Avaliação do Legiolert™ na deteção e

quantificação de Legionella pneumophila em

amostras de água

Sílvia Monteiro e Ricardo Santos, Laboratório Análises, Instituto Superior Técnico

Silvia.monteiro@tecnico.ulisboa.pt

Legionella pneumophila

• Principal responsável pelos surtos de Legionella

• Bactéria saprófita, encontrada naturalmente no ambiente aquático e

em solos

Sistemas de água quente

Chuveiros

Água Fria

Instalações Termais

Aerosois

Lamas

Ar Condicionado

• Torres de Refrigeração

Aspersores

Lagos Artificiais

Parasita intracelular de

amebas: Acanthamoeba

castellanii, espécies de

Hartmannella ou de Naegleria

Biofilme

Técnicas para detecção de Legionella

Técnicas para detecção de Legionella

ISO 11731:2017

PCR em tempo real

Baseada na detecção de Legionella

em meio de cultura selectivo

Técnicas para detecção de Legionella ISO 11731:2018

PCR em tempo real

Baseada na detecção de

Legionella por amplificação de

DNA

ISO 11731:2017

• Determinação de células de Legionella

viáveis e cultiváveis

• Distinção entre serogrupos de Legionella

pneumophila

• Isolamento de colónias de Legionella

penumophila para tipagem em situações de

surto

• Técnica fastidiosa

• Tempo desde colheita até obtenção de

resultados bastante elevado

• Ocorrência de falsos negativos

• Requer bastante treino

• Amostras com elevado grau de

interferentes apresentam acrescida

dificuldade

Vantagens Desvantagens

Legionella

viáveis

Legionella

Mortas

Legionella

viáveis-não

cultiváveis

Espécies que não

crescem em

GVPC Legionella

dentro de

protozoários

ISO 11731:2017

• Determinação de células de Legionella

viáveis e cultiváveis

• Distinção entre serogrupos de Legionella

pneumophila

• Isolamento de colónias de Legionella

penumophila para tipagem em situações de

surto

• Técnica fastidiosa

• Tempo desde colheita até obtenção de

resultados bastante elevado

• Ocorrência de falsos negativos

• Requer bastante treino

• Amostras com elevado grau de

interferentes apresentam acrescida

dificuldade

Vantagens Desvantagens

PCR em tempo real

• Resposta rápida (~4h)

• Elevada sensibilidade

• Amostras com elevado grau de interferentes

não apresentam dificuldades devido a elevada

especificidade

• Detecção de Legionella independentemente do

seu estado fisiológico

• Detecção de todas as espécies de Legionella

• Discriminação entre serogrupos de Legionella

pneumophila

• Requer bastante treino e sensibilidade

• Potencial para falsos positivos

• Em situações de surto em que esta

técnica é utilizada, será de uma

maneira geral necessário cultivar as

amostras para obter colónias isoladas

• Compostos inibidores de reacção

Vantagens Desvantagens

Legionella

viáveis

Legionella

Mortas

Legionella

viáveis-não

cultiváveis

Espécies que não

crescem em

GVPC Legionella

dentro de

protozoários

PCR em tempo real

• Resposta rápida (~4h)

• Elevada sensibilidade

• Amostras com elevado grau de interferentes

não apresentam dificuldades devido a elevada

especificidade

• Detecção de Legionella independentemente do

seu estado fisiológico

• Detecção de todas as espécies de Legionella

• Discriminação entre serogrupos de Legionella

pneumophila

• Requer bastante treino e sensibilidade

• Potencial para falsos positivos

• Em situações de surto em que esta

técnica é utilizada, será de uma

maneira geral necessário cultivar as

amostras para obter colónias isoladas

• Compostos inibidores de reacção

Vantagens Desvantagens

LEGIOLERTTM

LEGIOLERTTM

• Novo sistema para quantificação de Legionella pneumophila em

amostras de água potáveis e não potáveis

LEGIOLERTTM

• Baseado na detecção de uma enzima que indica a presença de Legionella

pneumophila através da utilização do substrato presente no reagente

Legiolert

LEGIOLERTTM

Reacção positiva para Legionella pneumophila

Reacção negativa para Legionella pneumophila

LEGIOLERTTM

• Fácil e rápido de executar – similar ao Colilert

• Resultados obtidos em 7 dias (para concluir negatividade das

amostras)

Detecta Legionella pneumophila: todos os serogrupos

Objectivo do estudo

Comparação entre LegiolertTM, ISO 11731:2018

e PCR em tempo real em amostras de água

potável e não potável

Métodos

Métodos

ISO 11731:2017: inoculação de amostra direta, tratamento ácido e calor em BCYE e GVPC

+

BCYE com cisteína

BCYE sem cisteína

Serogrupo

PCR: Concentração amostra + pretratamento viabilidade + extracção

Amplificação e detecção por PCR

Quantificação e Serogrupo

LEGIOLERTTM

Métodos – LegiolertTM Água Potável

100 mL amostra de água

Determinar dureza da água

Adicionar reagente

Legiolert à amostra de água

100mL Legiolert

+ amostra

100 mL amostra de água

Adicionar 0.33 ou 1mL suplemento

dureza

10

0 m

L

Contar @ 7 dia

=

Resultado

confirmado

Verter para Quanti-

Tray, selar, e

incubar a 39°C

Métodos – LegiolertTM Água não Potável

Contar @ 7 dia

=

Resultados

confirmado

Verter para Quanti-

Tray, selar, e

incubar a 37°C

100mL diluente estéril

Adicionar reagente Legiolert a

100 mL diluente estéril

Misturar 2 mL amostra com 2 mL

pretratamento; esperar 60 s

Pretratamento

Legiolert

Amostra de água

Adicionar 2 mL amostra de

água tratada

100mL Legiolert

+ Amostra

Resultados

Resultados

• Total de 177 amostras de água analisadas: 165 amostras de água potável e 12 amostras de água não potável

22

17

6

0

5

10

15

20

25

Legiolert PCR Cultura

% A

mos

tras

Positiva

s

Método

Percentagem Amostras Positivas

Resultados

Resultados – 1L volume

1L Legiolert

Total 177 Positivo Negativo

ISO 11731:2017 Positivo 11 1

Negativo 28 137

Legiolert

PCR Positivo 16 14

Negativo 23 124

ISO 11731:2017

PCR Positivo 12 18

Negativo 0 147

Resultados

28

44

28 28

0

10

20

30

40

50

Legiolert,

PCR e Cultura

Legiolert e

PCR

Legiolert e

Cultura

PCR e Cultura

% A

mos

tras

Pos

itiv

as

Métodos

Percentagem Amostras Positivas

Resultados

Teste de McNemar

Legiolert

Total 177 Positivo Negativo

ISO 11731:2017 X2-Valor 23,310 ρ = 1.0 x 10-6 (dif.)

Legiolert

PCR X2-Valor 1,73 ρ = 0.188 (n. dif.)

ISO 11731:2017

PCR X2-Valor - ρ = 8.0 x 10-6 (dif.)

Resultados

• Correlação quantitativa entre LegiolertTM e Cultura

(correlação Spearmans r = 0.377, n=53) • Correlação quantitativa forte entre PCR e Cultura

(correlação Spearmans r = 0.616, n=53)

Resultados

R = 0.379

Resultados

R2 = 0.617

Conclusões

Conclusões

• Detecção robusta de Legionella pneumophila, com baixa

interferência

• Não é necessária confirmação extra: positivo = confirmado

• Poucos falsos negativos

• Baixa subjectividade e baixa incerteza na contagem

• Range de contagem alargado, com poucos resultados

superiores ao limite máximo de contagem – não sendo,

portanto, necessário fazer novo teste da amostra

Conclusões

• Teste fácil de executar, reacção colorimétrica como

Colilert

• Aplicável a águas potáveis e não potáveis

• Técnica com elevado nível de reprodutibilidade e

repetibilidade

• No caso de investigações epidemiológicas, os poços podem

ser furados para isolamento de colónias

I just can't go with the flow anymore. I've been

thinking about joining a biofilm.