BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH VI SINH TRONG THỰC PHẨM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM

KHOA SINH HỌC

BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

VŨ THÙY LINH 0715174 1

BÁO CÁO PHƢƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH

VI SINH TRONG THỰC PHẨM I. Giới thiệu

Ngộ độc thực phẩm ở các nƣớc đang phát triển hiện đang ở mức báo động. Đặc biệt tình

trạng ngộ độc tập thể đang ngày càng có xu hƣớng gia tăng.

Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng ngộ độc thực phẩm, chiếm 55,8% trong số

đó là đến từ các loài vi sinh vật nhƣ Staphylococcus aureus, Coliform, E. Coli…

Chỉ tính riêng ở Việt Nam, hàng năm tổn thất do ngộ độc thực phẩm lên đến 30 tỷ đồng.

Nắm bắt đƣợc tình hình thực tế, trong tuần tháng 5 vừa qua ( từ 16/05 đến 21/05/2011)

khoa Sinh học đã tiến hành cho sinh viên thực nghiệm về các phƣơng pháp để kiểm định vi

sinh trong thực phẩm nhằm giúp sinh viên thực hành các phƣơng pháp kiểm định và gia

tăng kiến thức trong quá trình tiếp cận với các phƣơng pháp thực tế.

II. Mẫu thực phẩm

1. Tên mẫu: thịt heo tƣơi

2. Ngày thu: 16/05/2011

3. Nơi thu: Khu chợ- ĐHKHXH & NV

III. Tiêu chuẩn kiểm nghiệm:

TCVN 7046 : 2002 Thịt tƣơi- quy định kỹ thuật

IV. Kết quả kiểm định

1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1(g) mẫu (TPC)

1.1. Quy trình định lượng


KHOA SINH HỌC



1.2. Kết quả đếm khuẩn lạc

Độ pha loãng F Số khuẩn lạc N ( CFU)

10-4

>300

10-5

>300

10-6

323 và 358

1.3. Kết luận

- Kết quả: Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong 1 (g) mẫu lớn hơn 3x106 CFU/g


KHOA SINH HỌC



- Kết luận: Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong 1 (g) mẫu vƣợt tiêu chuẩn cho phép của

tiêu chuẩn Việt Nam (106 CFU/g)

1.4. Mở rộng

- Phƣơng pháp đổ đĩa đếm khuẩn lạc là một phƣơng pháp khá phổ biến và đƣợc sử

dụng rộng rãi để định lƣợng vi sinh vật, cụ thể ở đây là định lƣợng vi sinh vật hiếu

khí có trong mẫu thực phẩm. Trong bài thực tập mẫu đƣợc tiến hành pha loãng lên

đến 10-4

, 10-5

, 10 -6

đƣợc xem là nồng độ tƣơng đối loãng để tiến hành nuôi cấy

trong môi trƣờng PCA. Kết quả khi đếm khuẩn lạc đều lớn hơn 300. Từ đó ta thấy

mẫu thịt tƣơi đã nhiễm rất nhiều vi sinh vật hiếu khí. Nhiều chủng loại khác nhau.

- Về cơ bản thịt tƣơi là một thực phẩm khá dễ bị nhiễm vi sinh vật vì nó có đầy đủ

phẩm chất giúp vi sinh vật tồn tại và phát triển nhƣ t0, pH, độ nƣớc, thành phầm dinh

dƣỡng…Quá trình nhiễm có thể do chế biến, gia nhiệt chƣa tới hạn, nhiễm từ các

dụng cụ chế biến, vật chứa hoặc từ không khí, đất.

- Giải pháp: Cần giữ sạch sẽ trong quá trình chế biến thịt tƣơi. Không dùng các thiết bị

bẩn để đựng thịt, vùng chế biến phải thoáng, tránh xa cống rãnh hoặc vùng rác thải.

Xử lý sạch những phế phẩm không dùng đến. Quá trình bảo quản và vận chuyển phải

giữ nhiệt độ đúng theo yêu cầu để tránh ảnh hƣởng đến chất lƣợng thịt tƣơi.

Hình 1: Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong môi trƣờng PCA ở nồng độ 10-6

2. Coliform tổng số trong 1 (g) mẫu (C)



KHOA SINH HỌC



2.2. Kết quả đếm khuẩn lạc và ống sinh hơi

Độ pha loãng F Số khuẩn lạc N ( CFU)

10-4

50 và 15

- Số đĩa pha loãng mỗi nồng độ: n= 2


KHOA SINH HỌC



- Thể tích cấy vào đĩa: V=1ml

- Tỷ lệ xác nhận: R= số khuẩn lạc sinh hơi trong ống BGBL/tổng số khuẩn lạc đem đi

cấy=1 ( cả năm ống đều sinh hơi)

N x R

N x V x F

C = 32,5 x 104

( CFU/g)

2.3. Kết luận

- Coliform tổng số / g trong mẫu thịt tƣơi là 32,5 x 104 CFU/g

- Kết luận: Coliform tổng số trong 1(g) mẫu vƣợt tiêu chuẩn cho phép theo TCVN

102 CFU

2.4. Mở rộng

- Môi trƣờng VRB không hấp vô trùng nhƣ những môi trƣờng khác, mà đƣợc cân

vô trùng. Đun trong lò vi ba cho tan hết và giữ nhiệt ở 450C.

- Môi trƣờng BGLB Mật bò bile) và brilliant green ức chế hầu hết các vi khuẩn

gram và vi khuẩn gram– không phải Coliform. Brilliant green có nồng độ đặc

hiệu nhằm ngăn vi khuẩn kị khí lên men lactose sinh trƣởng ở 44 0C , Tránh đƣợc

hiện tƣợng dƣơng giả, lúc này Coliform phát triển làm đục môi trƣờng và sinh khí

trong ống durham do lên men lactose.

- Vì đặc tính của nhóm Coliform là có khả năng lên men lactose và sinh hơi trong

môi trƣờng nuôi cấy lỏng. Do đó trong quá trình định lƣợng Coliform tổng số ta

sử dụng môi trƣờng BGBL để quan sát khả năng sinh hơi của Coliform từ đó

khẳng định có xuất hiện Coliform trong mẫu. Trong bài thực tập này kết quả cho

ta thấy 5 ống BGBL có cấy khuẩn lạc Coliform đều sinh hơi.

- Coliform có thể đƣợc xem là vi sinh vật chỉ thị bởi vì số lƣợng của chúng hiện

diện trong mẫu chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong

thực phẩm. Sự hiện diện Coliform trong mẫu thịt tƣơi là khá lớn điều đó có thể

cho thấy sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong mẫu thịt tƣơi là khá

lớn.

- Khuẩn lạc có màu đỏ hoặc đỏ đậm do màu của môi trƣờng và thêm tủa quầng

muối mật có trong môi trƣờng.


KHOA SINH HỌC



Hình 2: Khuẩn lạc Coliform trong môi trƣờng VRB

3. Quy trình định tính Escherichia Coli giả định

3.1. Quy trình định tính


KHOA SINH HỌC



3.2. Kết luận

- Kết quả: Phản ứng thử Indol dƣơng tính. Xuất hiện vòng màu hồng trên mặt dung

dịch.

- Kết luận: Phát hiện E. Coli giả định trong 1(g) mẫu.


KHOA SINH HỌC



3.3. Mở rộng

- Thuốc thử sử dụng trong phản ứng Indol là Kovac’s. Cơ chất chính tham gia phát

hiện Indol trong môi trƣờng nuôi cấy là p-dimethyaminobanzaldehyde. Chất này

phản ứng với indol tạo thành phức hợp màu đỏ do nhân pyrol của indol phản ứng với

nhóm ahdehyde của DMAB tạo thành nhân quinone có màu đỏ.

- E.coli đƣợc xem nhƣ là vi sinh vật chỉ thị trong môi trƣờng ô nhiễm phân hay chất

thải. Ngƣời ta thƣờng xác định sự hiện diện của E.coli để kiểm tra xem mẫu thực

phẩm có bị nhiễm bẩn từ môi trƣờng hay thông qua nguồn nƣớc hay không.

4. Quy trình định lượng Staphylococcus aureus



KHOA SINH HỌC



4.2. Kết quả

Độ pha loãng F Số khuẩn lạc N (CFU)

10-3

21 và 14

- Số ống huyết tƣơng đông tụ 4

- Tỷ lệ xác nhận: R= Số khuẩn lạc đông tụ huyết tƣơng/ tổng số khuẩn lạc cấy = 4/5

N x R

N x V x F

C = 14 x 103

(CFU/g)

4.3. Kết luận

- Staphylococcus aureus có trong 1 (g) mẫu là 14 x 103 CFU/g

- Kết luận: Staphylococcus aureus trong 1 (g) mẫu vƣợt quá tiêu chuẩn cho phép của

TCVN: 102 CFU/g

4.4. Mở rộng

- Thành phần môi trƣờng BPA có lithium chloride và tellurite có tác dụng ức chế các

quần thể vi khuẩn thƣờng hiện diện cùng Staphylococcus trong khi đó pyruvate và

glycine kích thích sự phát triển của Staphylococcus. Khuẩn lạc Staphylococcus có hai

đặc điểm: Khuẩn lạc có màu đen do khử telurite thành telurium, dạng lồi và tạo vòng

trong xung quanh khuẩn lạc,đƣờng kính từ 2 – 5 mm do sự thủy phân protein. Sau đó

có thể xuất hiện 1 vòng đục ở trong vòng trong có tác động của lecithinase, một loại

lipase). Đây là một đặc tính thƣờng thấy và có tính chuyên biệt ở các tụ cầu khuẩn

gây bệnh.

- Coagulase là enzyme đƣợc tạo bởi S.aureus, là enzyme liên quan đến khả năng bền

nhiệt, có thể bền đến 600C trong 30 phút. Enzyme này là một protein tự nhiên, đƣợc

S.aureus tiết ra ngoài tế bào, dễ bị bất hoạt bởi các protease. Coagulase đóng vai trò

đông tụ huyết tƣơng, chúng kết hợp với các cấu tử trong huyết tƣơng thành từng khối

hay từng cục. Ứng dụng nguyên tắc này ngƣời ta sử dụng huyết tƣơng thỏ để tiến

hành phản ứng định lƣợng Staphylococcus aureus.

- Sự hiện diện mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh và

kiểm soát nhiệt độ của quá trình chế biến rất kém.


KHOA SINH HỌC



Hình 3: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus


KHOA SINH HỌC



5. Định tính Samonella trong 25 (g) mẫu

5.1. Quy trình định tính


KHOA SINH HỌC



5.2. Kết quả

Thử nghiệm KIA:

- Đối chứng: Trên đỏ dƣới vàng, có vệt đen và nứt thạch

- Mẫu: Không đổi màu môi trƣờng màu đỏ), không nứt thạch và không xuất hiện vệt

đen.

Thử nghiệm LDC:

- Đối chứng: Môi trƣờng LDC giữ nguyên màu tím (+)

- Mẫu: Môi trƣờng LDC giữ nguyên màu tím (+)

Thử nghiệm Manitol Phenol Red Broth:

- Đối chứng: Môi trƣờng chuyển từ màu đỏ sang vàng (+)

- Mẫu: Môi trƣờng giữ nguyên màu đỏ (-)

Thử nghiệm Urea Broth:

- Đối chứng: Môi trƣờng giữ nguyên màu hồng nhạt (-)

- Mẫu: Môi trƣờng giữ nguyên màu hồng nhạt (-)

Thử nghiệm Canh Trypton:

- Đối chứng: Không xuất hiện vòng màu hồng (-)

- Mẫu: Không xuất hiện vòng màu hồng (-)

Kết luận: Không phát hiện Samonella trong 25 (g) mẫu.

5.3. Mở rộng

Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả năng di động

không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhƣng không lên men saccharose

và lactose, không sinh Indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm

amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S. Salmonella có thể phân tích định

tính bằng mộ quy trình gồm 4 bƣớc: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định.

Salmonella thƣờng có mặt trong mẫu với số lƣợng nhỏ, bị tổn thƣơng và cùng hiện diện

chung với một số lƣợng lớn với các loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae có tính

cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trƣởng của Salmonella.

Vì trong môi trƣờng KIA lƣợng đƣờng chỉ chiếm 1% lactose và 0,1% glucose và

thuốc thử phenol red. Do đó sau khi lên men glucose hết Samonella bắt đầu sử dụng đến

pepton trong môi trƣờng, quá trình trao đồi này làm giải phóng NH3, làm kiềm hóa môi

trƣờng do đó phần nghiêng có màu đỏ. Ở phần sâu của môi trƣờng có pH acid bởi sự lên


KHOA SINH HỌC



men kỵ khí glucose, các sản phẩm thu đƣợc là acid hữu cơ, do đó làm cho môi trƣờng

chuyển thành màu vàng.

Khi enzyme lisine decarboxylase tác động lên amino acid L- lisin và khử nhóm

carboxyl, chúng tạo thành một amin và CO2 làm kiềm hóa môi trƣờng. Tiến hành thử phản

ứng LDC để xác định khả năng tổng hợp enzyme khử nhóm carboxyl hay tách hydrogen từ

các acid amin. Nếu sau khi nuôi cấy môi trƣờng chuyển màu vàng là âm tính, giữ nguyên

màu ban đầu là dƣơng tính. Từ kết quả trên ta có thể thấy Samonella là vi sinh vật có thể

tổng hợp nhóm enzyme khử nhóm carboxyl hoặc tách hydrogen từ acid amin khi môi

trƣờng giữ nguyên màu tím (+)

Vi khuẩn Samonella có khả năng lên men đƣờng manitol sinh acid khi có thuốc thử

phenol red sẽ làm môi trƣờng chuyển từ đỏ sang vàng. Samonella có khả năng lên men

đƣờng manitol do đó môi trƣờng ở ống đối chứng chuyển từ đỏ sang vàng.

Emzyme urease là một enzyme quan trọng trong tế bào vi sinh vật. Khi có cơ chất

urea hiện diện trong môi trƣờng, enzyme này đƣợc tổng hợp và phóng thích ra bên ngoài tế

bào xúc tác phản ứng thủy giải urea. Sản phẩm sau phản ứng làm cho môi trƣờng hóa kiềm

chuyển sang màu đỏ. Samonella không có khả năng sinh enzyme urease phân giải ure do đó

môi trƣờng giữ nguyên màu.

Tryptophan là một aminoacid có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật nhất định tạo

hợp chất indol. Sự tách amin từ tryptophan là một phản ứng khử. Qua quá trình này nhóm

amin đƣợc tách ra và chuyển thành NH3. DMAB trong môi trƣờng nuôi cấy phản ứng với

indol tạo màu đò. Samonella không có khả năng tách nhóm amin từ tryptophan vì vậy

không sinh indol. Phản ứng thử indol âm tính (-) không phát sinh vòng màu đỏ.

Hình 3: Hình dạng khuẩn lạc Samonella


KHOA SINH HỌC



Mục lục:

I. Giới thiệu ........................................................................................................................... 1

II. Mẫu thực phẩm.................................................................................................................. 1

1. Tên mẫu: thịt heo tƣơi.................................................................................................... 1

2. Ngày thu: 16/05/2011 .................................................................................................... 1

3. Nơi thu: Khu chợ- ĐHKHXH & NV............................................................................. 1

III. Tiêu chuẩn kiểm nghiệm: .............................................................................................. 1

IV. Kết quả kiểm định .......................................................................................................... 1

1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1(g) mẫu (TPC) ................................ 1

1.1. Quy trình định lƣợng ............................................................................................... 1

1.2. Kết quả đếm khuẩn lạc ............................................................................................ 2

1.3. Kết luận ................................................................................................................... 2

1.4. Mở rộng ................................................................................................................... 3

2. Coliform tổng số trong 1 (g) mẫu (C)............................................................................ 3


2.2. Kết quả đếm khuẩn lạc và ống sinh hơi .................................................................. 4

2.3. Kết luận ................................................................................................................... 5

2.4. Mở rộng ................................................................................................................... 5

3. Quy trình định tính Escherichia Coli giả định ............................................................... 6

3.1. Quy trình định tính .................................................................................................. 6

3.2. Kết luận ................................................................................................................... 7


KHOA SINH HỌC



3.3. Mở rộng ................................................................................................................... 8

4. Quy trình định lƣợng Staphylococcus aureus ................................................................ 8


4.2. Kết quả .................................................................................................................... 9

4.3. Kết luận ................................................................................................................... 9

4.4. Mở rộng ................................................................................................................... 9

5. Định tính Samonella trong 25 (g) mẫu ........................................................................ 11

5.1. Quy trình định tính ................................................................................................ 11

5.2. Kết quả .................................................................................................................. 12

5.3. Mở rộng ................................................................................................................. 12


KHOA SINH HỌC



BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH VI SINH TRONG THỰC PHẨM

Documents

Transcript of BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH VI SINH TRONG THỰC PHẨM