Facultad de Ingeniería y TecnologíaIngeniería Civil en Biotecnología

Proyecto de investigación Bioquímica Experimental 9 de Mayo 2012.Avance de Proyecto Nº1

“Extracción y Purificación de Beta galactosidasa a partir de Aspergillus níger.”

Braulio Contreras; Juan Domínguez.

Contreras . F; Fuentes. R.Resumen

En el presente trabajo se describe el avance que se a logrado de acuerdo a la planificación presentada , en esta etapa se logro cumplir con el primer objetivo especifico del trabajo el cual es cultivar el microrganismo Aspergillus Niger, el stock donde se obtiene el hongo para cultivarlo es un cultivo en placa proporcionada por el laboratorio de biotecnología de la universidad San Sebastián , para cultivo liquido se utilizo las condiciones del medio liquido presentadas en el anteproyecto, se inoculo el hongo en 2 matraces de 500 ml y con 250 ml de medio de cultivo en este caso se utilizo Difco TM

Malt Extract Broth el tiene todo las características optimas para el crecimiento del cultivo después se llevo al shacker por 2 dias a 32 °C y 200 rpm, el otro punto obtenido en este avance es la enzima comercial de β- Galactosidasa ( EC 3.2.1.23 ) desde Aspergillus Oryzae ( Sigma G – 5160) se obtuvo desde el proveedor de la enzima todas su caracterización se obtuvo su ph 4,5 , temperatura 30 °C también se obtuvo en forma bibliográfica la cinética de la enzima la cuales son Km 11,0 mM, Vmax 0.29min-1 estos datos van hacer corroborados después experimentalmente cuando se caracterice la enzima purificada desde nuestro hongo y y cuando se caracterice la enzima comercial.

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Abstract

This paper describes the progress that has accomplished according to plan submittedat this stage was achieved the first objective to meet specific work which is to cultivate the microorganism Aspergillus Niger, the stock where you get the fungus to cultivate plating is provided by the biotechnology laboratory of the University of San Sebastian ,was used for liquid culture liquid medium conditions presented in the draft, the fungus was inoculated into 2 flasks of 500 ml and 250 ml of culture medium in this case was used DifcoTM Malt Extract Broth has all the optimal characteristics for growth of the culture after the shacker took for 2 days at 32 ° C and 200 rpm, the other point obtained in this advance is the enzyme β-commercial galactosidase (EC 3.2.1.23) from Aspergillus oryzae (Sigma G - 5160) was obtained from the supplier of the enzyme all gave their characterization pH 4.5, temperature 30 ° C was also obtained in bibliographic form of the enzyme kinetics which are the Km 11.0 mM, Vmax 0.29min-1data will make later corroborated experimentally when the purified enzyme was characterized from our mushroom and and when it characterizes the commercial enzyme.

Introducción

El fin que persigue la biotecnología y los métodos de selección utilizados dentro de la misma, consiste en desarrollar procedimientos prácticos que permiten purificar la enzima (β-galactosidasa) u otro elemento puro de interés desde un microorganismos el cual tiene importancia a nivel industrial (2) (Doran, 1998). La producción de una enzima por los métodos de la biotecnología clásica o bioquímica experimental incluye dos etapas principales: la fermentación, en la que se multiplica el microorganismo productor de la enzima, y la de recuperación, separación y purificación, en la donde esta se aísla y se lleva al grado de pureza adecuado para su uso. La β-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es una enzima que hidroliza la lactosa en sus monómeros glucosa y galactosa, al escindir el enlace β 1-4. Se conoce que la leche, por su alto contenido en lactosa, no puede ser asimilada por cierto grupo de personas, pues les ocasiona trastornos digestivos a causa de que no sintetizan beta-galactosidasa (1) (Bayless et al., 1971). .Es un enzima esencial en el cuerpo humano, las deficiencias en la proteína puede resultar en Galactosialidosis o síndrome de Morquio B. En E. coli, el gen de β-galactosidasa, el gen lacZ, está presente como parte del sistema inducible operón lac que se activa en presencia de lactosa cuando el nivel de glucosa es bajo.

Los objetivos de este primer avance consistieron en estudiar las condiciones óptimas para preparar los cultivos, preparar las soluciones, determinar el ph y temperaturas que influirían en la propagación de Aspergillius Niger en el medio de cultivo, además de un estudio para determinar los parámetros cinéticos de la enzima comercial.

Materiales y Métodos

Medio de cultivo.

Se prepararo el medio cultivo acorde a las necesidades fisiológicas del microorganismo para obtener un cultivo de Aspergillus Niger. Para cada medio se utilizo DifcoTM

Malt Extract Broth el cual esta tiene el pH optimo para el cultivo (pH a 4,5), para tener un cultivo solo con organismo en estudio se autoclavaron 2 matraces de 250 ml con el medio a 15 psi por 15 minutos.

a) DifcoTM Malt Extract Broth (tabla 1)

2

componente g/1000ml g/250mlMalt extract

Maltose Technical

Dextrose

Yeast Extract

6

1.8

6

1,2

1,5

0,45

1,5

0,3

Para la preparación de medio de culitvo se utilizaron la balanza analítica para pesar 3,75 g de DifcoTM

Malt Extract Broth para preparar los 250 ml de medio para el cultivo del hongo, para sacar el medio de cultivo se utilizo la espátula.

Cuando esta el medio de cultivo preparado se autoclava a 15 psi por 15 minutos para esterilizar el medio, depues se deja enfriar por 2 horas para depues inocular con el stock de Aspergillus Nigerel cual fue proporcionado por el laboratorio de biotecnología de la universidad San Sebastian para este proceso se esterilizo el área con alcohol 70% y con 2 mecheros la inoculación fue con una haza curva la cual fue calentada hasta dejar el metal al rojo vivo para esterilizarla al estar el haza esterilizada se procede a extrarer de la placa una muestra de hongo la cual se introduce en el cultivo y se lleva a el shaker a 32 °C y 200 rpm por 48 horas.

Resultados.

a) Informacion enzima comercial (Tabla 2)

Enzima Beta galactosidasa EC 3.2.1.23PH 4.5 Temperatura 30ºCKm 11.0 mMVmax 0.29min-1

Los resultados para la determinación de pH óptimo se obtuvieron por bibliografía, al igual que la temperatura en que reacciona la enzima (3). Los parámetros cinéticos para la enzima comercial igual se obtuvieron por medio de bibliografía (4).

b) Medio de cultivo autoclavado (imagen 1)

c) Medio de cultivo con hongo después de 36 horas (imagen 2)

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Discusión.

Al principio de nuestro proyecto se realizo toda la búsqueda bibliográficas para la extracción y purificación de β- Galactosidasa desde Aspergillus Oryzae lo cual tuvo una modificación el hongo para la purificación se cambio por Aspergillus Níger por lo cual se tuvo que revaluar lo buscado por bibliografía si existía alguan cambio en los protocolos utilizados o cambios en el medio de cultivo , los resultados del cambio no fueron interferentes con el proyecto por que al ser las dos hongos de la misma especie no cambiaron nuestra formulación de proyecto.Los datos obtenidos por bibliografía de temperatura y ph de la enzima comercial son parámetros estudiados por varios papers por cual no se caracterizo la enzima comercial para obtener esos datos.Los parámetros cinéticos se realizo una buscada bibliográfica con paper que utilicen el mismo método para obtener estos datos esto se realizo para obtener este dato de forma teorica y después comparados con la enzima purificada desde el hongo y desde la enzima comercial

Conclusión.

Al obtener estos resultados se pude visualizar fácilmente que el cultivo se propago de buena manera, es importante determinar los factores ambientales óptimos (pH y temperatura). Debido a que bajo estas condiciones la β-galactosidasa cataliza la reacción con mayor velocidad.

Como el hongo creció en perfectas condiciones esto da paso a las siguientes actividades que salen indicadas en la planificación de nuestro proyecto las cuales corresponderían a la purificación de nuestra enzima β-galactosidasa

Bibliografía

(1) BAYLESS, T.M.; D.M. PAIGE and G.D. FERRY . Lactose intolerance and milk drinking habits. Gastroenterology, 1971

(2) Doran, P. 1998. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, California, USA. 439p.

(3) Robert E Lenga; Kristine L Votoupal β-galactosidasa http://www.sigmaaldrich.com 25-04-2012

(4) Seiichi Takasaki And Akira Kobata. PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF AN ENDO β-GALACTOSIDASE PRODUCED BY DIPLOCOCCUS PNEUMONIAE. The Journal Of Biological Chemistry . Vol. 251, No. 12, Issue of June 25, pp. 3603-3609, 1976.

(5) Whiteburst, R. Enzyme in food Technology. Editorial Sheffield Academic Press. New York, USA,2002.

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