Desenvolvimento de uma

ELISA sensvel para a deteo

de agentes clarificantes

contendo casena

em vinhos tintos e brancos

Mafalda Queiroz

Mestrado em Controlo da Qualidade - Controlo Bioqumico

Ano letivo: 2014/2015

Trabalho baseado no artigo: Deckwart M., et all, Development of a Sensitive ELISA for the Detection of

Casein- containing Fining Agents in Red and White Wines, J. Agric Food Chem., 2014, 62, 6803-6812

Objetivos

O objetivo do artigo foi desenvolver mtodos ELISA sensveis para a deteo de casenas em vinhos brancos e tintos.

E investigar o risco de resduos de alergnios em vinhos filtrados.

Introduo

As reaes alrgicas a leite de vaca ocorrem

contra a frao de casena denominada Bos d8, j

para as principais protenas de soro de leite

so a -lactoalbumina (Bos d4) e a

-lactoglobulina (Bos d5).

A alergia ao leite de vaca (CMA), e ao ovo de galinha,

so as mais comuns em crianas (1 a 7,5%) Por outro lado a CMA em

adultos rara (0,1 a 0,5% ), mas pode ser fatal. A maioria das crianas

superam a CMA aos 3 anos de idade tornando-se CMA

tolerante.

So aplicados na clarificao, para eliminar efeitos

indesejveis sobre as caractersticas

organolticas do vinho. atravs de uma ligao

no covalente aos compostos fenlicos.

Desde 02 de julho de 2012, a OIV, determinou que a

aplicao de agentes clarificantes tais como a

casena e os produtos derivados do leite durante o processamento de vinho tem de ser marcado, se o

produto final contiver mais de 0,25 mg/L de protena e/ou outros alergnios.

O mtodo recomendado pela OIV para a deteo de resduos potencialmente alergnicos de agentes

clarificantes no vinho a ELISA com um limite de

deteo (LOD) 0.25 mg / L e um limite de

quantificao (LOQ) 0.5 mg / L.

As casenas so fosfoprotenas maioritariamente encontradas no leite.

Possuem um nmero varivel de radicais fosfato ligados serina (P-Ser).

As e as casenas possuem uma estrutura flexvel devido ao seu elevado teor em prolina.

So suscetveis protelise.

A casena a mais hidroflica por s apresentar um radical fosfato.

Podem ser separadas em 4 grandes grupos: , , e .

O ponto isoeltrico da casena 4.6.

Casenas

Clarificao A clarificao o processo que

elimina todas as impurezas em suspenso do vinho e o torna lmpido. Existem duas tcnicas de clarificao: a colagem e a filtrao.

Na colagem adiciona-se ao vinho um produto clarificante: gelatina, bentonite (argila), entre outros. O produto coagula e forma partculas que sedimentam. Estas partculas atraem e arrastam as impurezas.

Na filtrao o vinho passa por um filtro e as partculas e impurezas em suspenso ficam retidas no filtro.

Convm apenas referir que h um mtodo de clarificao natural denominado btonnage. Este consiste na remoo peridica de leveduras que se depositam no fundo do recipiente onde ocorre a fermentao, por isso pode demorar vrios meses.

Produo

do Vinho

Padres e

Amostras

Padro de identificao da Casena Merck Matriz de Calibrao KalCasin Amostras de produtos comerciais de agentes clarificantes para estudo (12): Agrovin Begerow Enartis Erbsloh Laffort Spindal Vason

Anticorpos Policlonais anti-caseinato de potssio

Anticorpos anti-coelho de cabra conjugado com HRP

ELISA Sandwich Indireta

Anticorpo policlonal anti-casena Bovina e Ovina

Anticorpos Antiovelhas conjugada com HRP.

Anticorpos

ELISA

Anticorpos Immunoblotting

Anticorpos anti-coelho de cabra conjugado com HRP

Amostras

de Vinho

Tratamento

( WW2) Vinho Branco Mueller Thurgau (vindima 2009)

( RW2) Vinho Tinto Regent (vindima 2009)

Mostos inoculados com

Saccharomyces cereviseae

fermentados a 16-18 C

Sem clarificao

Filtrao pr envasilhamento com filtro de 0.45 m

Filtrao estril

Clarificao com dose mxima permitida de Bentonite (40g

KalCasin/hL)

Clarificao com dobro da dose mxima permitida de Bentonite

(80g KalCasin/hL)

Filtrao estril pr envasilhamento

A bentonite, uma argila natural (silicato de alumnio hidratado), largamente utilizada na indstria enolgica, que quando transformado num gel vai possuir cargas negativas superfcie fazendo com que seja capaz de reagir com as protenas do vinho (carregadas positivamente ao ph do vinho.

Mtodos Padro de Casenas e Agentes clarificadores

solues de 10-13 mg / 50 mL com 10 mM de soluo de carbonato sob agitao num agitador horizontal por pelo menos de 30 min.

Eletroforese

As condies de desnaturao foram a 200 V

Com cido propanosulfnico como tampo de corrida

O gel de eletroforese NuPAGE Bis-Tris 12%

As solues de protena foram diludas 1: 2 com a amostra de LDS tampo, que continha ditiotreitol (DDT) por reduo. Cada pista estava carregado com 20 mL de soluo de amostra.

As Protenas

Fixao da Protenas com etanol a 30% e cido actico a 10% em gua durante 30 min

Incubao com uma soluo contendo 0,1% tiossulfato de sdio, 30% de etanol, e 6,8% de acetato de sdio em gua ocorreu durante 30 min. Isto foi seguido por um passo de lavagem com gua.

soluo de nitrato de prata (0,2% de prata nitrato e de formaldedo em gua a 0,02%) durante 20 min.

Desenvolvimento da cor carbonato de sdio a 2,5% e 0,01% de formaldedo em gua

Paragem da reao EDTA a 1,8% em gua

Colorao

Eletroforese em

gel de

poliacrilamida

utilizando o

tampo de

Dodessilsulfato

de ltio

Mtodos Immunoblotting LDS-PAGE

Transferncia foi para uma membrana de nitrocelulose Atravs de um Western Blot Semi-seco.

Membrana Seca Foi bloqueada com uma soluo de: 0,5% de monolaurato de polietileno-sorbitano , cloreto de sdio a 0,9%, e 0,6% de tris (hidroximetil) - aminometano (Tris). Para inibir a ligao no especfica.

Incubao da Membrana Anticorpos primrios : anti- caseinato de potssio (1/10000) Anticorpos secundrios: Anti-coelho marcados com HRP (1/20000) temperatura ambiente.

Colorao soluo contendo 0,06% de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), 0,2% de sulfossuccinato dioctilsdio (DONS), etanol a 25%, cido ctrico a 0,7%, e 1% de Na2HPO4 em gua. O marcador de peso protena foi corado pela adio de soluo de vermelho Ponceau.

Mtodos

ELISA

Quantitativa

Indireta

ELISA Sandwich

Indireta

Solues Usadas

Preparados por dissoluo

12,5 mg da respetiva substncia em 50 mL de 10 mM de soluo de carbonato sob agitao num agitador horizontal durante pelo menos 30 min.

Padres e Agentes Clarificadores

foram preparadas por diluio

ELISA Indireta tampo de carbonato (pH 9,6)

ELISA Sandwich tampo PBS-Tween 20 (pH 9,6)

Solues de Calibrao

Tampo Carbonato: 75 mM de Na2CO3 e NaHCO3 175 mM em gua bidestilada

Tampo Tris-Tween 20: Tris 50 mM, NaCl 150 mM e 0,5% de Tween 20 em gua bidestilada

Constituio dos Tampes

Tampo PBS-Tween 20: 10 mM de NaH2PO4 H2O, Na2HPO4 70 mM, NaCl 150 mM e 0,5% de Tween 20 em gua bidestilada.

Tampo cido Ctrico: (pH 4,0) 210 mM de mono-hidrato de cido ctrico e 300 mM de KOH em gua bidestilada.

Solues de Lavagem

Preparado de fresco

Com 5 mg de TMB, dissolvido em 125 mL de acetona e 1 mL cheio com metanol, 19 mL de soluo tampo de cido ctrico, e 200 L de H2O2 (1%).

Substrato

2 M H2SO4 em gua bidestilada

Soluo de Paragem

Mtodos

ELISA

Indireta

Protocolo

200 L de amostra/poo com tampo

Foram deixadas over night a 8-9C

Placa foi lava 3xs com 300 L de soluo de bloqueio/ poo.

Os locais livres foram bloqueados com 250L/poo com soluo de bloqueio durante 2h temperatura ambiente com agitao horizontal.

Lavagem da placa 3xs com 300L/poo de soluo de lavagem

placa de 96 poos

Incubao com 200L/poo com anticorpo primrio em PBS-Tween 20 (1: 10000) durante 1h com agitao temperatura ambiente

Lavagem 3xs da placa com 300L/poo de soluo de lavagem

Marcao com anticorpo primrio

200L / poo de anticorpo secundrio em soluo de lavagem (1: 2000) e incubou-se durante 1 hora, agitando temperatura ambiente.

Lavagem da placa 3xs com soluo de lavagem e 3xs com tampo de cido ctrico.

Marcao com anticorpo secundrio

Realizada com enzimas

Por adio de 200 L/ poo soluo de substrato (TMB)

Por oxidao catalisada da HRP-TMB, gera-se um composto azul

A reao foi parada aps 5 minutos por adio de 100L/poo soluo de paragem, o que leva a uma mudana de cor para amarelo

A medio ocorre a 450 nm com 630 nm como comprimento de onda de referncia.

Reao colorimtrica

Feita atravs de medio em vinho branco na diluio de 1/10 e 1/20 para vinho tinto.

Validao do Mtodo

Mtodos

ELISA

Sandwich

Indireta

Protocolo

200 L de anticorpo de captura/poo com tampo de revestimento (1/20000)

Foram deixadas over night a 8-9C

Placa foi lava 3xs com 300 L/ poo de soluo de bloqueio.

Os locais livres foram bloqueados com 250L/poo com soluo de bloqueio durante 2h temperatura ambiente com agitao horizontal.

Lavagem da placa 3xs com 300L/poo de soluo de lavagem

placa de 96 poos

Incubao com 200L/poo de amostra em estudo em PBS-Tween 20 durante 1h com agitao temperatura ambiente

Lavagem 1x da placa com 300L/poo de soluo de lavagem

Aplicao da amostra

200L / poo de anticorpo primrio em soluo de lavagem (1: 2000)

Lavagem da placa 3xs com soluo de lavagem

Marcao com anticorpo primrio

200L / poo de anticorpo secundrio em soluo de lavagem (1: 2000)

Incubao durante 1h com agitao horizontal.

Lavagem da placa 3xs com soluo de lavagem e 3xs com soluo de cido Ctrico

Marcao com anticorpo secundrio

Realizada com enzimas

Por adio de 200 L/ poo soluo de substrato (TMB)

Por oxidao catalisada da HRP-TMB, gera-se um composto azul

A reao foi parada aps 5 minutos por adio de 100L/poo soluo de paragem, o que leva a uma mudana de cor para amarelo

A medio ocorre a 450 nm com 630 nm como comprimento de onda de referncia.

Reao colorimtrica

Feita atravs de medio em vinho branco e tinto na diluio de 1/10

Validao do Mtodo

Resultados

LDS-PAGE

Figure 2. LDS-PAGE and silver-staining of the casein fining agents. MW, molecular weight (kDa); M, molecular weight marker; lanes 112, fining agents 112; Std, casein standard; BSA, bovine serum albumin (66.4 kDa); CAS, casein (1925 kDa); BLG, -lactoglobulin (18.3 kDa); ALA, -lactalbumin (14.2 kDa).

Resultados

Imunoblot

Figure 3. Immunoblot of the casein fining agents. MW, molecular weight (kDa); M, molecular weight marker; lanes 112, fining agents 112; Std, casein standard; BSA, bovine serum albumin (66.4 kDa); CAS, casein (1925 kDa); BLG, -lactoglobulin (18.3 kDa); ALA, - lactalbumin (14.2 kDa).

v

Resultados

Filtrao

Table 6. Results of the Fined Red (RW) and White (WW) Wines Using the Developed ELISA Methods, Indirect ELISA for WW, and Indirect Sandwich ELISA for RW, with Casein and KalCasin as Calibration Substance (A:40g/hL KalCasin, B: 80g/hL KalCasin)

Concluses um mtodo sensvel e consegue detetar tanto as casenas como outras protenas do leite em quantidades residuais.

Resultados confirmados pelas tcnicas de immunoblot e SDS-PAGE.

uma matriz complexa e verificam-se interferncias nas metodologias utilizadas.

As metodologias de filtrao e esterilizao mecnicas tambm eliminam por si s as casenas presentes nos agentes de clarificao do vinho.

Obrigado pela vossa ateno

Bibliografia Infovini, Vinho tranquilo [em linha].

Disponvel em, http://www.infovini.com/pagina.php?codNode=18100. Consultado em 19/02/2015

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Sgarbieri V. C., Review: Strucural and Physicochemical Properties of Milk Proteins, Brazilian Journal of Food Tehnology, 2005, 1, 43-56.

Lisitsyn N. A., et al, Methods of Protein Immunoanalysis, Molecular Biology, 2014, vol.48, n. 5, 624-633

Bentonites [em linha]. Disponvel em, http://www.proenol.pt/files/products/Bentonites_FT050-08.pdf, consultado em: 09/03/2015