ISOLASI ISOLASI

DAN DAN

PEMISAHAN PROTEINPEMISAHAN PROTEIN

Pendahuluan

Protein adalah molekul organik yang terbanyak di dalam sel. Lebih dari 50% berat kering

sel terdiri atas protein. Selain itu, protein adalah biomolekul yang sesungguhnya,

karena senyawa ini yang menjalankan berbagai fungsi dasar kehidupan, antara lain

proses berkontraksi melakukan gerak, menjalankan berbagai proses metabolisme dalam

bentuk enzim. Protein dapat pula berperan membawa informasi dari luar ke dalam sel dan

di dalam bagian-bagian sel sendiri. Protein juga mengendalikan dapat tidaknya, serta

waktu yang tepat untuk pengungkapan informasi yang terkandung di dalam DNA, yang

diperlukan untuk sintesis protein itu sendiri. Jadi secara tidak langsung protein mengatur

perbanyakan diri sendiri dengan mengatur DNA, yang merupakan alat perekam informasi

untuk protein, sehingga dengan demikian operasinya di bawah kendali protein.

Secara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam-asam amino, yang terikat satu

sama lain dengan ikatan peptida. Ada suatu universalisme di dalam molekul protein.

Protein apapun dan berasal dari makhluk apapun juga ternyata hanya tersusun dari

20 macam asam amino saja. Perbedaan protein yang satu dengan yang lain disebabkan

oleh jumlah dan kedudukan asam-asam amino tersebut di dalam tiap-tiap molekul. Kedua

puluh asam-amino itu mempunyai ciri umum sebagai berikut. Pertama, semuanya

mempunyai konfigurasi L. Kedua, sama-sama mempunyai 1 gugus COOH dan 1 gugus

NH2 yang terikat ke atom C. Perbedaan individual dari asam-asam amino ini disebabkan

oleh perbedaan rantai samping. Yang menyebabkan perbedaan kimia antara asam-asam

amino tersebut, pada gilirannya akan menyebabkan perbedaan sifat kimia dan biologis dari

molekul protein yang disusunnya. Rantai samping R ini tidak ikut membentuk ikatan

peptida. Muatan suatu protein dalam suatu larutan ditentukan oleh gugus NH2 bebas di

suatu ujung dan gugus COOH bebas di ujung yang lain serta jumlah rantai yang

bermuatan.

Molekul protein, melalui ikatan hidrogen, berinteraksi dengan molekul air membentuk

mantel air. Karena molekulnya besar, di dalam air protein membentuk larutan koloid.

Adanya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi encer sanat meningkatkan kelarutan suatu

protein (salting in). Sifat ini, yaitu kelarutan dalam bentuk larutan koloid yang dipermudah

oleh mantel air dan elektrolit encer, dimanfaatkan untuk pemisahan protein. Selain itu, sifat

lain, yaitu ukuran molekul yang berbeda sebagai akibat dari jumlah asam amino yang

menyusun dan muatan yang tidak sama antar protein yang satu dengan yang lain karena

perbedaan jenis asam amino yang menyusunnya, menjadi dasar dari pemisahan protein

yang akan dilakukan pada praktikum berikut ini.

Tujuan Praktikum :

1. Mengenal reaksi umum berdasarkan adanya beberapa ikatan peptida pada suatu

protein dan mampu menggunakannya untuk melacak protein dalam suatu bahan

2. Melakukan pemisahan suatu protein dari kelompok protein lain secara reversibel

dengan menggunakan larutan garam divalen konsentrasi tinggi (salting out) dan

menerangkan mekanisme pemisahan tersebut.

3. Melakukan pemisahan protein secara reversibel, dengan menggunakan bahan

higroskopis dan menerangkan mekanisme pemisahan tersebut.

4. Melakukan pemisahan protein secara denaturasi ireversibel dengan menggunakan

pereaksi alkaloid, menerangkan mekanisme kerjanya dan mampu menggunakan

untuk melacak protein.

5. Memperlihatkan kemampuan logam berat dalam mengendapkan dan mendenaturasi

protein dan menjelaskan masalah yang ditimbulkan oleh logam berat sebagai

pencemar lingkungan.

6. Mengetahui cara pemisahan suatu protein dari protein lain ataupun senyawa lain,

berdasarkan perbedaan berat molekul, dengan menggunakan cara kromatografi gel

penyaring molekul sederhana.

Percobaan Protein

1. Uji Biuret

Tujuan :

Memperlihatkan bahwa protein mempunyai ikatan peptida yang bereaksi positif dengan uji

biuret. Reaksi ini tidak terjadi pada makromolekul lain.

Dasar :

Ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein dan polipeptida, dalam larutan bersuasana

alkali akan berwarna lembayung bila direaksikan dengan Cu++.

Bahan dan Pereaksi :

1. Larutan albumin atau putih telur

2. Air liur

3. Larutan pati 1%

4. NaOH 10%

5. Larutan CuSO4 0,1%

Cara Kerja dan Hasil :

Menyiapkan 4 tabung reaksi yang bersih. Mempipetkan ke dalam tabung reaksi, seperti

pada tabel 1.

Tabel 1. Prosedur Reaksi biuret

Tabung 1 2 3 4

Larutan albumin (putih telur) 1 mL - - -

Air liur - 1 mL - -

Larutan pati - - 1 mL -

Air suling - - - 1 mL

NaOH 10% 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Larutan CuSO4 * 1 tetes 1 tetes 1 tetes 1 tetes

Warna lembayung Ya Tidak Tidak Tidak

* Bila belum terbentuk warna lembayung, CuSO4 dapat ditambahkan lagi, sampai 10 tetes.

Kesimpulan :

Dari hasil percobaan diatas, dapat disimpulkan bahwa larutan yang bereaksi positif dengan

menghasilkan warna ungu melalui uji biuret adalah larutan albumin. Uji biuret positif

terhadap larutan yang mengandung mengandung protein, namun negatif pada larutan yang

tidak mengandung protein.

Jawaban Pertanyaan :

1. Ya, uji ini akan positif terhadap asam amino yang mengandung protein dengan

memiliki ikatan peptida.

2. Asam amino yang menyusun protein antara lain : Glisin, Alanin, Valin, Leusin,

Isoleusin, Fenilalanin, Metionin, Prolin, Triptofan, Serin, Treonin, Tirosin, Asparagin,

Glutamin, Sistein, Aspartat, Glutamat, Arginin, Lisin, Histidin.

3. Pengelompokan asam amino : Simple dan Conjugated.

4. Asam Amino esensial adalah asam amino yang dibutuhkan oleh tubuh tapi tidak

diproduksi oleh tubuh. Contohnya : Arginin, Histidin, Isoleusin, Methionin,

Phenylalanine, Threonin, Triptofan, Valin, Leusin. Sedangkan asam amino non

esensial adalah asam amino yang tidak begitu dibutuhkan oleh tubuh. Contohnya :

Hydroxiproline, Hydroxilisine, Glysine, Proline, Serin, Tyrosin, Aspargin, Glutamat,

Glisin, Cystein, Alanine.

2. Pengendapan Protein Dengan

Larutan Garam Konsentrasi Tinggi

(Salting Out)

Tujuan :

Memperlihatkan bahwa sebgai makromolekul yang larut dalam bentuk larutan koloid,

protein dapat dopisahkan satu dari yang lain, dengan menggunakan larutan garam divalent

konsentrasi tinggi.

Dasar :

Untuk larutan dalam air, suatu molekul harus dapat berinteraksi dengan molekul air

dengan cara membentuk ikatan hidrogen sehingga molekul tersebut tersebar rata

diantara molekul-molekul air. Adanya muatan listrik pada molekul terlarut sangat

membantu kelarutan, karena muatan yang sama saling menjauhi, sehingga agregasi

molekul tidak terjadi.

Protein merupakan makromolekul karena memiliki BM (berat molekul) besar. Pada

umumnya,protein mudah larut dalam air karena protein mempunyai kedua sifat berikut.

Gugus -CO- dan –NH- yang ada pada iktan peptida dapat berinteraksi dengan molekul air

melalui ikatan hidrogen, sedangkan berbagai rantai samping, yang diantaranya ada yang

hidrofilik,bahkan juga bermuatan, sangat mudah berinteraksi dengan molekul air. Selain

itu, muatan listrik yang sama dalam 2 partikel molekul protein yang sama, akan bertolakan,

sehingga membantu meningkatkan kelarutan protein (salting in).

Setiap keadaan yang menyebabkan ditariknya air yang mengelilingi molekul protein,

sangat mengurangi kelarutan protein, sehingga protein mengendap. Larutan garam

berkonsentrasi tinggi bersifat demikian. Selain itu, larutan garam berkonsentrasi tinggi

akan menetralkan muatan listrik, sehingga kelarutan akan makin berkurang.

Oleh karena pengendapan dengan cara ini hanya bersifat menarik air di sekeliling protein,

sedangkan molekul protein sendiri tidak mengalami perubahan kimia, maka perubahan

tersebut bersifat reversible. Kelarutan dan fungsi protein pada umumnya akan pulih

kembali bila dikembalikan ke keadaan semula.

Larutan garam divalent lebih efisien dalam mengendapkan protein, karena di dalam air

garam tersebut akan berdisosiasi menjadi 3 ion, yang masing-masing berinteraksi

sempurna dengan air. Sebagai contoh, globulin dapat diendapkan oleh (NH4)2SO4

setengah jenuh, sedangkan NaCl baru dapat mengendapkan protein tersebut bila berada

dalam larutan jenuh. Albumin, yang baru akan mengendap oleh (NH4)2SO4 jenuh, tidak

dapat diendapkan oleh NaCl jenuh, kecuali dengan penambahan asam mineral dalam

jumlah yang sangat kecil. Pada gambar 2.1 diperlihatkan mekanisme terjadinya

pengendapan protein oleh garam dalam konsentrasi tinggi.

H O H O H H H H O O O

R- R- O H H

N C N C C + (NH4)2SO4

NH3+ R+ O

Protein terlarut

NH3+ COO-

COO- NH3+

NH3+ COO-

COO- NH3+

Protein beragregasi / mengendap

Gambar 1. Pengendapan Protein Dengan Cara Salting Out

Bahan dan Pereaksi :

1. Serum sapi

2. Larutan ammonium sulfat (NH4)2SO4 jenuh

3. Larutan NaOH 10%

4. Larutan CuSO4 0,1%

Cara Kerja dan Hasil :

Menyiapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering. Melakukan prosedur seperti yang

tertera dalam tabel 2 :

Tabel 2. Percobaan salting out

Tabung 1

Serum sapi 1 ml

Amonium sulfat jenuh : tetes demi tetes 1 ml

Endapan : ada / tidak ada Ada endapan

Pisahkan endapan dengan menyaring

Lakukan uji biuret terhadap:

Filtrat

Endapan

-

+

Kesimpulan :

Protein dapat diendapkan dengan menggunakan garam konsentrasi tinggi melalui proses

salting out. Dengan penambahan ammonium sulfat yang jenuh akan mengendapkan serum

sapi sehingga larutan menjadi bersifat reversibel. Hal ini dikarenakan garam berdivalent

tinggi lebih kuat menarik mantel air daripada protein dalam serum.

Jawaban Pertanyaan :

1. Protein yang mengendap pada penambahan satu volume amonium sulfat jenuh ke

dalam satu volume serum adalah protein Albumin.

2. Yang tidak dapat diendapkan pada percobaan tersebut adalah Globulin.

3. Fungsi Albumin adalah mengikat Ligand, albumin disintesis di hati. Fungsi Protein

dalam darah = sebagai transport dan storage. Contoh : CO2 dan O2 dalam darah /

eritrosit.

4. Alkaptonuria, defisiensi enzim homogentisic acid dioxygenase.Ditandai dengan

perubahan warna urine yang menjadi gelap kalau didiamkan.

3. Pemisahan Protein Dengan Etanol

Absolut

Tujuan :

Memperlihatkan, bahwa sebagai makromolekul yang larut, protein dapat dipisahkan

dengan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolut.

Dasar :

Etanol absolut bersifat sangat kuat menarik air (higroskopis). Penambahan etanol absolut

pada suatu larutan protein, akan menyebabkan molekul air yang berinteraksi dengan

molekul protein melalui ikatan hidrogen ditarik oleh etanol. Akibatnya molekul-molekul

protein beragregasi satu sama lain sehingga mengendap. Bila agregat partikel protein

tersebut dibiarkan bersentuhan dengan etanol untuk waktu yang lama endapan yang

terbentuk tidak dapat dilarutkan lagi sehingga denaturasi yang terjadi irreversibel.

Dengan menggunakan etanol berbagai konsentrasi dan suhu yang rendah, Cohn pada tahun

empat puluhan telah berhasil memisahkan protein serum dalam 5 fraksi, dan fraksi V yang

diperoleh sebagian besar terdiri atas albumin.

Bahan dan Pereaksi :

1) Serum

2) Larutan albumin telur

3) Etanol absolut

4) Larutan NaOH encer

5) Larutan CuSO4

Cara Kerja dan Hasil :

Menyiapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering. Lakukan prosedur yang tertera pada

tabel 3 :

Tabel 3. Percobaan Pengendapan Protein Dengan Etanol Absolut

Tabung 1 2

Serum 1 ml -

Larutan albumin telur - 1 ml

Etanol absolut 1 ml 1 ml

Endapan: ada/tidak ada Ada endapan Ada endapan

Pisahkan endapan dengan menyaring

Uji biuret terhadap:

Filtrat

Endapan

-

+

-

+

Kesimpulan :

Protein dapat dipisahkan dengan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolut.

Kemudian dipisahkan antara endapan dan supernatan, lalu dites biuret tetap memberikan

hasil positif. Demikian juga serum dan etanol absolut, ditandai dengan warna ungu.

Jawaban Pertanyaan :

4. Pengendapan Protein Secara

Denaturasi Ireversibel

A. Pengendapan Dengan Pereaksi

Alkaloid

Tujuan :

Memisahkan protein dengan memisahkannya dengan senyawa yang bereaksi dengan

protein tersebut

Dasar :

“Pereaksi alkaloid” adalah asam-asam organik yang dapat mengendapkan alkaloid serta

protein. Pengendapan terjadi karena alkaloid dan protein mengandung nitrogen trivalen.

Asam trikloroasetat (TCA=tricgloracetic acid ) sering dipakai untuk deproteinisasi

(penyingkiran protein) dari suatu bahan. Asam sulfasalisilat sering dipakai unatuk melacak

ada tidaknya protein dalam urin patologis.

Bahan dan Pereaksi :

1. Serum

2. Asam triklosasetat (TCA: trichlos acetic acid) 10%

3. Asam sulfasalisilat 3%

Cara Kerja dan Hasil :

Siapkan dua tabung reaksi yang bersih dan kering. Lakukan prosedur yang tertera dalam

tabel 4.

Tabel 4.A.

Pengendapan Protein Dengan Menggunakan Pereaksi Alkaloid

Tabung 1 2

Serum 1 ml 1 ml

TCA 10% 1 ml 1ml

As. Sulfasalisilat - -

Endapan ada / tidak ada Ada Ada

Kesimpulan :

Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa serum merupakan protein yang mengandung

nitrogen trivalent yang apabila bereaksi dengan TCA atau asam sulfasalisilat akan

mengendap.

Jawaban Pertanyaan :

1. P

2. Urin normal tidak mengandung protein.

3. Proteinuria terlacak pada keadaan :

Cystinuria. Ekskresi sistin dalam urine meningkat (bisa mencapai 30 x nilai

normalnya). Ekskresi Lysine, Arginine dan Gangguan reabsorpsi asam

amino dari

Maple Syrup Urine Disease. Kadar Leusin, Isoleusin, Valine dan asam -

ketonya dalam plasma dan urin meninggi. Defek pada keadaan tidak adanya

atau berkurangnya aktivitas enzim dekarboksilase asam - keto. Terapinya :

penggantian protein dalam makanan dengan campuran asam amino yang tidak

mengandung Leusin, Isoleusin dan Valin.

Sistinosis ( = Cystine Storage Disease ). Merupakan gangguan dalam jaringan

dan organ terutama sistem R.E. Biasa disertai amino asiduria dan pasien

biasanya meninggal karena gagal ginjal akut.

B. Pengendapan protein dengan logam

berat

Tujuan :

Memperlihatkan, bahwa logam berat mengendapkan protein secara denaturasi ireversibel.

Dasar :

Protein bermuatan negatif membentuk garam dengan kation logam berat menjadikan

protein terdenaturasi dan mengendap.

Bahan dan Pereaksi :

1. Putih telur

2. larutan H9CL2 1%

3. Larutan Pb-asetat

Cara kerja dan Hasil :

Siapkan dua buah tabung reaksi, lakukan prosedur yang tertera dalam tabel 4.

Tabel 4.B.

Pengendapan Protein Dengan logam Berat

Tabung 1 2

Putih telur 1 ml 1 ml

H9CL2 Tetes demi tetes -

Pb-asetat - Tetes demi tetes

Endapan ada/tidak ada Ada Ada

Kesimpulan :

Protein apabila bereaksi dengan logam berat maka akan mengendap.

Jawaban Pertanyaan :

1. Ya, pada tiap kali penambahan logam berat selalu diikuti oleh penambahan

endapan protein. Hal ini dikarenakan logam berat mempunyai sifta pendenaturasi

protein dan kandungan kation logam berat akan bereaksi dengan molekul yang

bermuatan negatif yang dapat memicu pembentukan endapan pada protein.

2. Masing-masing dibutuhkan 5 tetes untuk proses pengendapan kedua kation.

3. Logam berat yang menjadi pencemar utama lingkungan adalah Pb dan sumber

pencemaran berasal dari asap kendaraan bermotor. Logam berat ini dapat

membahayakan sirkulasi pernafasan, sehingga terjadi infeksi saluran pernafasan.

Cystinuria. Ekskresi sistin dalam urine meningkat (bisa mencapai 30 x nilai

normalnya). Ekskresi Lysine, Arginine dan Gangguan reabsorpsi asam

amino dari

Maple Syrup Urine Disease

4. Hal yang dapat dilakukan bila terjadi keracunan logam berat yang akut adalah

dengan meminum susu untuk menetralisirnya.