Aluna: Ana Paula Segantin GaspariRibeiro Preto/2014

INTRODUODesenvolvimento de metalo-frmacos

Desenvolvimento de frmacos que interajam com stios especficos

Cisplatina: busca por frmacos que possam ser utilizados em tratamentos de tumores resistentes a ela.

DNA: intercalao com complexos distorce forma helicoidal (inibio da replicao de enzimas)

Variao de ligantes: diferentes interaes com o DNA.

MTODOSSntese e caracterizao dos complexos

Estudo da ligao dos complexos ao DNA (timo de bezerro) CT-DNA

- Espectros de absoro do CT-DNA na ausncia e presena dos complexos em tampo tris-HCl (pH = 7,2).

- Estudos de luminescncia na presena de brometo de etdeo: competio pela interao com o DNA.

MTODOS Estudo da interao dos complexos a uma protena (albumina de soro bovino). Por que albumina?

Abundncia no sangue

Interao com frmacos

Transporte de ons metlicos, complexos pela corrente sangunea

Ligao reversvel endgenos e exgenos

Mudanas no espectro de emisso do triptofano mudana de conformao.

MTODOSLigao dos complexos a protena (albumina de soro bovino)

- Anlise da intensidade de emisso de resduos de triptofano (excitao em 280 nm e emisso em 345 nm) ao adicionar os complexos em tampo fosfato.

Estudos de citotoxicidade

-Teste MTT em clulas HeLa (cncer cervival humano) e clulas sadias NIH3T3 (fibroblasto embrionrio de rato)

RESULTADOS E DISCUSSO

Snteses[Ru(H)(Cl)(CO)(PPh3)3] + MeOH

Refluxo por 12hcis-[RuCl2(DMSO)4] +MeOH

Refluxo por 12h

Espectroscopia Uv-vis com adio de quantidades crescentes de DNA (titulao)Adio do CT-DNA solues dos complexos fazendo-se fatores de correo para no terem erros devido diluio.

Duas Hipteses:

Deslocamento para a regio IV (batocrmico) e diminuio das bandas (hipocrmico) Interao via intercalao

Deslocamento da a regio UV (hipsocrmico) e aumento das bandas (hipercrmico) Interao eletrostticaWang, H.F., Shen, R. e Tang, N. European Journal of Medicinal Chemistry, 44 (2009) 4509-4515

Espectroscopia Uv-vis com adio de quantidades crescentes de DNA- Diminuio das bandas e pequeno desvio para IV (2 nm) com adio de CT-DNA: intercalao.

Ligante (Ci = 25 M)Complexo 1 (Ci = 25 M)Complexo 2 (Ci = 25 M)

AbsorbnciaAbsorbnciaAbsorbncia*CT-DNA variando de 0 a 40 M

Clculos das constantes de ligao intrnseca

Kb = 1,4 x104 L mol-1 (HL)Kb = 4,11 x 104 L mol-1 (Complexo 1)Kb = 9,90 x104 L mol-1 (Complexo 2)

Complexo 2 > Kb devido ao maior efeito hidrofbico de complexos que contm DMSO.

Ligantes: tamanho e forma interferem na fora da ligao com o DNA.AFINIDADEComplexos > Ligante livreComplexo 2 > Complexo 1

Ensaios de Fluorescncia: confirmao da interao por via intercalativa - brometo de etdeo (BE)

BE forma complexos com cidos nuclicos e possuem intensa fluorescncia na presena de DNA, devido intercalao.

- Verificao da supresso da fluorescncia: competio pelo stio de ligao. Confirmao da interao via intercalao.

Ensaios de Fluorescncia: confirmao da interao por via intercalativa - brometo de etdeo (BE)Intensidade de emissoIntensidade de emissoIntensidade de emissoliganteComplexo 1Complexo 2Clculo da constante de Stern-Volmer para obteno de Kq (quenching constant)[BE] = 7,5 M / [DNA] = 7,5 M / [COMPLEXOS] = 0 16 M

Clculos das constantes de supressoKq = 1,73 x102 L mol-1 (HL)Kq = 1,55 x 103 L mol-1 (Complexo 1)Kq = 8,26 x105 L mol-1 (Complexo 2)

Supresso da fluorescncia do BE ocorre devido competio pela intercalao com o DNA

ComprovaoAFINIDADEComplexos > Ligante livreComplexo 2 > Complexo 1

Estudo da Interao dos complexos com a albuminaIntensidade de emissoIntensidade de emissoIntensidade de emissoCondies: Albumina: 1 M, ex = 280 nm e em = 345 nm.Ligante, Complexo 1 e 2 = 0-12 M

Aumento da concentrao do ligante, complexo 1 e 2 SupressoLiganteComplexo 1 Complexo 2

Clculos das constantes de supressoKb = 4,4 x103 L mol-1 (HL)Kb = 2,02 x104 L mol-1 (Complexo 1)Kb = 3,40 x 105 L mol-1 (Complexo 2)

Complexo 2 > Kb devido ao maior efeito hidrofbico de complexos que contm DMSO, maior interao com a protena.AFINIDADEComplexos > Ligante livreComplexo 2 > Complexo 1

CitotoxicidadeTestes MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) determinao colorimtrica de viabilidade celular.

Somente clulas vivas reduzem o reagente amarelo (MTT) ao produto azul (formazan).

IC50 = concentrao requerida do complexo para levar 50% das clulas morte.

Citotoxicidade

ConclusoComplexo 2 apresenta uma maior afinidade pelo DNA e pela albumina, e tambm apresenta melhores resultados de citotoxicidade.

Ambos os complexos so ativos contra clulas cancergenas, mas no so ativos contra linhagens sadias.

Obrigada =)