Aplikasi 1-Butil-3-Metilimidazolium Klorida [Bmim]Cl ...

Aplikasi 1-Butil-3-Metilimidazolium Klorida [Bmim]Cl Terhadap

Efektifitas Ekstraksi Resveratrol dari Biji Melinjo (Gnetum gnemon) Menggunakan Microwave Assisted Extraction

Satya Muslimah, Abdul Mun’im, Arif Arrahman

Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia, Kampus UI Depok, Depok, 16424, Indonesia

Email : [email protected]

Abstrak Resveratrol memiliki berbagai aktivitas biologis seperti antioksidan, anti kanker, dan anti inflamasi. Tanaman melinjo khususnya bagian biji diketahui mengandung resveratrol serta turunannya. Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan kondisi optimum MAE dalam memperoleh kadar reveratrol dari biji melinjo (Gnetum gnemon) menggunakan metode permukaan respon RSM. Untuk memperoleh resveratrol dari biji melinjo secara optimal perlu dilakukan ekstraksi dengan metode yang sesuai. Serbuk biji melinjo diekstraksi dengan MAE (Microwave-Assisted Extraction) dengan pelarut jenis ionic liquid yaitu [Bmim]Cl. RSM (Response Surface Methodology) digunakan guna merancang desain ekspermen dan menentukan kondisi optimum MAE dalam memperoleh kadar resveratrol. Faktor dalam desain eksperimen antara lain konsentrasi pelarut, rasio sampel terhadap pelarut, serta waktu ekstraksi. Tiap ekstrak ditentukan kadar resveratrolnya menggunakan metode KCKT serta ditentukan kandungan total fenolik dengan metode Folin-Ciocalteu. Hasil analisis kondisi optimum diperoleh dengan faktor konsentrasi pelarut [Bmim]Cl 1.0 mol/L, rasio sampel terhadap pelarut 1:15,5 dan waktu ekstraksi 12,5 menit dengan indeks desirability 0,869.

Application of 1-Butyl-3-Methylimidazolium Chloride (Bmim)Cl on Resveratrol Extraction from Melinjo (Gnetum gnemon) Seeds

Abstract

Resveratrol has various biological activities such as antioxidative, anti cancer, and anti inflammation. Melinjo seeds are known to have the content of resveratrol and its derivatives. This study aimed to determine the optimum condition of MAE in obtaining resveratrol concentration from melinjo seeds using RSM. To obtain resveratrol from melinjo seeds optimally , it needs to do extraction with appropriate method. Dried melinjo seeds were extracted by MAE method using ionic liquid solvent [Bmim]Cl. RSM (Response Surface Methodology) was used to arrange experiment design and determine optimum condition in order to obtain resveratrol concentration. The factors that used in this design experiment were solvent concentration, ratio, and extraction time. Each extract was determined its resvertarol content using HPLC method and total phenolic content by Folin-Ciocalteu method. The analysis result of optimum condition obtained was the condition with solvent concentration of [Bmim]Cl 1,0 mol/L, solid-liquid ratio 1:15,5 mL, and extraction time 12,5 minutes with desirability index 0,869. Keywords: Gnetum gnemon; Response Surface Methodology; Resveratrol

Aplikasi 1 ..., Satya Muslimah, FFAR UI, 2017

Pendahuluan

Tanaman Melinjo (Gnetum gnemon L.) merupakan tanaman berbiji terbuka yang

banyak tumbuh di wilayah Indonesia. Biji melinjo memiliki kandungan kimia seperti

tannin, stilbenoid serta flavonoid. Stilbenoid merupakan kandungan yang umumnya

ditemukan, dan resveratrol adalah derivat stilbenoid yang cukup banyak diperoleh (Konno

et al., 2013). Resveratrol adalah senyawa polifenol yang dapat ditemukan di beberapa

spesies tumbuhan diantaranya Red wine, kacang, dan Japan giant knotweed (De Souza

Rocha et al., 2016; Q. Zhang et al., 2015; Z. Zhang, Liu, Li, & Yao, 2009). Namun karena

harganya cukup mahal dan ketersediaannya yang sulit sehingga digunakan tanaman melinjo

yang lebih murah dan mudah didapat. Pada penelitian ini digunakan cairan ionik

[Bmim]Cl sebagai jenis pelarut alternatif yang lebih aman dan ramah lingkungan.

Berdasarkan percobaan ekstraksi trans-resveratrol pada tanaman Polygoni Cuspidati oleh

Fu-You Du et al, diketahui bahwa cairan ionik [Bmim]Cl mampu menghasilkan perolehan

ekstraksi hingga 35,8%. MAE (Microwave-Assisted Extraction) digunakan sebagai metode

ekstraksi karena memiliki banyak keuntungan seperti penggunaan bahan uji dan volume

pelarut yang sedikit dan proses ekstraksi cepat (Routray and Orsat, 2012). Proses optimasi

dilakukan terhadap beberapa faktor ekstraksi seperti konsentrasi pelarut, waktu ekstraksi

serta rasio sampel terhadap pelarut. Optimasi tersebut dilakukan dengan menggunakan

RSM (Response Surface Methodology) yang bertujuan mereduksi pengujian yang

dilakukan serta menggambarkan kondisi optimum pada proses ekstraksi resverartrol dari

biji melinjo melalui grafik respon permukaan.

Tinjauan Teoritis

2.1 Melinjo (Gnetum gnemon L.)

Tanaman melinjo (Gnetum gnemon L,.) merupakan jenis tumbuhan berbiji terbuka

yang dapat ditemukan pada daerah kering hingga beriklim tropis. Pada dasarnya melinjo

merupakan tanaman gymnospermae yang dimana bijinya hanya dilapisi oleh kulit terluar dari

buah namun tidak oleh daging buah. Terdapat 3 lapisan yang membungkus biji melinjo.

Lapisan pertama, kulit luar yang lunak dan agak tebal (sarcotesta), lapisan ke dua kulit tengah

bersifat agak keras berwarna kuning bila biji muda, dan coklat ke hitaman bila biji tua

(sklerotesta) dan lapisan ke tiga berupa kulit dalam bersifat tipis berwarna putih kotor

(endotesta). Daging biji terletak di bawah lapisan kulit ke tiga, sebagai persediaan makanan,

bagi lembaga biji bila akan berkecambah (Sananto, 1991). Kandungan kimia biji melinjo


antara lain berupa dimer resveratrol seperti (Gnetin C, Gnetin L, gnemonosid A dan

gnemonosid D) dan juga mengandung trans-resveratrol dan glukosidanya. Taksonomi dari

tanaman ini adalah sebagai berikut (Integrated Taxonomic Information System, 2014) :

Kerajaan : Plantae

Divisi :Tracheophyta

Subdivisi : Spermatophyta

Kelas : Gneptosida

Subkelas : Gnetidae

Bangsa : Ephedrales

Suku : Gnetaceae

Marga : Gnetum

Jenis : Gnetum gnemon L. Resveratrol

Resveratrol (3,4’,5-trihidroksistilben) adalah molekul polifenol golongan stilbenoid

yang ditemukan di beberapa spesies tumbuhan termasuk Red wine (de Souza Rocha et al.,

2016), kacang (Q. Zhang et al., 2015), Japan giant knotweed (Z. Zhang et al., 2009) dan

lainnya. Resveratrol memiliki banyak mekanisme aksi terkait dengan manfaatnya terhadap

kesehatan seperti agen antioksidan (Yao et al., 2010), anti kanker, anti diabetes (Rai, Mishra,

Suman, & Shukla, 2016), serta agen anti inflamasi (Yu et al., 2015).

Ekstraksi

Ekstraksi merupakan kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga

terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Ekstraksi dibagi menjadi 2

metode yaitu cara dingin dan cara panas. Metode dingin meliputi maserasi dan perkolasi,

untuk metode panas meliputi refluks, soxhlet, MAE, UAE, digesti, infusa serta dekokta

(Departemen Kesehatan RI, 2000).

MAE (Microwave-Assisted Extraction)

MAE (Microwaved-Assisted Extraction) merupakan suatu proses ekstraksi melalui

pemanasan pelarut yang berkontak dengan sampel menggunakan energi gelombang mikro

untuk mempartisi senyawa target dari sampel matriks di dalam pelarut (Renoe, 1994).

Mekanisme ekstraksi pada metode MAE yaitu adanya proses pemanasan dan penguapan air

didalam sel bahan akibat panas radiasi gelombang mikro sehingga menimbulkan semakin


tingginya tekanan pada dinding sel sehingga sel membengkak (swelling) dan tekanannya akan

mendorong dinding sel dari dalam, meregangkan dan memecahkan sel tersebut (Calinescu,

Ciuculescu, Popescu, Bajenaru, & Epure, 2001).

Cairan Ionik (Ionin liquid)

Ionic Liquid (IL) merupakan garam organik dalam keadaan cair yang terdiri dari

kation organik dipasangkan dengan organik atau anorganik (Tang, Bi, Tian, & Row, 2012).

Keunggulan cairan ionik antara lain stabilitas termal yang baik, viskositas yang tinggi, ramah

lingkungan, dapat didaur ulang, selektifitas yang tinggi, tekanan uap yang dapat diabaikan

sehingga pelarut tidak mudah menguap, dan tidak mudah terbakar (Tang et al., 2012).

Penetapan Kadar Resveratrol

Penetapan kadar senyawa resveratrol telah dilakukan dengan menerapkan berbagai

metode pada penelitian-penelitian sebelumnya seperti GC-MS, LC-MS/MS, serta KCKT

(Cacho et al., 2013; Ramalingam & Ko, 2016; Souto et al, 2001). KCKT (Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi) merupakan metode yang paling banyak diujikan pada penetapan kadar

senyawa resveratrol. Sebagai contoh pada penelitian Souto et al ia berhasil memperoleh kadar

resveratrol dari tanaman Brazillian Red Wine dengan metode KCKT dengan perolehan kadar

sebesar 5,75 mg/L (Souto et al, 2001). Banyaknya penggunaan metode KCKT pada penelitian

resveratrol dikarenakan keunggulan yang dimiliki dari metode tersebut cukup banyak antara

lain waktu analisis cepat (10-60 menit), sensitivitas serta selektifitas yang tingi, dapat

menganalisis berbagai senyawa sekaligus, dapat digunakan berbagai macam detektor, serta

mudah dalam mengoperasikan instrument.

Uji Total Kandungan Fenolik

Uji total fenolik dapat dilakukan melalui metode spektrofotometri dengan menggunakan

pelarut organik dan pereaksi Folin-Ciocalteu (Karim et al, 2011). Tahapan prosedurnya yaitu

dengan mencampurkan ekstrak dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dan Na2CO3 dan diinkubasi

selama ± 2 jam. Larutan yang telah diinkubasi kemudian dihitung absorbansinya dengan alat

spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm. Standar asam galat digunakan sebagai

kontrol positif. Prosedur yang sama diulangi untuk pengujian larutan standar asam galat dan

garis kalibrasi diinterpretasikan. Berdasarkan pengukuran absorbansi, konsentrasi fenolat

dapat terbaca (mg/ml) dari garis kalibrasi; kemudian kandungan fenolat dalam ekstrak

dinyatakan dalam kesetaraan asam galat (mg asam galat/g ekstrak)(Milan,2011


Metode Penelitian Alat

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Shimadzu LC-20 AT), microsyringe ujung tumpul,

detektor UV-Vis diode array, kolom C18 (ZORBAX Eclipse XDB), detektor UV-Vis SPD-

20A, microwave (Modena), microplate reader (Versa Max), Oven (Memmert), waterbath

Hahn shin HS-3001, lemari pendingin dengan temperatur 2-6°C (Sharp), vortex mixer (Ika

MS 3 Digital:WiseMix), labu tentukur, pipet volume (pyrex), pipet makro 100-1000 µL, pipet

mikro 1-10 µL dan 10-100 µL (Lambda Plus), bejana kromatografi, pipa mikrokapiler,

timbangan analitik, timbangan digital (Kenko),balon karet dan alat gelas lainnya. Bahan

Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji kering dari tanaman melinjo

(Gnetum gnemon L.) yang diperoleh dari wilayah Pandeglang, Banten. Bahan lain yang

digunakan adalah cairan ionik 1-Butil-3-Metilimidazolium Klorida [Bmim]Cl

(Shanghai,China) , akua destilata (Brataco,Indonesia), akua demineralisata(Brataco,Indonesia),

akua bidestilata, standar resveratrol (Wako, Japan), etil asetat, n-heksan, asam asetat glasial,

asetonitril, metanol p.a, asam galat (Sigma-Aldrich, USA), reagen Folin-Ciocealteu (Sigma-

Aldrich, USA), Natrium Karbonat (Na2CO3) (Sigma-Aldrich, USA).

Penyiapan Bahan Uji

Simplisia biji melinjo dilakukan sortasi basah dengan memilih biji yang kondisinya baik

dan memisahkannya dari kotoran-kotoran yang ada. Biji kemudian dicuci dengan air yang

mengalir. Selanjutnya dilakukan pengeringan menggunakan lemari pengering. Simplisia

kering selanjutnya disortasi untuk memisahkan pengotor yang kemungkinan masih terdapat

pada simplisia kering. Simplisia digiling menggunakan mesin penggiling untuk dijadikan

serbuk kemudian diayak menggunakan pengayak berukuran 50 mesh.

Ekstraksi

Serbuk simplisia ±1 gram diekstraksi dengan konsentrasi pelarut, volume pelarut serta

waktu ekstraksi sesuai dengan yang tertera pada desain eksperimen. Hasil ekstraksi

disentrifugasi 15 menit supernatannya disaring. Larutan filtrat dituang ke dalam vial coklat

lalu ditambahkan larutan garam Na2CO3 dan etil asetat yang setara dengan jumlah volume

supernatan dari tiap sampel ekstrak. Campuran disentrifugasi dan diuapkan supernatannnya.

Tahapan partisi dengan etil asetat tersebut diulang sebanyak 5 kali untuk masing-masing

sampel ekstrak hingga didapat ekstrak kering.


Penetapan Kadar Total Fenolik dengan Microplate Reader

Penentuan kadar fenolik total dilakukan dengan menggunakan microplate reader dan

pereaksi Folin-Ciocalteu berdasarkan metode yang dilakukan oleh Bobo-Garcia,G. et al.

a. Pembuatan Kurva Kalibrasi Standar Asam Galat

Standar asam galat ditimbang 25 mg dan dilarutkan pada 25 mL metanol p.a, diperoleh

konsentrasi sebesar 1000 ppm. Larutan asam galat dipipet masing-masing 125 µL; 250 µL;

500 µL; 1 mL dan 2 mL kedalam labu ukur 5 mL dan diencerkan dengan metanol p.a hingga

diperoleh konsentrasi 25, 50, 100, 200, dan 400 ppm. Larutan hasil pengenceran dan blanko

dipipet 20 µL dan dimasukkan kedalam lempeng mikroplate lalu dicampur dengan 100 µL 1:4

pereaksi Folin-Ciocalteu dan 75 µL larutan natrium karbonat 10% lalu diinkubasi 2 jam.

Absorbansi diukur pada 750 nm menggunakan microplate reader. Selanjutnya serapan yang

diperoleh dibuat kurva kalibrasi dan ditentukan persamaan regresi linearnya.

b. Pengukuran Sampel Serapan

Ekstrak kering biji melinjo sejumlah berat tiap sampel dilarutkan 4mL metanol p.a.

Larutan ekstrak dan blanko dipipet 20 µL dan dimasukkan kedalam lempeng mikroplate lalu

ditambahkan 100 µL 1:4 pereaksi Folin-Ciocalteu dan 75 µL larutan natrium karbonat 10% .

Larutan diinkubasi selama 2 jam lalu absorbansi diukur pada 750 nm menggunakan

microplate reader. Kadar fenolik total dihitung menggunakan kurva kalibrasi standar asam

galat. Hasilnya dinyatakan dalam satuan mg ekivalen asam galat pergram sampel (mg/g GAE)

(G. Bobo et al., 2014).

Penetapan Kadar Resveratrol dengan metode KCKT Penetapan kadar resveratrol dilakukan dengan menggunakan metode KCKT

berdasarkan penelitian (Souto,et al., 2001) dengan adanya modifikasi.

a. Pembuatan Larutan Baku Resveratrol

Standar Resveratrol 10 dilarutkan kedalam 10 mL etanol dan diperoleh konsentrasi 1000

ppm. Larutan diencerkan dengan mengambil 1 mL kedalam labu ukur 10 mL, diperoleh

larutan konsentrasi 100 ppm. Larutan 100 ppm di lakukan pengenceran kembali dengan

memipet 750 µL, 650 µL, dan 2,5 mL dan masing-masing dicukupkan volumenya dengan

etanol 5 mL kecuali pada cairan 2,5 mL dicukupkan hingga volume 25 mL, diperoleh larutan

dengan konsentrasi 15, 13, dan 10 ppm. Larutan konsentrasi 10 ppm diencerkan dengan

memipet 0,5 mL, 2,5 mL dan 4,5 mL lalu dimasukkan ke labu ukur 5 mL dan dicukupkan


volumenya dengan etanol 5 mL, diperoleh larutan dengan konsentrasi 1, 5, dan 9 ppm. Hasil

pembuatan larutan standar adalah konsentrasi larutan 1, 5, 9, 13, dan 15 ppm. Larutan baku

resveratrol dituang 5 mL ke dalam vial untuk diinjek sebanyak 20 µL dan dideteksi pada

panjang gelombang 306 dengan laju alir isokratik fase gerak 1,0 mL/menit. Luas puncak dan

waktu retensi yang ditunjukkan pada kromatogram dicatat dan dibuat kurva baku serta

persamaan regresi liniernya.

b. Pembuatan Larutan Sampel

Pada pembuatan larutan sampel, tiap ekstrak kering dilarutkan dengan metanol:air (50:50)

dan dicukupkan volumenya hingga 5 mL. Sampel diinjek 20 µL dan dideteksi oleh alat KCKT

pada panjang gelombang 306 nm dengan laju alir 1,0 mL/menit. Hasil kadar diperoleh dengan

memasukkan nilai luas area tiap sampel kedalam persamaan regresi linear dari kurva baku

standar.

c. Kondisi KCKT

Kondisi KCKT yang digunakan untuk penetapan kadar adalah:

Nama : HPLC Shimadzu LC-20 AT

Panjang gelombang : 306 nm

Laju alir : 1 mL/menit

Volume yang diinjeksi : 20 µL

Fase gerak : A. Aqua bidestilata = 75 %

B. Asetonitril = 25%

Detektor : UV-Vis

Kolom : ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4,6 x 150 mm, 5 µm

3.4.5 Analisis Data

Seluruh data dari hasil pengujian digunakan untuk menyusun persamaan matematis

menggunakan Software Design expert® Version 10. Tahapan yang dilakukan diawali dari

memasukkan seluruh data kadar resveratrol tiap sampel kedalam software, selanjutnya model

analisis ditentukan dan diperoleh persamaan matematis yang berguna untuk mendapatkan

kondisi optimum dari MAE yang didapat dengan cara memplotkan data yang didapat kedalam

suatu grafik yang berupa bentuk grafik respon permukaan 3 dimensi.


Hasil dan Pembahasan Ekstraksi

Ekstraksi dilakukan dengan menimbang ±1 gram serbuk melinjo dan menggunakan

metode MAE serta pelarutnya yaitu cairan ionik Bmim[Cl]. Pemilihan metode didasarkan atas

efisiensi waktu dan bahan juga metode ini dapat meningkatkan efektivitas pelarut ionik dalam

proses ekstraksi (Routray and Orsat, 2012). Digunakannya pelarut Bmim(Cl) didasarkan atas

penelitian du et al yang membuktikan kemampuan bmim(Cl) dalam memperoleh kadar

resveratrol yang cukup baik yaitu sebesar 35,8% yang dimana lebih besar dibanding kadar

perolehan resveratrol dari cairan ionik lain seperti Bmim(BF4) (Du et al., 2007). Serbuk biji

melinjo kemudian diekstraksi dengan konsentrasi pelarut, waktu ekstraksi serta volume

pelarut sesuai yang tertera pada desain eksperimen.

Tabel 1. Jumlah eksperimen (run) beserta variasi faktor

Run Konsentrasi Pelarut

[bmim]Cl (mol/L)

Waktu Ekstraksi (menit)

Rasio Sampel-Pelarut

1 1.0 10 13 2 1.5 12.5 13 3 0.5 15 15.5 4 0.5 10 15.5 5 1.0 12.5 15.5 6 0.5 12.5 18 7 1.0 12.5 15.5 8 0.5 12.5 13 9 1.0 10 18 10 1.5 12.5 18 11 1.0 15 18 12 1.0 12.5 15.5 13 1.5 15 15.5 14 1.0 15 13 15 1.0 12.5 15.5 16 1.5 10 15.5 17 1.0 12.5 15.5

Dari perhitungan persentase ekstraksi, didapat bahwa persentase ekstraksi tertinggi

berada pada run 12 dengan persentase ekstraksi 14,3% yaitu dengan berat ekstrak 143 mg,

sedangkan untuk persentase ekstraksi terendah ada pada sampel 11 dengan perolehan 0,46%

atau 4,6 mg. Hasil persentase dari seluruh ekstrak dapat dilihat pada Lampiran 1.


Keterangan: run 12 merupakan sampel dengan rendemen ekstrak terbesar, sedangkan run 11 merupakan sampel

dengan rendemen ekstrak terkecil.

Gambar 1. Grafik perolehan rendemen ekstrak biji Melinjo

Berdasarkan grafik, terlihat perbedaan yang sangat jauh antara persentase rendemen

satu sampel dengan yang lainnya, khususnya pada run 12 dibanding sampel yang lain. Pada

run 12 yang memiliki persentase rendemen tertinggi yaitu 14,3% memiliki kondisi MAE

dengan konsentrasi pelarut Bmim(Cl) 1,0 mol/L, rasio sampel terhadap pelarut 1:15,5 serta

waktu ekstraksi selama 12,5 menit. Pada dasarnya cairan ionik bersifat kental dengan semakin

tingginya konsentrasi yang dimiliki, sehingga hal tersebut dapat menyebabkan terjadinya

penurunan hasil rendemen ekstrak dengan semakin tingginya konsentrasi Bmim(Cl) yang

digunakan. Hasil rendemen ekstrak yang semakin kecil tersebut dikarenakan ketika proses

sentrifugasi, semakin tinggi konsentrasi pelarut maka semakin kental larutan ekstrak sehingga

lebih sulit untuk dipisahkan. Akibatnya volume supernatan yang diambil pun juga akan

semakin sedikit dan hal ini berdampak pada berat rendemen ekstrak yang semakin rendah.

Penurunan ini selain disebabkan oleh faktor konsentrasi juga dapat dipengaruhi oleh faktor

lain yaitu waktu ekstraksi. Semakin lama waktu ekstraksi maka volume larutan ekstrak yang

dihasilkan pun akan semakin sedikit akibat proses pemanasan. Faktor rasio sampel terhadap

pelarut juga memberikan pengaruh terhadap perolehan rendemen ekstrak. Semakin tinggi

rasio solid-liquid, semakin mudah pelarut berdifusi kedalam struktur sampel sehingga

rendemen ekstraknya pun akan semakin tinggi (Qian et al, 2017). Namun pada ekstraksi yang

dilakukan dengan MAE, volume pelarut yang lebih tinggi dapat memberikan hasil yang lebih

rendah (Eskilsson et al, 2000). Terlepas dari hasil rendemen ekstrak diatas, penelitian ini


sendiri bukan bertujuan dalam menentukan kondisi optimum MAE dalam memperoleh ekstrak

padat, melainkan bertujuan untuk memperoleh kadar resveratrol, sehingga sampel dengan

berat ekstrak padat yang besar tidak menjamin akan mengandung kadar resveratrol yang lebih

tinggi dari sampel yang berat ekstrak padatnya lebih kecil.

Penetapan kandungan Total Fenolik

Pada pengujian total kandungan fenolik ekstrak biji melinjo metode yang digunakan

adalah metode Folin-Ciocalteu dengan alat microplate reader. Alasan digunakannya

microplate reader dikarenakan jika dibanding dengan spektrofotometer uv-vis efisiensi

penggunaan bahan sampel lebih hemat. Prinsip dari metode Folin Ciocalteau yaitu

terbentuknya senyawa kompleks berwarna biru yang dapat diukur pada panjang gelombang

750 nm.

a. Pembuatan Kurva Kalibrasi

Sebagai pembanding kandungan fenol resveratrol, digunakan asam galat. Pemilihan

asam galat didasarkan atas sifatnya yang stabil dan murni, serta harganya yang lebih murah

dibanding pilihan lainnya. Tahapan awal, disiapkan larutan stok asam galat 1000 µg/mL

dalam metanol. Larutan stok diencerkan hingga terbentuk larutan standar dengan kadar 25; 50;

100; 200; 400 µg/mL. Pengenceran dilakukan secara triplo. Dari data yang diperoleh, dibuat

kurva kalibrasi yang menghasilkan persamaan regresi linear y = 0,0084x+0,1689 dengan

harga koefisien relasi (R2) = 0,999 yang dapat dilihat pada gambar berikut.

Gambar 2. Kurva Kalibrasi Asam Galat


b. Pengukuran kadar fenolik sampel

Kadar fenolik total pada masing-masing ekstrak dinyatakan dalam satuan mg GAE/g

(Gallic Acid Equivalent). Kadar total fenolik dari seluruh sampel dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Kadar perolehan total kandungan fenolik ekstrak biji melinjo

Pada penelitian kali ini, sampel dengan total fenolik tertinggi diperoleh pada run 12

yaitu 1,736 mg GAE/g, dan kadar fenolik terendah berada pada sampel 11 yaitu 0,203 mg

GAE/g, Data penetapan kadar fenolik total ekstrak biji melinjo (Gnetum gnemon L.) untuk

seluruh sampel dapat dilihat pada Lampiran 2. Sama halnya seperti perolehan rendemen

ekstrak, faktor-faktor ekstraksi yang menunjukkan kadar tertinggi dari total fenolik adalah

konsentrasi pelarut 1,0 mol/L, rasio sampel-pelarut 1:15,5 serta waktu ekstraksi 12,5 menit

yaitu secara singkat tergambar di run 12 pada grafik diatas. Salah satu faktor yang

mempengaruhi perbedaan kadar total fenolik adalah waktu ekstraksi. Peningkatan waktu

ekstraksi mampu meningkatkan kelarutan zat terlarut dan koefisien difusi, tetapi dapat pula

memungkinkan terdenaturasinya senyawa fenolik jika waktu ekstraksi terlalu lama (Pinelo et

al., 2005).

Penetapan Kadar Resveratrol dengan KCKT

a. Perhitungan Kurva Kalibrasi Standar

Larutan standar resveratrol diinjeksi 20 µL dengan konsentrasi 1,3,5,9,13,15 ppm. Kurva

Kalibrasi dibuat dengan memasukkan konsentrasi sebagai sumbu X dan area sebagai sumbu Y.

Kurva kalibrasi yang dihasilkan memiliki persamaan garis Y= 149376X+33194 dengan nilai

R= 0,9995. Grafik kurva kalibrasi standar resveratrol dapat dilihat pada gambar berikut.


Gambar 4. Grafik kurva kalibrasi standar resveratrol

Pengukuran kadar resveratrol pada larutan sampel

Pengujian kadar resveratrol pada sampel secara KCKT dilakukan secara duplo.

Volume tiap sampel yang disuntikkan sebanyak 20 µL. Kadar tiap sampel diperoleh dari area

kromatogram untuk selanjutnya dimasukan ke dalam persamaan regresi linear. Kadar

resveratrol dari tiap run dapat dilihat pada gambar berikut.

Gambar 5. Grafik Perolehan Kadar Resveratrol

Berdasarkan gambar diatas, diketahui kadar terbesar berada pada run 12 yaitu sebesar

0,059 mg/g dengan faktor yang dimiliki berupa rasio solid-liquid 1:15,5, waktu ekstraksi 12,5

menit serta konsentrasi 1 mol/. Sedangkan kadar terendah berada pada run 2 yaitu dengan


perolehan kadar sebesar 0,00093 mg/g. Konsentrasi Bmim(Cl) pada run 12 sebesar 1.0 mol/L,

yang dimana konsentrasi ini merupakan merupakan nilai tengah diantara konsentrasi 0.5 dan

1.5 mol/L. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan zaixiang lou et al, diketahui bahwa

semakin tinggi konsentrasi cairan ionik, maka semakin tinggi kadar senyawa fenolik yang

diperoleh. Pada gambar, kenaikan kadar dari konsentrasi 0.5 mol/L ke 1.0 mol/L mengalami

penaikan yang signifikan. Namun pada konsentrasi pelarut 1.5 mol/L, terjadi penurunan kadar

resveratrol. Oleh karenanya konsentrasi pelarut Bmim(Cl) yang disimpulkan sesuai untuk

memperoleh kadar resveratrol adalah sebesar 1.0 mol/L.

Analisis Data Menggunakan Response Surface Methodology

Dalam penelitian ini, software Design Expert digunakan sebagai media dalam analisis

data optimisasi menggunakan RSM. Desain yang digunakan pada RSM adalah Box-Behnken.

Hasil yang akan diperoleh dari metode RSM ini adalah berupa kondisi optimum dari tiap-tiap

faktor ekstraksi dalam memperoleh kadar resveratrol. Hasil tersebut ditampilkan dalam bentuk

grafik respon permukaan 3 Dimensi. Tahapan awal yang dilakukan adalah memasukkan kadar

resveratrol dari tiap sampel pada desain eksperimen. Dari data-data tersebut maka selanjutnya

diperoleh model analisis yang disarankan yaitu model quadratic. Selanjutnya dilakukan

analisis “lack of fit test”. Istilah lack of fit dapat didefinisikan sebagai ukuran adanya

ketidaksesuaian antara data dengan model yang digunakan. Nilai “prob > F” yang diupayakan

dalam analisis ini adalah lebih besar dari 0,05 dengan arti hubungan antara data dengan model

analisis telah sesuai. Berdasarkan analisis menggunakan model quadratic, diperoleh nilai lack

of fit sebesar 0,5141 yaitu lebih besar dari nilai 0,05. Hal ini menunjukkan bahwa model yang

digunakan memiliki status lack of fit yang tidak signifikan yang berarti hubungan antara data

dengan model analisis telah sesuai. Langkah berikutnya yaitu diperolehnya nilai indeks

desirability dengan nilai 0,869 yang berarti nilai ini sudah baik dalam menentukan kondisi

optimum karena merupakan nilai yang mendekati 1 (Stat-Ease, 2013). Tahapan terakhir yang

dilakukan adalah melihat kondisi optimum yang tergambar pada grafik respon permukaan

dalam bentuk 3 Dimensi. Grafik ini terdiri dari 3 yaitu grafik hubungan antara faktor

konsentrasi dengan rasio pelarut, rasio pelarut dengan waktu ekstraksi, serta konsentrasi

pelarut dengan waktu ekstraksi. Ketiga grafik tersebut dapat dilihat pada gambar berikut.


Gambar 6. Grafik respon 3 dimensi antara rasio sampel-pelarut vs konsentrasi pelarut

Gambar 7. Grafik respon 3 dimensi antara konsentrasi pelarut dan waktu ekstraksi

Gambar 8. Grafik respon 3 dimensi antara waktu ekstraksi dan rasio sampel-pelarut

Berdasarkan ketiga gambar diatas, kondisi optimum ditunjukkan oleh area puncak

yang ditandai oleh titik merah yang berada di puncak grafik. Dari gambar diatas diketahui

bahwa kondisi optimum yang diperoleh adalah ekstraksi dengan konsentrasi pelarut 1,0 mol/L,

rasio sampel terhadap pelarut 1:15,5 , serta waktu ekstraksi selama 12,5 menit. Hasil tersebut

serupa dengan kondisi ekstraksi dari ekstrak run 12 yaitu sampel dengan kadar resveratrol

tertingi sebesar 0,059 mg/g. Dari hasil kondisi optimum yang diperoleh melalui Design


Expert® dapat disimpulkan bahwa run 12 merupakan kondisi optimum MAE dalam

memperoleh kadar resveratrol dari biji melinjo menggunakan RSM.

Kesimpulan

Kondisi optimum pada MAE guna memperoleh kadar resveratrol menggunakan pelarut ionic

liquid Bmim(Cl) dengan metode RSM yaitu ekstrak dengan faktor konsentrasi pelarut 1 mol/L,

rasio sampel pelarut 1:15,5 serta waktu ekstraksi 12,5 menit. Kadar trans-resveratrol yang

diperoleh dengan menggunakan metode KCKT adalah sebesar 0,059 mg/g. Kadar kandungan

total fenolik yang diperoleh pada kadar tertinggi sebesar 1,7365 mg GAE/g simplisia dan

kadar yang terendah diperoleh dengan kadar 0,2036 mg GAE/ g simplisia.

Saran

Sebaiknya dilakukan tahap preoptimasi sebelum menentukan nilai faktor untuk dimasukkan

kedalam RSM, guna dihasilkannya hasil akhir dari grafik respon permukaan dalam bentuk 3

dimensi dengan tampilan bentuk yang bagus yaitu berupa payung yang menggambarkan

kondisi optimum ekstraksi. Faktor optimasi dapat ditambahkan dengan faktor yang lebih

beragam guna memperoleh kondisi ekstraksi yang lebih optimum dengan perolehan kadar

resveratrol yang jauh lebih tinggi.


Daftar Referensi Bobo-Garcia. Gloria, Arroqui. Cristina, Virseda. P.(2014). Intra-laboratory validation of

microplate methods for total phenolic content and antioxidant activity on plyphenolic extracts, and comparison with conventional spectrophotometric methods. Journal of Agricultural and Food Chemistry.

Bradley, N. (2007). The Response Surface Methodology. Indiana University of South Bend,

73. Du, F.; Xiao, X.; Li, G. (2007). Application of ionic liquids in the microwave-assisted

extraction of trans-resveratrol from Rhizma Polygoni Cuspidati. Journal Chromatography A, 1140, 56–62.

E. Kato, Y. Tokunaga, and F. Sakan, “Stilbenoids isolated from the seeds of melinjo (Gnetum

gnemon L.) and their biological activity,” Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 57, no. 6, pp. 2544–2549, 2009.

Konno, H., et al. (2013). Melinjo (Gnetum gnemon L.) seed extract decreases serum uric acid

levels in nonobese Japanese males: A randomized controlled study. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.

Routray, W., Orsat, V., 2012. Microwave-assisted extraction of flavonoids: a review. Food Bioprocess Technol. 5 (2), 409-424.

Souto, A.A., Carneiro, M.C., Seferin, M., Senna, M.J.H., Conz, A., & Gobbi, K. (2001). Determination of trans-Resveratrol Concentrations in Brazilian Red Winesby HPLC. Journal of Food Composition and Analysis, 14(4), 441–445.

Sunanto, Hatta. 1991. Budidaya Melinjo dan Usaha Produksi Emping. Yogyakarta : Kanisius. Tang, B., Bi, W., Tian, M., & Row, K. H. (2012). Application of ionic liquid for extraction

and separation of bioactive compounds from plants. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 904, 1–21.

Yu, P., Dong, L., Zhang, Y., Chen, W., Xu, S., Wang, Z., Liang, G. (2015). Design, synthesis and biological activity of novel asymmetric C66 analogs as anti-inflammatory agents for the treatment of acute lung injury. European Journal of Medicinal Chemistry, 94(15), 436–446.

Zhang, Q., Bian, Y., Shi, Y., Zheng, S., Gu, X., Zhang, D., et al. (2015). An economical and efficient technology for the extraction of resveratrol from peanut (Arachis hypogaea) sprouts by multi-stage countercurrent extraction. Food Chemistry, 179, 15–25.

Zhang, Z., Liu, L., Li, H., & Yao, S. (2009). Synthesis, characterization and evaluation of uniformly sized core-shell imprinted microspheres for the separation trans-resveratrol from giant knotweed. Applied Surface Science, 255(23), 9327–9332.


Lampiran 1. Tabel Persentase Rendemen Ekstrak Biji Melinjo

Sampel ekstraksi

Berat ekstrak kering

(mg)

Persentase perolehan ekstrak (%)

1 8,0 0,8 2 9,0 0,9 3 20,1 2,01 4 10,6 1,06 5 38,0 3,8 6 15,0 1,5 7 26,0 2,6 8 18,0 1,8 9 9,6 0,96 10 11,0 1,1 11 4,6 0,46 12 143 14,3 13 13,4 1,34 14 78,0 7,80 15 12,3 1,23 16 54,6 5,46 17 46,0 4,60


Lampiran 2. Hasil Penetapan Kadar fenolik Total Ekstrak Biji Melinjo

Sampel Ekstrak Absorbansi I

(765 nm)

Absorbansi II

(765 nm)

Absorbansi

rata-rata (765

nm)

Kadar Fenolik

Total

(mg/g GAE)

Koefisien

Variasi

1 1,7694 1,7766 1,773 0.7638 0,28715

2 0,6184 0,64 0,6292 0.2191 2,42744

3 1,7936 1,7532 1,7734 0.7640 1,61086

4 1,2071 1,2486 1,2278 0.5042 2,38994

5 1,6527 1,7301 1,6914 0.7250 3,23578

6 2,6602 2,6612 2,6607 1.1865 0,02657

7 1,7932 1,7545 1,7738 0.7642 1,54296

8 1,2405 1,1198 1,1801 0.4815 7,23194

9 0,7474 0,8221 0,7847 0.2932 6,73091

10 1,7639 1,5847 1,6743 0.7168 7,56815

11 0,6029 0,5904 0,5966 0.2036 1,48141

12 2,1314 2,0941 2,1127 1.7365 1,24837

13 1,8562 1,7767 1,8164 0.7845 3,09477

14 3,443 3,225 3,334 1.5071 4,62355

15 2,496 2,308 2,402 1.0633 5,53439

16 1,5153 1,6626 1,5889 0.6761 6,55507

17 2,559 2,3801 2,4695 1.0955 5,12224


Lampiran 3. Hasil Penetapan Kadar Resveratrol Ekstrak Biji Melinjo

Sampel

Ekstrak

Area I

(mV)

Area II

(mV)

Area rata-rata

(mV)

Kadar Resveratrol

(mg/g)

1 1608242 1606649 1607445,5 0,042

2 595169 640837 618003 0,015

3 1680282 1661459 1670870,5 0,043

4 917253 915918 916585,5 0,023

5 1876697 1877858 1877277,5 0,049

6 1196986 1195384 1196186,5 0.031

7 1848288 1852901 1850594,5 0,048

8 1008264 1001709 1004986,5 0,026

9 475607 477460 47653,5 0,011

10 1371496 1372384 1371940 0,035

11 370720 371005 370862,5 0,009

12 2282348 2259551 2270949,5 0,059

13 1151617 1150571 1151094 0,029

14 1091035,1 1089023,3 1090029,2 0,028

15 802394 804015 803204,5 0,020

16 1529892 1528216 1529054 0,040

17 1393376 1407608 1400492 0,036


Aplikasi 1-Butil-3-Metilimidazolium Klorida [Bmim]Cl ...

Documents

Transcript of Aplikasi 1-Butil-3-Metilimidazolium Klorida [Bmim]Cl ...