• Experiências das aulas laboratoriais

• Fraccionamento celular:

• centrifugação diferencial

• centrifugação em gradiente de densidade

• Quantificação proteica

• Na+/K+ ATPase

• Definição dos grupos de trabalho.

BIOENERGÉTICA E

METABOLISMO

5 de Março de 2009

Aula Teorico/Prática

Sumário:

Experiências das aulas laboratoriais

Parte I

1- Homogeneização de um Tecido

2- Fraccionamento Celular por Centrifugação Diferencial e em

Gradiente de Densidade

3- Determinação da Concentração de Proteína da Fracção Sub-celular

Objectivos:

1) Proceder à separação de diferentes fracções subcelulares de

células de cérebro de rato por centrifugação diferencial e em

gradiente de densidade.

2) Determinar a concentração de proteína total da fracção

enriquecida em membranas plasmáticas sinápticas (SPM),

utilizando o método colorimétrico do Reagente de Biureto.

Células eucarióticas: plantas versus animais

As células eucarióticas possuem uma variedade de

organelos, que podem ser isolados para posterior

estudo de função na célula, sendo esse o objectivo

do trabalho prático proposto no âmbito da disciplina

de Bioenergética e Metabolismo

Como podemos fazer esse isolamento?

Fraccionamento celular

> Isolamento e identificação de organelos celulares

ou macromoléculas com vista ao seu estudo

bioquímico

1. homogeneização do tecido ou da suspensão

celular, conduzindo à ruptura das células e à

libertação dos núcleos, mitocôndrias, lisossomas,

etc

2. separação e purificação dos diferentes

organelos recorrendo a centrifugações diferenciais

e/ou em gradiente

Homogeneização

> Primeiro passo do processo

de fraccionamento

> A membrana plasmática

é rompida em condições que

não conduzem à destruição dos

componentes internos da célula

Exs:

- Sonicação (sons de elevada frequência)

- Esferas de vidro

- Potter-helvehjein

- Ultra-Turrax

- Waring-blender

- French press

Fraccionamento celular

Centrifugação diferencial

> Técnica proposta em 1940 por

Albert Claude, Christian de Duve e

colaboradores para separar

componentes celulares com base

no seu tamanho e densidade

Fraccionamento celular

Centrifugação em gradiente de densidade

> Para se conseguir um grau

de purificação mais elevado

> Os organelos são separados

por sedimentação através de um

gradiente de uma substância densa

(ex. Sacarose, ficoll), diferencial de

densidade

> Partículas de diferentes

tamanhos sedimentam através do

gradiente a taxas diferentes,

movendo-se como bandas discretas

Os organelos sedimentam até que a

sua densidade seja igual a do

gradiente

Fraccionamento celular

Fraccionamento celular

UltracentrifugaçãoAté 100 000 rpm

Fraccionamento Sub-celular

Quantificação da proteina pelo

método do Biureto

The Biuret assay is a copper ion based protein assay, protein

solutions are mixed with an alkaline solution of copper salt, cupric

ions (Cu2+). The protein assay is based on the interaction of cupric

ions with protein in an alkaline solution. The interaction of cupric

ions (Cu2+) with protein results in a purple color that can be read at

540nm. The amount of color produced is proportional to protein

concentration.

Construção duma curva padrão com

BSA (Albumina do soro de Bovino) – D.O. 540 nm

“Problems Based Learning (PBL)”

PBL1: Explique qual a diferença entre o fraccionamento celular por centrifugação diferencial e por centrifugação em gradiente de densidade?

PBL2: Uma vez isolada uma determinada fracção sub-celular que métodos o investigador poderá utilizar para caracterizar a pureza da fracção?

Parte II

• DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE DA NA+/K+ ATPASE EM

MEMBRANAS PLASMÁTICAS SINÁPTICAS ISOLADAS DE

CÉREBRO DE RATO

Objectivo:

• Determinar a actividade da Na+/K+- ATPase em membranas

plasmáticas (SPM-isoladas do cérebro de rato), pela análise

do fosfato resultante da hidrólise de ATP, em diferentes

condições experimentais, utilizando uma curva padrão de

fosfato.

Experiências das aulas

laboratoriais

Figura - Por cada molécula de ATP hidrolisada dentro da célula, são bombeados 3

Na+ para fora e 2 K+ para dentro, contra os respectivos gradientes de

concentração. O inibidor específico desta bomba (uabaína) compete com o K+ pelo

mesmo local de ligação na enzima, no exterior da célula.

Bomba NA+/K+ ATPASE

O gradiente de Na+ produzido pela actividade da bomba Na+/K+, regula indirectamente o volume

celular e o potencial de membrana. Em células nervosas electricamente activas, a Na+/K+- ATPase

tem por função restabelecer o potencial de repouso depois de cada ciclo de despolarização, pelo

que cerca de 2/3 da energia total, utilizada por estas células, é consumido na actividade desta

enzima.

Bomba NA+/K+ ATPASE

Objectivo:

Determinar a actividade da Na+/K+- ATPase em membranas plasmáticas (isoladas do

cérebro de rato), pela análise do fosfato resultante da hidrólise de ATP, em

diferentes condições experimentais, utilizando uma curva padrão de fosfato.

Quantificação do fosfato

(Pi) pelo Reagente de

Molibdato (D.O. 660 nm).

A quantidade de fosfato será proporcional

à quantidade de ATP hidrolisado resultante

da actividade da Na+/K+- ATPase

nas membranas plasmáticas

“Problems Based Learning (PBL)”

PBL3: Porque razão se faz a determinação da actividade da

bomba Na+/K+ ATPase nas membranas plasmáticas

sinápticas?

PBL4: Que tipo de transporte membranar se dá na Na+/K+

ATPase nas membranas plasmáticas sinápticas?