Appl. Environ. Microbiol. 1987 Pyne 2844 8
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8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1987 Pyne 2844 8
1/6
1987, 53(12):2844.Appl. Environ. Microbiol.
Bary W. WilsonJohn W. Pyne Jr., Dorothy L. Stewart, James Fredrickson and
Coriolus versicolorFraction fromSolubilization of Leonardite by an Extracellular
http://aem.asm.org/content/53/12/2844Updated information and services can be found at:
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8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1987 Pyne 2844 8
2/6
V o l .
5 3 ,
N o .
1 2
P P L I E D AND
ENVIRONMENTAL
M I C R O B I O L O G Y ,
D e c .
1 9 8 7 ,
p . 2 8 4 4 - 2 8 4 8
0 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 7 / 1 2 2 8 4 4 - 0 5 0 2 . 0 0 / 0
C o p y r i g h t
1 9 8 7 ,
A m e r i c a n
S o c i e t y
f o r
M i c r o b i o l o g y
S o l u b i l i z a t i o n o f L e o n a r d i t e
b y
an E x t r a c e l l u l a r
F r a c t i o n
f r o m
C o r i o l u s
v e r s i c o l o r
JOHN
W.
PYNE, J R . , *
DOROTHY
L .
S T E W A R T ,
JAMES
FREDRICKSON,
AND BARY
W
WILSON
B a t t e l l e , P a c i f i c N o r t h w e s t
L a b o r a t o r i e s , R i c h l a n d , W a s h i n g t o n
9 9 3 5 2
R e c e i v e d
3
J u n e
1 9 8 7 / A c c e p t e d
1 0
S e p t e m b e r
1 9 8 7
C o r i o l u s
v e r s i c o l o r h a s
p r e v i o u s l y
b e e n
s h o w n
t o
d e g r a d e l e o n a r d i t e ,
an
o x i d i z e d
form o f
l i g n i t e .
A n
e x t r a c e l l u l a r
f r a c t i o n
c o n t a i n i n g
p r o t e i n p u r i f i e d
f r o m
a C .
v e r s i c o l o r
c u l t u r e
s o l u b i l i z e d
l e o n a r d i t e i n
v i t r o .
E x p r e s s i o n o f
t h e
a c t i v i t y
d i d
n o t
r e q u i r e
t h e
p r e s e n c e
o f l e o n a r d i t e
a n d
a p p e a r e d
d u r i n g
i d i o p h a s e . D u r i n g
i o n - e x c h a n g e
a n d
g e l
f i l t r a t i o n c o l u m n
c h r o m a t o g r a p h y ,
l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t y
e l u t e d
w i t h
s y r i n g a l d az i ne o x i da s e
a c t i v i t y
a n d w i t h
p r o t e i n ,
as
m e a s u r e d
b y
A 2 8 0
a n d
t h e b i u r et
p r o t e i n
a s s a y .
S y r i n g a l d a z i n e
i s a
s u b s t r a t e
o f t h e
p o l y p h e n o l
o x i d a s e
f o r m e d
b y
C . v e r s i c o l o r .
C o m p a r i s o n
o f
l e o n a r d i t e -
b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t y
w i t h
t h e
e f f e c t s o f
c h e l a t o r s a n d s u r f a c e - a c t i v e
a g e n t s
o n
l e o n a r d i t e
showed
t h a t
b i o s o l u b i l i z a t i o n
w as
n o t d u e t o e i t h e r
s u r f a c t a n t
o r
c h e l a t i n g
a b i l i t y .
H e a t t r e a t m e n t o f t h e
p r e p a r a t i o n
a t
6 0 C
f o r
3 0 m i n
s i g n i f i c a n t l y
r e d u c e d b o t h
s y r i n g a l d a z i n e
o x i d a s e
a n d
l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t i e s .
C y a n i d e ,
a z i d e ,
a n d
t h i o g l y c o l a t e , w h i c h ar e
known i n h i b i t o r s o f
s y r i n g a l d a z i n e
o x i d a s e
a c t i v i t y
o f C .
v e r s i c o l o r ,
a l s o
i n h i b i t e d l e o n a r d i t e
b i o s o l u b i l i z a t i o n .
From t h e s e
d a t a ,
we c o n c l u d e t h a t t h e
p u r i f i e d
p r o t e i n
f r a c t i o n f r o m
C .
v e r s i c o l o r
c o n t a i n s
a
s y r i ng a l d a zi n e o x i d as e
a c t i v i t y
t h a t p a r t i c i p a t e s
i n
l e o n a r d i t e
b i o s o l u b i l i z a t i o n
b y
e n z y m a t i c
a c t i o n .
M i c r o b i a l
b i o s o l u b i l i z a t i o n , a s e v i d e n c e d
b y t h e f o r m a t i o n
o f
d i s c r e t e p r o d u c t d r o p l e t s
f r o m l o w - r a n k c o a l
b y C o r i o l u s
v e r s i c o l o r
a n d
P o r i a m o n t i c o l a , was
f i r s t
r e p o r t e d
b y
C o h e n
a n d G a b r i e l e
( 2 )
a n d h a s
s i n c e
b e e n c o n f i r m e d
a n d
e x t e n d e d
t o
i n c l u d e C a n d i d a
s p .
s t r a i n M L 1 1 3 ,
P e n i c i l l i u m
w a k s -
m a n i i , S p o r o t h r i x
s p . , A s p e r g i l l u s s p .
( 9 ) , S t r e p t o m y c e s s p .
8 , B j e r k a n d e r a a d u s t a , P o r i a
p l a c e n t a , a n d Fomes a n -
n o s u s
( 1 0 ) .
T h e
t e r m
b i o s o l u b i l i z a t i o n h a s b e e n c o i n e d t o
e m p h a s i z e
t h e
m e t a b o l i c
o r i g i n
o f
t h e
s o l u b l e p r o d u c t . I n
n a t u r e ,
many
f u n g i u s e
c o m p l e x
p l a n t o r g a n i c
m o l e c u l e s
a s
s o u r c e s
o f
c a r b o n a n d
e n e r g y ,
a n d some
f u n g i
a r e
p r o m i n e n t
l i g n i n
d e g r a d e r s ,
w h i c h
m ay
a c c o u n t
f o r
t h e i r a b i l i t y t o
d e g r a d e
l o w - r a n k
c o a l s .
T h e
m a t e r i a l
u s e d
b y C o h e n
a n d
G a b r i e l e
( 2 )
i n
t h e i r
i n i t i a l
w o r k w a s
p r e s e n t
a s a n
o v e r b u r d e n t o
a l i g n i t e d e p o s i t a n d
w a s c o n s i d e r e d a
l e o n a r d i t e ( 4 ) . T h e p r o d u c t f o r m e d
b y t h e
a c t i o n o f
C . v e r s i c o l o r o n l e o n a r d i t e i s a
w a t e r - s o l u b l e
m a t e r i a l t h a t i s
d a r k
b r o w n
o r b l a c k .
T h i s m a t e r i a l i s
v e r y
a n i o n i c a n d
w e a k l y a c i d i c a n d c o n t a i n s
b o t h a r o m a t i c
a n d
a l i p h a t i c
p r o t o n s
i n a b o u t
a 1 : 1
p r o p o r t i o n .
A p p r o x i m a t e l y
85 o f
t h e
p r o d u c t
h a s
a
m o l e c u l a r m a s s
g r e a t e r t h a n
5 0 , 0 0 0
d a l t o n s a t
pHs 3
a n d
6 . 4 . A t p H 1 0 . 4 ,
40
o f
t h e
s o l u t e
h a s
a
m o l e c u l a r m a s s
g r e a t e r t h a n
5 0 , 0 0 0 d a l t o n s , a n d a b o u t
45
h a s
a
m o l e c u l a r m a s s b e t w e e n
1 0 , 0 0 0 a n d
5 0 , 0 0 0
d a l t o n s .
M e t a l
i o n s a r e
i m p o r t a n t e l e m e n t s
i n
t h e s t r u c t u r e o f
l o w - r a n k
c o a l s
( 5 ) , a n d t h e
c e l l - f r e e b i o s o l u b i l i z a t i o n
o f
c o a l
m ay
b e d u e
o n l y
t o
c h e l a t i o n . A
s e c o n d p o s s i b l e r o l e
o f
t h e
c e l l
e x t r a c t
i s
a s
a
s u r f a c t a n t .
A
p r o t e i n
f r a c t i o n
f r o m
P s e u d o m o n a s
f l u o r e s c e n s
l o w e r s s u r f ac e t e ns i o n a n d i n -
c r e a s e s
c o a l
s o l u b i l i t y
( R .
M.
F a k o u s s a , P h . D .
t h e s i s ,
F r i e d r i c h - W i l h e l m s
U n i v e r s i t y ,
B o n n ,
F e d e r a l
R e p u b l i c o f
G e r m a n y ,
1 9 8 1 ) .
T h e
r e s u l t s
p r e s e n t e d h e r e s h o w
t h a t
t h e
b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t y
o f C . v e r s i c o l o r
i s d u e
n e i t h e r
t o
c h e l a t i o n
n o r t o
s u r f a c t a n t c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e c e l l
e x t r a c t ,
b u t
r a t h e r
t o
a n o t h e r
m e c h a n i s m s u c h a s e n z y m a t i c b o n d
c l e a v a g e .
A
l a c c a s e l i k e
a c t i v i t y m ay
b e i n v o l v e d
i n
*
C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .
b i o s o l u b i l i z a t i o n
b y
C . v e r s i c o l o r
( 1 1 ) .
T h i s
a r t i c l e
p r e s e n t s
f u r t h e r
e v i d e n c e
s u p p o r t i n g
t h e
p a r t i c i p a t i o n
o f
l a c c a s e l i k e
a c t i v i t y
i n
b i o s o l u b i l i z a t i o n o f l e o n a r d i t e
b y
a n
e x t r a c e l l u l a r
f r a c t i o n .
M A T E R I A L S AND
M E T H O D S
M a t e r i a l s . C . v e r s i c o l o r ATCC 1 2 6 7 9 a n d
p r o d u c t
d e r i v e d
f r o m
f u n g a l a c t i o n o n
l e o n a r d i t e
w e r e
g i f t s o f
M a r t i n
C o h e n
o f t h e
U n i v e r s i t y
o f
H a r t f o r d .
L e o n a r d i t e
was o b t a i n e d
f r o m
A m e r i c a n
C o l l o i d
C o . ,
S k o k i e ,
I l l .
D E A E - c e l l u l o s e
( M a t r e x -
C e l l u f i n e
A M ) ,
G C - 2 0 0 M a t r e x - C e l l u f i n e f o r
g e l
f i l t r a t i o n ,
a n d
u l t r a f i l t r a t i o n
m e m b r a n e s
w e r e o b t a i n e d
f r o m A m i c o n
C o r p . ,
L e x i n g t o n ,
M a s s .
P i r i c u l a r i a
o r y z a e
l a c c a s e
w a s
f r o m
S i g m a
C h e m i c a l
C o . ,
S t .
L o u i s ,
M o .
P r o t e i n a s e K
( 2 0
U / m g )
was
f r o m
S i g m a .
B o v i n e
p a n c r e a s t r y p s i n ( 2 , 9 1 6
U / m g )
a n d
t h r e e - t i m e s - c r y s t a l l i z e d
p o r c i n e
s t o m a c h
m u c o s a l
p e p s i n
( 2 , 7 0 0
U / m g ) w e r e o b t a i n e d
f r o m
C a l b i o c h e m -
B e h r i n g ,
La
J o l l a ,
C a l i f . B u f f e r s
a n d o t h e r
i n o r g a n i c
a n d
o r g a n i c
s a l t s w e r e o f
r e a g e n t - g r a d e
q u a l i t y o r
b e t t e r .
D e t e r m i n a t i o n o f
l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t y .
An i n
v i t r o
a s s a y
w a s u s e d
t o m e a s u r e
l e o n a r d i t e b i o s o l u b i l i z a t i o n .
L e o n a r d i t e w a s
g r o u n d t o
p a s s a 2 8 - m e s h
s i e v e ,
a n d
1 0 - m g
s a m p l e s
w e r e
p l a c e d i n
s e p a r a t e c u l t u r e
t u b e s , w h i c h
w e r e
l o o s e l y
c a p p e d
a n d a u t o c l a v e d
a t
1 2 1 C
f o r 1 5 m i n .
A u t o c l a v e d
l e o n a r d i t e s a m p l e s w e r e
c o o l e d a n d u s e d
i m m e -
d i a t e l y
o r s t o r ed
a t
5 C
u n t i l
n e e d e d .
T h e
t o t a l
v o l u m e
o f
t h e
a s s a y
m i x t u r e was 1
m l ,
a n d
t h e m n i x t u r e c o n t a i n e d 0 . 1 m m ol
o f
s o d i u m
p h o s p h a t e
a t
p H 5 . 2 . T h e
a s s a y
m i x t u r e w a s
i n c u b a t e d a t t h e
d e s i r e d
t e m p e r a t u r e
w i t h
m a n u a l m i x i n g
e v e r y
3
m i n .
M i x i n g
was
k e p t
g e n t l e
t o
k e e p
p a r t i c l e s
s u s p e n d e d
b u t
o f f
t h e t e s t t u b e
w a l l s . A f t e r
i n c u b a t i o n , t h e
m i x t u r e
w a s
b r i e f l y c e n t r i f u g e d
a t 3 , 0 0 0
x
g
i n
a b e n c h t o p
c l i n i c a l
c e n t r i f u g e f o r 3 0
s
t o
s e p a r a t e t h e c o a l
f r o m t h e
l i q u i d .
An
a l i q u o t
o f
t h e s u p e r n a t a n t
w a s d i l u t e d i n w a t e r ,
a n d
i t s
A 2 9 0
was
m e a s u r e d
s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y . T h e
a b s o r b a n c e s o f a b l a n k
l a c k i n g
e n z y m e
a n d
a n
e n z y m e
b l a n k
w e r e
s u b t r a c t e d
f r o m
t h e a b s o r b a n c e
o f t h e r e a c t i o n m i x -
2 8 4 4
-
8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1987 Pyne 2844 8
3/6
E X T R A C E L L U L A R
SOLUB IL IZ A T I O N OF
LEONARDITE
O L .
5 3 ,
1 9 8 7
2 . 7
~
N
A
1 . 8
-
I
D
0 . 9
_
O _C
20 0
25 0 30 0
35 0
W a v e l e n g t h
( n m )
40 0
45 0
F I G . 1 . A b s o r p t i o n s p e c t r a o f
r e a c t i o n b u f f e r s a n d r e a c t i o n
p r o d -
u c t .
T h e
U V - v i s i b l e s p e c t r a
o f
l a c c a s e
assay b u f f e r s ar e
c o m p a r e d
w i t h t h e
spectrum o f
t h e
b i o s o l u b i l i z a t i o n p r o d u c t .
A ,
0 . 1
M s o d i u m
p h o s p h a t e ,
p H
5 . 2 ; B , 0 . 1 M s o d i u m
c i t r a t e , p H 5 . 2 ; C ,
0 . 1 M
MES,
p H
5 . 2 ;
a n d
D ,
8
, u g o f f u n g a l l y
p r o d u c e d
p r o d u c t
p e r
m l .
t u r e .
T h i s c o r r e c t e d a b s o r b a n c e was
t h e v a l u e r e p o r t e d f o r
t h e
a c t i o n o f t h e a c t i v e
f r a c t i o n . A t
p H 5 . 2 ,
t h e
0 . 1
M
p h o s p h a t e
b u f f e r
c a u s e d
v e r y
l i t t l e
s o l u b i l i z a t i o n
o f
l e o n a r -
d i t e .
P r e p a r a t i o n
o f
c r u d e f r a c t i o n
b i o s o l u b i l i z i n g
l e o n a r d i t e .
C .
v e r s i c o l o r
was
grown i n
a
Chemap
C F - 2 0 f e r m e n t o r
a t
2 5 C
s u p p l i e d
w i t h
4
l i t e r s
o f f i l t e r e d a i r p e r
m i n
a t a t m o s p h e r i c
p r e s s u r e a n d w i t h 1 5
l i t e r s o f
g r o w t h
m e d i u m .
T h e
g r o w t h
medium
u s e d
was
t h a t
r e p o r t e d b y F a h r a e u s
a n d R e i n h a m -
mar
( 3 ) .
A
s t a n d a r d
t w o - s t a g e R u s h t o n t u r b i n e ( s i x - b l a d e )
a g i t a t o r
system
was
u s e d a t a
s p e e d o f 4 0 0
r p m .
I n o c u l a
f o r
t h e
f e r m e n t o r w e r e
t h r e e 5 0 - m l S a b o u r a u d
m a l t o s e b r o t h
c u l t u r e s
o f C .
v e r s i c o l o r grown f o r 7 t o
1 0
d a y s a t
2 3 C
w i t h
no
a g i t a t i o n ( 2 ) .
H y p h a l
mats were
t r a n s f e r r e d t o
a 5 0 0 - m l
E r l e n m e y e r
f l a s k
w i t h a
g r o u n d - g l a s s
f i t t i n g c o n t a i n i n g
2 0 0
m l
o f
d i s t i l l e d water a n d
1 0 0
m l
o f 3 - m m - d i a m e t e r g l a s s
b e a d s
a n d
were s h a k e n
v i g o r o u s l y . M y c e l i a l
f r a g m e n t s w e r e
t h e n
t r a n s f e r r e d t o t h e
f e r m e n t o r . A f t e r
3
d a y s o f
g r o w t h ,
0 . 3
m l
o f
2 , 5 - x y l i d i n e
was
a d d e d
t o
i n c r e a s e
t h e
l e v e l s
o f
e x t r a c e l l u l a r l a c c a s e
a c t i v i t y ( 3 ) .
The
p r o d u c t i o n
o f
e x t r a c e l -
l u l a r
e n z y m e s
was
m o n i t o r e d
b y m e a s u r i n g
s y r i n g a l d a z i n e
o x i d a s e
a c t i v i t y
i n
t h e
c u l t u r e
b r o t h
w i t h 7 . 5
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a l d a z i n e i n
a
0 . 1 M
c i t r a t e - p h o s p h a t e
b u f f e r
( p H
5 . 2 )
( 1 ) o r a
0 . 1
M
p h o s p h a t e
b u f f e r
( p H
5 . 2 )
( 6 ) . P r o t e i n
l e v e l s
w e r e
d e t e r m i n e d
b y
t h e
b i u r e t
method
( 7 ) .
A t 7
d a y s
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i n o c u l a t i o n ,
t h e
f e r m e n t a t i o n
b r o t h was
s e p a r a t e d
f r o m
t h e
C .
v e r s i c o l o r
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b y
f i l t r a t i o n
t h r o u g h
t h r e e
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o f c h e e s e c l o t h . The r e s u l t a n t f l u i d was
t h e n f i l t e r e d
t h r o u g h
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u l t r a f i l t r a t i o n membrane w i t h
a
m o l e c u l a r
w e i g h t
c u t o f f
o f
1 0 0 , 0 0 0 ( H 5 P 1 0 0 - 4 3 ; A m i c o n ) .
The
h i g h - m o l e c u l a r - w e i g h t
m a t e r i a l i n t h e e x t r a c e l l u l a r
f l u i d
was
c o n c e nt r a t e d w i t h an
u l t r a f i l t r a t i o n membrane w i t h
a
m o l e c u l a r
w e i g h t
c u t o f f o f
1 0 , 0 0 0 ( H 5 P 1 0 - 4 3 ; A m i c o n ) .
The
r e s u l t i n g
r e t e n t a t e
( 1
l i t e r )
was
f i l t e r e d
b y
d i a l y s i s
w i t h
t h r e e
3 0 0 - m i
p o r t i o n s
o f
d e i o n i z e d
w a t e r w h i l e
b e i n g
c o n t i n u a l l y
p a s s e d
t h r o u g h
t h e membrane t o m a i n t a i n
a
c o n s t a n t volume
o f
1
l i t e r . The r e t e n t a t e
was
c l a r i f i e d
b y
c e n t r i f u g a t i o n
a t
6 , 0 0 0
x
g
f o r 1 0
m i n .
The
r e s u l t i n g
s u p e r n a t a n t
was
a p p l i e d
t o a
D E A E - c e l l u l o s e
c o l u m n
( 2 b y
3 0
c m )
t h a t
h a d b e e n
e q u i l i b r a t e d
w i t h
0 . 0 1
M
s o d i u m
p h o s p h a t e
b u f f e r
( p H
7 . 0 ) .
The
c o l u m n
was
f i r s t washed
w i t h 1 0 0
m l o f
0 . 0 1
M
s o d i u m
p h o s p h a t e
b u f f e r
( p H
7 . 0 ) ,
and
t h e n
a d s o r b e d
p r o t e i n
was
e l u t e d
f r o m
t h e
column w i t h a l i n e a r
g r a d i e n t
o f
2 0 0 ml
o f
0 . 0 1 M
s o d i u m
p h o s p h a t e
( p H 7 . 0 )
and 2 0 0
ml
o f
0 . 5 M
s o d i u m c h l o r i d e - 0 . 0 1
M
sodium
p h o s p h a t e ( p H
7 . 0 ) .
T h i s
p u r i f i c a t i o n
s c h e m e f o l l o w e d
t h a t o f B o l l a g a n d
L e o n o w i c z
( 1 ) . T h e i r p u r i f i c a t i o n
s y s t e m y i e l d e d
a p r o t e i n p r e p a r a t i o n
t h a t
w a s h o m o g e n e o u s b y
c e t y l p y r i d i n i u m
b r o m i d e - p o l y -
a c r y l a m i d e
e l e c t r o p h o r e s i s . T h e s y r i n g a l d a z i n e
o x i d a s e -
c o n t a i n i n g
f r a c t i o n
was f r o z e n a t
- 1 5 C
u n t i l
u s e d ;
i t r e -
t a i n e d
1 0 0 %
o f
i t s
a c t i v i t y a f t e r s e v e r a l
m o n t h s o f
s t o r a g e
a t
t h a t
t e m p e r a t u r e .
RESULTS
A N D
DISCUSSION
L e o n ar d it e , a n
o x i d i z e d f o r m o f
l i g n i t e ( 1 1 ) , w a s t h e
s u b s t r a t e f o r
t h e b i o s o l u b i l i z i n g a c t i v i t y
o f a n e x t r a c e l l u l a r
f r a c t i o n
o b t a i n e d
f r o m
C . v e r s i c o l o r .
T h e c e l l - f r e e
r e a c t i o n
w a s f u r t h e r c h a r a c t e r i z e d
t o
d e v e l o p
a
d e p e n d a b l e
i n v i t r o
a s s a y
f o r
s t u d y i n g t h e
o p t i m i z a t i o n
a n d
m e c h a n i s m s o f t h e
a c t i v i t y o f
t h e c e l l e x t r a c t . F i g u r e 1
s h o w s
t h e
U V - v i s i b l e
s p e c t r u m o f t h e
b i o s o l u b i l i z a t i o n
p r o d u c t
o b t a i n e d
b y
t h e
a c t i o n
o f
C .
v e r s i c o l o r
c u l t u r e s g r o w n
i n t h e p r e s e n c e
o f
l e o n a r d i t e . A l s o s h o w n
i n F i g . 1 a r e t h e
s p e c t r a o f b u f f e r s
c o m m o n l y
u s e d
t o
a s s a y l a c c a s e a c t i v i t y , i n c l u d i n g 0 . 1
M
M E S
( m o r p h o l i n e e t h a n e s u l f o n i c
a c i d ) ( 5 ) ,
0 . 1
M c i t r a t e , a n d
0 . 1
M
p h o s p h a t e
( 1 ) .
From
t h e s e s p e c t r a , i t
i s
c l e a r t h a t
a
w a v e l e n g t h
o f 2 9 0 nm o r a b o v e
w o u l d b e u s e f u l f o r
t h e
a s s a y .
A t
w a v e l e n g t h s
- 2 9 0 n m , c o n s i d er a b l e p r o d u c t
a b s o r b a n c e i s
e v i d e n t ,
w h i l e
b a c k g r o u n d
a b s o r b an c e d u e
t o
b u f f e r
i s m i n i m a l .
T a b l e
1 s h o w s
A 3 5 0
o f
l e a c h a t e s
f r o m
r e p r e s e n t a t i v e
c o a l s w i t h p h o s p h a t e ,
c i t r a t e ,
a n d
a c e t a t e
b u f f e r s . T h e
p h o s p h a t e b u f f e r
was
c h o s e n f o r
r o u t i n e
u s e
b e c a u s e o f
i t s
l o w s o l u b i l i z i n g e f f e c t o n
l e o n a r d i t e
a n d
i t s l o w
a b s o r b a n c e
i n t h e
s p e c t r a l
r e g i o n w h e r e
t h e
p r o d u c t a b s o r b s
s t r o n g l y .
T h e
e n z y m e
p r e p a r a t i o n
u s e d was a
f r a c t i o n o b t a i n e d
f r o m D E A E - c e l l u l o s e
b y
t h e
p r o c e d u r e o f B o l l a g a n d
L e o n o w i c z
( 1 )
f o r t h e i s o l a t i o n
o f l a c c a s e s .
T h e
e n z y m e
p r e p a r a t i o n
h a d
a
b a r e l y
d i s c e r n i b l e b l u e
c o l o r
w h i c h ,
w e
p r e s u m e d ,
was d u e
t o
t h e
p r e s e n c e
o f
l a c c a s e .
F i g u r e
2
s h o w s t h e
t i m e
c o u r s e
o f
t h e
b i o s o l u b i l i z i n g a c t i v i t y
o n
l e o n a r d i t e a t 2 3 C . V a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f
t h e
e x t r a c e l l u -
l a r f r a c t i o n w e r e
u s e d ,
a n d
t h e
b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t y
was
n o t
l i n e a r
w i t h
r e s p e c t
t o
c o n c e n t r a t i o n
( F i g .
2 ,
i n s e t ) .
O n
t h e
b a s i s o f
t h e s e
e x p e r i m e n t s ,
a n
a s s a y p e r i o d
o f 2 0
m i n
was
u s e d
i n
s u c c e e d i n g e x p e r i m e n t s .
T h e
s t a b i l i t y
o f t h e
p r o d u c t
a b s o r b a n c e was
c o n s t a n t
f o r
more t h a n
2
h a f t e r
t h e
r e m a i n -
i n g
l e o n a r d i t e
p a r t i c l e s
w e r e f i l t e r e d
o f f .
T h e d e g r e e o f l e o n a r d i t e
s o l u b i l i z a t i o n
b y
s e v e r a l s u r -
f a c t a n t s w a s d e t e r m i n e d . T h e
s u r f a c t a n t s t e s t e d i n c l u d e d
s o d i u m
d o d e c y l
s u l f a t e ,
Tw e en 8 0
( p o l y o x y e t h y l e n e s o r b i t a n
m o n o o l e a t e ) ,
a n d
c e t y l p y r i d i n i u m
c h l o r i d e ,
e a c h
i n
0 . 1
M
s o d i u m
p h o s p h a t e
b u f f e r
( p H
5 . 2 ) .
None
o f
t h e
s u r f a c t a n t s
t e s t e d
s o l u b i l i z e d
l e o n a r d i t e
s i g n i f i c a n t l y . T h e r e f o r e ,
b i o -
s o l u b i l i z a t i o n i s
p r o b a b l y
n o t d u e
t o s u r f a c t a n t
a b i l i t y .
When
T A B L E 1 . C o a l
l e a c h i n g b y s y r i n g a l d a z i n e
o x i d a s e
a s s a y
b u f f e r s a
A 3 5 0
o f
f i l t r a t e
f r o m :
B u f f e r
a n d
c o n t r o l
T e x a s
B e u l a h
B e u l a h
L e o n a r d i t e
T e x a s
e a h
s t a n d a r d
l i g n i t e
z a p
no 3
n o . 3
0 . 1 M s o d i u m 3 . 9
0 . 6 5
0 . 0 7 1
0 . 0 6 9
p h o s p h a t e
0 . 1
M s o d i u m
c i t r a t e
1 4 . 5 b
0 . 8 4
1 . 4 5 5
2 . 7 4
0 . 1 M s o d i u m
a c e t a t e
3 . 4 8 0 . 0 4 7 0 . 0 3 7
0 . 0 3 6
W a t e r 2 . 6 2 0 . 2 8 0 . 1 6 3
0 . 0 5 1
A
4 0 0 - m g
s a m p l e
o f
c o a l
w as
a d d e d
t o 4 m l o f b u f f e r o r
w a t e r .
T h e
m i x t u r e
was
i n c u b a t e d
f o r
2
d a y s .
C o a l was
r e m o v e d
b y f i l t r a t i o n ,
a n d
t h e
o p t i c a l
d e n s i t y
o f
t h e f i l t r a t e
w as
m e a s u r e d a t 3 5 0
nm .
b
E s t i m a t e d
b y d i l u t i n g
a n
a l i q u o t
o f t h e
s o l u t i o n
i n
w a t e r .
2 8 4 5
-
8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1987 Pyne 2844 8
4/6
-
8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1987 Pyne 2844 8
5/6
E X T R A C E L L U L A R
SOLUBILIZATION O F L E O NA R DI T E
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3
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0.50 . '
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F I G .
4 . C h r o m a t o g r a p h y
o f
l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t y
on
D E A E - c e l l u l o s e . C r u d e
p r e p a r a t i o n was
d i l u t e d 1 : 1 0
w i t h water a n d
t h e n a p p l i e d
t o a D E A E - c e l l u l o s e c o l u m n ( 1 . 5
b y
2 8 cm;
M a t r e x -
C e l l u f i n e
A M ; A m i c o n ) p r e v i o u s l y
e q u i l i b r a t e d w i t h 0 . 0 1 M s o d i u m
p h o s p h a t e ( p H 7 . 0 ) .
S y r i n g a l d a z i n e
o x i d a s e
a n d l e o n a r d i t e - b i o s o l -
u b i l i z i n g
a c t i v i t i e s
were
e s t i m a t e d
as
d e s c r i b e d
i n
M a t e r i a l s
a n d
M e t h o d s .
T h e
e l u t i o n
p r o f i l e
o f
p r o t e i n
was
d e t e r m i n e d
s p e c t r o p h o -
t o m e t r i c a l l y b y
i t s
A 2 8 0 .
P r o t e i n was e l u t e d
w i t h a
g r a d i e n t o f
0
t o 0 . 3
M
s o d i u m c h l o r i d e , a n d
3 m l o f
e l u a t e was
c o l l e c t e d .
S a l t
c o n c e n -
t r a t i o n was
d e t e r m i ne d b y m e a s u r i n g i o n i c
s t r e n g t h .
b e c a u s e t h e s e
enzymes ar e
g l y c o p r o t e i n s a n d ar e a d a p t e d
f o r f u n c t i o n i n
an
e x t r a c e l l u l a r m i l i e u
c o n t a i n i n g p r o t e a s e s .
H i g h
s y r i n g a l d a z i n e
o x i d a s e
a c t i v i t y i n t h e p u r i f i e d c e l l -
f r e e
p r e p a r a t i o n
s u g g e s t e d
t h a t t h i s a c t i v i t y
may b e
r e l a t e d
t o
l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t y .
T h e p u r i f i e d
prepara-
t i o n
c o n t a i n i n g l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t y
was r e -
c h r o m a t o g r a p h e d
on D E A E - c e l l u l o s e . A
g r a d i e n t
o f
1 0 0
m l
o f 0 . 0 1
M s o d i u m
p h o s p h a t e
( p H 7 . 0 )
a n d
1 0 0
m l
o f 0 . 3 M
s o d i u m
c h l o r i d e - 0 . 0 1
M
s o d i u m p h o s p h a t e
( p H 7 . 0 )
was
u s e d
t o
e l u t e a d s o r b e d
p r o t e i n s
f r o m
t h e c o l u m n . L e o -
n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t y
e l u t e d
w i t h
s y r i n g a l d a z i n e
o x i d a s e
a c t i v i t y .
A 2 8 0 p a r a l l e l e d t h e e l u t i o n
p a t t e r n s o f
s y r i n g a l d a z i n e
o x i d a s e
a n d
l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i -
t i e s . The
c o e l u t i o n
o f
s y r i n g a l d a z i n e
o x i d a s e a n d
l e o n a r d i t e -
b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t i e s , a l o n g
w i t h p r o t e i n , i s
s t r o n g
e v i -
d e n c e
t h a t
s y r i n g a l d a z i n e
o x i d a s e
a c t i v i t y
i s
r e s p o n s i b l e
f o r
l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t y ( F i g .
4 ) .
The c o n c e n t r a t i o n
o f
p r o t e i n
i n t h e
p e a k
f r a c t i o n
f r o m t h e
D E A E - c e l l u l o s e
c o l u m n was e s t i m a t e d
t o b e
0 . 2
m g / m l .
By
u s i n g
t h e
c o n c e nt r a t i o n o f
p r o t e i n
c a l c u l a t e d
f r o m t h e
b i u r e t
assay
a n d t h e m o l e c u l a r
mass f o r
s y r i n g a l d a z i n e
o x i d a s e o f
6 4 , 0 0 0
d a l t o n s
( 1 ) ,
t h e c o n c e n t r a t i o n
o f
p r o t e i n
i n
t h e
p e a k
f r a c t i o n s
( F i g . 4 ,
f r a c t i o n
4 1 )
was
d e t e r m i n e d
t o
b e
ap p r o x -
i m a t e l y
7
F . M .
T o
p r o d u c e
t h e c o l o r
e q u i v a l e n t
t o
t h a t
g i v e n
b y
t h e
f r a c t i o n s
c o n t a i n i n g b i o s o l u b i l i z i n g a c t i v i t y ,
t h e
con-
c e n t r a t i o n
o f
c h e l a t o r
s h o u l d
b e
on
t h e
o r d e r
o f
0 . 1
M,
o r
more t h a n
1 0 , 0 0 0 t i m e s
g r e a t e r
t h a n t h e
p r o t e i n
c o n c e n t r a -
t i o n . The c o n c e n t r a t i o n o f
p r o t e i n
i n t h e
a c t i v e f r a c t i o n s
was
t o o
l o w f o r
t h e
p r o t e i n t o
b e an
e f f e c t i v e
m e t a l
i o n
c h e l a t o r .
Each
p e p t i d e
c h a i n w o u l d
h a v e
t o c h e l a t e
a t l e a s t
5 , 0 0 0
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c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t
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b i c a r b o n a t e ,
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[ A m i c o n ]
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0 . 0 5
M
ammonium
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F r a c t i o n s ( 1 . 5 m l )
were
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a n d
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5 ) .
S y r i n g a l d a z i n e
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r e a d i l y d e t e c t e d , b u t l e o n a r d i t e - b i o -
s o l u b i l i z i n g a c t i v i t y
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s o l u b i l i z a t i o n was e x p e c t e d b e c a u s e
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A 2 8 0
were c o m b i n e d i n t h r e e p o o l s ,
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0 . 0 1 M
ammonium b i c a r b o n -
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c o n t a i n e d
s i g n i f i c a n t
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s y r i n g -
a l d a z i n e o x i d a s e
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The
c o e l u t i o n
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o x i d a s e a n d
l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t i e s f r o m t h e g e l
f i l t r a t i o n c o l u m n
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T h e e l u t i o n p o s i t i o n
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a c t i v i t i e s
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m o l e c u l a r
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a t l e a s t
5 0 , 0 0 0 d a l t o n s .
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ar e
e f f e c t i v e i n h i b i t o r s
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l e o n a r d i t e .
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i n h i b i t s
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b y 7 0
a n d
b i o s o l u b i l i z i n g
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S y r i n g a l d a z i n e
a n d
l e o n a r d i t e ,
t h e s u b -
s t r a t e s u s e d
i n t h e
assays,
ar e d i f f e r e n t
e n o u g h
c h e m i c a l l y
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t h e
d i f f e r e n c e i n
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T h e r e
may
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b e t w e e n
t h e
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s t e p s o f
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t i o n s o r , more
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may
b e
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p a r t i a l l y
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t h e
c a t a l y t i c r e a c t i o n s e q u e n c e
w h i c h
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t h e
i n h i b i t o r s .
The
e f f e c t s
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a n d a z i d e on
t h e
l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g
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f u r t h e r
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2 5 30
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p r e p a r a t i o n
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l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t y .
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p r e p a r a t i o n
c o n t a i n i n g l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g a c t i v i t y ( 2 . 8
mg
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was
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am m oniu m s u l f a t e .
The
p r e c i p i t a t e
was c o l l e c t e d
b y c e n t r i f u g a t i o n
a t
3 , 0 0 0
x
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p r e c i p i t a t e
was
s u s p e n d e d
i n 0 . 5 ml o f 0 . 0 5
M a m m o n i u m
b i c a r b o n -
a t e ,
a n d t h i s s o l u t i o n
was
a p p l i e d
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f i l t r a t i o n column
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GC-200
M a t r e x - C e l l u f i n e ;
A m i c o n ) .
F r a c t i o n s
( 1 . 5 m l )
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2 - m i n
i n t e r v a l s .
S y r i n g a l d a z i n e
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d e t e r m i n e d
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F r a c t i o n s
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V O L .
5 3 ,
1 9 8 7
2 8 4 7
-
8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1987 Pyne 2844 8
6/6
A P P L . E N V I R O N .
M I C R O B I O L .
S e v e r a l
l i n e s
o f
e v i d e n c e d e m o n s t r a t e
t h a t l e o n a r d i t e
b i o s o l u b i l i z a t i o n
i s
c a t a l y z e d
b y a C . v e r s i c o l o r
s y r i n g a l d a -
z i n e
o x i d a s e .
B o t h s y r i n g a l d a z i n e
o x i d a s e
a n d
b i o s o l u b i l -
i z i n g a c t i v i t i e s
ar e r e d u c e d
b y p r e i n c u b a t i o n
a t
6 0 C b u t
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5 3 C .
A
s h a r p d e c l i n e
i n
a c t i v i t y w i t h
a
s m a l l
i n c r e a s e i n
t e m p e r a t u r e i n d i c a t e s
an e n z y m a t i c
a c t i v i t y .
B o t h a c t i v i t i e s
were i n h i b i t e d
t o v a r i o u s d e g r e e s
b y s u r f a c t a n t s ,
a z i d e , a n d
c y a n i d e .
T h e tw o
a c t i v i t i e s c o e l u t e d
d u r i n g c h r o m a t o g r a p h y
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D E A E - c e l l u l o s e
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g e l
f i l t r a t i o n
c o l u m n s .
T h e
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s t r o n g l y s u g g e s t s
t h a t t h e a g e n t r e s p o n s i b l e
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b i o s o l u b i l i z a t i o n
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a c t i v i t y .
T h e
l e o n a r d i t e - b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t y
o f
C .
v e r s i c o l o r
c an
p o s s i b l y
b e
u s e d
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f i r s t
s t e p i n a l o w - t e m p e r a t u r e ,
l o w - p r e s s u r e
a p p r o a c h
t o c o a l
b e n e f i c i a t i o n .
T h e r e s u l t s
p r e s e n t e d h e r e
show
t h a t b i o s o l u b i l i z i n g
a c t i v i t y
i s a s s o c i -
a t e d w i t h
a
s p e c i f i c
e n z y m a t i c
a c t i v i t y .
F u t u r e w o r k
w i l l
f o c u s on
e n h a n c i n g t h e
p r o d u c t i o n o f
t h e
enzyme a c t i v i t y
b y
b o t h
s e l e c t i o n t e c h n i q u e s
a n d m a n i p u l a t i o n
o f f u n g a l
c u l t u r a l
p a r a m e t e r s .
A s e c o n d area o f
r e s e a r c h
w i l l
b e
t h e
e x a m i n a -
t i o n o f t h e
u s e o f t h e e x t r a c e l l u l a r
m a t e r i a l f o r
s o l u b i l i z i n g
l i g n i t e s
a n d c o a l s .
ACKNOWLEDGMENT
T h i s p r o j e c t
was
f u n d e d
b y a
c o n t r a c t
w i t h
t h e
E l e c t r i c Power
R e s e a r c h
I n s t i t u t e .
L I T E R A T U R E
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t h e
f u n g u s P o l y p o r u s
v e r s i c o l o r a n d
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P r i n t i n g
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P r o c e e d i n g s
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t h e
T e n t h
A n n u a l
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C o n f e r e n c e
o n
C l e a n
L i q u i d
a n d
S o l i d F u e l s ,
A p r i l
2 3 - 2 5 , 1 9 8 5 ,
P a l o A l t o ,
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E l e c t r i c
P o w e r
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6 . L e o n o w i c z , A . ,
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1 9 8 1 .
Q u a n t i t a t i v e
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t i o n o f
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f o r m s
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s o m e
w h i t e - r o t f u n g i u s i n g
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a s u b s t r a t e . Enzyme
M i c r o b .
T e c h n o l .
3 : 5 5 - 5 8 .
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1 9 4 0 .
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r e a c t i o n
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t h e
d e t e r m i n a t i o n
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I I .
M e a s u r e m e n t s
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b y
a D u b o s c q
c o l o r i m e t e r
c o m p a r e d w i t h
v a l u e s o b t a i n e d
b y
t h e
K j e l d a h l
p r o c e d u r e .
J . B i o l .
C h e m . 1 3 5 : 7 2 7 - 7 3 1 .
8 . S t r a n d b e r g ,
G . W . , a n d
S . N .
L e w i s .
1 9 8 7 .
T h e s o l u b i l i z a t i o n
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c o a l
b y
a n e x t r a c e l l u l a r p r o d u c t
f r o m
S t r e p t o m y c e s
s e t o n i i
7 5 V i 2 . J . I n d .
M i c r o b i o l . 1 : 3 7 1 - 3 7 5 .
9 . W a r d ,
H .
B . 1 9 8 5 . L i g n i t e - d e g r a d i n g
f u n g i
i s o l a t e d f r o m
a
w e a t h e r e d o u t c r o p
s y s t e m .
S y s t e m . A p p l .
M i c r o b i o l . 6 : 2 3 6 -
2 3 8 .
1 0 .
W i l s o n ,
B .
W . ,
E .
J .
L e w i s ,
D .
L . S te wa r t,
a n d
S .
M.
L i .
1 9 8 5 .
M i c r o b i a l
c o n v e r s i o n
o f
c o a l ,
p .
3 1 . 1 - 3 1 . 8 . I n
P r o c e e d i n g s
o f
t h e
T e n t h
A n n u a l
EPRI
C o n t r a c t o r s '
C o n f e r e n c e
o n
C l e a n
L i q u i d
a n d
S o l i d
F u e l s ,
A p r i l 2 3 2 5
1 9 8 5 , P a l o A l t o ,
C a l i f .
E l e c t r i c
P o w e r R e s e a r c h I n s t i t u t e ,
P a l o
A l t o , C a l i f .
1 1 . W i l s o n , B .
W . ,
E .
J . L e w i s , D .
L . S t ew ar t ,
S .
M.
L i ,
R .
M .
B e a n ,
E . K . C h e s s ,
J . P y n e , M.
C o h e n ,
a n d H . A r o n s o n . 1 9 8 6 .
M i c r o b i a l
p r o c e s s i n g
o f
f u e l s ,
p . I V 8 8 - I V 9 8 . I n
P r o c e e d i n g s
o f
t h e D e p a r t m e n t
o f E n e r g y C o a l
L i q u e f a c t i o n
C o n t r a c t o r s
M e e t i n g , P i t t s b u r g h , P a . ,
N o v e m b e r 1 9 - 2 1 ,
1 9 8 5 . N T I S , S p r i n g -
f i e l d ,
V a .
2 8 4 8
PYNE E T AL.