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操作

B601 : Biofilm Formation Assay KitIssued on September 25, 2019

Technical Manual

バイオフィルム形成量・バイオフィルム形成阻害測定

Biofilm Formation Assay Kit

冷暗所にて保存してください。

－プレートリーダー (590 nm の吸光フィルター )－インキュベーター (37 oC)－ 20–200 µl のマルチチャンネルピペット－エタノール－生理食塩水

　バイオフィルムは、微生物とその代謝物である細胞外多糖から構成される集合体で、あらゆる環境に存在しています。医療器具内の細菌汚染やう蝕・歯周病の感染症はバイオフィルムが要因とされており、様々な分野でバイオフィルムの関与が指摘されています。バイオフィルム内の微生物は抗生物質等に対して強い耐性を獲得しているため、バイオフィルムによる汚染は深刻な問題となっています。そのため抗バイオフィルム活性を有する薬剤や食品成分の探索が注目を集めています。　Biofilm Formation Assay Kit はクリスタルバイオレット染色法によりバイオフィルム形成量および薬剤のバイオフィルム形成阻害を測定することができます。蓋に固定されたペグにバイオフィルムを形成させるため、洗浄・染色操作によりバイオフィルムが剥がれることがなく、多検体を簡便に測定することが可能です。

使用上のご注意 ・キットには滅菌済みの 96-well Plate が 10 枚添付されています。開封後は使用時まで滅菌状態を保ち、　各工程で新しい 96-well Plate をご使用ください。・バイオフィルム形成条件（培地・培養時間等）は微生物種により異なります（表 1参照）。バイオフィルム　形成条件を確立後、バイオフィルム形成阻害測定を行ってください。

96-peg Lid(1) 96-well Plate ①の各ウェルに菌懸濁液 ※180 μl　　を入れる。96-peg Lid を被せてインキュベーター　内で 37°C で培養する（ペグ上にバイオフィルム　が形成される）。※バイオフィルム形成阻害を測定する場合は、種々　の濃度の被検物質を含む菌懸濁液 180 μl を入れて　ください。

(2) 96-well Plate ②、96-well Plate ③の各ウェルに　滅菌生理食塩水 200 μl を、96-well Plate ④の各　ウェルに Crystal Violet Solution 200 μl を入れる。

(3) 96-well Plate ②、96-well Plate ③に手順 (1) の　96-peg Lid を順次浸して洗浄する※。続けて　96-well Plate ④に 96-peg Lid を被せて室温で　30 分静置する。※洗浄の際は、96-peg Lid を緩やかに生理食塩水　に浸し、激しい振とうは避けてください。

(4) 96-well Plate ⑤、96-well Plate ⑥の各ウェルに　滅菌生理食塩水 200 μl を、96-well Plate ⑦の　各ウェルにエタノール 200 μl を入れる。

(5) 96-well Plate ⑤、96-well Plate ⑥に手順 (3) の 　96-peg Lid を順次浸して洗浄する※。続けて 96-　well Plate ⑦に 96-peg Lid を被せて室温で 15 分　静置する。※洗浄の際は、96-peg Lid を緩やかに生理食塩水　に浸し、激しい振とうは避けてください。

(6) 96-peg Lid を取り外し、マイクロプレートリー　ダーで 590 nm の吸光度を測定する。

96-well Plate ① 菌 +被検物質溶液

96-well Plate ②

96-well Plate ③

96-well Plate ④

96-well Plate ⑤

96-well Plate ⑥

Crystal VioletSolution

滅菌生理食塩水

滅菌生理食塩水

エタノール

滅菌生理食塩水

滅菌生理食塩水

(1)

(2) , (3)

(4) , (5)

(6)

吸光度測定 (590 nm)

使用上のご注意使用上のご注意

96-well Plate ⑦

100 testsCrystal Violet Solution 22 ml×1

96-peg Lid ×196-well Plate ×10

株式会社同仁化学研究所熊本県上益城郡益城町田原 2025-5熊本テクノリサーチパーク　〒 861-2202Tel:096-286-1515 ( 代表 ) Fax:096-286-1525 E-mail: info@dojindo.co.jp URL: www.dojindo.co.jp

本製品は試験・研究用途です。臨床診断用途には使用できません。ご質問・ご要望は下記までお問い合わせください。

ドージン・イースト ( 東京 )東京都港区芝大門 2-1-17 朝川ビル 7F 〒 105-0012Tel: 03-3578-9651 ( 代表 ) Fax: 03-3578-9650フリーダイヤル :0120-489548 フリーファックス :0120-021557

B601 : Biofilm Formation Assay Kit

ε-Poly-L-lysine によるバイオフィルム形成阻害実験例：Staphylococcus aureus(1) 培養した菌懸濁液を Mueller-Hinton broth(MHB) 培地で約 107 CFU/ml となるように希釈し播種用菌液 　とし、96-well Plate ①の各ウェルに 180 μl ずつ播種した。

(2) MHB 培地で 10000 μg/ml ε-Poly-L-lysine ( 被検物質 ) を調製し、フィルター滅菌濾過した。10000 　μg/ml ε-Poly-L-lysine を約 107 CFU/ml 菌懸濁液にて 5 倍希釈し、2000 μg/ml ε-Poly-L-lysine 溶液を　　　調製した。2000 μg/ml ε-Poly-L-lysine 溶液 180 μl を手順 (1) の 96-well Plate ①の一番左端のウェルに　　入れた。ピペッティングにて混合し、順次倍々希釈して、ε-Poly-L-lysine の 2 倍希釈系列 ( 各ウェルに　180 μl) を調製した。96-peg Lid を被せ、37℃で 24 時間インキュベートした。

　（1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.6, 7.8, 3.9, 1.95, 0.98, 0 μg/ml）(3) 96-well Plate ② 上で菌を含まない MHB 培地を用いて手順 (1), (2) と同様の ε-Poly-L-lysine の希釈系列　( 各ウェルに 180 μl) を調製し、手順 (2) の 96-peg Lid を被せ、37℃でさらに 72 時間インキュベートした。

(4) 96-well Plate ③上で MHB 培地を用いて手順 (3) と同様に ε-Poly-L-lysine 希釈系列 (180 μl/ well) を調製　し、手順 (3) の 96-peg Lid を被せ、37℃でさらに 24 時間インキュベートした。

(5) 96-well Plate④、96-well Plate⑤の各ウェルに滅菌生理食塩水200 μlを入れた。96-well Plate⑥の各ウェ　ルに Crystal Violet Solution 200 μl を入れた。

(6) 手順 (4) の 96-peg Lid を 96-well Plate ④、96-well Plate ⑤に順次浸して、2 回洗浄した。続けて 96-　　well Plate ⑥に 96-peg Lid を被せ、室温で 30 分静置した。

(7) 96-well Plate⑦、96-well Plate⑧の各ウェルに滅菌生理食塩水200 μlを入れた。96-well Plate⑨の各ウェ　ルにエタノール 200 μl を入れた。

(8) 手順 (6) の 96-peg Lid を 96-well Plate ⑦、96-well Plate ⑧に順次浸して、2 回洗浄した。続けて 96-　　well Plate ⑨に 96-peg Lid を被せ、室温で 15 分静置した。

(9) 96-peg Lid を取り外し、マイクロプレートリーダーを用い 590 nm の吸光度を測定した。

参考文献 1) T. Tsukatani, et al., J. Microbiol. Biotech. Food Sci., 2016, 6, 677–680

表 1　実験例 2

Enriched BHI：hemin 5 μg /ml、 menadione 0.5 μg /ml を含む enriched BHI broth（3.7% brain heart infusion、0.5% yeast extract、0.05% cysteine)

本キットは福岡県工業技術センター生物食品研究所との共同開発品です。

図 2 バイオフィルム形成阻害

実験例

Concentration (μg/ml)

Abs

orba

nce

(590

nm)

10 　　　 100 　　　　 1000

菌種 菌希釈培地接種菌濃度

[CFU/ml]

培養時間

[h]被検物質希釈用培地 培養雰囲気

Pseudomonas aeruginosa Brain heart infusion broth 106 24 MHB 好気条件下

Escherichia coil Brain heart infusion broth 107 24+72+24 MHB 好気条件下

Streptococcus mutans TSB+2％ Sucrose 107 24+72 TSB+2％ Sucrose 嫌気条件下

Porphyromonas gingivalis Enriched BHI 107 24+72 Enriched BHI 嫌気条件下

1.0

2.0

3.0

被検物質：P. aeruginosa / Protamine sulfate 　　　　　S. mutans / 4-Isopropyl-3-methylphenol

0

P. aeruginosa S. mutans

図 1 S. aureus バイオフィルム形成阻害

ε-Poly-L-lysine Concentration (μg/ml)

Abs

orba

nce

(590

nm)

1 10 100 10000

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

ε-Poly-L-lysine の S. aureus バイオフィルムに対するMBIC（最小バイオフィルム形成阻害濃度）が約 250 μg/ml であることが確認できた。

Protamine sulfate の P. aeruginosa バイオフィルムに対するMBIC（最小バイオフィルム形成阻害濃度）が約 250 μg/ml、4-Isopropyl-3-methylphenol の S. mutans バイオフィルムに対する MBIC が約 400 μg/ml であることが確認できた。