Bio-Analyse · 2010-10-04 · La Polymerase Chain Reaction (PCR) Animation tirée du site du...
Transcript of Bio-Analyse · 2010-10-04 · La Polymerase Chain Reaction (PCR) Animation tirée du site du...
Bio-Analyse
A. GarnierGCH-7007A-2010
Mise en contexte
Problème réel: Quantifier la production en adénovirus recombinant, produit par culture de HEK-293S
– Dynamique de la production– Méthodes standards longues, fastidieuses et peu précises.– Méthode indirecte, 1ère génération: suivre la protéine
d’intérêt (ici la PTP1C)– Méthode de 2ème génération: suivre l’expression d’un gène
rapporteur (ici la « green fluorescent protein », GFP) suite à une infection secondaire, puis mesure au (fluorescence assisted cell sorter » (FACS: directe ou indirecte?
Titration virale: Méthode de plage de lyse
FACS
Fluorescence
Généralisation
L’utilisation de gènes rapporteurs (reporter genes) est très fréquente:– GFP, lac Z (le gène de la β-galactosidase, gène
de la luciférase) Distinction importante entre méthode directe
et indirecte– Appliquer au cas de la mesure de la
concentration en micro-organismes
Méthodes directes pour la biomasse
Masse sèche (filtration) Dénombrement:
– Hemacymètre– Coulter– FACS
Avantages et inconvénients Autres méthodes directes: utilisation de
colorants, CFU, dilutions limites…
Quelle est la précision des méthodes basées sur le dénombrement
Rappel de la loi de Poisson:– x: nb d’évènements quelconques observés dans un
espace dimensionnel quelconque– n: espérance de x – espace dimensionnel peut être le temps, une longueur,
une surface, un volume, etc
Alors:
!)exp(),Pr(
xnnnx
x⋅−=
Exemple classique: le standard téléphonique
Un standard reçoit en moyenne 60 appels/h. quelle est la probabilité qu’il reçoive 0, 1, 2, 3, etc appels durant la prochaine minute?
n = 1 appel/minute x = 0, 1, 2, 3, etc P(0,1) = exp(-1)*10 / 0! = 0,368 P(1,1) = exp(-1)*11 / 1! = 0,368 P(2,1) = exp(-1)*12 / 2! = 0,184 P(3,1) = exp(-1)*13 / 3! = 0,06 …..
Pr(x,1) vs x, pour n=1
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 1 2 3 4
x (appels/min)
P(x
,1)
Pr(x,100) vs x
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,04
0,045
80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100
102
104
106
108
110
112
114
116
118
120
x (-)
P(x
,100
) +/- 10%
Écart-type de la loi de Poisson
É.-t. (σ)= n1/2
Estimation de l’é.-t. (s) = x1/2
Estimation de l’é.-t. relatif: s/x = x-1/2
Indication pour le dénombrement:– Limite inférieure: 100-200 évènements– Limite supérieure: « comptabilité »!
Autre application de la loi de Poisson: dilutions limites
Ex: concentration d’un échantillon en micro-organismes =107 cellules/mL
7 éprouvettes contenant chacune 9 mL de milieu de culture stérile, inoculées, laissées à incuber
1 mL d’échantillon
1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10
?
1/10
9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml
Milieux initialement stériles
On peut calculer la probabilité que P(x>0,n)
!)exp(),Pr(
xnnnx
x⋅−= )exp(1),0Pr(1),0Pr( nnxnx −−==−=>
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
n (-)
Pr(
x>0,
n)
Dilutions limites répétées (ex préc.)
1 mL d’échantillon
1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10
1 mL d’échantillon
1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10
1/101/10 1/10 1/10 1/101 mL d’échantillon
1/10 1/10 1/10
1/101/10 1/10 1/10 1/101 mL d’échantillon
1/10 1/10 1/10
1/101/10 1/10 1/10 1/101 mL d’échantillon
1/10 1/10 1/10
P(x>0,n)=3/5
n≈1
X = 107 !!!
Méthodes indirectes de détermination de la concentration en micro-organismes
Densité optique:– Turbidité: 545 nm– L’absorption lumineuse
peut également servir à déterminer la concentration en:
– Protéines: 214nm (lien peptidique), 280nm (aromatiques: Tyr, Trp, Phe)
– ADN: 260 nm
Fluorescence…
Autres mesures du déroulement d’un procédé de bioproduction
Nutriments: sucres, ac. aminés, vitamines, O2 Constituants cellulaires: ADN, protéines, ARN
(gene chip) Sous-produits métaboliques: acides
organiques, alcools, ammoniaque, CO2 Produit d’intérêt Autres: pH, T, vitesse d’agitation, viscosité,
mousse, marqueurs cellulaires, etc
Composition cellulaire
Variation de la composition cellulaire
Méthodes
Sondes: pH, OD, pCO2, T Tests enzymatiques, exemples:
– Glucose par hexokinase(hk) (mesure de la fluorescence du NADH exc. 320-370, ém 420-460) :
Glucose + ATP hk G6P + ADPG6P + NAD glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH) 6-PG +NADH
– G6PDH par G6PG6P + NADP G6PDH 6-PG + NADPH
Méthodes (suite)
Immuno-affinité: Anticorps-antigène
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
La Polymerase Chain Reaction (PCR)
Animation tirée du site du Réseau Lyonnais d'Ingénierie Éducative (RELIE), École Normale Supérieure de Lyon (cliquez sur le lien).
PCR en temps réel (real time)
Expression génétique
Biopuces
(cliquez sur une des images pour l’animation)
Séparation + détection
Électrophorèse (SDS-PAGE)
Western: EP + anticorps spécifiques à protéines
Southern: EP + ADN marqué
Northern: EP + ARN marqué
Tiré de Segura, Garnier et al (2007).Figure 2. Fractionation of purifiedretroviral vector preparations by 1DGel ElectrophoresisPurified virus preparations with (a) andwithout (b) subtilisin treatment werefractionated on a 4-12% Tris-Glycinepolyacrylamide gel (Invitrogen) rununder reducing conditions and visualizedby silver staining. Protein bands from gelb were excised and subjected to in-geltryptic digestion prior to MS/MSanalysis. Bands containing statisticallysignificant peptide identifications (A-L)are indicated on gel b. Figure 2c showsthe protein profiles of samples a (green)and b (blue) superimposed. Thetheoretical migration positions of allMoMLV viral-encoded proteins areindicated in figure c.
Électrophorèse SDS-PAGE
Gel d’électrophorèse 2-D
(Échantillon de sérum sanguin, Gygi et al., 2000)
2-DE des protéines soluble de levures
Séparation + détection = chromatographieEx: High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
Réservoir dePhase mobile Pompe
Échantillon
Colonne
Échantilloneur
Détecteur
Collecteur de fraction
•Échange d’ions•Tamis moléculaire•Interaction hydrophobe•Phase inverse•Électrophorèse
•En fonctionde la colonne•Gradient
•UV/visible•Fluorescence•Infra-rouge•Indice de réfraction•Conductivité•Spectrométrie de masse
•Automatique•Réfrigéré
Exemple de HPLC (Agilent 1100)
Hydrolysat trypsique de la BSA
Chromatographie
Chromatographie (suite)
Chromatographie (suite)
Temps de rétention: identification; surface sous le pic: quantification tM: temps d’élution de la phase mobile tR: temps de rétention tR’: temps de rétention réduit = tR-tM k: facteur de fixation = tR’/tM σ: écart-type d’un pic gaussien δ: largeur du pic à mi-hauteur = 2,354 σ ω: largeur du pic à la base = 4 σ σ/tR: écart-type relatif N: efficacité de la colonne = (tR/σ)2 = 5,545 (tR/δ)2 = 16 (tR/ω)2
N: nb de plateau théorique H: hauteur de plateau théorique = L/N, où L: longueur de la colonne
Exemple: 2 colonnes de 25 cm, 1 et 2– tR1 = 416,4 - tR2 = 481,2� δ1= 10,2s - δ2= 13,2sCalculez N1, N2, h1, h2 identifiez la colonne la plus efficace
Chromatographie (suite)
Pour 2 pics:– α: facteur de sélectivité = tRB’/tRA’ = kB/kA, où B est le pic le plus à droite– Pour phase stationnaire, phase mobile et T données, α=constante– Résolution (RS)= ∆t/ω
Exemple, 3 pics A, B et C:tM =83,4s tR(A)= 195stR(B)= 415,4 tR(C)= 481,2Calculez αB/A et αC/B
Chromatographie (suite)
+
−
=B
BS k
kNR1
14 α
α
222 1
116
+
−=
B
BS k
kRNα
α
mobile phase la de vitesseuoù
11
16)(3
2
22
=
+
−=
B
BSR k
ku
HRBtα
α
Calcul de Résolution (RS):
Spectroscopie de masse – arc magnétique
Spectrométrie de Masse -Quadrupole
m/z 10-4000 Précision :~m/z 0.1-0.2 Vitesse de balayage: 5000 m/z
par sec Le temps de vie d’un ion de sa
formation a sa détection ~40-100 μs.
www.bris.ac.uk
Spectrométrie de Masse - Temps d’Envol (TOF)
L’incorporation d’un réflectron dans le tube du TOF ou une extraction ionique délayée (Cornish et Cotter, 1994;
Cotter et al., 2004)
TOF est communément employé avec MALDI, il peut aussi être utilisé avec un ESI (Boyle et Whitehouse, 1992)
www.chemistry.adelaide.edu.au
Spectroscopie de masse 3 (GCMS)
Spectroscopie de masse 1
Spectroscopie de masse 4 (LCMS)
Tout est dans l'interface LC-MS
L'electro-atomisation (electro-spray ionisation, ESI)
Spectrométrie de Masse – analyse de protéines par MSMS
(Yates, 1998; Westermeier et Naven, 2002; Graves, 2002)
MS spectrum
MS/MS ion spectrum
m/z
m/z
Dissociation nomenclature fragment proposée par Roepstorff, 1984
Exemple d'analyse MSMS
Albumine
Protéine majeure du sérum sanguin (20-30 g/L), souvent utilisé en milieu de culture de cellules de mammifères
Exemple d'analyse MSMS
Albumine
Informations obtenues sur Expasy
>P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin - Bos taurus (Bovine). MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPF DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYY ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVA RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRR HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLP DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVV STQTALA
Number of amino acids: 594 Molecular weight: 68026.9 Theoretical pI: 5.77
position mass peptide sequence position mass peptide sequence
25-28 500,2463 DTHK 300-309 1177,5591 ECCDKPLLEK
29-34 712,3736 SEIAHR 310-318 1015,4877 SHCIAEVEK
37-44 974,4577 DLGEEHFK 319-336 1955,9596 DAIPENLPPLTADFAEDK
45-65 2435,2427 GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK 341-346 752,3573 NYQEAK
66-75 1163,6306 LVNELTEFAK 347-359 1567,7427 DAFLGSFLYEYSR
76-88 1349,546 TCVADESHAGCEK 361-371 1283,7106 HPEYAVSVLLR
89-100 1362,6722 SLHTLFGDELCK 375-386 1388,5708 EYEATLEECCAK
101-105 545,3405 VASLR 387-399 1497,6314 DDPHACYSTVFDK
106-117 1364,4803 ETYGDMADCCEK 402-412 1305,7161 HLVDEPQNLIK
118-122 658,3155 QEPER 413-420 1011,42 QNCDQFEK
123-130 977,4509 NECFLSHK 421-433 1479,7954 LGEYGFQNALIVR
131-138 886,4152 DDSPDLPK 438-451 1511,8427 VPQVSTPTLVEVSR
139-151 1519,7461 LKPDPNTLCDEFK 460-468 1052,4499 CCTKPESER
157-160 537,282 FWGK 469-482 1667,8131 MPCTEDYLSLILNR
161-167 927,4934 YLYEIAR 483-489 841,46 LCVLHEK
169-183 1888,9268 HPYFYAPELLYYANK 490-495 660,3563 TPVSEK
184-197 1633,6621 YNGVFQECCQAEDK 499-507 1024,455 CCTESLVNR
198-204 701,4014 GACLLPK 508-523 1823,8996 RPCFSALTPDETYVPK
205-209 649,3338 IETMR 524-528 609,2878 AFDEK
212-218 703,4097 VLASSAR 529-544 1850,8993 LFTFHADICTLPDTEK
223-228 649,3338 CASIQK 549-557 1014,6193 QTALVELLK
229-232 508,2514 FGER 558-561 509,3194 HKPK
236-241 689,3729 AWSVAR 562-568 818,4254 ATEEQLK
249-256 922,488 AEFVEVTK 569-580 1399,6926 TVMENFVAFVDK
257-263 789,4716 LVTDLTK 581-587 725,2593 CCAADDK
267-280 1578,5981 ECCHGDLLECADDR 588-597 1050,4924 EACFAVEGPK
281-285 517,298 ADLAK 598-607 1002,583 LVVSTQTALA
286-297 1386,6206 YICDNQDTISSK
Albumine: fragments trypsiques
Analyse LC et MS1 de l'albumine trypsique
ANALYSE MS2, cliquez ici
Identification de protéine, cliquez ici(Logiciel Mascot, Matrix Science)
Protéomique du sérum sanguin
Tirumalai et al., 2003
•60 à 80 g/L de protéine (Tirumalai et al., 2003)•10 000 protéines différentes •22 protéines = 99% de la quantité protéinique du sérum (Zhang et al., 2005)•12 log de variation de concentration (Anderson et Anderson, 2002; Zhang et al., 2005)
Protéomique du sérum sanguin
Anderson et Anderson, 2002
Microscopie de cellules vivantes
Imagerie hyper-spectrale
High content analysis/screening (HCS)
http://en.wikipedia.org/wiki/High-content_screening
http://www.cellomics.com/ http://www.highcontentanalysis.com/ Invitrogen http://www.biacore.com/high-content-
analysis/index.html