BÍLKOVINY = PROTEINY Polymery aminokyselin propojených peptidovou vazbou

20 AK → 2018 variant pro peptid složený z 20 AK!!!

Průměrná bílkovina ≈ 300 AK

Relativní molekulová hmotnost (bezrozměrné číslo)

Molární hmotnost (g/mol)

Molekulová hmotnost (Mh) - jednotka Dalton (Da) resp. kDa – 1/12

hmotnosti atomu 12C

Příklad: albumin 66 438 g/mol = 66438 Da = 66,438 kDa

Klasifikace proteinů

1. Funkce – specifické, obecné

2. Chemické složení

3. Tvar molekul

1. Funkce obecné: zdroj energie a dusíku

Účinné pufry (krev, cytosol)

Přispívají významně k udržení osmotického tlaku vně i uvnitř

buněk

1. Specifické funkce proteinů

Typ proteinu Příklad Výskyt & funkce

Katalytické (enzymy) Trypsin

DNA polymerasa

Hydrolysa peptidové vazby

Synthesa DNA

Regulační (hormony) Insulin

Růstový hormon

Stimulace metabolismu glc

Stimulace růstu kostí

Ochranné Protilátky

Interferon

Vazba na cizorodé látky

Brání replikaci virů

Skladovací Kasein

Ferritin

Mléčná bílkovina

Zásoba Fe v játrech

transportní Hemoglobin

Myoglobin

Transport O2 v krvi

Transport/skladování O2 ve

svalu

Strukturní Kolagen

Ribosomální

proteiny

Vláknité pojivové tkáně

Ribosomy

Kontraktilní Myosin

Aktin

Svalová vlákna

Genetické funkční

proteiny

Histony

Represory

Asociace s DNA

v chromosomech

Blokují expresi genu

Toxické proteiny Ricin

Cholera toxin

Toxický protein z Ricinus

communis

Bakteriální toxin

2. Chemické složení

• Jednoduché

• Složené – polypeptidová + neproteinová část

Metaloproteiny

Fosfoproteiny

Glykoproteiny

Lipoproteiny

Nukleoproteiny

Enzymy s prostetickou skupinou

3. Rozdělení proteinů podle tvaru molekul

• Globulární

• Fibrilární

• Membránové

Další možné způsoby dělení proteinů:

Podle lokalizace nebo dějů ve kterých působí:

Extracelulární x intracelulární

Krevní bílkoviny

Mléčné bílkoviny

Membránové receptory

Elektrontransportní systémy

Primární struktura bílkovin

pořadí aminokyselinových zbytků v peptidovém řetězci

zápis: od N-konce k C-konci

Primární struktura determinuje prostorové uspořádání a funkci proteinů

ZÁKONITOSTI:

• Primární struktura je zapsána v DNA (gen)

• Neexistuje společná sekvence, ani částečně

• Kombinace AK bez omezení

• Proteiny se stejnou funkcí z jedinců jednoho druhu jsou identické ale…

• Polymorfismus bílkovin vs mutace.

• Bílkoviny jeví druhovou specifitu (sekvenční homologie) - zákon

isopolárních záměn

N-konec C-konec

Cα

Homologie proteinů

% identity

% podobnosti

URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY

A. Aminokyselinové složení - určení počtu jednotlivých AK zbytků

(kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 – 110 ºC, 24 h)

B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace

disulfidických můstků)

2. Určit N-konec a C-konec

3. nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy (peptidy)

4. Určení pořadí aminokyselin v těchto peptidech

5. Sestavit primární strukturu řetězce

6. Určit způsob propojení původních řetězců

2. Určení N-koncové AK

např.:

- DNF

- dansyl chlorid

2. Určení C-koncové AK

• Specifické enzymové štěpení (karboxypeptidasy)

• Redukce -COOH LiBH4 na -OH, identifikace aminoalkoholu

• Hydrazinolýza (NH2-NH2) – aminoacyl hydrazidy AK

URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY

A. Aminokyselinové složení - určení počtu jednotlivých AK zbytků

(kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 – 110 ºC, 24 h)

B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace

disulfidických můstků)

2. Určit N-konec a C-konec

3. nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy (peptidy)

4. Určení pořadí aminokyselin v těchto peptidech – Edmanova metoda

5. Sestavit primární strukturu řetězce

6. Určit způsob propojení původních řetězců

3. Specifické štěpení polypeptidového řetězce

Trypsin – štěpí specificky za basickými aminokyselinami Lys, Arg

Chymotrypsin – štěpí za aromatickými aminokyselinami (Phe, Tyr, Trp)

(CNBr – štěpí za Met)

• Separace peptidů (chromatografie)

• Určení sekvence – Edmanovo odbourání

N-Leu-Val-Phe-Asp-Lys-Glu-Tyr-Gly-Ile-Arg-Ser-Phe-Thr-Lys-Cys-Pro-Ala-Trp-Lys-His-Met-Arg-Trp-Gly-C

↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑

leu-val-phe-asp-lys

Glu-tyr-gly-ile-arg

Ser-phe –thr-lys

Cys-pro-ala-trp-lys

His-met-arg

Trp-gly

Leu-Val-Phe

Asp-Lys-Glu-Tyr

Gly-Ile-Arg-Ser-Phe

Thr-Lys-Cys-Pro-Ala-Trp

Lys-His-Met-Arg-Trp

Gly

URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY

A. Aminokyselinové složení - určení počtu jednotlivých AK zbytků

(kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 – 110 ºC, 24 h)

B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace

disulfidických můstků)

2. Určit N-konec a C-konec

3. nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy (peptidy)

4. Určení pořadí aminokyselin v těchto peptidech – Edmanova metoda

5. Sestavit primární strukturu řetězce

6. Určit způsob propojení původních řetězců

4. Edmanova reakce určení pořadí AK v kratších úsecích (peptidech)

- reakce s fenylisothiokyanátem

příslušné AK

URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY

A. Aminokyselinové složení - určení počtu jednotlivých AK zbytků

(kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 – 110 ºC, 24 h)

B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace

disulfidických můstků)

2. Určit N-konec a C-konec

3. nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy (peptidy)

4. Určení pořadí aminokyselin v těchto peptidech – Edmanova metoda

5. Sestavit primární strukturu řetězce

6. Určit způsob propojení původních řetězců

5. Sestavení primární struktury – hledání překrývajících se sekvencí peptidů

URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY

A. Aminokyselinové složení - určení počtu jednotlivých AK zbytků

(kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 – 110 ºC, 24 h)

B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace

disulfidických můstků)

2. Určit N-konec a C-konec

3. nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy (peptidy)

4. Určení pořadí aminokyselin v těchto peptidech – Edmanova metoda

5. Sestavit primární strukturu řetězce

6. Určit způsob propojení původních řetězců

Kovalentní struktura

( primární struktura + posttranslační modifikace)

1. Propojení řetězců kovalentními vazbami, disulfidové můstky

2. Odštěpení částí řetězců (./.)

3. Úpravy postranních řetězců aminokyselin – nekódované AK

4. Připojení mastných kyselin

5. Glykosylace (Asn, Ser/Thr)

6. Fosforylace (dočasné či trvalé)

7. Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory enzymů...)

8. Metaloproteiny (koordinačně kovalentní vazby různé síly)

1 - 3: jednoduché bílkoviny

4 - 8: složené bílkoviny

2. Odštěpení částí řetězců - příklad

Obecné znaky prostorového uspořádání proteinů

(obecně „organisovaných“ biopolymerů)

1. Nativní struktura odpovídá minimu Gibbsovy energie, dané

výhodností nekovalentních interakcí

2. Nativní struktura je určena kovalentní strukturou

3. Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích s

okolím (nevazebné interakce !).

4. Prostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické (primární,

kovalentní, sekundární, terciární, kvarterní struktura)

5. Nativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformačně

dynamické systémy)

6. Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).

•Nativní struktura (konformace) - prostorové uspořádání, jež

umožňuje biopolymeru vykonávat biologickou funkci

- Charakter peptidové vazby – planární uspořádání!!

- Vlastnosti postranních řetězců

Prostorové uspořádání proteinů je dáno

primární (kovalentní) strukturou :

trans konfigurace

60% 40%

Konformace peptidového řetězce

Torzní úhly Φ a Ψ

Plně natažený polypeptidový řetězec,

trans konfigurace – Φ=Ψ=180º až -180 º

Sterická omezení – postranní skupiny

Sekundární struktura proteinů

obecné charakteristiky

Pravidelné nebo periodické uspořádání polypeptidového řetězce

Vzájemné prostorové uspořádání blízkých částí řetězce

Fixovány především vodíkovými můstky NH …..CO

Linus Pauling, Robert Corey (1951)

Předpoklady: • Peptidová vazba a okolní atomy Cα tvoří planární útvar a jsou v trans

konfiguraci

• Vazebné úhly a meziatomové vzdálenosti v proteinech odpovídají těmto

veličinám v malých organických molekulách

• Prostorové uspořádání proteinů vyžaduje tvorbu maximálního počtu

vodíkových můstků

α-helix a β-struktury

parametry:

Stoupání závitu: 0.54 nm

3,6 Ak zbytku/závit

Počet atomů 11

α- helix pravotočivá šroubovice

Ochota polypeptidového řetězce tvořit helikální struktury závisí na:

a) Přítomnosti AK zabraňujících tvorbě α-helixu – prolin, hydroxyprolin

b) AK s objemnými postranními řetězci

c) Iontové interakce – závisí na pH – př. polylys, polyglu

β-struktura (skládaný list)

•Stabilizace – meziřetězcové vodíkové můstky

Pozor: Pravidelné sekundární struktury netvoří celý

řetězec

β-ohyby: -X-gly-pro-Y-

X,Y – polární AK

Další pravidelné struktury

Vyšší pravidelné struktury - motivy

Vyšší pravidelné struktury - motivy

Terciární struktura

Prostorové uspořádání vzdálených částí řetězce

Fixace disulfidovými můstky a nekovalentními interakcemi!!

Terciární struktura

Karbonanhydrasa

•Prostorové uspořádání všech částí

polypeptidového řetězce

•Správné uspořádání je podmínkou

funkce (biologické aktivity)

•Zahrnuje:

nevazebné interakce

disulfidové můstky

nebílkovinné složky

rentgenostrukturní analysa

• globulární – nižší obsah sek. struktur, core x obal,

• fibrilární – vláknité, tyčovité, dlouhé úseky sekundárních struktur

Kvarterní struktura uspořádání podjednotek

Domény

Příklady bílkovin s kvarterní strukturou

Bílkovina Rel.mol.hm

oligomeru

(Da)

Počet

podjed-

notek

Charakter, funkce

hemoglobin (lidský) 64 500 4 2 + 2 podjednotky dvou typů (22

tetramer), přenos kyslíku

-amylasa (lidská) 97 600 2 identické podjednotky, enzym

(hydrolytické štěpení škrobu)

alkoholdehydrogenasa (kvasinky) 150 000 4 enzym (katalysuje redukci acetaldehydu

na ethanol)

ferritin (lidský) 480 000 20 skladování železitých iontů

glutaminsynthetasa (E.coli) 592 000 12 enzym (synthesa Gln z Glu), kulovité

podjednotky tvoří 2 šestiúhelníky umístěné

nad sebou

pyruvátdekarboxylasa (E.coli) 4 400 000 72 enzymový komplex, podjednotky 3 typů,

každá katalysuje jednu dílčí reakci

hemocyanin (plži) 8 000 000 160 metaloprotein obsahující Cu2+; přenos O2;

dutý válec 40x40 nm

virus tabákové mozaiky 39 300 000 2130 helikálně uspořádané identické

podjednotky (rel.m.h. 17 500) tvořící

komplex s RNA

Levinthal‘s Paradox:

We assume that there are three conformations for each amino acid (ex. α-helix, β-sheet and random coil). If a protein is made up of 100 amino acid residues, a total number of conformations is

3100 = 515377520732011331036461129765621272702107522001 ≒ 5 x 1047.

If 100 psec (10-10 sec) were required to convert from a conformation to another one, a random search of all conformations would require

5 x 1047 x 10-10 sec ≒ 1.6 x 1030 years.

However, folding of proteins takes place in msec to sec order.

Therefore, proteins fold not via a random search but a more sophisticated search process.

Skládání (svinování) proteinů

Skládání (svinování) proteinů

- neprobíhá náhodným způsobem

- probíhá postupně:

1. malé dočasné periodické struktury

2. supersekundární struktury, strukturní

domény a "roztavená" glubule

3. Nativní struktura - závěrečné úpravy za

účasti enzymů (peptidylprolin-cis-trans-

isomerasa, proteindisulfid-isomerasa)

- Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky?

Chaperony

Vlastnosti proteinů

Nábojové vlastnosti

Rozpustnost – v závislosti na pI

Denaturace – ztráta nativní konformace

Kooperativita (denaturační přechod)

Příklad: teplotní denaturace

Jsou málo stabilní - denaturují

Faktory způsobující denaturaci

•Fyzikální – teplo, záření

•Chemické – organická rozpouštědla,

soli, kyseliny, zásady, chaotropní činidla

(močovina, quanidin HCl), detergenty

Kooperativita (příklad hemoglobin x myoglobin)

aneb jak struktura ovlivňuje funkci proteinů

Myosin – molekulární motor – aktomyosinový komplex –

kontrakce svalu

Aktin

Příklady struktury některých proteinů

•Imunoglobuliny = protilátky •Funkce – obraný, imunitní systém

•Základní pojmy: antigen,

hapten, epitop

α-Keratin

•Protofibrily propojeny S-S můstky

Gly, ser, cys

α-helix

β-keratin (fibroin z hedvábí) – skládaný list

• 1/3 Gly, 1/5 Pro nebo Hypro

• Triplet Gly-X-Pro (nebo Gly-X-Hyp)

se často opakuje

• Levotočivá šroubovice, 3 AK zbytky

/otáčku

• Superšroubovice pravotočivá ze 3

levotočivých helixů

LH RH

Kolagen