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BIOCATÁLISIS EN MEDIOS NO

CONVENCIONALES

Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM


1.DISOLVENTES ORGÁNICOS2.FLUIDOS

SUPERCRÍTICOS3.LÍQUIDOS IÓNICOS

Enzimología en Disolventes Orgánicos ?

El uso de disolventes orgánicos en altas proporciones paraincrementar la solubilidad de reactantes fue examinado en 1975 en la reacción con colesterol oxidasa aislada para producircolestenona.

Pero la síntesis enzimática se creyó que era incompatible con la mayoría de las síntesisorgánicas realizadas en medios no acuosos(DOGMA ).

Buckland, B.C., Dunnill, P., Lilly, M.D. The enzymatic transformation of water-insoluble reactants in non aqueous solvents. Conversion of cholesterol to cholest-4-ene-3-one by a Nocardia sp., Biotechnol. Bioeng. 1975 17, 815-826


EL DOGMA: La catálisis enzimática solo en medios acuososLa estructura 3D activa de una

enzima depende de una granvariedad de factores:

Lipasa de Rhizomucor miehei:

Residuos hidrofóbicos

Residuos hidrofílicos

Exposición de residuosaminoacídicos :

Los resíduos hidrofílicos están(principalmente) expuestos al disolvente (acuoso).

Los resíduos hidrofóbicos están(principalmente) enterrados en el interior de la enzima.

Se establece un equilibrio entre unos y otros

Si las propiedades del medioenzimático se varían de agua a disolventes mas hidrofóbicos y menos polares este equilibriopodría fallar ⇒ desnaturalización.


Esta situación cambió despues de la publicación de los trabajosde A. M. KLIBANOVhacia la midad de los 80, cuando mostróque las ENZiMAS (al menos algunas de ellas) ERAN CAPACES DE TRABAJAR EN DISOLVENTES ORGÁNICOS


IMPORTANCIA DE LOS DISOLVENTES ORGANICOS :

Los Químicos Orgánicos comenzaron a usar enzimas

Los sustratos interesantes para trabajar con ellos son generalmente insolubles en agua


BIOTRANSFORMACIONES EN DISOLVENTES ORGANICOS : VENTAJAS

1.- Mejor recuperación de productos como consecuencia de la omisión de etapas de extracción durante la purificación.

Los agentes causantes de la formación de emulsiones se pueden suprimir y la recuperación de producto(s) se facilita por el uso de disolventes orgánicos de bajo punto de ebullición.


Un ejemplo industrial


2.- Incremento en la solubilidad de los sustratos orgánicos (no polares), aumentando la velocidad de reacción.

3.- Un medio orgánico es un medio hostil para la vida de las células, por tanto la contaminación microbiana es despreciable (decisivo a escala industrial, donde mantener la esterilidad podría ser un serio problema)

4.- La desactivación y/o la inhibición causada por los sustratos y/o los productos lipofílicos se reduce al mínimo puesto que su baja solubilidad en los disolventes orgánicos conduce a una concentración local reducida en la superficie de la enzima.

5.- Algunas reacciones secundarias (hidrólisis de grupos lábiles – e.g., epóxidos o anhídridos - polimerización de quinonas, racemisación de cianohidrinas) son dependientes de agua y por tanto suprimidas en medios orgánicos.


6.- La inmovilización de enzimas es a menudo innecesaria ya que pueden ser recuperadas por simple filtración. Si se quiere puede ser suficiente la adsorción sobre la superficie de un soporte barato, como Celita (tierra de diatomeas), sílice o bolas de vidrio (no desorción).

7.-Algunas de las reacciones responsables de la desnaturalización de enzimas son mediadas por agua:

Hidrólisis de enlaces peptídicos (especialmente en asparragina).

Hidrólisis de enlaces amida en cadenas laterales (asparragina y glutamina).

Eliminación y oxidación (principalmente residuos cisteína)

Por tanto, las enzimas deberían ser mas estables en un entorno con bajo contenido en agua


Oglno, H., Nakagawa, S., Shinya, K., Muto, T., Fujimura, N., Yasuda, M., and Ishlkawa, A.: Purification and characterization of organic solvent-stable lipase from organic solvent-tolerant Pseudomonas aeruginosa LST-03. J. Biosci. Bioeng., 89,451-457 (2000).


Ogino, H., Watanabe, F., Yamada, M., Nakagawa, S., Hirose, T., Nogachi, A., Yasuda, M., and Ishikawa, H. Purification and characterization of organic solvent-stable proteasefrom organic solvent-tolerant Pseudomonas aueruginosa PST-01. J. Biosci. Bioeng., 87, 61-68 (1999).


Asp

His

SerON NH H

O

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

Asp

His

SerO

C

R1

N N

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

OO

O

O H

H

R2O O-

Asp

His

SerO

C OR1

N NH

O

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

Asp

His

SerO

C

R1

N N

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

O H

H

HO O-

C O

R1

R2O INTERMEDIOTETRAÉDRICO #1

INTERMEDIOTETRAÉDRICO #2

ENZIMA ACILADA

C O

R1

R2OC O

R1

HO

R2OH

OH

H

H2O

8.- Último pero no menos importante: los equilibrios pueden ser invertidos

MECANISMO DE SERIN HIDROLASASEN AGUA


Asp

His

SerON NH H

O

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

Asp

His

SerO

C

R1

N N

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

OO

O

O H

H

HO O-

Asp

His

SerO

C OR1

N NH

O

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

Asp

His

SerO

C

R1

N N

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

O H

H

O O-

C O

R1

HO INTERMEDIOTETRAÉDRICO #1

INTERMEDIOTETRAÉDRICO #2

ENZIMA ACILADA

C O

R1

HOC O

R1

R2O

OH

R2

R2-OH

H2O

R2

EN DISOLVENTES ORGANICOS


OTROS SISTEMAS DIFERENTES

1.- AGUA-CO-SOLVENTE MISCIBLE : SISTEMAS MONOFÁSICOS

La enzima, el sustrato y/o el producto están disueltos en unadisolución monofásica de agua y un co-solvente.

Que disolventes?:

Alcoholes de cadena corta: MeOH, EtOH, PrOH, …

Disolventes polares: DMSO, DMF, acetona, dioxano, THF…

Usados para la transformación de sustratos lipofílicos, escasamentesolubles en agua, para acelerar la velocidad de reacción.

En algunos casos, las selectividades de esterasas y proteasas podríaser mejorada.


En general la mayor parte de los cosolventes pueden ser usados hastaaprox.. 10% (V/V) sin producir problemas en la enzima.

En algunos casos pueden usarse combinaciones enzima/disolvente de hasta 50-70%.

Si la proporción alcanza un cierto umbral, el agua esencial unida eseliminada conduciendo a la desnaturalización.

Solo raramente algunas enzimas (inusualmente estables) permanecencataliticamente activas en disolventes orgánicos miscibles en agua con bajo contenido en agua:

Subtilisina

Algunas lipasas: eg, CAL (lipasa de Candida antarctica)

Estos cosolventes han sido usados para disminuir la temperatura de congelación de sistemas acuosos para biotransformaciones realizadas a temperaturas por debajo de 0°C (“crioenzimología”).

1.- AGUA-CO-SOLVENTE MISCIBLE : SISTEMAS MONOFÁSICOS


2.-AGUA DISOLVEN. INMISCIBLE AGUA

SUSTRATO PRODUCTO

SUSTRATO PRODUCTO


Separación espacial del biocatalizador de la fase orgánica.

Concentración limitada de compuestos orgánicos (sustrato y producto) alrededor de la enzima:

no inhibición.

La eliminación del producto de la superficie de la enzima nos lleva a que se complete la reacción

La reacción enzimática solo se produce en la fase acuosa :

Una transferencia de masa suficiente de/los reactante/s a los/y producto/s del catalizador y entre las dos fases es necesaria.

Es crucial agitar o remover:

Suficiente para la transferencia de masa pero puede llevarnos a la desactivación por procesos químicos o mecánicos.

Comparación de velocidades: La partición no tiene porqué limitar a la kcat.


Algunos ejemplos industriales


3.- DISOLVENTES ORGÁNICOS PUROS

Dos posibilidades:

1) ENZIMAS SUSPENDIDAS (Catálisis heterogénea)

a.- Enzima en polvo (liofilizada)

c.- Enzima adsorbida sobre un soporte poroso

b.- Cristales de enzima


2) ENZIMAS SOLUBILIZADAS (Catálisis Homogénea)

d.- Enzimas modificadas covalentemente e.- Enzimas solubilizadas por surfactantes.

f.-Enzimas solubilizadas por polímeros. g.-Enzimas solubilizadas por microemulsiones


Reemplazando todo el agua (alrededor del 98%) por agua inmiscible en disolventes orgánicos nos lleva a una suspensión de la enzima sólida en una disolución orgánica monofásica.El biocatalizador parece estar “seco” a un nivel macroscópico, pero allípermanece unido a una cantidad de agua residual.La superficie total de las enzimas sólidas está en el rango de 1 a 3 x 106

m2/kg, similar a sílice o carbón activo.Casi uno o dos tercios del volumen total está hueco, con numerosas cavidades ocupadas por el disolvente, y canales que lo atraviesan dando lugar a un agregado macroscópico como una esponja.Si se provee suficiente agitación, el sustrato no solo es transformado por los centros activos expuestos a la superficie, también por los que están ocultos.


3.-DISOLVENTES ORGÁNICOS PUROS

CONSECUENCIA:LAS PROTEINAS EN DISOLVENTES

HIDROFÓBICOS RETIENEN SU ESTRUCTURA NATIVA

DOGMA!


Este hecho es causado por un atrapamiento cinético de la conformación activa por:

3.-DISOLVENTES ORGANICOS PUROS

1.- Fuertes puentes de hidrógeno entre los átomos de proteína.2.- Estructura más rígida.

En disolventes hidrofóbicosimmiscibles en agua, cualquier agua que estuviera presente, permanecerá en la superficie de la proteína debido a la naturaleza hidrofílica y solvofóbica de dicha superficie.


231 moléculas de agua en el cristal


Pregunta crucial: Qué cantidad de agua es requerida para retener la actividad catalítica de las enzimas en esta clase de disolventes?Respuesta: Se ha comprobado y aceptado que se requiere un valor aproximado de 0.2 g H2O / g proteina.

R.M. Daniel, R.V. Dunn, J.L. Finney, and J.C. Smith. The role of dynamics in enzyme activity. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2003, 32:69–92.

Depende mucho del tipo de enzima:α-quimotripsina necesita solo 50 moléculas de agua por molecula de proteína para permanecer cataliticamente activa (mucho menos que una monocapa).Subtilisina y lipasas son mas o menos similares.Polifenol oxidasa requiere 3.5 x 107 moléculas de agua.

Como podemos determinar la cantidad de agua necesaria?


Primera aproximación: controlar la cantidad de agua

HN

O

O

OCl

n-PrOH, THF

subtilisinHN

O

O

O

Affleck et al. Enzymatic catalysis and dynamics in low-water environtments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 1100-1104

Debe ser medida,y es variable dependiendo de la naturaleza del disolvente

A medida que es mas hidrofílico, mayor la cantidad de agua retenida por el disolvente.


Aproximación óptima: controlar la ACTIVIDAD DE AGUA

Que es la actividad de agua?

A + B C + D

Keq = [A] x [B]

[C] x [D]FALSO !

Keq = aA x aB

aC x aDai = γiXi

γi = coeficiente de actividadXi = fracción molar


Analogía entre a w y temperatura

La misma temperatura, perodiferente cantidad de calor ⇒diferentes capacidades caloríficas

El calor se distribuye de

forma diferente,

pero la temperatura es la misma.


Agua en la fase vapor

Agua en el disolvente

Agua en el microentorno de la enzima


The solubility of water: higher in solvent than in

FIXED WATER AMOUNT

FIXED WATER ACTIVITYWATER IN THE ENZYME

WATER IN THE VAPOUR

WATER IN THE SOLVENT


La concentración de agua alrededor de la enzima, en el disolvente y en la fase gas será diferente.

Pero la actividad de agua debería ser la misma en los tres componentes, una vez que se ha alcanzado el equilibrio.

Así, los efectos de equilibrio, como la hidratación de la enzima y el balance entre la hidrólisis y síntesis (en hidrolasas) dependerán de aw.

Simplificando, aw puede ser considerado como una medida de la preferencia del agua para estar en un entorno mejor que en otro.

Las moléculas de agua en un medio a altos valores de awse mueven a otro de menor aw. El movimiento resultante reduce las diferencias entre los valores de aw del medio, hasta que son iguales en el equilibrio.


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