BAUSTEINE DES LEBENS - Repetition Klinische Chemie · • Sie können das Prinzip folgende Methoden...

Klinische Chemie Theorie "Proteine"

medi, Bildungsgang medizinisches Labor 1 P. Hirschi

BAUSTEINE DES LEBENS

Lernziele Phase 1 b: Wissen aus Biochemie wird vorausgesetzt.

• Sie kennen die wichtigsten Funktionen der Proteine im menschlichen Körper und jeweils ein Beispiel dazu.

• Sie kennen die Proteine Albumin und CRP im Detail, sowie die diagnostische Bedeutung von Procalcitonin, Granulozytenelastase, Neopterin, Hämopexin und Haptoglobin.

• Sie können die Akute-Phase-Reaktion beschreiben. • Sie kennen die Markerproteine für Herz-Kreislauferkrankungen (hsCRP,

Homocystein, BNP/ANP) • Sie können das Prinzip folgende Methoden zur Bestimmung von Proteinen

beschreiben: Biuret-Gesamtproteinbestimmung, Nephelometrie, Turbidimetrie, Serumproteinelektrophorese (Verknüpfung zur Labortechnik).



Inhaltsverzeichnis:

A. Grundlagen (in Biochemie behandelt) 1. Einleitung…………………………………………………..…………………..……. 3 2. Aufbau und Struktur der Proteine……………………………..…………..……. 4 3. Stoffwechsel der Aminosäuren…………………………….……..……………... 6 4. Denaturierung von Proteine …………………………………………..….….…... 6

B. Aufgaben der Proteine und wichtige Vertreter

5. Aufgaben der Proteine………………………………………………..…………... 8 6. Proteine in der Diagnostik……………………………………………..……….… 9 7. Wichtige Proteine, Proteingruppen……………………………………..…….… 9 7.1. Albumin………………………………………………………………………........….. 9 7.2. Akute-Phase-/ Anti-Akute-Phase-Proteine…………………………………......... 10 7.3. Weitere im Kranheitsgeschehen wichtige Proteine……………………….......... 14 7.4. Markerproteine bei Herz-Kreislauferkrankungen……………………….……...... 16

C. Analytik 8. Analytik der Plasmaproteine………………………………………………........ 20 8.1. Bestimmungsindkationen……………………………………………………….…. 20 8.2. Biuret-Methode zur Gesamtproteinbestimmung……………………….............. 21 8.3. Immunologische Protein-Nachweisverfahren………………………………....… 21 9. Trennverfahren der Serumproteine……………………………………......….. 24 9.1. Serumelektrophorese…………………………………………………………........ 24 9.2. Immunfixationselektrophorese…………………………………………………….. 30 9.3. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese……...…………………………………… 30 9.4. Isoelektrische Fokussierung……………………………………………………..... 31 9.5. Kapillarelektrophorese…………………………………………………………..…. 32 10. Dysproteinämien………………………………………………………………..…. 33



A. GRUNDLAGEN PROTEINE Siehe Biochemie

1. EINLEITUNG

Der wissenschaftliche Name der Eiweisse - „PROTEINE“ - beschreibt ihre Bedeutung besser als die deutsche Bezeichnung. Es ist vom Griechischen „proteios“, d.h. „erstrangig“, abgeleitet und unterstreicht damit die Bedeutung dieser Stoffgruppe. Proteine setzten sich aus Bausteinen, den so genannten Aminosäuren (AS) zusammen. Im menschlichen Blutplasma zirkuliert ein heterogenes Gemisch aus Proteinen. Das mengenmässig wichtigste Eiweiss im Plasma ist das Albumin. 20% der Proteine müssen durch die Nahrung aufgenommen werden, 80% werden vom Körper aus Aminosäuren selbst synthetisiert. 20 verschiedene Aminosäuren braucht der Körper als Bausteine für seine Peptide, bzw. Proteine. Acht davon sind essentiell, d.h. sie müssen mit der Nahrung aufgenommen werden: Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin, Threonin, Lysin, bei Säuglingen zusätzlich noch: Arginin und Histidin. Ohne Proteine ist kein Leben möglich. Sie machen den grössten Teil der Körpersubstanz aus. Vor allem sind sie durch die Vielseitigkeit ihrer Aufgaben gekennzeichnet: Wir unterscheiden zwischen einfachen und zusammengesetzten Proteinen, den so genannten Proteiden. Einfache Proteine bestehen nur aus Aminosäuren, am Aufbau von Proteiden sind dagegen noch andere Stoffe beteiligt, z.B. Fette, Kohlenhydrate (KH), Chromogene. usw. . Beispiele: Glycoproteide: AS + KH; Lipoproteide: AS + Fett; Nukleoproteide: AS + Nukleinsäuren; Chromoproteide: AS + Farbstoffe (z.B. Hämoglobin)



2. AUFBAU UND STRUKTUR DER PROTEINE AMINOSÄUREN (AS) Die allgemeine Strukturformel einer Aminosäure:

Abb.1. Grundformeln von Amino-Gruppe, Carboxy-Gruppe und Aminosäure. Die Gruppen sind in der nichtionisierten Form dargestellt.

Die Aminogruppe hat basische, die Carboxylgruppe saure Eigenschaften.

Abb2: Die 20 in Proteinen vorkommenden AS unterscheiden sich nur im Rest (R):



Aminosäuren als Zwitterionen:

Aminosäuren liegen in wässriger Lösung als Ionen vor und können je nach Milieu sowohl als Säure wie auch als Base wirken, man spricht daher von einem ampholyten Charakter der AS und natürlich auch der daraus aufgebauten Proteine.

Abb. 3: AS sind Zwitterionen

Am isoelektrischen Punkt sind Aminosäuren nach aussen elektrisch neutral, d.h. sie besitzen gleich viele positive wie negative Ladungen und sind somit ungeladen.

PEPTIDE

Zwei miteinander verknüpfte Aminosäuren bilden unter Wasserabspaltung (Kondensation) ein Dipeptid, drei ein Tripeptid; bei bis zu 10 Einheiten spricht man von einem Oligopeptid. Die Verknüpfung von mehr als 10 AS ergibt ein Polypeptid.

Abb. 4:Die Peptidbindung: Zwei Aminosäuren werden durch die Peptidbindung zu einen Dipeptid.

PROTEINE

Werden bei der Proteinbiosynthese mehr als 100 AS durch Peptidbindung verknüpft, so entsteht ein Protein oder Eiweiss.

Struktur der Proteine:

Primärstruktur: Abfolge der AS im Peptid/Protein, z.B. Val – Ser – Gly – Ser – Cys



Sekundärstruktur: Räumliche Anordnung der AS-Kette aus helikalen und faltblattartigen Sequenzen.

Tertiärstruktur: Gesamtfaltung der Peptidkette/des Proteins

Quartärstruktur: Mehrere Peptidketten sind am Aufbau des Proteins beteiligt, diese Untereinheiten nennt man SUBUNITS.

Abb. 5: Von oben – Primär-, Sekundär- (β-Faltblatt, Helix), Tertiär- und Quartärstruktur

3. STOFFWECHSEL DER AMINOSÄUREN

Die Hauptquelle der für die endogene Proteinsynthese benötigten AS sind die Nahrungsproteine. Die Aminosäuren werden von der Darmwand resorbiert und gelangen via Blutbahn zu den Körperzellen, vorwiegend aber zu den Leberzellen, dort werden aus ihnen neue Proteine synthetisiert (Ausnahme AK, Proteohormone).

Im Organismus werden auch ständig Proteine abgebaut, solche, die der Organismus nicht mehr braucht. Der Körper kann AS nicht speichern, einige werden je nach Bedarf in andere AS umgewandelt (Transaminierung, in Leber und Niere).

Aus den freiwerdenden AS beim Proteinabbau muss der entstandene Stickstoff entfernt werden. Dies geschieht in der Leber durch die oxidative Desaminierung, wobei Ammoniak (NH3) entsteht, ein starkes Zellgift. Ammoniak wird in der Leber sofort in den ungiftigen Harnstoff (siehe Harnstoffcyclus) überführt und über die Blutbahn abtransportiert. Harnstoff ist ein ungeladenes, kleines Molekül, dieses kann die Membran der Glomeruli passieren und, da es wasserlöslich ist, mit dem Urin ausgeschieden werden.

Abb. 6: Die Glutamatdehydrogenase (GlDH) katalysiert die oxidative Desaminierung, wobei von Glutamat Ammoniak abgespalten wird.



Proteine mit einer Molekularmasse < 40000 Dalton können die Basalmembran frei passieren. Solche mit einer Molekularmasse < 67000 Dalton werden in den Glomeruli der Nieren ladungsabhängig filtriert und im Tubulus wieder rückresorbiert. Kommt es bei Nierenkrankheiten zu einer Schädigung der Glomeruli-Membran, werden auch grössere Proteine ausgeschieden, eine Untersuchung der Urin-Proteinzusammensetzung kann uns daher wertvolle diagnostische Aussagen ermöglichen.

4. DENATURIERUNG VON PROTEINEN

Beim Kochen von Eiern, beim Sauerwerden von Milch und bei vielen anderen Vorgängen gerinnen Proteine. Dieser Vorgang wird auch als Denaturierung bezeichnet, da hier die natürliche – native – räumliche Struktur der Proteine verändert wird. Bekanntestes Beispiel dafür ist das Eiweiss im Hühnerei, das beim Kochen fest wird, weil sich der räumliche Aufbau der Proteinmoleküle geändert hat. Der ursprüngliche flüssige Zustand kann nicht mehr hergestellt werden. Menschen denaturieren Speisen, um sie leichter verdaulich zu machen.

Durch die Denaturierung ändern sich die physikalischen und physiologischen Eigenschaften der Proteine.

Denaturierung bedeutet ein Entfalten der dreidimensionalen Struktur, die hydrophoben Bindungen werden gelöst, die Peptidkette liegt fast gestreckt vor. Hierbei geht die biologische Aktivität, z. B. die Enzymaktivität, verloren. Hohes Fieber kann daher lebensgefährlich werden: Durch eine zu hohe Temperatur werden körpereigene Proteine denaturiert und können somit ihre Aufgaben im Organismus nicht mehr erfüllen. Einige Proteine der roten Blutkörperchen denaturieren beispielsweise bereits bei 42 °C. Dabei ist das Fieber wichtig da Fremdkörper, so genannte Antigene, schon bei geringeren Temperaturen denaturieren. Abb. 7: Denaturiertes Enzym

Denaturierung erfolgt durch:

- Erwärmung über 40 Grad - Veränderung des pH-Wertes, z.B durch Säuren, Laugen - Ultraschall - Strahlung - starkes Schütteln des proteinhaltigen Materials - organische Lösungsmittel (z.B. Alkohol).

http://de.wikipedia.org/wiki/Fieber

http://de.wikipedia.org/wiki/Rote_Blutk%C3%B6rperchen

http://de.wikipedia.org/wiki/Antigen



Bei sehr schwacher pH-Verschiebung ist die Denaturierung reversibel (umkehrbar), durch Einstellung des korrekten pH-Wertes. Die Denaturierung durch Erwärmung

ies durch organische

(mässig) kann durch Abkühlen und Einstellung eines günstigen pH-Werts in einigen Fällen wieder rückgängig gemacht werden. Die reversible Denaturierung ist nur möglich, wenn keine Zerstörung der Primärstruktur vorliegt.

Irreversibel werden Proteine denaturiert, wenn dLösungsmittel ausgelöst wurde.

B. AUFGABEN PROTEINE UND WICHTIGE VERTRETER

5. AUFGABEN DER PROTEINE

Pro gängen im Körper beteiligt, zum

teine sind an sämtlichen StoffwechselvorTeil auch mehrfach. Unten sind die wichtigsten Aufgaben erwähnt, es gibt aber noch viele mehr.

Blutgerinnung: Die meisten Gerinnungsfaktoren und deren Inhibitoren sind Proteine, z. B. Antithrombin, Fibrinogen, Plasminogen.

z. B. Alanin-Amino-

eine, z. B.

der Verlust

n oder Säuren, z. B. Hämoglobin.

nd löslich.

02 Speicher im Muskel)

Enzyme: Enzyme sind Biokatalysatoren. Alle Enzyme und viele Enzyminhibitoren sind Proteine (meist Proteide), Transferase ALAT, Aspartin-Amino-Transferase ASAT, Gamma-Gutamyltranspeptidase GGT, Lactat-Dehydrogenase LDH,… . Immunabwehr: Zum Immunsystem gehören das Komplementsystem und die Immunglobuline (Ig) – dies sind auch wieder ProtKomplementfaktoren C3, C4; Immunglobuline IgG, IgM, IgE, IgA. Kolloidosmotischer Druck: Albumin hält aufgrund seiner hohen Konzentration den kolloidosmotischen Druck aufrecht. Mangel oführt zu Ödemen (Bauchwasser). pH-Pufferung: Aufgrund ihrer Zwitterioneneigenschaft (+/- Ladung je nach Milieu) wirken sie im Blut als Base

Proteaseinhibitoren: Neutralisieren Proteasen (diese bauen Proteine ab, freigesetzt aus Körperzellen oder Bakterien) z. B. α1-Antitrypsin.

Signalvermittlung: Viele Hormone sind Peptide oder Proteine, z. B. Insulin. Transport: Viele Substanzen sind im Blutplasma ungenügeProteine dienen daher als Vehikel für den Transport von Metallen, Hormonen,Lipiden, Vitaminen, usw., z. B. Albumin, Caeruloplasmin, Haptoglobin. Entzündungsreaktion: Akute-Phase Proteine wie CRP und Infektmarker wie Interleukin 6 sind an der Entzündung beteiligt.

Ausgangsstoffe für Hormone (Insulin) und Neurotransmitter (Serotonin) Sauerstofftransport: Hämoglobin, Myoglobin (



6. PROTEINE IN DER DIAGNOSTIK

In der Diagnostik von Krankheiten bestimmt man Proteine als Marker verschiedener

linisch-chemischen-Labor:

Geschehen im Körper. In Reagenzien werden Enzyme (auch wieder Proteine) verwendet zur Umsetzung von Substraten, zwecks Bestimmung der Konzentration eines Analyten im Probenmaterial. Wichtige Proteingruppen im kProteingruppe Funktion Einzelne Proteine Akute-Phasen-Proteine

(APP)

geschehen,

bei

CRP, A,

ren C3, C4

Beteiligt amEntzündungsAnstieg um mehr als 25%Entzündungen

C-Reaktives-ProteinSerumamyloid-A-Protein SAFibrinogen, α1-Antitrypsin, saures α1-Glykoprotein, Haptoglobin, Fibrinogen, Caeruloplasmin, Komplementfakto

Infektmarker (nicht Anstieg bei Infektionen, den

r α (TNFα)

w.

APP) erfüllen aber die Kriterieneines APP nicht ganz, werz.B. von anderen Geschehen im Körper beeinflusst

Interleukin-6 (IL6), TumornekrosefaktoNeopterin, Granulozyten-Elastase, Procalcitonin, us

Anti-Akute-Phase- in der Albumin, Transferrin, usw. Proteine

Konzentrationabnahmeakuten Entzündungsphase

Risikomarker-Proteine ng von Herz-

Troponin, Creatinkinase

tid), usw.

bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen

Diagnostik und VerlaufsbeurteiluKreislauferkrankungen.

herzspezifisch = CK-MB, hsCRP, Homocystein, Mikroalbumin, BNP (Natriuretisches Pep

Tumormarker Diagnostik, rteilung bei hes Antigen), Verlaufsbeu

Tumorerkrankungen

Calcitonin, PSA (prostataspezifiscAlpha-Fetoprotein, usw.

7. WICHTIGE PROTEINE / PROTEINGRUPPEN

7.1. ALBUMIN

Albumin ist mengenmässig das wichtigste Plasmaprotein und

Abb. 8: Aszites (Bauchwassersucht) aufgrund Albuminmangel beim Alkoholiker mit

macht beim Gesunden ca. zwei Drittel der Gesamtproteinkonzentration aus. Es spielt eine zentrale Rolle für die Wasserbindung im Blutplasma → kolloidosmotischer Druck. Aufgrund seiner Bindungskapazität. für Wasser von ca. 18 ml/g, hält es das Blutvolumen konstant. Ein Albumin-Mangel oder -Verlust führt zu Ödemen, da Wasser aus dem Gefässystem ins Gewebe einströmt.

Leberzirrhose



Hydrophobe Stoffe wie Fettsäuren, Bilirubin, Spurenelemente, bestimmte Vitamine, Hormone, Kationen (Mg2+, Ca2+) und Pharmaka, könnten ohne Bindung an Albumin im

mungsmethode

Blut nicht transportiert werden. Die Synthese von Albumin erfolgt in der Leber. Der Abbau erfolgt über die Niere, dem Gastrointestinaltrakt und in den Gewebezellen der Leber.

Bestim : Absorptions-Fotometrie, Turbidimetrie

Mikroalbumin

Dieser etwas irreführende Begriff bezeichnet nicht etwa besonders kleine Albuminmoleküle sondern er beschreibt eine anhaltende, leicht erhöhte renale

umin: < 20 mg/Tag.

Albuminausscheidung. Im Urin werden dann Albuminkonzentrationen von 20 – 200 mg/l gefunden.

Referenzwert für Alb

n Teststreifen eingesetzt, der u. a. auch die Gesamtproteinkonzentration im Urin erfasst, der Teststreifen reagiert besonders

ten für Nephropathien ist dieser Test aber zu unempfindlich, denn bereits eine leicht erhöhte Albuminausscheidung, die vom

In der Urindiagnostik wird routinemässig ei

empfindlich auf Albumin. Diese Methode reicht in der Routine normalerweise aus zum Nachweis einer Proteinurie.

Bei besonders anfälligen Patien

normalen Teststreifen nicht erfasst wird, ist ein früher Hinweis für den Beginn einer Nierenschädigung.

Wichtig ist dieser Hinweis vor allem bei: ⇒ Diabetes mellitus ⇒ Bluthochdruck

.2. AKUTE-PHASE-/ ANTI-AKUTE-PHASE-PROTEINE 7

DIE AKUTE-PHASE-PROTEINE (APP):

Nach Zerstörung von Gewebe, z. B. durch Verletzung oder Infektion, kommt es zu einer komplexen Serie von Reaktionen des Organismus, mit dem Ziel

- den Erreger zu eliminieren; die Gewebsschädigung zu begrenzen

- die Reparaturmechanismen in Gang zu setzen - den Gesamtorganismus wieder zu einer normalen Funktion zu bringen

http://de.wikipedia.org/wiki/Hydrophob

http://de.wikipedia.org/wiki/Fetts%C3%A4uren



Dieser kumulative Prozess wird als Entzündung bezeichnet und der frühe Anteil dieser Reaktion als Akute-Phase-Antwort (APA). Unter anderem wird unter der APA die Änderung der Konzentrationen einer grossen Anzahl von Plasmaproteinen - den. Akute-Phase-Proteinen (APP)- nach ca. 4 – 12 Stunden verstanden. Sie sind mit einem Anstieg im Plasma um mindestens 25% definiert.

Akute-Phase-Protein Anstieg Plasmakonzentration - C-Reaktives-Protein (CRP) - Serum-Amyloid-A-Protein (SAA)

bis zu 2000fach

- α1-Antitripsin (α1-Protease-Inhibitor) - Fibrinogen

2 – 5fach

- Caeruloplasmin - Komplementfaktoren C3 und C4 - saures α-1-Glykoprotein - Haptoglobin

2fach

Dieser Anstieg wird durch Zytokine wie Tumornekrosefaktor-α (TNFα), Interleukin 1 und 6 (IL-1, IL-6) aus phagozytierenden Zellen induziert. Die APA umfasst Fieber, B- u. T-Zellaktivierung, ACTH- und Cortisolfreisetzung, sowie veränderte hepatische Synthese der APP und Anti-Akute-Phase-Proteine (AAPP). Die Bedeutung der APP liegt in einer gesteigerten Zufuhr regulatorischer Proteine an den Ort der Entzündung oder Gewebsverletzung.

Abb. 9: Ablauf der Akute-Phase-Antwort

Der Konzentrationsanstieg der APP im Plasma korreliert mit dem Ausmass der Entzündung, bzw. der Gewebsschädigung. In der Diagnostik wird dieser Effekt zur Diagnose und dem Therapieverlauf ausgenutzt.

Sind diese Proteine als Reaktion auf einen bakteriellen Infekt angestiegen, so wird der erfolgreiche Einsatz einer Antibiotikatherapie durch das Absinken ihrer Plasmakonzentration angezeigt. Ein wichtiger Anhaltspunkt hierfür ist die Halbwertszeit:



Halbwertszeit (HWZ), das ist die (theoretische) Zeit, in der nur noch die Hälfte der gemessenen Konzentration des jeweiligen APP im Plasma vorhanden ist.

Die HWZ von CRP beträgt etwa 6 - 8 Stunden, die vom sauren α1-Glykoprotein und Caeruloplasmin 2 – 3 Tage. Fibrinogen, Haptoglobin und α1-Antitrypsin sinken erst nach 4 Tagen auf die Hälfte ihrer Konzentration ab.

Kriterien für einen guten Marker einer Entzündung:

- Anstieg bei jedem Infekt, aber Differenzierung der Infekte möglich (viral, bakteriell)

- deutlicher Anstieg im Vergleich zu Referenzbereich - kurze Halbwertszeit - rasche Bestimmbarkeit - keine Beeinflussung durch andere Krankheiten oder Geschehen im Körper

Proteine die zwar häufig auch zu den APP gezählt werden, weil ihre Konzentration entsprechend ansteigt, obige Kriterien aber nicht ganz erfüllen, weil sie noch von anderen Geschehen im Körper beeinflusst werden, sind: (Siehe auch weiter unten bei: "weitere wichtige Proteine im Krankheitsgeschehen"):

⇒ Haptoglobin: Wird durch intravasale Hämolyse beeinflusst ⇒ Fibrinogen: Ist an der Gerinnung beteiligt und ist somit nicht

entzündungsspezifisch.

Die wichtigsten APP sind: C-reaktives-Protein (CRP), Serum-Amyloid-A Protein (SAA)

C-REAKTIVES PROTEIN

Fakten:

- Schnelle Reaktionszeit mit einem Anstieg nach 4 - 6 h; deutlichster Anstieg aller APP; kurze Halbwertszeit (HWZ von ca. 6 – 8 h)

- Bestimmungen mit immunchemischen Tests, turbidimetrisch oder nephelometrisch, innerhalb 15 Minuten möglich

- CRP ist entzündungsspezifisch, im Gegensatz zu Temperaturmessung, Blutsenkung und Leukozytenzählung, welche auch zur Diagnostik eines Infekts beurteilt werden (Blutsenkung wird heute seltener durchgeführt, da sehr unspezifisch Abb. 10: CRP

Referenzwert von CRP: < 5 mg/l



Das CRP oder Capsel-reaktive Protein ist ein kohlenhydratfreies Protein, Synthese und Freisetzung erfolgt durch die Leberzelle. Seinen Namen erhielt es, weil CRP an Polysaccharidkapseln von Streptokokken binden und diese präzipitieren kann. Gemeinsam mit den Plasmaproteinen SAA, α1-Antitripsin (α1-Protease-Inhibitor) Fibrinogen, Caeruloplasmin, Komplementfaktoren C3, C4, saurem α-1-Glykoprotein, usw., gehört das CRP zu den Akute-Phase-Proteinen. Den stärksten Stimulus der Akute-Phase-Reaktion bilden bakterielle Infektionen.

Das CRP wird als unspezifischer Entzündungsparameter unter anderem zur Beurteilung des Schweregrades entzündlicher Erkrankungen herangezogen.

CRP ist heute das diagnostisch wichtigste APP. Die Interleukinfreisetzung (z.B. Interleukin 6 – IL 6) aus Makrophagen am Entzündungsort, stimuliert die CRP-Synthese, es bildet Komplexe mit Mikroorganismen und induziert so die Phagozytose durch Makrophagen, Komplementaktivierung und Stimulation der Leukozyten, daher ist CRP ein Teil des Immunsystems. Es wirkt als Opsonin, welches das Komplementsystem aktivieren kann, indem es die Ursache der Entzündung „markiert“, und damit für dessen Abräumung sorgt.

Bereits wenige Stunden nach Beginn der akut infektiösen (z. B. bakt. Infekt), oder nicht infektiösen Entzündung (z.B Nekrosen) kommt es zu einem CRP-Anstieg im Plasma. Nach etwa 24 Stunden werden Maximalwerte erreicht, die bezeichnend für die Art des Infekts sind:

- < 10 mg/l: Erkältung, Schwangerschaft, Angina, Asthma, virale Infekte - 10 – 100 mg/l: schwerere virale Infekte, Herzinfarkt, Bronchitis, Cystitis,

Gicht, Pankreatitis - > 100 mg/l: Grössere Verletzungen, Sepsis (Blutvergiftung), postoperativ.

Zur Erinnerung: Nach dem Einsetzen einer erfolgreichen Therapie sinkt die CRP-Konzentration gemäss der zu erwartenden Halbwertszeit von ca. 6 - 8 Stunden auf die Hälfte ab.

Bestimmungsindikation:

Fieber und Leukozytenanstieg sind ebenfalls Entzündungszeichen, aber relativ unspezifische, ihr Stimulus kann vielfältig sein. Mit CRP hingegen lässt sich ein Infekt diagnostizieren und beobachten.

- Diagnose und Verlaufbeurteilung von Infektionen und Beurteilung der Therapie

- Ende der Schwangerschaft, bei vorzeitigem Blasensprung, um bei intrauterinen Infektionen rechtzeitig handeln zu können

- HIV-Patienten: Durch ihre verminderte Abwehr sind sie besonders anfällig für Infektionen

- postoperativ bestimmt, hat CRP prognostische Funktion für das Auftreten von Komplikationen

- rheumatische Erkrankungen

http://de.wikipedia.org/wiki/Kohlenhydrat

http://de.wikipedia.org/wiki/Protein

http://de.wikipedia.org/wiki/Caeruloplasmin

http://de.wikipedia.org/wiki/Akute-Phase-Protein

http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Akute-Phase-Reaktion&action=edit

http://de.wikipedia.org/wiki/Erkrankung



Bestimmungsmethoden:

CRP wird immunchemisch bestimmt, d. h. mit Hilfe von Antigen-Antikörper-Komplexbildung. Im Handel sind nephelometrische und turbidimetrische Methoden (siehe weiter unten) erhältlich. Zur Verlaufskontrolle sollte jedoch immer die gleiche Methode verwendet werden, da die Referenzbereiche zwischen den verschiedenen Methoden variieren. Lipämie und andere Trübungen, bei denen sich Teilchen an die CRP-Antikörperkomplexe im Testansatz anlagern können, führen zu falsch hohen Werten.

SERUM-AMYLOID-A-PROTEIN

Verhält sich ähnlich wie das CRP und wird in den USA anstatt dessen bestimmt.

ANTI-AKUTE-PHASE-PROTEINE (AAPP)

Bei akuten Entzündungen mit Vermehrung der Akute-Phase-Proteine sinkt die Plasmakonzentration der Anti-Akute-Phase-Proteine. Zur Diagnose eines Infekts wird ihre Bestimmung aber nicht eingesetzt. Zu den AAPP gehören:

- Präalbumin - Albumin - Transferrin

7.3. WEITERE IM KRANKHEITSGESCHEHEN WICHTIGE PROTEINE:

Die Konzentration einiger der folgenden Plasmaproteine steigt zwar auch an bei einer Entzündung (oder anderen Krankheiten), diese Proteine erfüllen aber die Kriterien der APP nicht. Trotzdem sind sie wichtig für die Diagnose, um von einer Erkrankung so viele Zustandsbilder wie möglich zu erhalten, bzw. um Krankheiten zu differenzieren.

INTERLEUKIN 6 (IL-6), TUMORNEKROSEFAKTOR α (TNF α)

IL-6 und TNFα - beides Zytokine - können als direkter Marker der Entzündungsreaktion angesehen werden, da sie aus den im Entzündungsgebiet befindlichen Makrophagen freigesetzt werden, dagegen sind APP nur indirekte Anzeichen, da sie zytokinvermittelt produziert werden. IL-6 und TNFα steigen aus dem Grund auch schneller an als die APP. Bei einigen Krankheitsbildern ist IL-6 daher ein sensitiverer Marker als CRP:



- Neugeborenensepsis: CRP-Anstieg gering, wegen ungenügender Syntheseleistung der unreifen Leber

- Sepsis im Erwachsenenalter: IL-6 ist hier ein prognostischer Marker für die Überlebenswahrscheinlichkeit, wenn die Konzentration < 40 U/ml aufweist.

Nachteil: Die HWZ von IL-6 und TNFα ist mit 20 Minuten zu kurz um eine klare Aussage über einen Therapieerfolg zu machen.

Bestimmungsmethode: Immunoassays

PROCALCITONIN

Procalcitonin ist ein Prohormon von Calcitonin (ein Hormon des Caliumstoffwechsels aus der Schilddrüse). Es reagiert selektiv auf systemische und septisch verlaufende

Infektionen durch Bakterien, Pilze und Protozoen. Bei viralen Infektionen, Abstossungsreaktionen, Neoplasien ist kein Anstieg zu verzeichnen.

Procalcitonin steigt ca. 2 Stunden nach Kontakt mit dem Erreger an und wird speziell bei generalisierten Infekten und zur Unterscheidung bakterieller/viraler Infekte verwendet.

Bestimmungsmethode: Immunoassays

GRANULOZYTEN ELASTASE

Als proteolytisches Enzym wird es im entzündeten und nekrotisierenden Gewebe aus neutrophilen Granulozyten, Makrophagen und Endothelzellen freigesetzt und dient dem Abbau von phagozytiertem Material.

Mit einer Halbwertszeit von 1 Stunde stellt es einen ergänzenden Entzündungsparameter zu CRP dar (HWZ 6 – 8 h), es ermöglicht damit eine Erkennung kurzzeitiger Verschiebung im Entzündungsprozess. Wichtig ist dies z. B. postoperativ zur Erfassung von Komplikationen und bei einer Sepsis, ob die Therapie anspricht. Die Granulozyten-Elastase ist relativ unspezifisch und nicht wie CRP geeignet, Entzündungen abzugrenzen.

Bestimmungsmethode: Turbidimetrie



NEOPTERIN

Neopterin zeigt die Aktivität der unspezifischen Abwehr an (Komplement, Monozyten). Es wird folgendermassen eingesetzt:

- Screening von Blutspenden: Normale Neopterinkonzentration schliesst eine Vielzahl von Erkrankungen aus (HIV, CMV – heute setzt man in grossen Labors jedoch PCR ein)

- HIV-Patienten: Bei 90 % aller HIV-Infizierten werden erhöhte Neopterinwerte gefunden, z. T. noch vor dem Nachweis von spezifischen Antikörpern. Neopterin gibt ausserdem Hinweise auf den Verlauf der HIV-Infektion, es verhält sich umgekehrt proportional zur Abnahme der T-Helfer-Zellen.

- Transplantation: Prognostische Aussagekraft für Komplikationen nach der Transplantation; die Notwendigkeit von Biopsien kann reduziert werden.

Bestimmungsmethode: ELISA (Enzym-linked Immunosorbent Assay), RIA (Radioimmunoassay)

HAPTOGLOBIN, HÄMOPEXIN

Haptoglobin transportiert intravasal freigesetztes Hämoglobin, Hämopexin transportiert freies Häm.

Beide Proteine werden zur Verlaufsbeurteilung einer Hämolyse bestimmt, ihre Konzentration nimmt dabei ab. Hämopexin hat den Vorteil, dass die Detektionsgrenze tiefer ist, d.h. man kann die Konzentrationsabnahme bis zu einem sehr tiefen Wert verfolgen.

Bestimmungsmethode: Nephelometrie, Turbidimetrie

7.4. MARKERPROTEINE BEI HERZ-KREISLAUF-ERKRANKUNGEN

Einige wichtige Proteine sollten hier besprochen werden, die Enzyme der Herz-Kreislaufdiagnostik werden bei der Theorie zu den Enzymen behandelt. Lipoprotein (a), ein weiterer Risikomarker, folgt bei den Lipiden.

hs-CRP Homocystein Mikroalbumin Natriuretische Peptide BNP und ANP Lipoprotein (a) (siehe Skript: Lipide) Myoglobin, Troponin, CK-MB (siehe Skript: Enzyme - MKI-Diagnostik)



HIGHSENSITIV-CRP (HS-CRP)

Highsensitiv-CRP ist ein Risikomarker der Atherosklerose.

Wir haben bereits das CRP bei den Entzündungsparametern kennen gelernt. Vom hs-CRP spricht man, wenn ein besonders sensitives Messverfahren eingesetzt wird, wobei latexverstärkte Partikel verwendet werden. Beim CRP als Akute-Phase-Protein gilt ein Referenzwert von < 5 mg/l, beim hs-CRP misst man unter diesem Bereich, hier gilt ein Referenzwert von < 1 mg/l.

Unter Atherosklerose versteht man die durch Verletzung der Gefässwand ausgelöste Plaquesbildung. Ursachen für diese Schädigung können Rauchen, Diabetes, Übergewicht Hyperhomocysteinämie (siehe unten) und Hypercholesterinämie sein. Es kommt zur Entzündung der Gefässwand mit Freisetzung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren, Einwanderung von Zellen des Immunsystems, Aktivierung des

Komplementsystems und der Gerinnung. Die glatten Muskelzellen proliferieren, es kommt zur Bildung eines Plaques, der die normalerweise elastische Gefässwand verhärtet und verengt.

Abb.11: Plaquesbildung

Im schlimmsten Fall verschliesst der Plaques das Gefäss vollständig. Betrifft es eine der Herzkranzarterien, so führt dieser Verschluss zum Myokardinfarkt.

Bei diesem Vorgang handelt es sich anfänglich um sehr kleinflächige Entzündungen, die Freisetzung von CRP ist daher minimal. Wie man aber in zahlreichen Studien entdeckt hat, liegt hier die Plasmakonzentration über 1 mg/l, gemessen mit „highsensitiven“ Assays. Man bezeichnet diesen Parameter jetzt hs-CRP und beurteilt damit das Risiko einer Atherosklerose, sowie indirekt das Myokardinfarkt-Risiko.

Bestimmungsmethode: Turbidimetrie, Nephelometrie – AK auf Latexpartikel gebunden bewirken dabei einen noch sensitiveren Nachweis.



Homocystein

Abb. 12: Homocystein-Stoffwechsel

Chemisch gesehen gehört Homocystein zu der Gruppe der Aminosäuren. Im Körper wird Homocystein aus Methionin, einer essentiellen Aminosäure gebildet, das mit der Nahrung zugeführt wird (Fleisch, Milch).

Die schwefelhaltige AS Homocystein wird normalerweise schnell wieder abgebaut, wobei Vitamin B6, B12 und Folsäure benötigt wird. Homocystein ist ein Zwischenprodukt bei der Umwandlung (Methylierung) von Methionin in andere AS, die für den Aufbau von Proteinen notwendig sind. Ist der Homocysteinstoffwechsel gestört, so steigt die Konzentration im Plasma an. Eine Konzentration von über 12 μmol/l gilt als unabhängiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen.

Eine Homocysteinerhöhung kommt vor bei:

- genetische Störungen (Enzymdefekte im Homocysteinstoffwechsel) - Mangel an Vitamin B12, B6 und Folsäure - Niereninsuffizienz oder Medikamenteninterferenzen (Antiepileptika)

Homocystein in hoher Plasmakonzentration ist bei der Entstehung der atherosklerotischen Plaques beteiligt. Zusammen mit dem Lipoprotein LDL (Cholesterin) führt es in einem oxidativen Prozess zur Gefässendothel-Schädigung und somit zur Entzündungsreaktion in der Gefässwand. Das Blutgefäss kann sich verengen und verschliessen, Thromben können sich lösen und eine Embolie bewirken. Bei Verschluss einer Herzkranzarterie kommt es zum Infarkt.

Therapie: Vitamin B12, B6 und Folsäuregabe

Bestimmungsmethode: Chromatographie, Immunoassays



Bluthochdruck kann zur Schädigung der Gefässe führen, es kommt zu einer gesteigerten Thromboseneigung, durch Bildung von Plaques. Vor allem die feinen Nierenkapillaren sind davon betroffen. Folgen davon: Herzinfarkt, Nierenversagen. Das Risiko kann durch die Bestimmung von Mikroalbumin abgeschätzt werden.

Nachgewiesen wird die Mikroalbumin-Ausscheidung mit sehr empfindlichen Teststreifen, die Albumin mittels eines immunologischen Reaktionsprinzips erfasst. Die Entscheidungsgrenze liegt hier bei 20 mg/l.

In der Urindiagnostik werden Sie noch mehr über die physiologische und pathologische Urinprotein-Zusammensetzung erfahren.

Natriuretische Peptide BNP, ANP

Die Gruppe der natriuretischen Peptide besteht aus dem atrialen natriuretischen Peptid ANP und dem brain natriuretic peptide BNP (wurde zuerst im Hirn gefunden).

Beide werden aus den Herzmuskelzellen ausgeschüttet – BNP aus den Muskelzellen der Herzkammern und ANP aus den Vorhöfen – als Reaktion auf eine erhöhte Wandspannung, wie es bei einer Erhöhung des Blutvolumens (Überwässerung ⇒ BD

) vorkommt. Beide Hormone wirken mindernd auf das Blutplasmavolumen (siehe Skript „Wasserhaushalt“) und somit blutdrucksenkend. Eine erhöhte BNP- bzw. ANP-Konzentration im Bluplasma kann Zeichen für das Vorliegen einer Herzinsuffizienz sein und auch Aufschluss über deren Schweregrad geben. Die Plasmakonzentration der natriuretischen Peptide kann zu prognostischen Zwecken bei bereits bestehender Herzinsuffizienz eingesetzt werden.

Bestimmungsmethoden: Radioimmunoassay, Fluoreszenzimmunoassays, usw.



C. ANALYTIK

8. ANALYTIK DER PLASMAPROTEINE

8.1. BESTIMMUNGSINDIKATIONEN

GESAMTPROTEIN

- Ergänzungsuntersuchung zur Serumelektrophorese - Nachweis einer Dysproteinämie (Störung der Plasmaprotein-Zusammensetzung) - Störungen des Wasserhaushaltes - Verlaufskontrolle zahlreicher Erkrankungen (v. A. Leber, Niere, Darm), dabei ist

zu beachten, dass die Blutentnahme immer zu gleichen Bedingungen erfolgt (Patient liegend, keine schwere Muskelarbeit vorher)

- Verlauf von malignen Blutkrankheiten (Plasmozytom).

Das Gesamtprotein wird routinemässig, nahezu ausschliesslich mit der Biuret-Methode bestimmt (nach Weichselbaum 1946).

IMMUNGLOBULINE

Der Gesamtanteil der Immunglobuline wird mit der Serumelektrophorese (s.u.) ermittelt, diese Untersuchung hat aber nur in Bezug auf die Proteinverteilung im Plasma Bedeutung. Aufgetrennt werden die einzelnen Immunglobulinfraktionen durch Isoelektrische Fokussierung (s.u.) in der Liquordiagnostik oder der Diagnose von Paraproteinämien (maligne Erkrankung von Lymphozyten und Plasmazellen). Eine Bestimmung der Immunglobulinklassen IgG, IgM, IgE, IgA führt man bei speziellen Fragestellungen wie Titerbestimmungen, Allergien, usw. in der Serologie mittels immuologischen Nachweisverfahren durch.

EINZELPROTEINE

Einzelproteine aus dem Plasma wie Albumin, CRP, Homocystein, bestimmt man zur Diagnose und Verlaufsbeurteilung zahlreicher Erkrankungen. Gemessen werden sie mittels immunchemischen Nachweisverfahren wie ELISA, Turbidi- und Nephelometrie.

Proteine im Urin wie Albumin, Transferrin, a1 Mikroglobulin, b2-Mikroglobulin, IgG, Antitrypsin, zur Identifikation einer Proteinurie werden elektrophoretisch aufgetrennt und die Muster danach interpretiert. Siehe dazu auch "Proteinurien". Es ist auch möglich diese Markeproteine einzeln im Urin mittels Nephelometrie, oder Turbidimetrie zu bestimmen.



ENZYME

Bei den Enzymen wird häufig die Aktivität gemessen (seltener die Masse), indem man sie in vitro ihr bevorzugtes Substrat umsetzten lässt und die Extinktionsänderung auf Zeit fotometrisch erfasst. Zum Beispiel gibt ein Anstieg der Plasmakonzentration bestimmter Zellenzyme einen Hinweis auf eine Organschädigung, oder ein Absinken von Plasmaenzymen zeigt eine Zellfunktionsstörung an (mehr darüber bei der Enzymdiagnostik).

8.2. BIURET-METHODE ZUR GESAMTPROTEINBESTIMMUNG

Präanalytik:

Die Probenentnahme muss standardisiert erfolgen, der Patient sollte liegen. Blutentnahme am stehenden Patient verursacht bis zu 10% höhere Werte. Ebenso die Blutentnahme nach aktiver Muskelarbeit.

Testprinzip:

Protein und Kupfer-II-Ionen bilden in alkalischer Lösung blau-violette Komplexe. Voraussetzung für die Reaktion ist das Vorhandensein von mindestens zwei Peptidbindungen (also mindestens ein Tripeptid).

Die Biuret-Reaktion beruht darauf, dass die Aminosäureketten der Proteine an ihren Stickstoffatomen mit Kupferionen farbige Salzkomplexe bilden. Die Intensität der Farbentwicklung ist proportional der Zahl der Peptidbindungen und damit der Proteinkonzentration. Liegen die Proteine in einem Probenmaterial (Urin, Liquor) in zu geringer Konzentration vor, so lassen sie sich mit Trichloressig ausfällen, abzentrifugieren und erneut in Lösung bringen, wobei sie nun höher konzentriert sind. Dieses Verfahren nennt man Anreicherung. Die anschliessende Bestimmung erfolgt mit der Biuret-Methode.

Referenzwert: Plasma eines Erwachsenen: 66 – 83 g/l

8.3. IMMUNOLOGISCHE PROTEIN-NACHWEISVERFAHREN

Nephelometrie, Turbidimetrie

Diese Messverfahren sind der Fotometrie ähnlich, gemessen wird aber entweder das durch Antigen-Antikörperkomplexe in der Probe entstandene seitliche Streulicht = Nephelometrie, oder der durch die entstandenen Komplexe abgeschwächte, eingestrahlte axiale Lichtstrahl = Turbidimetrie.



Nephelo- und Turbidimetrie

Abb. 13: Nepheleometrie / Turbidimetrie

Immunoassays

Stellvertretend für alle Immunoassays wie RIA, FPIA, MEIA, hier der klassische ELISA-Test (Enzyme-linked immunosorbend assay). Mehr dazu in der Immunologie. Alle anderen Methoden basieren etwa auf dem gleichen Prinzip, nämlich einer AK-AG-Reaktion und einer entsprechenden Markierung zum Nachweis.

Abb. 14: ELISA



PRÄZIPITATION UND HIGH-DOSE-HOOK-EFFEKT:

Unter Präzipitation versteht man eine immunologische Reaktion, bei der es durch Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen zu einer Ausfällung (sichtbar als Trübung) aus einer Lösung kommt. So kann mit Hilfe bekannter Antikörper ein Antigen nachgewiesen werden und umgekehrt.

Vorraussetzung ist, dass Antikörper mit 2 (IgG) oder 10 (IgM) Bindungsstellen an Antigene binden, die ihrerseits wieder mehrere Bindungsstellen besitzen, die von weiteren Antikörpern besetzt werden können. Dadurch kommt es zu einer Vernetzung zahlreicher AG-AK, so dass diese schliesslich auf Grund ihrer Grösse eine messbare Trübung (Ausfällung) im Ansatz verursachen.

Menge und Grösse der Antigen-Antikörper-Komplexe sind abhängig vom Verhältnis, in dem sich die beiden Partner in der Lösung befinden. Ist ein deutlicher Überschuss an CRP-Antigenen vorhanden, kommt es kaum zur Ausbildung grösserer Komplexe und die Ausfällung ist gering, da für jedes AG ein AK vorhanden ist und so die gebildeten Komplexe wieder zerfallen. Dieser Antigenüberschuss heisst mit Fachausdruck HIGH-DOSE-HOOK-EFFEKT

Um bei hohen Konzentrationen nicht fälschlicherweise einen zu tiefen Wert zu messen, sollte das erhaltene Resultat immer mit der Messung einer verdünnten Probe abgesichert werden.

Abb. 16: Veränderung des Grades der Ausfällung mit zunehmender Konzentration der Antigene – beschrieben mit der

Heidelberger-Kurve.

Abb. 15: Schematische Darstellung der Präzipitation



9. TRENNVERAHREN DER SERUMPROTEINE

9.1. SERUMELEKTROPHORESE

Prinzip

Unter Serumelektrophorese versteht man die Wanderung von in Lösung befindlichen Teilchen (hier Proteine) auf einer Folie (Zellulose-Acetat, Agarosegel), beim Anlegen einer Gleichspannung. Trennmedium ist eine Pufferlösung mit einem bestimmten pH-Wert. Durch unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten der verschiedenen Plasmaproteine werden sie in Fraktionen aufgetrennt. Nach der Färbung werden die Banden mit einem Densitometer ausgewertet und in Kurvenform dargestellt.

Proteine besitzen freie NH2- und COOH-Gruppen, sie tragen daher in wässriger Lösung, je nach pH-Wert des verwendeten Puffers, positive oder negative Ladungen.

⇒ Im sauren pH-Bereich (pH < 7,0) sind Proteine positiv geladen. ⇒ Im alkalischen pH-Bereich (>7,0) sind Proteine negativ geladen.

Vorraussetzung für die elektrophoretische Wanderung der Teilchen ist ihre elektrische Nettoladung (Differenz von positiver und negativer Ladung,) diese ergibt sich aus dem pH-Wert des Puffers und dem isoelektrischen Punkt des jeweiligen Proteins.

An ihrem isolektrischen Punkt (IEP) sind Proteine elektrisch neutral, hier ist keine Wanderung im elektrischen Feld möglich.

Der IEP der Serumproteine liegt im sauren pH-Bereich. Beispiele:

- Albumin IEP bei pH 4.6 - Alpha-Globuline (α1Lipoproteine HDL, α1Glycoprotein, α1Antitrypsin,

α2Makroglobulin, Haptoglobin) IEP bei pH 4.8 - Beta-Globuline (Transferrin, β-Lipoprotein, Komplement) IEP bei pH 5.2 - Gamma-Globuline (IgA, IgM, IgG,..) IEP bei pH 6.4

Für die Elektrophorese werden üblicherweise Puffer mit einem pH-Wert von 8,6 verwendet, bei diesem Wert liegen alle Proteine als Anionen (negativ geladen) vor und wandern zur Anode (Pluspol!!). Bei einem pH-Wert, der unter dem der meisten Proteine liegt, sind die Proteine positiv geladen und wandern zur Kathode (Minuspol!!).



Eine gefärbte Eiweiss-Elektrophorese: Die Auftragsstelle des Serums war auf dem rechten Rand. Die Eiweisse wandern zum + Pol. Albumin wandert am schnellsten, die Gamma-Globuline fast gar nicht. Man erkennt die 5 Banden, wobei die gamma-Globulin Bande sehr breit ist, d. h. es befinden sich verschiedene Arten Antikörper darin. Dieses EP-Muster entspricht dem eines Gesunden. Abb. 17: EP

Wie lässt sich nun die Wanderung der Proteine erklären?

Beim Albumin ist der Unterschied zwischen IEP und pH-Wert des Puffers am grössten; es wandert daher am schnellsten und weitesten. Gemäss der Reihenfolge der zunehmenden IEPs folgen dann die anderen Proteine.

Neben der Ladung sind noch folgende Parameter für die elektrophoretische Beweglichkeit von Bedeutung, jedoch weniger ausschlaggebend:

- Versuchsbedingungen: Temperatur, Feldstärke, Ionenstärke des Puffers - Molekülform - Molekülgrösse

Wozu macht man eine Serumprotein-Elektrophorese?

⇒ Erkennen der Ursache für Dysproteinämien ( = Störung der Plasmaprotein-Zusammensetzung) und Ausschluss einer Dysproteinämie bei Störungen im Wasserhaushalt (mit Kenntnis des Hämatokrits).

⇒ Erkennung und Beobachtung von Eiweissverlusten. Protein kann z.B. über die Niere und den Darmtrakt verloren gehen. Das Muster der im Blut verbleibenden Proteine, kann Hinweise auf die Ursache des Verlusts liefern.

⇒ Erkennung und Verlaufsbeurteilung von "abnormen" Proteinen (Paraproteinen). Bei verschiedenen bösartigen Erkrankungen des Blutes oder der Lymphknoten können "abnorme" Proteine, genauer gesagt unvollständige Antikörper, im Blut vorkommen. Man nennt sie Paraproteine. Ihr Auftreten im Blut bezeichnet man als Paraproteinämie oder monoklonale Gammopathie.



Durchführung der Zellulose-Acetat-Elektrophorese:

Probenmaterial:

Die Elektrophorese nur mit Serum durchführen, im Plasma befindet sich Fibrinogen, welches eine prominente Extrabande ergibt und so die Interpretation des EP-Muster beeinträchtigt – genauso verhält es sich mit Hämoglobin bei hämolytischen Proben.

• Die Probe wird mit einem Auftragsstempel auf die Zellulose-Acetat-Folie aufgetragen. Allerdings nicht in der Mitte der Folie sondern versetzt Richtung Minus-Pol (Kathode), weil die Proteine ja in Richtung Plus-Pol (Anode) wandern werden. Die Folie kommt anschliessend in einen Träger.

• Die beiden Enden der Folie und die beiden Pole (Kathode und Anode) tauchen in den Puffer ein.

• Der Elektrophorese-Apparat wird dann an das Netzgerät angeschlossen.

Abb. 18: EP-Durchführung

Abb. 18: EP – Start der Trennung

Färbung der Proteine:

Nach der Auftrennung wird die Cellulose-Azetat-Folie mit einem Proteinfarbstoff (z.B. Ponceau-Rot) gefärbt, danach überschüssiger Farbstoff in Entfärbebädern ausgewaschen. Man erkennt jetzt verschiedene Proteingruppen.

So sieht eine gefärbte Serumprotein-Elektrophorese auf Cellulose-Azetat aus. Rechts die Proteine, die am schnellsten und daher am weitesten gewandert sind.

Für die weitere Besprechung drehen wird die Folie um. Dies hat einen einzigen Grund: diese Darstellung hat sich eingebürgert.

Auf den ersten Blick erkennt man verschiedene Gruppen von Proteinen = Fraktionen.



Abtrennung der wichtigsten Protein-Fraktionen

Abb. 19: Färbung der EP / entstehende Fraktionen

Die größte Fraktion ist das Albumin. Den anderen, die zur Proteingruppe der Globuline gehören, gab man der Reihenfolge nach griechische Buchstaben. Man spricht daher vom Alpha-1-Globulin, Alpha-2-Globulin, Beta-Globulin und Gamma-Globulin.

Ermittlung der Anteile der einzelnen Fraktionen

Da die Vermehrung oder Verminderung der einzelnen Fraktionen von medizinischer Bedeutung sein kann, ist es notwendig, den Anteil der einzelnen Fraktionen zu bestimmen, das heisst, die einzelnen Fraktionen zu quantifizieren. Dazu gibt es verschiedene Verfahren. Meist wird die Folie, nachdem sie durch spezielle Chemikalien transparent (durchsichtig) gemacht wurde, mit einem Densitometer ausgewertet. Dabei wird eine Absorptionskurve bei 545 nm mit gleichzeitiger Markierung der Fraktionsgrenzen geschrieben und die Flächeninhalte unter der Kurve in Prozent ausgedrückt.

Die Elektrophoresekurve: Durch Abtasten der transparent gemachten Folie in einem Photometer oder einem Scanner entsteht aus den Unterschieden der Färbeintensität in der Folie eine Kurve - die Elektrophoresekurve. Früher wurde die Fläche unter der Kurve mit Millimeterpapier bestimmt, heute übernehmen das Computer. Die Ergebnisse werden zuerst einmal als Anteil am Gesamtprotein angegeben. Beta-Globulin 10% heisst z.B., dass die Beta-Globulin Fraktion 10% des Gesamtproteins ausmacht. Kennt man die Konzentration des Gesamtproteins im Blut (z.B. 60 g/l) kann man auch die absolute Konzentration der Beta-Globulin-Fraktion berechnen (das ergibt 6 g/l).

Abb. 20: Die EP Kurve



Viele Proteine bilden eine Fraktion

Man muss sich bewusst sein, dass die Fraktionen keine einzelnen Proteine sind, sondern dass in einer Gruppe viele verschiedene Proteine enthalten sind:

• Albuminfraktion: o Albumin,

• Alpha-1-Fraktion (Alpha-1-Globulin): o alpha-1-Lipoprotein (HDL) o alpha-1-Glykoprotein o alpha-1-Antitrypsin

Akute Phase Proteine

• Alpha-2-Fraktion (Alpha-2-Globulin): o Alpha-2-Makroglobulin o Coeruloplasmin o Haptoglobin

• Übergang von Alpha-2 zu Beta:

Akute Phase Proteine

o prä-Beta-Lipoprotein (VLDL/Triglyzeride) • Beta-Fraktion (Beta-Globulin):

o Hämopexin o Transferrin o Beta-Lipoprotein (LDL)

Anti-Akute Phase Protein

o Komplement • Am Übergang von Beta zu Gamma:

o Antikörper der Klasse IgA o Fibrinogen (nur bei der Verwendung von Plasma)

• Gamma-Fraktion (Gamma-Globuline): o Antikörper der Klasse IgG und IgM

http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_ephorese_eiweiss.htm#Albumin

http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_cholesterin.htm

http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef2/lbef_alpha1glykoprotein.htm

http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_a1antitrypsin.htm

http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_haptoglobin.htm

http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_triglyzeride.htm

http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef2/lbef_haemopexin.htm

http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_transferrin.htm

http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_cholesterin.htm

http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_immunglobuline.htm

http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_fibrinogen.htm

http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_immunglobuline.htm



Abb. 21: Interpretation von EP-Kurven



9.2. IMMUNFIXATIONS-EKTROPHORESE

Mit der Immunfixations-Elektrophorese können wir Plasmazellerkrankungen, die zum Auftreten von monoklonalen Immunglobulinen im Plasma und Urin führen, erkennen.

Durchführung:

Die Immunfixation erfolgt im Anschluss an die Serumelektrophose auf einem Agarosegel. Es werden. mehrere Banden desselben Patienten gleichzeitig aufgetrennt und anschliessend jeweils mit verschiedenen Antiseren überschichtet, welche AK gegen das gesuchte Protein im Patientenmaterial enthalten. Die AK diffundieren in das Gel und bilden mit den korrespondierenden AG unlösliche Komplexe (siehe Immunologie – Immundiffusion). Diese verbleiben bei den anschliessenden Waschschritten im Gel, während die übrigen Proteine der Probe und Antiseren weggeschwemmt werden. Abschliessend erfolgt eine Färbung mit einem Proteinfarbstoff. Die Beurteilung der Immunfixationselektrophorese auf aussergewöhnliche Banden führt man visuell durch.

Anwendung:

⇒ Angewendet wird sie mit Serum zur Weiterabklärung einer Paraproteinämie (monoklonale Immunglobulinvermehrung) und zur Beurteilung der Immunglobuline bei verschiedenen Fragestellungen.

⇒ Im Urin können mit der Immunfixationselektrophorese so genannte Bence-Jones-Proteine erkannt werden. Diese Immunglobulinleichtketten-Krankheit kann für sich alleine auftreten oder begleitend zu einem Plasmazytom vorkommen. Der Nachweis ist im Urin eindeutiger als im Serum.

Abb. 22: Negative (normale; links) und positive (krankhafte, rechts) Immunfixations-Elektrophorese. Als positiv gilt eine Immunfixation bei Nachweis klar abgegrenzter Banden (Pfeile). Im vorliegenden Fall existiert ein Paraprotein vom Typ IgG Lambda

9.3. SDA-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE

Diese Technik trennt Proteine nur nach ihrer Molekülgrösse auf.



Durchführung:

Das Detergenz Natrium-Dodecylsulfat (engl. sodium dodecyl sulfate = SDS) lagert sich im Überschuss an Proteine an und überdeckt mit seiner negativen Ladung die Ladung der Proteinmoleküle. Die durch SDS bewirkte Entfaltung der Proteinmoleküle führt zu einer Auftrennung komplex zusammengesetzter Proteine in ihre Untereinheiten, die nun eine Kugelgestalt besitzen.

Als Trennmedium dient ein Polyacrylamidgel, entsprechend dessen Porengrösse werden Proteine darin in Abhängigkeit von ihrer Molekülgrösse unterschiedlich stark zurückgehalten. Als "Motor" der Wanderung dient zwar immer noch die (negative) Ladung der Proteine, durch die Beschaffenheit des Trenngels ist aber nur noch die Grösse der Proteine entscheidend. Grosse Moleküle bleiben in der Nähe der Auftragsstelle, kleine wandern weiter. Der Einsatz von Kalibratoren erlaubt die Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen in der Probe. Die Proteine werden nach der Trennung angefärbt.

Anwendung:

Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese dient in der Labordiagnostik vor allem der Untersuchung von Urinproteinen auf die Molekülgrösse der ausgeschiedenen Proteine, zur Differenzierung tubulärer und glomerulärer Schädigungen (siehe Theorie „Proteine im Urin“).

ABB.23: SDS PAGE

9.4. ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG

Zur Erinnerung: Der isoelektrische Punkt ist definiert als der pH-Wert, bei dem ein Protein gegenüber der Lösung in welcher es sich befindet, keine Nettoladung aufweist. Der IEP liegt für jede Proteinart bei einem anderen IEP, er wird bei folgendem Verfahren zur Trennung und Fokussierung von Proteinen genutzt.



Durchführung:

Trennmedium ist ein im elektrischen Feld stabiler pH-Gradient der durch ein Gemisch von Polyelektrolyten (Ampholyten) gebildet wird. Die Proteine wandern, bis sie im Trennmedium ihren isoelektrischen Punkt erreicht haben, d. h. die Nettoladung gleich Null ist, dort bleiben sie dann fokussiert.

Anwendung:

Dieses Verfahren wird bei Liquorproteinuntersuchungen angewendet, zum Nachweis von oligoklonalen Immunglobulinen im Liquor. Oligoklonale Banden im Liquor, das sind Banden die aus einer Art (oder wenig unterschiedliche) Immunglobuline bestehen, die nicht auch im Serum vorkommen. Diese sind ein Hinweis auf eine lokale humorale Immunreaktion im ZNS (siehe Liquordiagnostik).

Abb. 24: IEF

9.5. KAPILLAR-ELEKTROPHORESE

Die neueste Variante der Elektrophorese ist die Kapillar-Elektrophorese, auch Kapillar-Zonen-Elektrophorese (KZE) genannt. Wie der Name andeutet, findet dabei die elektrophoretische Trennung in einer Kapillare, also in einem sehr dünnen Röhrchen statt.

Bei der Kapillarelektrophorese findet die elektrophoretische Trennung in einer mit Puffer gefüllten Glaskapillare statt. Bei den meisten Applikationen verwendet man 20 bis 100 cm lange, fused-silica Kapillaren mit einem Durchmesser von 10 bis 100 µm.



Durchführung:

Nach der Probenaufgabe am Kapillarinlet tauchen beide Kapillarenden in die Puffergefässe ein. Zwischen den Kapillarenden wird eine Spannung bis zu 30000 V angelegt. Die Probenkomponenten migrieren im elektrischen Feld unterschiedlich schnell in Richtung Outlet und durchqueren dabei einen Detektor, mit dem eine qualitative und quantitative Auswertung erfolgen kann.

Abb. 25: Schema der Kapillar- Elektrophorese Die Auftrennung der Stoffe findet in einer dünnen Kapillare statt (1/100 bis 1/10 mm Innendurchmesser, 20 bis 200 cm lang)

Wie bringt man die Probe hinein? Das geschieht, indem man kurzzeitig den linken Pufferbehälter durch das Probengefäss ersetzt und dann ein wenig Probe z.B. durch Ausübung von Druck oder durch einen Stromstoß in die Kapillare bringt. Es gibt für die Probenaufgabe verschiedenste Verfahren. Jedes hat Vor- und Nachteile.

Wie werden die getrennten Proteine erfasst? Der Detektor zeichnet vorbeifliessende Stoffe auf, weil diese eine Schwächung des einfallenden Lichts verursachen. Für die Protein-Elektrophorese werden meist UV-Lichtquellen und UV-Detektoren verwendet.

Die Proteine wandern Richtung Minus-Pol: Bei der Kapillar-Elektrophorese wandern die Proteine Richtung Minus-Pol, obwohl sie negativ geladen sind. Der Grund ist der bei der Kapillar-Elektrophorese übermächtige elektro-osmotische Fluss (EOF = Wanderung von positiv geladenen Teilchen aus dem Puffer, Richtung Katiode, diese nehmen Wasser mit. Die negativen Teilchen aus dem Puffer werden vom Trägermaterial gebunden). Der EOF geht Richtung Minus-Pol. Die Proteine wollen zwar Richtung Plus-Pol wandern, der EOF reisst sie aber zum Minus-Pol mit.

Gamma-Globuline kommen als erste zum Detektor: Auch dies ist für die Protein-Elektrophorese ungewöhnlich, bei der man Gamma-Globuline als langsame, nur gering wandernde Fraktion kennt. Aber gerade deswegen kommen die Gamma-Globuline bei der Kapillar-Elektrophorese als erste zum Detektor. Weil sie dem EOF am wenigsten Widerstand entgegensetzen.



Vorteil gegenüber der herkömmlichen Elektrophorese:

⇒ Wenig Probenmaterial (< 10 nl) ⇒ keine Färbung der Proteine ⇒ automatisierbar ⇒ Ergebnisse nach wenigen Minuten;

10. DYSPROTEINÄMIEN

Veränderungen der Gesamtproteinkonzentration im Blutplasma sind entweder ein Zeichen einer Dysproteinämie oder einer Störung des Wasserhaushaltes. Die Zusammensetzung der Plasmaproteine sieht etwa so aus.

60% Albumin 16% Immunglobuline (Ig) 24% übrige Plasmaproteine

Ein Erwachsener hat normalerweise eine Gesamtproteinkonzentration von 66-83 g/l.

Unter Dysproteinämien verstehen wir eine Störung der Plasmaprotein-Zusammensetzung aufgrund Vermehrung, Verminderung oder dem (pathologischen) Neuauftreten von Plasmaproteinen.

Dabei handelt es sich IMMER um eine Verminderung des Albumins (Vermehrung kommt NIE vor), oder Zu- bzw. Abnahme der Immunglobuline. Die anderen Plasmaproteine führen selbst bei einer Konzentrationsänderung um ein Vielfaches nicht zu einer erkennbaren Veränderung der Gesamtproteinkonzentration. Der Anteil von 24% beinhaltet ein Gemisch aus den verschiedensten Proteingruppen, welche - einzeln betrachtet - nur in einer sehr geringen Konzentration vorkommen.

Echte Hyperproteinämie (> 90 g/l):

Häufigste Ursache = Plasmazellerkrankung mit pathologisch erhöhter Immunglobulinsynthese. Weiters bei einem akuten entzündlichen Geschehen, infolge Immunglobulinzunahme (Leberzirrhose, Tuberkulose). Normalerweise nimmt das Albumin in diesem Fall ab. Vorübergehende Hyperproteinämien ergeben sich aus der erheblichen Zunahme der Ig und einer verzögerten Albuminabnahme

Echte Hypoproteinämie (<40 g/l):

Kennzeichen: Ödeme und Ergüsse in den Körperhöhlen



Ursache: Verminderung der Albumin- bzw. Immunglobulinsynthese oder ein Proteinverlust durch die Nieren (meist nur Albumin vermindert), oder bei Blutungen über den Darm bei Colitis, Gastroenteritis (alle Proteine gleichermassen vermindert).

Weitere Ursachen: Malabsorbtionssyndrom, Antikörpermangelsyndrom (z. B. AIDS), Verbrennungen.

Pseudo-Dysproteinämien bei Störungen im Wasserhaushalt

Störungen im Wasserhaushalt führen zu Pseudoproteinämien. Mit der Gesamtproteinbestimmung allein können wir sie nicht von den echten Dysproteinämien unterscheiden. Hier ist der Hämatokrit ausschlaggebend und das Ergebnis der Serumelektrophorese.

⇒ Pseudohyperproteinämie

Ursachen: Wasserverlust durch Erbrechen, Durchfall, Dursten. Weiters bei der diabetischen Azidose mit erhöhter Urinmenge.

Der Hämatokrit und das Gesamtprotein sind dabei (scheinbar) erhöht, da Wasser im Gefässystem fehlt.

⇒ Pseudohypoproteinämie

Ursachen: Bei stärkerem Blutverlust strömt proteinarme Gewebsflüssigkeit in die Blutbahn → Verdünnungs-Hypoproteinämie. Weiters sind proteinfreie Infusionslösung (Plasma wird dadurch verdünnt) und die 2. Hälfte der Schwangerschaft (Wasserzunahme in den Gefässen) Ursachen einer Pseudohypoproteinämie.

Der Hämatokrit und das Gesamtprotein sind dabei (scheinbar) vermindert, da Wasser im Gefässystem zunimmt.

Abb. 26: Echte -und Pseudo-Dysproteinämien



Quellenangaben:

www.med4you.at

www.biorama.ch

Skript Urs Übersax

Klinische Chemie für den Einstieg, Hallbach

Labor und Diagnose, Lothar Thomas

Lexikon der medizinischen Laboratoriumsdiagnostik, Gressner Arndt

http://www.med4you.at/

http://www.biorama.ch/

BAUSTEINE DES LEBENS - Repetition Klinische Chemie · • Sie können das Prinzip folgende Methoden...

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