1 PID kontrol çalışmaları. .......................................................................................... 89

5.4.2 Teorik PID kontrol çalışmaları. .............................................................................. 92

5.4.3 GMV kontrol çalışmaları. ....................................................................................... 98

5.4.3.1 Teorik GMV kontrol çalışmaları. ........................................................................ 98

5.4.3.2 Deneysel GMV kontrol çalışmaları. .................................................................... 105

6. TARTIŞMA VE SONUÇLAR. .................................................................................... 108

KAYNAKLAR. ................................................................................................................. 115

EKLER ............................................................................................................................... 119

vii

EK 1 Mikroorganizma Kalibrasyonu ............................................................................. 120

EK 2 Teorik Sistem Tanımlama için MATLAB Programı. .......................................... 121

EK 3 Teorik PID Kontrolu için MATLAB Programı. .................................................. 123

EK 4 Teorik GMV Kontrolu için MATLAB Programı................................................. 126

EK 5 Deneysel GMV Kontrolu için VISIDAQ Programı. ............................................ 130

ÖZGEÇMİŞ ....................................................................................................................... 142

viii

SİMGELER DİZİNİ

A....R Kesikli zaman girdi/çıktı modelde yer alan polinomlar

a Genlik seviyesi

Cs Substrat derişimi (g substrat/L)

CS0 Başlangıç substrat derişimi (g substrat/L)

Cx Mikroorganizma derişimi (g kuru hücre/L)

e(t) Gürültü

E Ardışık fark vektörü

EA Aktivasyon enerjisi (kmol/J)

FO2 Hava akış hızı (ml/dk)

Fs Substrat akış hızı (ml/dk)

H Henry sabiti

J GMV Yöntemi için maliyet fonksiyonu

K Yatışkın hal kazancı

Kc Oransal sabit

KM Monod sabiti (g substrat/L)

N PRBS girdi sinyali periyodu

Nmin,max Minimum ve maksimum karıştırıcı hızları (devir/dk)

NO Oksijen molar akısı

P(t) Kovaryans matris

Qe Hata sinyali

Qo Kontrol çıkış sinyali

r Set noktası

ro Mikroorganizma özgül oksijen aktarım hızı

rx Mikroorganizma çoğalma hızı (g kuru hücre/L st)

R Evrensel gaz sabiti

s(t) t anında sisteme etki eden sinyal

t Zaman (s, dk veya st)

td Kesikli zaman

T Sıcaklık

Tsw Kare dalga periyodu

ix

Tp PRBS girdi sinyali toplam periyodu

u(t) Ayarlanabilen değişken (Glikoz akış hızı, L/dk)

uc(t) Sürekli zaman girdi sinyali

ud(t) Kesikli zaman girdi sinyali

V Maliyet fonksiyonu

VR Reaktör hacmi (L)

x(t) Ara değişken

y(t) Çıktı değişkeni (Çözünmüş oksijen derişimi, mg/L)

)t(ŷ Modelden elde edilen çıkış değişkeni

Y Ardışık veri vektörü

SXY Substrat verim katsayısı

2OXY Oksijen verim katsayısı

zi Çoğalma ortamındaki bir iyonun gücü

Yunan Alfabesi

∆ Fark işleci (∆=1-q-1)

Φ Pse output (yalancı çıktı)

)t(ε Gerçek çıkış değişkeni ile model çıkış değişkeni arasındaki fark

θ Parametre vektörü

λ Unutma çarpanı

µ Mikroorganizma özgül çoğalma hızı (h-1)

maxµ Mikroorganizma özgül çoğalma hızı (h-1)

τ Zaman sabiti

Dτ Türevsel zaman sabiti

Iτ İntegral zaman sabiti

rτ Yükselme zamanı

ϕ Veri vektörü

Tϕ Veri vektörünün transpozu

x

φ Ardışık veri vektörü

Tφ Ardışık veri vektörünün transpozu

Kısaltmalar

ARMAX Auto Regressive Moving Average with Exogenous

CARMA Controlled Auto Regressive Moving Average

CPR Karbondioksit tüketim hızı

DO Çözünmüş oksijen derişimi

EKK En Küçük Kareler Yöntemi

GMV Genelleştirilmiş Minimum Varyans Kontrol

IAE Hata mutlak değeri integrali

ISE Hata karesi integrali

MV Minimum Varyans Kontrol

OAH Oksijen aktarım hızı

OHH Oksijen harcanma hızı

OUR Oksijen tüketim hızı

PID Oransal-İntegral-Türevsel Kontrol

RQ Solunum oranı

YEKK Yinelemeli En Küçük Kareler Yöntemi

xi

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 3.1 Mikroorganizmaların sınıflandırılması ................................................................ 11

Şekil 3.2 t anında giriş değişkeni u(t), çıkış değişkeni y(t) ve gürültü e(t). ........................

içeren bir dinamik sistem . .................................................................................. 23

Şekil 3.3 Sistem tanımlama akış diyagramı. ....................................................................... 27

Şekil 3.4 Bir sistemde bulunabilecek girdi ve gürültüler. ...................................................... 30

Şekil 3.5 Yinelemeli parametre hesaplama yönteminin şematik gösterimi. ....................... 36

Şekil 3.6 Sistem yalancı-çıktısının blok diyagramı. ........................................................... 45

Şekil 3.7 PRBS sinyalinin şematik gösterimi ..................................................................... 48

Şekil 4.1 Deney sistemi. ...................................................................................................... 54

Şekil 4.2 On-line RQ ile glikoz kontrol sistemi. ................................................................. 55

Şekil 4.3 Glikoz ölçer ile glikoz kontrol sistemi. ................................................................ 56

Şekil 4.4 t=4 anında mikroorganizmaların görünüşü. ......................................................... 58

Şekil 5.1 Glikoz başlangıç derişiminin mikroorganizma çoğalmasına etkisi. .................... 60

Şekil 5.2 Başlangıç substrat derişimi ile özgül çoğalma hızının ve 7. saatin sonunda. ......

elde edilen mikroorganizma derişiminin değişimi ............................................... 61

Şekil 5.3 pH değerine karşı bilgisayar sinyali değişimi ...................................................... 62

Şekil 5.4 Glikoz besleme pompası için gösterge değerine karşı akış hızının değişimi ...... 63

Şekil 5.5 Glikoz pompası için gösterge değerine karşı akış hızının değişimi .................... 63

Şekil 5.6 CO2 probu için multisensör gösterge değerine karşı bilgisayar sinyali. ..............

değişimi. .............................................................................................................. 64

Şekil 5.7 Glikoz ölçer cihazının kalibrasyonu .................................................................... 65

Şekil 5.8 Eklenen mikroorganizma hacminin glikoz ölçer sinyali ile değişimi. ................ 65

Şekil 5.9 Mikroorganizmasız glikoz çözeltisi ile deriştirilen ve steril saf su. ....................

ile seyreltilen ortamların glikoz ölçer sinyali ile değişimi.. ................................ 66

Şekil 5.10 Mikroorganizmalı ortamdaki glikoz derişiminin glikoz ölçer sinyali. ..............

ile değişimi. ....................................................................................................... 66

Şekil 5.11 Etanol gösterge değerine karşılık etanol derişimi (%v/v) değeri. ...................... 67

Şekil 5.12 Kesikli tepkime kabında mikroorganizma derişiminin zamanla değişimi......... 69

Şekil 5.13 Kesikli tepkime kabında çözünmüş oksijen derişiminin zamanla değişimi. ..... 69

Şekil 5.14 Kesikli tepkime kabında etanol derişiminin zamanla değişimi. ........................ 70

xii

Şekil 5.15 Kesikli tepkime kabında sıcaklık ve pH’ın zamanla değişimi.. ......................... 71

Şekil 5.16 Kesikli tepkime kabında glikoz derişiminin zamanla değişimi. ........................ 71

Şekil 5.17 Yarı- kesikli tepkime kabında mikroorganizma derişiminin zamanla . .............

değişimi. ............................................................................................................. 72

Şekil 5.18 Yarı- kesikli tepkime kabında çözünmüş oksijen derişiminin. ..........................

zamanla değişimi. .............................................................................................. 73

Şekil 5.19 Yarı- kesikli tepkime kabında etanol derişiminin zamanla değişimi. ................ 73

Şekil 5.20 Yarı- kesikli tepkime kabında glikoz derişiminin zamanla değişimi. ............... 74

Şekil 5.21 Yarı- kesikli tepkime kabında gaz faz CO2 nin zamanla değişimi. ................... 74

Şekil 5.22 Yarı- kesikli tepkime kabında pH’ın zamanla değişimi. .................................. 75

Şekil 5.23 Yatışkın koşul. ................................................................................................... 75

Şekil 5.24 Glikoz akış hızına 4.4 ml/dk’dan 84 ml/dk’ya pozitif basamak etki. ................

verilmesi. ........................................................................................................... 77

Şekil 5.25 Glikoz akış hızına 4.4 ml/dk’dan 84 ml/dk’ya pozitif basamak. .......................

etki verildiğinde substrat derişiminin zamanla değişimi. .............................. 77

Şekil 5.26 Doğrusal regresyon yöntemi. ............................................................................. 78

Şekil 5.27 Kesikli tepkime kabında teorik mikroorganizma derişiminin. ..........................


Şekil 5.28 Kesikli tepkime kabında teorik substrat derişiminin zamanla değişimi. ........... 79

Şekil 5.29 Kesikli tepkime kabında teorik çözünmüş oksijen derişiminin. ........................


Şekil 5.30 Kesikli tepkime kabında mikroorganizma derişiminin zamanla değişimi......... 80

Şekil 5.31 Yarı-kesikli tepkime kabında teorik mikroorgaznizma derişiminin. .................


Şekil 5.32 Yarı-kesikli tepkime kabında teorik substrat derişiminin zamanla. ..................

değişimi. ............................................................................................................ 81

Şekil 5.33 Yarı-kesikli tepkime kabında teorik DO derişiminin zamanla değişimi. .......... 82

Şekil 5.34 Yarı-kesikli tepkime kabında teorik mikroorganizma derişiminin. ...................


Şekil 5.35 Yarı-kesikli tepkime kabında teorik substrat derişiminin zamanla . .................

değişimi. ............................................................................................................ 83

Şekil 5.36 Yarı-kesikli tepkime kabında teorik DO derişiminin zamanla değişimi. .......... 83

xiii

Şekil 5.37 na=2 nb=2 lamda=1 için kovaryans matris değişiminin etkisi. ......................... 85

Şekil 5.38 na=2 nb=2 lamda=0.9 için kovaryans matris değişiminin etkisi. ...................... 85

Şekil 5.39 na=3 nb=2 lamda=1 için kovaryans matris değişiminin etkisi. ......................... 86

Şekil 5.40 na=3 nb=2 lamda=0.9 için kovaryans matris değişiminin etkisi. ...................... 86

Şekil 5.41 na=2 nb=2 α =1000 için lamda değişiminin etkisi. ........................................... 87

Şekil 5.42 na=3 nb=2 α =1000 için lamda değişiminin etkisi. ........................................... 88

Şekil 5.43 Simulink kapalı devre diyagramı. ...................................................................... 90

Şekil 5.44 Set noktasına 2 g/L’den 20 g/L’ye pozitif basamak etki verildiğinde. ..............

sistemin PID kontrolu. ...................................................................................... 91

Şekil 5.45 0 g/L’den 0.07g/L’ye pozitif basamak etki verildiğinde sistemin . ...................

PID kontrolu. ..................................................................................................... 91

Şekil 5.46 0 g/L’den 0.5g/L’ye pozitif basamak etki verildiğinde sistemin. ......................

PID kontrolu. ..................................................................................................... 92

Şekil 5.47 Sabit set noktalı gürültüsü e=0.005 olan Teorik PID Kontrol sonuçları. .......... 93

Şekil 5.48 Sabit set noktalı gürültüsü e=0.005 olan Teorik PID Kontrol sonuçları. .......... 94

Şekil 5.49 Set noktası değişimi olarak kare dalganın kullanıldığı Teorik PID. ..................

Kontrol sonuçları. .............................................................................................. 95

Şekil 5.50 Set noktası değişimi olarak sabit genlikli rastgele etkinin kullanıldığı. ............

Teorik PID Kontrol sonuçları. ........................................................................... 96

Şekil 5.51 Set noktası değişimi olarak değişken genlikli rastgele etkinin. .........................

kullanıldığı Teorik PID Kontrol sonuçları. ....................................................... 97

Şekil 5.52 Yarı-kesikli biyoreaktörün sabit set noktasında Teorik. ....................................

GMV kontrol (e=0.005). .................................................................................. 99

Şekil 5.53 Yarı-kesikli biyoreaktörün sabit set noktasında Teorik. ....................................

GMV kontrol sonuçları (e=0.015). ................................................................... 100

Şekil 5.54 Yarı-kesikli biyoreaktörün set noktası değişimi olarak kare. ............................

dalganın kullanıldığı Teorik GMV kontrol sonuçları. ...................................... 102

Şekil 5.55 Yarı-kesikli biyoreaktörün sabit periyotta rastgele set noktası. .........................

değişimi kullanıldığı Teorik GMV kontrol sonuçları. ...................................... 103

Şekil 5.56 Yarı-kesikli biyoreaktörün değişken periyotta rastgele set noktası. ..................


Şekil 5.57 Yarı-kesikli biyoreaktörün değişken periyotta rastgele set noktası. ..................

xiv

değişimi kullanıldığı Deneysel GMV kontrol sonuçları. .................................. 106

Şekil 5.58 Yarı-kesikli biyoreaktörün değişken periyotta rastgele set noktası


xv

ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Proseslerin kontrolü ......................................................................................... 42

Çizelge 4.1 Katı besi ortamı bileşimi. ................................................................................. 51

Çizelge 4.2 Sıvı besi ortamı bileşimi. ................................................................................. 52

Çizelge 5.1 Sistem giriş değişkenine verilen etkiler deneyi için biyoreaktörün. ................

işletim koşulları ............................................................................................... 76

Çizelge 5.2 Kovaryans matrisin unutma çarpanı ve mertebe ile değişimi. ......................... 84

Çizelge 5.3 Unutma çarpanının mertebe ile değişimi. ........................................................ 87

Çizelge 5.4 Proses reaksiyon eğrisi için doğrusal regresyonla hesaplanan. ......................

parametre değerleri. ......................................................................................... 90

Çizelge 5.5 Farklı yöntemlerle hesaplanan PID parametreleri. .......................................... 90

Çizelge 5.6 Verilen etkilere göre Teorik PID ve Teorik GMV Kontrolun. ........................

karşılaştırılması. .............................................................................................. 105

Çizelge 5.7 Verilen etkilere göre Teorik PID ve GMV Kontrolun karşılaştırılması. ......... 107

1

1. GİRİŞ Endüstride “ekmek mayası” olarak bilinen ve etanol, gliserol, ekmek mayası, β -

glukan ve invertaz enzimi üretiminde kullanılan S.cerevisiae ile, havalı koşullarda

çoğaltıldığında maya, havasız koşullarda çoğaltıldığında ise etanol üretilir. Prosesin

ekonomisi açısından mikroorganizma çoğaltma basamağında yüksek hacimsel hücre

verimliliği elde etmek gerekir. Biyokatalizör olarak kullanılan mikroorganizmaların en

yüksek derişimde üretildiği ve içerdiği enzimlerin aktivitelerinin en fazla olduğu pH,

sıcaklık, çözünmüş oksijen derişimi, hava akış hızı, karıştırma hızı, substrat derişimi vb.

işletim parametreleri vardır. Bu biyoreaktör işletim parametreleri dikkatli seçilmeli ve

optimum değerlerinde kontrol edilmelidir.

Substrat derişimi bu parametrelerin en önemlilerinden biridir. Besi ortamının

bileşiminin ve derişiminin mikroorganizma çoğalması üzerinde etkisi oldukça fazladır.

Substrat derişiminin fazla olması, mikroorganizma çoğalmasının inhibe olmasına neden

olabilmektedir. Aynı koşul, havasız koşullarda çoğalma oluyormuşçasına etanol

üretimine yol açar. Bu durum “Crabtree Etkisi” olarak bilinmektedir. Amaç

mikroorganizma üretmek olduğundan bu durum istenmez. Substratların çoğalmayı

engelleyici seviyeleri hücrelerin ve substratın tipine çok bağlıdır. Maya üretiminde

glikozun 200 g/L üzerindeki derişimi, inhibe edicidir. Bu belirtilen nedenlerle glikoz

kontrolünün önemli olduğu görülmektedir.

Yapılan çalışmada literatürde optimum glikoz derişimi için verilen değerlerin geçerliliği

test edilmiştir. Kontrol çalışmalarına başlamadan önce ayarlanabilen giriş değişkeni ile

kontrollü değişken arasındaki ilişkinin belirlenmesinin hedeflendiği dinamik

incelemeler gerçekleştirilmiştir.

Tez kapsamında biyoreaktör işletim parametrelerinin önemi ve biyoreaktörlerin

kontrolu ile ilgili genel bilgiler verilmiştir. Biyoreaktörlerde kullanılan ticari kontrol

ediciler ve ölçüm elemanları tanıtılmıştır. Proseste ayarlanabilen ve kontrol edilen

değişkenler arasındaki ilişki sistem tanımlama ile belirlenmiştir. Ürün verimliliğini

2

arttırmak üzere havalı ortamda yarı kesikli işletilen biyoreaktörde besi ortamındaki

glikoz derişiminin Genelleştirilmiş Minimum Varyans (GMV) ve PID algoritmaları ile

kontrolu üzerine yapılan çalışmalar sunulmuştur.

Yapılan çalışmada, yarı-kesikli olarak işletilen, 5L hacminde, laboratuvar ölçekli, ısıtma

ceketli bir biyoreaktör kullanılarak ekmek mayası üretimi boyunca glikoz derişiminin

kontrolu, kendinden ayarlamalı kontrol yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Girdi-

çıktı değişkeni verileri yardımıyla biyorektör parametrik modellerle tanımlanmış ve

farklı parametre hesaplama yöntemleriyle parametreler belirlenmiştir. Deneylerde,

biyotepkime ortamının glikoz derişimi glikoz ölçer cihazı ile ölçülerek, sisteme on-line

bağlı bilgisayara gönderilmiştir. Bilgisayardaki kendinden ayarlamalı kontrol

algoritması, glikoz derişimini istenen değerde tutmak üzere sisteme gönderilmesi

gereken besleme akış hızını hesaplamış ve gerekli sinyali pompaya göndermiştir.

Mikroorganizma çoğalmasına etki eden ve bu tez kapsamında kontrol edilen parametre

olan glikoz derişiminin en uygun değerinin bulunarak biyoreaktörün bu derişimde

işletilmesi ve kontrol edilmesi ürün verimi açısından oldukça önemlidir. Bu nedenle

glikoz derişiminin kontrolüne yönelik çalışmalara ilk olarak kesikli biyoreaktörde

optimum biyoreaktör işletim parametrelerinin bulunması ile başlanmıştır. Kesikli

işletilen biyorektörlerde farklı başlangıç substrat derişimlerinde mikroorganizma

çoğaltılarak elde edilen mikroorganizma derişim profillerinden en yüksek

mikroorganizma derişiminin en kısa zamanda elde edildiği glikoz derişimi olan 20 g/L

değeri optimum glikoz derişimi olarak belirlenmiştir. Bu sonuca hem mikroorganizma

çoğalması boyunca UV spektrofotometre yardımıyla belirlenen mikroorganizma

derişimlerinin hem de mikroskop ve Thoma lamı kullanılarak belirlenen canlı

mikroorganizma sayılarının zamanla değişimi incelenerek ulaşılmıştır. Gerçekleştirilen

deneyler sonucunda çoğalmanın Monod kinetiğine uygun olarak gerçekleştiği

belirlenmiştir.

Optimum çalışma koşulları belirlendikten sonra sistemin dinamik davranışını incelemek

amacıyla sistem tanımlama çalışmalarına geçilmiştir. Bu amaçla açık hat biyoreaktör

3

işletimi ile kontrol edilmesi gerektiği sonucuna ulaşılan glikoz derişiminin, çoğalma

boyunca sabit tutulmasının mikroorganizma derişiminde, etanol derişiminde ve CO2(g)

oluşumunda nasıl bir değişime yol açtığı incelenmiştir. Biyoreaktörden belirli zaman

aralıklarında alınan örnekler mikroorganizma derişiminin belirlenmesi için

spektroskopik yöntemle analizlenmiştir. Çoğalma boyunca DO probu ile çözünmüş

oksijen derişimi (DO), etanol probu ile etanol derişimi ve multisensör ölçüm cihazıyla

üretilen gaz faz CO2 ve gaz faz O2 derişimlerinin de zamanla değişimi gözlenmiştir.

Böylece gerçekleştirilen dinamik deneyler ile mikroorganizmanın çoğalması boyunca

biyoreaktörde zamanla mikroorganizma derişimi, glikoz derişimi, etanol derişimi, gaz

faz CO2 derişimi ve çözünmüş oksijen derişiminin (DO) değişimi incelenmiştir.

Biyoreaktöre steril koşullarda besi ortamı beslenerek mikroorganizmanın optimum

çoğalma koşulları sağlanmıştır. Bu amaçla pH=5 değerinde tutulup, 2 L/dk akış hızında

hava beslenerek, ceketten ısıtma suyu uygun sıcaklık ve akış hızında geçirilerek besi

ortamının 32 0C’de yatışkın hale gelmesi sağlanmıştır. Steril koşullarda

mikroorganizma aktarımından sonra çoğalma boyunca pH, sıcaklık, glikoz derişimi,

DO, etanol derişimi Visidaq paket programında yazılan programla on-line olarak

kaydedilmiş ve gözlenmiştir.

S. cerevisiae mikroorganizmasının havalı koşullarda kesikli ve yarı kesikli bir

biyoreaktörde glikozun karbon ve enerji kaynağı olarak kullanıldığı kültür ortamındaki

dinamiğini ifade etmek için kütle korunum denklemleri oluşturulmuştur. Bu denklem

sistemleri MATLAB programlama dilinde kodlanarak mikroorganizma çoğalması

boyunca teorik olarak mikroorganizma, glikoz ve çözünmüş oksijen derişimleri ile

reaktör sıcaklığının zamanla değişimleri elde edilmiştir. Elde edilen sonuçlar deneysel

çalışmalardan elde edilenlerle karşılaştırılmıştır. Yarı kesikli işletimde kesikli işletime

göre mikroorganizma derişiminin %10 arttığı belirlenmiştir.

Biyoreaktörde gerçekleştirilen dinamik çalışmalar kapsamında ayarlanabilen giriş

değikeni olan glikoz akış hızına verilen pozitif basamak etkiye prosesin cevabı ve

kontrollu değişken olan glikoz derişiminin zamanla değişimi verileri elde edilmiştir. Bu

çalışmalar mikroorganizmalı ortamda gerçekleştirilmiştir. Bu incelemelerde glikoz

derişiminin çoğalmayı inhibe edici olduğu derişim değerlerinin üzerine çıkılmamasına

4

dikkat edilerek, istenilen işletim şartlarında en uygun glikoz akış hızının belirlenmesine

çalışılmıştır. PID kontrol parametrelerinin belirlenmesi amacıyla prosesin birinci

mertebeden ölü zamanlı modeli de “Doğrusal Regresyon” yöntemi ile belirlenmiştir.

Prosesin girdi-çıktı verileri yardımıyla sistemi tanımlayan doğrusal ARMAX tipi bir

girdi-çıktı modeli elde edilmiştir. Model parametrelerinin hesaplanmasında YEKK

Yöntemi kullanılmıştır. Sistemi ifade eden en uygun parametrik modelin bulunması

amacıyla farklı kovaryans matrisin başlangıç değeri, unutma çarpanı değeri ve

mertebeler için çalışmalar yapılmıştır.

S. cerevisiae mikroorganizmasının çoğaltıldığı kesikli ve yarı kesikli işletilen

biyoreaktörde glikoz derişiminin kontrolüne yönelik olarak “teorik” ve “deneysel”

kontrol çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Teorik kontrol çalışmaları MATLAB

programlama dilinde hazırlanan GMV ve PID kontrol yöntemlerinin başarısı farklı

glikoz derişimi set değerleri için ISE değerlerine göre karşılaştırılmıştır. Sisteme on-line

bağlı bilgisayardaki Visidaq paket programında Visual Basic dilinde kodlanan GMV

kontrol algoritması ile glikoz derişiminin deneysel kontrolu da gerçekleştirilmiştir.

PID kontrol parametreleri Cohen-Coon parametre hesaplama yöntemi ile

hesaplanmıştır. Ancak MATLAB paket programında yazılan YEKK algoritması

kullanan PID kontrol algoritması Cohen-Coon parametre hesaplama yöntemi ile

bulunan parametreler ile sistemin kontrolunu sağlayamamıştır. Bu nedenle PID

parametrelerinin sisteme en uygun değerleri deneme-yanılma yöntemiyle bulunmuştur.

PID kontrol parametreleri ile S. cerevisiae mikroorganizması çoğaltılan yarı kesikli

işletilen biyorektörde glikoz derişiminin teorik PID kontrolu gerçekleştirilmiştir.

5

2. KAYNAK ARAŞTIRMASI Suzuki et al. (1986), uçucu karbon kaynağı olan etanol beslemesi ve çözünmüş oksijen

(DO) seviyesinin kontrolu için bir geri beslemeli kontrol sistemini ve otomatik kontrol

stratejilerini geliştirmişlerdir. Mikrobiyal çoğalma için optimum etanol derişimini

korumak üzere çıkış gazındaki karbondioksit derişimi, etanol beslemesinin basamak

tarzında kontrolu için kullanılmıştır. Ayrıca hataları düzeltmek üzere oransal-türevsel

(PD) kontrol programı kullanılmıştır. Basamak tarzında kontrolun katsayıları

stokiyometrik olarak hesaplanmıştır ve PD parametreleri deneysel olarak önceden set

edilerek çoğalma boyunca değiştirilmemiştir. DO ve giriş gazındaki oksijen kısmi

basıncı sırasıyla çıkış gazındaki karbondioksit derişimine dayalı ve oksijen tüketim

hızına bağlı olarak hazırlanmış basamak tarzında bir program ile değiştirilmiştir.

Basamak tarzında kontrolun katsayıları stokiyometri ve moleküler oksijen için madde

denkliğinden tahmin edilmiştir. PD kontrol programı DO seviyesindeki değişimleri

düzeltmek üzere karıştırma hızını ayarlamak üzere kullanılmıştır. Çoğalma boyunca

parametrelerin değiştirilmesine gerek olmamıştır. Bu ileri kontrol programları

kullanılarak Candida Brassica’nın yarı-kesikli çoğalması boyunca etanol derişimi ve

DO seviyesi sırasıyla 3.4-3.7 g/L ve 2.2-2.8 ppm’de kontrol edilmiştir. Elle işletime

gerek duyulmayan bu çoğalmada mikroorganizma derişimi 80 g/L’ye ulaşmıştır.

Williams et al. (1986), adaptif kontrol tekniğinin bir fermentasyon prosesine

uygulanmasının uygunluğunu incelemişlerdir. Bir fermentasyon prosesinin doğrusal

olmayan zamanla değişen parametreleri, doğrusallaştırılmış matrisler olarak on-line

olarak tahmin edilmiştir. Denemeler on-line, gerçek zaman adaptif kontrol paketi ile

küçük ölçekli bir fermentörde gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar hem tek hem de çok

değişkenli kontrol için sunulmuş ve maya hücre çoğalmasının kontrolunun başarılı

olduğunu göstermiştir.

Ringbom et al. (1996), biyoproseslerde anahtar hal değişkenlerini kestiren bir dinamik

model, yarı-kesikli ekmek mayası üretiminin kontrolu çin kullanılmıştır. Hal

kestirimleri on-line ölçümler ile kütle denklikleri birleştirilerek yapılmıştır. Kontrol

stratejisinin amacı, etanol ve asetik asit gibi metabolik ürünler oluşmaksızın, mümkün

6

olan en yüksek hücre çoğalmasnı sğlayacak ve tümüyle hücrelerin solunumla

tüketebilecekleri mümkün olan en yüksek glikoz akışını sağlayacak ve tümüyle

hücrelerin solunumla tüketebilecekleri mümkün olan bu yüksek glikoz akışını

sağlamaktır. Kontrol algoritmasının basamak tarzında ilerleyişi istenmeyen tersinmez

metabolik yol izlerinden kaçınmak üzere bir strateji bulmak amacıyla geliştirilmiştir.

Son algoritmada, metabolizmadaki böyle istenmeyen değişimler, hücre içi

karbonhidratların birikiminin kestiriminden tahmin edilmiştir. Genelleştirilen kontrol

stratejisi ile laboratuar ölçekli S. cerevisiae çoğalmasında maksimum verimde, mümkün

olan en yüksek çoğalma hızına yakın bir değer elde edilmiştir.

Zigova (2000), S. cerevisiae BT150 ile çözünebilen insan N-deglyglycosylated

rekombinant β-1,4 galaktosiltransferaz (NdrGal-T) nin rekombinant üretimi için geri

beslemeli RQ kontrolu yarı-kesikli proses için incelemişlerdir. Optimum NdrGal-T

üretmi için birçok ‘solunum oranı, RQ’ değerini denemişlerdir. Hem biyokütle hem de

enzim üretimi için en iyi RQ değeri 1.0 olarak belirlenmiştir. RQ’nun 1.0 değerinde

elde edilen hacimsel aktivitesi diğer tüm RQ değerlerinde elde edilenden (8 µL-1) dört

kat daha fazladır (32 µL-1). Ön kültürdeki optimum glikoz derişimi 25 g/L’dir. Ön

kültürdeki yüksek glikoz derişimlerinde düşük glikoz derişimlerine göre etanol üretimi

artmakta ancak bu durumun biyokütle ve enzim üretimi üzerine pozitif bir katkısı

olmadığı bulunmuştur. Düşük glikoz derişimleri sadece etanolü azaltmamakta aynı

zamnada biyokütle oluşum (1.69 g/h’den 0.81 g/h’e ve enzim toplam verimliliği de

(2.24 µh-1’den 0.81 µh-1’e ) azalmaktadır.

Serio et al. (2001), bu çalışmada bütün reaktör çeşitlerinde (kesikli,yarı-kesikli,sürekli)

ekmek mayası çoğalmasını tanımlamak için genel sibernetik model geliştirilmiştir.

Kütle aktarımı oksijen limitini de dikkate alan model, literatürdeki sürekli işletimli

farklı havalandırma gaz bileşimleriyle test edilmiştir. Ulaşılan sonuçlar, modelin

yetersiz havalandırma koşullarında bile S.cerevisiae çoğalmasını tanımladığını

göstermiştir. Böylece bu çalışma endüstriyel biyoreaktörlerin optimizasyonu ve

modellemsi için yararlı olmuştur.

7

Akesson et al. (2001), günümüzde çeşitli proteinlerin üretiminde genetiği oynanmış

Escherichia coli bakterisi kullanılmaktadır. E. coli kültürlemesinde yan ürün asetatın

birikiminden kaçınılmalıdır. Asetat oluşumu, özgül glikoz tüketimi kritik değeri

geçtiğinde ortaya çıkmaktadır ve uygun besleme stratejisi ile bu durumdan kaçınılabilir.

Bu durumdaki zorluk kritik glikoz tüketiminin iyi bilinmemesinden kaynaklanmaktadır.

Bu çalışmada glikoz beslemesinin kontrolu için eski verilere ihtiyaç duymaksızın

beslemeyi kritik glikoz tüketiminde sağlayacak bir yaklaşım analiz edilmiştir.

Valentinotti et al. (2003), S. cereivisiae’nin yarı-kesikli fermantasyonda maksimum

biyokütle üretimi analizlenmiştir. Sıklıkla sınırlı oksijen kapasitesine dayandırılan

metabolik darboğaz yüzünden, biyokütle verimliliğini düşüren substrat derişiminin

kritik değerinin üzerinde olması ile etanol oluşmaktadır. Böylece biyokütle üretimini

maksimize edebilmek için substrat derişimi kritik değerde tutmalıdır. Ancak, bu değer

bilinmemekte ve deneyden deneye de değişebilmektedir. Bu zorluğun üstesinden

gelebilmek için hücrelerin çok az miktarda etanol üretimine izin verilmektedir. Bu

yolla, maksimum biyokütle üretim problemi, etanol derişiminin ayarlanmasına dönüşür.

Adaptif kontrol yöntemi etanolu istenen set noktasında tutabilmek için kullanılmıştır.

Sadece tek bir parametrenin on-line olarak tahmini gereklidir.

Miskiewicz et al. (2005), yarı-kesikli ekmek mayası prosesinin optimizasyonunda

biyokütle verimini maksimize etmek için gereken besleme profilinin, bu prosesin

optimizasyonunda özgül çoğalma hızını maksimize etmek için kullanılan besleme

profilinden farklı olduğu görülmüştür. Her iki profil de F(t)=a/(1+b.exp(-c.t)) şeklinde

bir fonksiyon ile tanımlanabilir. Burada F8t), t anında biyoreaktöre giren glikoz

beslemesini, ve a,b ve c eşitliğin sabitlerini göstermektedir. Optimizasyon amacına göre

parametreler farklı değerler almaktadır. Aynı zamanda biyokütle veriminin maksimize

edilmesi ve özgül çoğalma hızının maksimize edilmesi şeklindeki iki amacın birbiriyle

çeliştiği gösterilmiştir.

8

Arndt et al. (2005), hücre dışı fitaz üreten Escherichia coli rekombinanının

kesikli/yarı-kesikli kültürlemede besleme fazı için kontrol edici geliştirilmiştir. Kalman

filtresi tarafından kestirilen proses değişkenlerine dayalı fitaz üretimini maksimize

etmek ve asetat üretimini minimize etmek amacıyla ileribeslemeli ve geri beslemeli

kontrol edici uygulanmıştır. Kalman filtresi glikoz ölçümlerinin gürültüsünü düşürmek

ve ileri besleme kontrol edicisinin yardımını hesaplamada kullanılan biyokütle

derişiminin, substrat (glikoz) derişiminin, maksimum özgül çoğalma hızının ve de

reaksiyon hacminin kestirimi için kullanılmıştır. PI kontrol edici glikoz derişimini

istenen set noktası olan 0.2 gL-1 e ayarlayabilmek için uygulanmıştır. Ortam içine fitaz

salgısı asetat üretiminin azaldığı düşük glikoz derişimlerinde artmaktadır. Kontrol edici

tarafından kullanılan tek ölçülen değişken olan glikoz derişimi akış injeksiyon analizi

(FIA) kullanılarak belirlenmiştir. Kontrol edicinin işlemi ayrıca onun E. coli

kültürlemesindeki uygulaması verilmiştir. Standat sapması 0.0666 gL-1 olan averaj on-

line ölçülen glikoz derişimi 0.208 gL-1 ‘dir. Kültürleme boyunca ölçüm sisteminde hata

meydana gelmiştir. Bu hata ile kontrol edici sisteminin yanıtımı ayrıtıda tartışılmıştır.

Oksijen ölçümüne dayalı kontrol edici karşılaştırılmıştır. Fitazın verimi verilen

sistemele aynıdır.

Wang et al. (2007), etanol derişimi ve solunum oranındaki değişime (RQ) bağlı olarak,

yüksek hücre yoğunluğuna sahip S. cerevisiae çoğalması ile glutathion (GSH) üretimi

için glikoz besleme hızının kontrolu çalışılmıştır. GSH verimi ve kuru kütle ağırlığı 52

saat çoğalmadan sonra sırasıyla, 1620 mg/L ve 140 mg/L’ye ulaşmıştır. Buna ek olarak,

“precursor “aminoasitlerin tek seferlik eklenmesinin optimizasyonu ile 38 saat

çoğaltmadan sonra GSH verimi 2020 mg/L’ye ulaşmıştır. GSH’ın verim ve verimliliği

sırasıyla %25 ve %70 artmıştır. Ayrıca, çoğalma süresi 38 saate düşmüştür ve

“precursor” aminoasit eklenmemiş sonuçlarla da karşılaştırılmıştır.

9

Velut et al. (2007), bu makale biyoreaktörlerin maksimum oksijen transfer kapasitesine

yakın işletimi için yarı kesikli fermentasyon tekniğini sunar. Metod, kesikli “probing”

besleme stratejisinin ve sıcaklık kontrollu yarı kesikli tekniğin avantajlarını

kapsamaktadır. Reaktör maksimum oksijen transfer kapasitesine ulaştığında sıcaklık,

oksijen ihtiyacını azaltmak için düşürülmektedir. Çözünmüş oksijen derişiminin iyi

kontrolünü sağlamak için “mid-ranging” kontrol edici, karıştırma hızı ve sıcaklığı

ayarlamak üzere kullanılmaktadır. Besleme stratejisi analizlenmiş ve hem deney hem de

benzetimlerle açıklanmıştır.

Kasperski et al. (2008), bu çalışmada amaç, çözünmüş oksijen derişimindeki salınımsal

değişikliklere göre parçalı olarak beslemenin yapıldığı ekmek mayası üretiminde,

besleme giriş hızını optimize etmektir. Optimizasyon kriteri biyokütütle verimi ve özgül

çoğalma hıznın eş anlı maksimize edilmesidir. Böyle bir kriterin maksimize edilmesi

besi ortamındaki glikoz derişiminin kritik glikoz seviyesinden yüksek olmasını

gerektirir. Ayrıca parçalı olarak beslemenin büyüklüğü de solunum oranının set değeri

tarafından kısıtlanmaktadır. Optimizasyon prosesinde solunum oranınının set değeri ve

parçalı olarak beslemenin hacmindeki dinamik değişimlerin önemli iki faktör olduğu

bulunmuştur. Solunum oranının set değeri olan 1.1’in altında olduğundaki parçalı

beslemeler ve bu beslemenin +-%10 aralığındaki değişimleri optimum olarak

değerlendirilmiştir. Parçalı besleme büyüklüğünün +_%10 ve solunum oranı set

değerinin 1.1 değerinde ulaşılan biyokütle verimi 0.55 gg-1 ve özgül çoğalma hızı

0.14 h-1’tir. Başalngıç biyokütle derişimi de besin girişinin optimizasyonunda büyük bir

öneme sahiptir. Başlangıç biyokütle derişimindeki artış havalı fermantasyonu teşvik

ederek biyokütle verimi ve özgül çoğalma hızında azalmaya sebep olur

Klockow et al. (2008), Saccharomyces cerevisiae’nın yarı kesikli çoğaltılması için

modele dayalı substrat kontrol sistemi sunulmuştur. Amaç proses boyunca substrat olan

glikoz derişiminin sabit set noktasında tutulabilmesidir. Hücreler glikoz derişimine göre

metabolizmalarını “saf oksidatif”ten “oksidatif-reductive”’e doğru değiştirebildiğinden

set noktaları 0.07 gL-1 ve 0.5 gL-1 seçilmiştir. On-line ölçüm sistemindeki gürültü ve en

az 6 dk olan ölü zaman nedeniyle çoğalma boyunca glikoz derişiminin doğru kontrolu

10

için problem teşkil etmektedir. Bu etkileri ortadan kaldırmak için basit FIA sistemine

dayalı glikoz ölçümleri, genişletilmiş Kalman filtresi kullanılarak kontrol sistemi

tamamlanmıştır. Kalman filtresi prosesin dinamiği ile tam anlamıyla baş

edebilmektedir. Glikoz ölçümüne dayalı olarak her üç dakikada bir biyokütle ve glikoz

derişimini hatta çoğalma hızı faktörü ve besi ortamı hacmini kestirmiştir. Glikoz

derişimini istenen set değerlerinde tutabilmek için proses değişkenlerinin kestirilen

değerlerinin kullanıldığı bir ileri beslemeli kontrol edici, PI kontrol edici ile

tamamlanmıştır. Kontrol boyunca set noktaları olan 0.07 ve 0.5 gL-1 için ölçümlerin

standart sapmaları sırasıyla 0.002 gL-1 ve 0.022 gL-1.

11

3. KURAMSAL TEMELLER

3.1 Mikroorganizmaların Sınıflandırılması

Mikroorganizmalar Şekil 3.1’den görülebileceği gibi iki ana grupta incelenmektedir.

Bunlar; prokaryotlar ve ökaryotlardır. Her iki grubunda alt grupları bulunmaktadır.

Prokaryotlar; bakteriler ve mavi-yeşil algler olmak üzere iki ana alt grupta, ökaryotlar

ise; mantarlar, algler ve protozoa olmak üzere üç alt grupta incelenmektedir.

Şekil 3.1 Mikroorganizmaların sınıflandırılması (Pekin 1979)

3.2 Mayanın Tarihçesi Biyoteknolojinin gelişimi tarihsel olarak dört evrede incelenmektedir (Keuler 1993).

Birinci evre olarak eski çağlarda yapılan fermantasyon uygulamaları kabul

edilmektedir. İlk biyoteknolojik prosesler, alkol fermantasyonları (şarap,bira) ve süt

ürünlerinin fermantasyonudur. Sümerlerin alkol fermantasyonunu bildikleri, yapılan

tarihsel kazılardan bilinmektedir. Daha sonra Mısırlılar ekmek üretiminde mayayı

kullanmışlardır.

12

İkinci evre mikrobiyolojinin gelişmesi ile başlamıştır. 1867’de Lois Pasteur’ün

fermantasyonlardan mayanın sorumlu olduğunu gösteren kitabı basılmıştır. Robert

Koch ve Emil Christian Hansen’in ilk endüstriyel biyoteknolojik çalışmayı yapmıştır.

Üçüncü evre fermantasyon teknolojisinde gerçekleştirilen ilerlemeleri içerir. Bu evre

1940’larda penisilin üretimi ve büyük fermantörlerin geliştirilmesi ile başlar. Daha

sonra sürekli fermantasyon, immobilize enzim ve hücre proseslerinin geliştirilmesi ile

devam eder.

Dördüncü evre rekombinant DNA teknolojisi olarak adlandırılır. Bu teknoloji ile maya

hücresinin iç yapısında saklı olan biyolojik bilgiler ve organizmanın genetik

özelliklerinin değiştirilmesine çalışılmaktadır. Aynı dönemde bilgisayar teknolojisinin

biyoteknolojide yoğun olarak kullanılmasına başlanmıştır.

3.3 Maya Hücresi

Maya hücresi kompleks bir mikroorganizmadır. Bakterilere göre hacimleri daha

büyüktür. Mayanın çoğalması uç verme veya hücre bölünmesi şeklinde geçekleşir

(Bailey and Ollis 1986). Çok gelişmiş bir organizma olan maya hücresinin hücre duvarı,

hücre ağırlığının %25 ini oluşturur ve mayayı dış etkenlerden korumakla birlikte pek

çok enzime de sahiptir. Hücre çekirdeği, DNA’ları içerir. Hücre içinde fazla miktarda

mitokondri bulunur ve bunlar hücre içinde enerji sağlanmasında kullanılır. Hücre içi

diğer metabolik olaylar sitoplazmada gerçekleşir. Depo parçacıklarında ise glikoz ve

yağlar stoklanmaktadır.

Maya hücresi glikoliz ve etanol oluşumu olmak üzere iki önemli metabolik faaliyet

gerçekleştirir. Biyokütle oluşumunu sağlamak üzere gerçekleşen reaksiyonlarda eberji

gerekir. Bu enerji ortamda bulunan bazı maddelerin indirgenmesi ile sağlanır. Maya

hücresi tarafından hem karbon hem de enerji kaynağı olarak kullanılan şeker, enerji

13

üretiminde ve hücre içi yapıtaşlarının oluşumunda görev alır. Şekerin parçalanması ile

hücreyi oluşturan yağlar, polisakkaritler ve proteinler oluşur.

İçerisinde şekerin sukroz olarak bulunduğu melas, endüstriyel ekmek mayası üretiminde

şeker kaynağı olarak kullanılır. Melas içerisindeki sukroz, hücre içinde fruktoz ve

glikoza dönüşür. Daha sonra glikozun oksijenle yakılmasıyla piruvat elde edilir. Oluşan

piruvat, hücrenin oksijen kapasitesine ve ortamdaki oksijen miktarına bağlı olarak

alkole veya oksijeni kullanarak enerji ve biyokütleye dönüşür.

3.4 Ekmek Mayası

Mikroorganizma olarak adlandırılan ve çoğunlukla tek hücreli olan küçük canlılar insan

yaşamını pek çok şekilde etkiler. Bu küçük canlılar insan, hayvan, bitki hastalıklarına

ve besin maddelerinin bozulmalarına neden oldukları için zararlı görünmelerine karşın

besin, ilaç ve kimya sanayinde birçok maddenin üretilmesinde ve yeryüzündeki canlı

hayatının devamını etkileyen kritik faaliyetlerin yerine getirilmesinde insanlık yararına

önemli rol oynarlar. Maya, hiç şüphesiz insanlık tarihi boyunca güvenle tüketilen en

önemli mikroorganizmalardan biridir.

Çok sayıda maya çeşidi bulunmaktadır. Bu çalışmada Sacchoromyces cerevisiae mayası

esas alınmıştır. Sacchoromyces cerevisiae, endüstride ticari anlamda; ekmek mayası

alkollü içecekler ve son yıllarda benzine karıştırılarak motorlu taşıtlarda kullanılan

teknik alkol üretiminde kullanılmaktadır (Beşli et al. 1995).

Sacchoromyces cerevisiae mayası ökaryotik mikroorganizmadır. Besin kaynağı olarak

glikoz, fruktoz, sukroz ve maltoz gibi şekerlerin yanında laktik, tartarik, suksinik, asetik

asitleri ve etanolü kullanır. Bundan dolayı heterotrof mikroorganizmadır. Havalı ve

havasız ortamda üreyebilir. Gelişmesi için en uygun sıcaklık aralığı 27-30 οC ve, en

düşük ve en yüksek sıcaklıklar ise sırasıyla 1-3 οC ve 40 οC dir. pH değeri ise 4-5

aralığında maksimum çoğalma sağlar.

14

Başlangıçta çok düşük verimliliği ile alkol fermantasyonunun bir kopyası olan ekmek

mayası prosesinde 19.yy’ın ikinci yarısında, mikrobiyolojinin gelişmesi ile birlikte

büyük ilerlemeler olmuştur. Daha sonra 1886 yıllarında İngiltere’de sürekli

havalandırma yöntemi uygulanmıştır. En fazla ilerleme 1920’lerde saf kültürlerin

kullanılması ve ucuz şekerli çözelti eldesi için hububat değişiminin yapılması ile

sağlanmıştır. Bu tarihten sonra maya üretim prosesi daha ayrıntılı bir şekilde ele

alınmıştır.

Son zamanlarda prosesin otomatik kontrolü üzerinde durulmaktadır. Bu konudaki

sorunlardan birisi prosesi yüksek verimlilikte tutacak şekilde substrat beslemesini

kontrol etmektir.

Maya hücresinin gelişebilmesi için besine ve enerjiye ihtiyacı vardır. Maya hücresi

gerekli besini ve enerjiyi sağlayabilmek amacıyla şeker (glikoz veya maltoz) kullanılır.

Bunun yanı sıra kullandığı diğer maddeler vitaminler ve minerallerdir. Temel

gereksinimlerinden bir diğeri ise oksijendir. Maya hücresi etanol üretimi olmaksızın

büyümek için şeker ile birlikte oksijeni kullanır. Bira ve şarap üretiminde olduğu gibi,

eğer ortamda yeterli oksijen yoksa maya etanol üreterek çoğalmaya devam eder.

Mayanın istenilen şekilde üretilebilmesi için ortamdaki oksijen ve şeker aktarımının iyi,

etanol oluşumunun az olması gerekmektedir. Bunlardan da anlaşılacağı gibi yüksek

etanol derişimi maya hücreleri için toksik etkiye sahiptir. Etanolün kendisi de bir

karbon kaynağı olduğundan maya hücresi büyümek için etanolü de kullanabilir. Etanol

toksik olduğundan maya gelişebilmek için şekeri etanole tercih eder. Büyüme sırasında

maya hücresi karbondioksit üretir. Maya hücresi etanol üretirken oksijen

kullanmadığından mayanın durumunu tanımlayabilecek bir başka güvenilir değişken

karbondioksit üretim hızının (CPR), oksijen tüketim hızına (OUR) oranıdır. Bu oran

solunum katsayısı, solunum oranı (‘Respiratory Quotient’, RQ) olarak

adlandırılmaktadır.

Sacchoromyces cerevisiae mayasının üretiminde, besi ortamındaki mayanın gelişerek

üreyebilmesi, maya için gerekli besi maddelerini ve enerji kaynağını içeren besi

15

ortamının oluşturulması, gelişmeyi engelleyici maddelerin ortamda bulunmaması ve

pH, sıcaklık gibi işletim koşullarının maya için uygun olması gerekmektedir.

3.4.1 Maya gelişimini düzenleyici etkiler

Maya üremesi sırasında söz konusu olabilecek önemli etkiler aşağıda açıklanmıştır.

Pasteur etkisi: Solunum ile fermantatif aktivitenin bastırılması mayada keşfedilen ilk

düzenleyici etkidir. Enerji metabolizması ile bağlantısı çok iyi belirlenmiştir ancak

biyolojik ayrıntılar ile bunların gözlenen gelişme kinetiği ve diğer düzenleyici

sistemlerle olan ilişkisi halen tartışma düzeyindedir (Bellgardt and Yuan 1991).

Crabtree etkisi: oksijen ve şeker fazlalığı altında solunumlu- fermantatif metabolizma

olarak tanımlanır. ‘Crabtree’ etkisi, orijinal olarak solunum enzimlerinin ‘Pasteur’

etkisinin tersi gibidir. Her ikisi de ekmek mayası üretiminin kontrolü için önemlidir,

çünkü oksidatif metabolizmanın sınırlı kapasitesine göre fazla miktarda şekerin

sağlanması (ya doygunluk, ‘Crabtree’ etkisi; yada dış oksijen temini ‘Pasteur’ etkisi ile)

hücre kütlesinin düşük verimde fermantatif gelişmesine sebep olur.

Glikoz Etkisi: Tüketim sistemlerinin tutuklanması veya glikozun yüksek derişimlerde

bulunduğu durumlarda diğer substratların kullanılabilmesi için gerekli olan yol izleridir.

Bu tutuklanma sonucunda, ortamda yüksek derişimlerde başka substratlar bulunsa bile

başlangıç katabolizması için tercih edilen substrat glikoz olur. Bu, ortamda oluşan

etanolün neden tercih edilmediğinin de açıklamasıdır.

16

3.4.2 Maya aktivitesini etkileyen etkenler

3.4.2.1 Besin maddelerinin etkisi

a) Melas: Şeker kamışı veya pancarı melasları ekmek mayası üretiminin ana

hammaddesi ve ana karbon kaynağıdır. Melas içindeki sakaroz maya hücrelerine

glikoz ve fruktoz olarak taşınır. Melasın bileşimi, şeker rafinasyon teknolojisi ve

tarım-iklim koşullarına göre değişiklik arz eder. Bu değişiklikler ekmek mayası

üretiminde problem teşkil eder.

b) Azot: azot maya hücreleri için önemli bir elementtir. Ortama amanyok, amonyak

tuzları ve üre formunda ilave edilir.

c) Oksijen: Maya üretimi için çok önemli bir başka hammadde oksijendir. Oksijen

kaynağı olarak hava kullanılır. Oksijensiz ortamda maya ürün katsayısı (YX/S) çok

düşük seviyelerde iken, oksijenli ortamda bu katsayı çok daha yüksektir. Üretimde

amaç en yüksek ürün verimliliğini elde etmektir. Bu da reaktördeki şeker seviyesini

çok düşük seviyede tutacak oksijen girdisini sağlayarak temin edilir. Oksijen

‘aerobik’ fermantasyonda temel besindir. Diğer besinlere nazaran da suda

çözünürlüğü çok düşük olması sebebiyle de temini en güç olanıdır.

d) Vitaminler ve iz elementler: Üretimde; canlı hücrenin ırkı, kullanılan melas ve

suyun içeriği bakımından kalitesi olmak üzere üç temel faktöre bağlı olarak ortama,

özel vitamin ve tuz ilave tuzların katılmasına gerek duyulur (Kristiansen 1994).

Büyüme ortamına eklenen birkaç vitamin hücre büyümesine pozitif etkiler. Biotin,

pantothenate ve inositol ekmek mayası için gerekli vitaminlerdendir. İz elementleri

ekleme hakkında bilimsel literatürdeki bilgi belirsizdir. Bunun nicel ve nitel

açıklamaları zordur. Kültür ortamına eklenen Cu, Zn, Fe, Mo ve Mn ürün miktarını

ve fermantasyon başarısını arttırır.

17

e) Tuzlar: Azotun yanında, ortama mineral tuzlar olarak fosfor, magnezyum ve

kalsiyum ilave edilir.

f) Köpük önleyici: Reaktör içinde karıştırmanın da etkisiyle oluşabilecek köpürmeyi

önlemek için gerektiğinde ortama katılır.

3.4.2.2 Sıcaklığın etkisi

Mayalar için sıcaklık, diğer organizmalarda olduğu gibi gelişmeyi sınırlandıran bir

etkendir. Mayaların gelişmeleri ve çoğalmaları genellikle 0-45 οC arasında olmaktadır.

En uygun çalışma sıcaklığı ise 20-30 οC arasında değişir. Yüksek sıcaklık zehirli

metabolik atıkların artmasına neden olmaktadır. Ayrıca yüksek sıcaklık mayanın

parçalanma yeteneğini arttırır ve hücre bölünmesinin daha erken olmasını sağlayarak

hücre yapısını geriletir. Yüksek sıcaklık nedeniyle fermantasyon sırasında yüksek

miktarda alkol oluşmaktadır.

3.4.2.3 Oksijen etkisi

Mayalar havalı veya havasız ortamda üreyebilirler. Mayanın uygun besi ortamında

havalı koşullarda üreyebilmesi ile ortamda karbondioksit ve su oluşur. Havasız ortamda

ise etil alkol ve karbondioksit gelişimi olur. Etil alkol fermantasyonunda çeşitli

indirgenme ve yükseltgenme tepkimeleri sonucu glikoz önce pirüvik aside, sonra

asetaldehide ve en son olarak da etil alkole dönüşür.

Havalı ortamda:

KcalOHCOOOHC 688666 2226126 ++→+ (3.1)

Havasız ortamda;

KcalCOOHHCOHC 5662 2526126 ++→ (3.2)

18

Havalı ortamda açığa çıkan enerji, havasız ortama kıyasla 12 kat fazladır. Bu tür

fermantasyonlarda reaktöre verilen hava içindeki oksijen, gaz fazından sıvı faza geçerek

ortamda mikroorganizmalar tarafından tüketilir. Amaç maya üretimi yapmak ise havalı,

alkol üretimi yapmak ise havasız ortamda çalışmak gerekmektedir.

3.4.2.4 pH etkisi

Ortam pH’sının mayaların gelişimi üzerine etkisi vardır. Mayalar hafif asidik ortamda

çoğalıp gelişirler. Genel olarak uygun pH, 4-5 arasında değişir.

3.4.2.5 Metabolizma ürünlerinin etkisi

Etil alkol mayalar için en önemli metabolizma ürünü olmakla birlikte mayalar için

inhibe edici bir özellik taşır. %2’lik etil alkol derişimi maya çoğalmasını yavaşlatır, etil

alkol derişimi %10 olduğunda ise durur (Köşker 1980). Sacchoromyces cerevisiae

mayası için ortamdaki etil alkol derişiminin etkisi Wilke (1981) tarafından incelenmiş

ve yaklaşık 93 g/L etil alkol derişiminde maya üreme ve etanol üretim hızının sıfır

olduğu bulunmuştur. Diğer bir metabolizma ürünü olan karbondioksitin maya

üzerindeki etkisi oldukça azdır. Ancak 8 atm’lik karbondioksit basıncı fermantasyonu

durdurabilir. Bu da fermantasyon reaktörü için mümkün olmayan bir basınçtır.

3.5 Biyoreaktörler

Bitki, hayvan ve insan hücrelerini veya başlı başsına enzimleri kullanarak

hammaddeleri biyolojik olarak özel ürünlere dönüştürmek için kullanılan reaktörlerdir.

Biyoreaktörlerde; sıcaklık, pH, substrat, tuzlar, vitaminler, oksijen derişimi ayarlanarak

hücre büyümesi için optimum koşullar sağlanır.

19

3.5.1 Biyoreaktör işletim türleri

Biyoreaktörler işletim şekillerine göre kesikli, yarı kesikli ve sürekli olmak üzere

sınıflandırılabilirler.

• Kesikli işletim (‘Batch’): endüstriyel biyoreaktörler genellikle kesikli işletim ile

çalıştırılırlar. Kesikli işletimde, biyoreaktör ilk önce fermantasyon sıvısı ile doldurulur,

hücreler ortama aşılanır ve hücrelerin üremeleri için belli bir süre beklenir. Bu süre

sonunda hücre yoğunluğunun veya ürün derişiminin belli bir değere ulaşması öngörülür.

Bu süre sonunda reaktör boşaltılır ve yeni bir işlem için hazırlanır.

Kesikli işletimde, reaktör hazırlama, hücre üremesi, reaktör boşaltma ve temizleme

olmak üzere dört evre söz konusudur. Fermantasyon işlemi boyunca herhangi bir

besleme veya ürün uzaklaştırma işlemi yapılmaz. Sadece havalı fermantasyon için hava

beslemesi yapılır. Reaksiyon süresince substrat ve biyokütle derişimi değişir. Reaksiyon

boyunca substrat derişimi azalırken, biyokütle derişimi artar.

• Yarı kesikli işletim (‘Fed-batch’): Yarı kesikli işletimde, biyoreaktöre

fermantasyon boyunca substrat beslemesi yapılır. Reaktörden alınan örnekler dışında

herhangi bir ürün uzaklaştırması söz konusu değildir. Sürekli substrat beslemesi

yapılması ve ürün uzaklaştırılmaması nedeniyle toplam reaksiyon hacmi zamanla artar.

Yarı kesikli işletim, girdi beslemesi yapılarak kesikli işletimin devamı olarak

çalıştırılabileceği gibi hücre büyüme ve çoğalma evreleri ayrı fazlar olarak kontrol

edilebilir. Bunun yanında yarı kesikli işletimde farklı besleme şekilleri ile farklı kontrol

metotları uygulanabilir. Bu işletimde yüksek derişimde biyokütle ve ürün elde edilir.

• Sürekli işletim (‘Continuous’): Sürekli işletimde, bir taraftan reaktöre substrat

beslemesi yapılırken, diğer taraftan da ürün uzaklaştırılır. Besleme ve uzaklaştırma

hızları reaktör hacmi sabit kalacak şekilde yapılır.

20

Sürekli işletimle çalışan reaktörlerde, reaksiyon başladıktan kısa bir süre sonra sistem

yatışkın hale ulaşır. Bu işletim şekli arıtma endüstrisinde ve diğer bazı endüstrilerde

kullanılır. Ayrıca laboratuar çalışmalarında, organizmaların üreme kinetiklerinin ve

enzim reaksiyon kinetiklerinin belirlenmesinde kullanılır.

3.6 Proses Gözleme ve Kontrol

3.6.1 pH kontrol

pH kontrol ürün verimliliği açısından önemli bir parametredir. Amaç istenen metabolik

etkiye ulaşmaktır. Ortama uygun asit baz eklemesi ile kontrol sağlanır. Asit veya baz

kültür ortamında çabuk dağılır, fakat pH elektrotu kültür ortamının sembolik bir

örneğini ölçer. pH kontrol, ayarlanan ‘set noktası’ ve pH’ın gerçek değeri arasında

karşılaştırma yapar. pH ölçümü gerçekte sadece sterillenebilir elektrotlar (genelde,

‘Mettler-Toledo’ elektrotları) kullanılarak yapılır.

Set noktası ayarı, pHmin ve pHmax dan oluşur. Eğer pH ayarlanan set noktası arasında

kalırsa olumsuz etkiler oluşmaz. pH hassasiyeti belirtilmelidir (± 0.02 pH).

3.6.2 Çözünmüş oksijen derişiminin kontrolü

Antibiyotik ve organik asitlerin üretiminde önemlidir. Çözünmüş oksijen derişimi, kütle

aktarım katsayısını hesaplamada önemli rol oynar. DO ölçüm ve kontrolü ürün

verimliliği ve seçimliliği açısından çok önemli bir parametredir. DO kontrol

fermantasyon prosesleri için karakteristiktir.

Çözünmüş oksijen derişimini kontrol etmek için farklı DO kontrol yöntemleri vardır.

Karıştırıcı devir hızı (N), hava giriş hızı ( Qhava), gaz karışımı içerisindeki oksijen

derişimi (QO2) ve karıştırıcı devir hızıyla beraber hava giriş hızı birleştirilerek

değiştirilebilir.

21

Çözünmüş oksijen derişimi ayarı, % veya derişim cinsinden ölçülür. DO kontrolünde

önemli parametreler karıştırıcı hızının limitleri Nmin ve Nmax ‘dır. Karıştırıcı hızının

limitlerinin seçimi için bir çok kriter vardır;

Minimum karıştırıcı hızının seçim kriteri; kısmen de olsa türbülent akış rejiminin

korunması ve kabarcık dağılımının sağlanmasıdır.

Maksimum karıştırıcı hızının seçim kriteri; yoğun köpük oluşum noktası hücrelerde

telafisi olmayan deformasyonların oluşum noktası, aşırı yüzey gerilimi ve

buharlaşmadır.

3.6.3 Sıcaklık kontrol

Sıcaklık ölçüm ve kontrolü sadece kültüre olan etkisinden değil, diğer sensörlere olan

etkisinden dolayı da önemlidir. Sıcaklık ölçümleri için, paslanmaz çelik Pt 100 sensörü

kullanılır. Sıcaklık fermantasyon prosesleri için çok önemli bir parametredir. Çünkü

biyosentez verimliliği ve çoğalması sıcaklıktaki iki derecelik değişimle önemli oranda

değişir. Çoğalma ortamı sıcaklığı yaygın olarak ±0.5 0C doğrulukta ölçülür.

Laboratuvar biyoreaktörlerinde sıcaklık kontrolü termoçiftin biyoreaktör içine

daldırılması ve soğutma/ısıtma suyunun ceketten gönderilmesiyle sağlanır.

Sıcaklık kontrol proseslerinde iyi performans alınamamasının nedeni PID

parametrelerinin seçimidir. Bu durum, sıcaklıkta salınımlara neden olur. Sıcaklık

kontrolündeki zorluklardan biri de ortam reolojisi ve ısı aktarım alanıdır.

3.6.4 Basınç kontrolü

Basınç burbon tüpü basınç ölçerlerle ölçülür. Sensör yerleştirilmesinde, mikrobiyal

gelişim boyunca çatlakların bulunmamasına veya diğer katıların yığın oluşturmamasına

dikkat edilmelidir.

22

3.6.5 Köpük kontrolü

Köpük oluşumu istenmeyen bir durumdur. Köpük oluşumu fermantasyon ortamını

kaybetmeye neden olur. Köpüklenme durumunda yüksek doğrulukta analiz ve ölçümler

yapılamaz.

Köpük seviyesi mekanik olarak kontrol edilebilir. Disk tipi özel bir köpük kırıcı

biyoreaktörün üst kapağına monte edilir. Eğer yoğun köpük oluşumu olursa bu çok

fazla işe yaramayacaktır. Köpük kırıcı ilave edilmelidir.

3.6.6 Substrat derişiminin kontrolü

Besi ortamının yapısı ve derişiminin mikroorganizmanın çoğalması üzerinde etkisi

oldukça fazladır. Substrat derişiminin fazla olması mikroorganizmaların inhibe

olmasına neden olur. Çalışmada kullanılan S. cerevisiae mikroorganizması için bu

durum daha da önem kazanmaktadır. Çünkü bu mikroorganizmanın çoğaltıldığı

ortamlarda substrat derişiminin fazla olması –havalı ortamda da olsa- havasız koşullarda

çoğalma oluyormuşçasına etanol üretimi gerçekleşir. Bu duruma ‘Crabtree Etkisi’ denir

(Frukawa 1983). Amaç mikroorganizma üretmek ise bu durum istenmez. Substratların

çoğalmayı engelleyici seviyeleri hücrelerin ve substratın tipine çok bağlıdır. Maya

üretiminde glikozun 200 g/L üzerindeki derişimi, sudaki indirgenme aktivitesi

nedeniyle, inhibe edicidir (Shuler and Kargi 1992).

Mayanın istenilen şekilde üretilebilmesi için ortamdaki oksijen ve şeker aktarımının iyi,

etanol oluşumunun az olması gerekmektedir. Bunlardan da anlaşılacağı gibi yüksek

etanol derişimi maya hücreleri için toksik etkiye sahiptir. Etanolün kendisi de bir

karbon kaynağı olduğundan maya hücresi büyümek için etanolü de kullanabilir. Etanol

toksik olduğundan maya gelişebilmek için şekeri etanole tercih eder. Büyüme sırasında

maya hücresi karbondioksit üretir. Maya hücresi etanol üretirken oksijen

kullanmadığından mayanın durumunu tanımlayabilecek bir başka güvenilir değişken

karbondioksit üretim hızının (CPR), oksijen tüketim hızına (OUR) oranıdır. Bu oran

23

solunum katsayısı, solunum oranı (‘Respiratory Quotient’,RQ) olarak

adlandırılmaktadır. Glikoz kontrolü, solunum oranı (‘Respiratory Quotient’,RQ) ile

sağlanabilir.

3.6.6.1 Solunum oranı (‘Respirartory Quotient’, RQ )

Solunum oranı; üretilen karbondioksitin tüketilen oksijeni oranıdır;

2

2

tüketilenO

olusanCORQ = (3.3)

Solunum oranı ölçümü mikroorganizmanın tükettiği substrat miktarını verir.

3.7 Sistem Tanımlama

Sistem tanımlama (System identification) kontrol algoritmasında yer alan oldukça

önemli ve zaman alan bir işlevdir. Şekil 3.2’deki gibi verilen bir dinamik sistem

deneysel verilerden yararlanılarak modellenir. Sistem fiziksel özelliklerini en iyi

yansıtan matematiksel model bulunmaya çalışılır.

Şekil 3.2 t anında giriş değişkeni u(t), çıkış değişkeni y(t) ve gürültü e(t) içeren bir dinamik sistem

Sistemlerin modellenmesi değişik yöntemlerle gerçekleştirilebilir. Giriş değişkenine

birim basamak etki verildiğinde elde edilecek çıkış değişkeni değerlerinin grafiksel

olarak değerlendirilmesi buna bir örnektir. Diğer bir yol matematiksel model

kullanmaktır. Bunun için diferansiyel ve fark eşitliklerinden yararlanılır. Bu tür

Sistem Çıkış değişkeni

y(t)

Giriş değişkeni

u(t)

Gürültü, e(t)

24

modeller sistemin dinamik davranışını yeterince tanımlamaktadır. Matematiksel

modeller birçok alanda ve uygulamada oldukça yararlıdır. Matematiksel model

oluşturmanın basitçe iki yolu vardır.

1. Modelleme: bir analitik yaklaşımdır. Basit fizik kanunları, kütle-enerji dengeleri bir

prosesi tanımlamak için kullanılır.

2. Sistem tanımlama: bu bir deneysel yaklaşımdır. Sistemde bazı deneyler

gerçekleştirilir. Kaydedilen veriler kullanılarak modelin deneysel verilerle

uygunluğu araştırılır.

Bir çok durumda prosesler oldukça karmaşıktır. Klasik fizik kanunları, kütle-enerji

dengeleri vb. ifadeler, kullanılabilir bir modelin elde edilmesi için yeterli olmayabilir.

Bu gibi durumlarda sistem tanımlama yöntemleri uygulanır. Yüksek dereceli sistemlerin

modelleri, fizik yasaları kullanılarak bulunan modellere göre daha kolay elde edilebilir.

3.7.1 Modelleme

S. cerevisiae mikroorganizmasının havalı koşullarda yarı kesikli bir biyoreaktörde

glikozun karbon ve enerji kaynağı olarak kullanıldığı kültür ortamındaki dinamiğini

ifade etmek için kütle korunum denklikleri geliştirilmiştir.

Kesikli bir biyoreaktörde hücrelerin çoğalma hızı Eşitlik 3.4’te verilmiştir;

Xdt

dxµ= (3.4)

Monod kinetinğine göre (3.5),

SKS

Sx

+= maxµ

µ (3.5)

25

ise, yarı kesikli bir biyoreaktör için mikroorganizma çoğalma hızı Eşitlik 3.6’da

verilmiştir,

)( 0max xx

V

F

KS

Sx

dt

dx

RS

−++

=µ

(3.6)

Burada F hacimsel akış hızını(mL/min), VR reaktördeki toplam hacmi(mL), x0 başlangıç

mikroorganizma derişimini, S substrat derişimini (g/L) temsil etmektedir.

Substrat tüketim hızı Eşitlik 3.7 ile ifade edilmiştir.

)(1

0max

/

SSV

F

KS

Sx

Ydt

dS

RSSX

−++

−=

µ (3.7)

Burada ise SXY / substrat verim katsayısını, S0 başlangıç substrat derişimini (g/L)

göstermektedir.

Eşitlik 3.8 ve 3.9’da ise özgül çoğalma hızı ve biyoreaktör hacminin zamanla değişimi

görülmektedir.

0=dt

dµ (3.8)

Fdt

dV= (3.9

BİR BİYOREAKTÖRDE GLİKOZ DERİŞİMİ KONTROLU Zeynep...

Documents

Transcript of BİR BİYOREAKTÖRDE GLİKOZ DERİŞİMİ KONTROLU Zeynep...