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Trabajo fin de grado.
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TRABAJO FIN DE GRADO
QO-1: Aplicación de la interacción carbohidrato proteína
al aislamiento de lectinas de fuentes naturales
Alberto Valero Delgado
Granada, Junio 2015
Grado en Bioquímica
Curso 2014-2015
Lista de abreviaturas Orden alfabético
BSA albúmina de suero bovino
ConA concanavalina A.
cm-1 centímetros recíprocos.
H2O2 peróxido de hidrógeno.
HEPES ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-etano-sulfónico.
Lectina-HRP lectina-peroxidasa de rábano picante, siglas del inglés “horseradish peroxidase”.
nm nanómetros.
PBS tampón fosfato salino, siglas del inglés “phosphate buffered saline”.
PBST tampón fosfato salino con tween 20.
PHA fitohemaglutinina
PNA aglutinina del cacahuete, siglas del inglés “peanut agglutinin”.
r.p.m. revoluciones por minuto.
Tox temperatura de oxidación.
UEA aglutinina de Ulex europeanus.
WGA aglutinina del germen de trigo, siglas del inglés “wheat germ agglutinin”.
Resumen
Las lectinas son proteínas que poseen la capacidad de reconocer determinadas secuencias de
carbohidratos. Este reconocimiento propicia una unión no covalente y reversible entre la lectina
y los carbohidratos. Las lectinas se encuentran mayoritariamente en vegetales, lo que las hace un
componente presente en la dieta. Además, se ha demostrado que muchas de ellas resisten la
proteólisis estomacal e incluso altas temperaturas. Estas características permiten a las lectinas
pasar la barrera estomacal y unirse a enterocitos intestinales, donde pueden afectar el metabolismo
local. Incluso se ha descrito que un pequeño porcentaje de estas lectinas pueden pasar al torrente
sanguíneo y producir problemas sistémicos, convirtiéndose en agentes alérgenos. Para saber más
acerca de las lectinas son necesarias resinas o polímeros capaces de aislarlas a gran escala
mediante cromatografía de afinidad. Con las resinas comerciales actuales, el escalado se convierte
en una tarea cara y son necesarias alternativas económicas y fiables. Entre estas alternativas, el
entrecruzamiento de glicoproteínas supone una forma rápida, barata y reproducible de lograr una
resina con un amplio abanico de carbohidratos expuestos a la unión de lectinas. En este trabajo la
fuente de glicoproteínas empleada fue la clara de huevo de gallina. Se obtuvo un polímero
funcional que se utilizó para la detección de lectinas resistentes a un proceso de cocción. Se
emplearon alubias rojas cocinadas (Phaseolus vulgaris) como posible fuente de lectinas
resistentes. Alubias procedentes de un plato precocinado y enlatado de fabada. Los resultados
confirmaron una posible existencia de lectinas de unión a N-acetilglucosamina y resistentes a las
altas temperaturas de cocción en esta especie.
Abstract
Lectins are proteins that can recognize several sequences of carbohydrates. This recognition
allows a non-covalent and reversible union between lectin and carbohydrates. Lectins are mainly
found in vegetables this means they are a common component in our diet. Furthermore, it has
been proved that many of them can withstand stomach proteolysis and even high temperature.
These features allow lectins to go through the stomach wall and join intestinal enterocytes and
so they may affect local metabolism. Besides, it has been proved that a small amount of it can
even enter the blood flow and cause systemic difficulties becoming into allergenic elements.
Resins or polymers are necessary in order to know more about lectins and for large-scale
isolation of them by affinity chromatography. Using present day commercial resins, escalate
becomes an expensive task and that is the reason why trustable and economical alternatives are
necessary. Amongst these alternatives, crosslinking of glycoprotein becomes a cheap, inexpensive
and reproducible way to achieve a resin with a wide range of carbohydrates exposed to protein
bound. In this study the source of glycoprotein used was the albumen of hen eggs. A functional
polymer was obtained which was used to detect lectins resistant to a boiling process. Cooked
kidney beans (Phaseolus vulgaris) as a possible source of resistant lectins were used, just beans
from a pre-cooked and canned meal. Results confirmed a possible existence of lectins that bind
N-acetylglucosamine and resist high cooking temperatures in this specie.
Índice
1. Introducción…………………………………………………………………………….1
2. Objetivos………………………………………………………………………………...5
3. Plan de trabajo………………………………………………………………………….7
4. Metodología……………………………………………………………………………..9
4.1 Síntesis y extracción de los polímeros………………………………………………9
4.2 Caracterización de los polímeros……………………………………………………9
4.2.1 Análisis elemental y análisis termogravimétrico…………………………...9
4.2.2 Espectro infrarrojo………………………………………………………...10
4.2.3 Medida de la funcionalidad del polímero frente a lectina-HRP…………..10
4.3 Ensayo frente a fuente natural……………………………………………………...11
5. Resultados y discusión………………………………………………………………...13
5.1 Síntesis de los polímeros…………………………………………………………...13
5.1.1 Síntesis con divinil sulfona………………………………………………..13
5.1.2 Síntesis con epiclorhidrina………………………………………………...14
5.2 Extracción y secado de los polímeros sintetizados………………………………...15
5.3 Caracterización de los polímeros sintetizados……………………………………..15
5.3.1 Análisis elemental…………………………………………………………16
5.3.2 Espectro infrarrojo………………………………………………………...16
5.3.3 Análisis termogravimétrico………………………………………………..17
5.3.4 Ensayo con lectinas-HRP………………………………………………….18
5.4 Aislamiento y detección de lectinas en fabada cocinada…………………………..20
6. Conclusiones…………………………………………………………………………...24
Bibliografía…………………………………………………………………………….25
Introducción
Introducción
1
1. Introducción
Las lectinas son un tipo de proteínas que tienen la capacidad de unirse específicamente a
monosacáridos u oligosacáridos. Estas uniones son no covalentes y reversibles. Comprenden
puentes de Hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, de Van Der Waals o atracciones dipolo. Una
lectina tiene, por tanto, la capacidad de discriminar entre secuencias de carbohidratos y ser
selectiva en su unión a ellos. Aunque las lectinas alcanzan su mayor expresión en tejidos
vegetales, están presentes también en animales e incluso microorganismos. Su amplia presencia
en la naturaleza está vinculada con fenómenos regulatorios, adhesivos y de defensa.[1] Se ha
demostrado que algunas lectinas son expresadas en plantas como mecanismo de defensa ante el
ataque de agentes patógenos e incluso algunas tienen efectos insesticidas.[2]
Las lectinas comprenden un grupo ampliamente heterogéneo desde el punto de vista bioquímico
y estructural. Existen lectinas con un único sitio de unión a carbohidratos (Merolectinas), con dos
o más sitios de unión (Hololectinas) o incluso con dominios catalíticos (Quimerolectinas).
La alta expresión de las lectinas en los vegetales provoca que éstas estén muy presentes en
alimentos consumidos diariamente, siendo un componente de nuestra dieta. Se ha demostrado que
algunas lectinas son resistentes a las condiciones proteolíticas del estómago así como a la
temperaturas alcanzadas durante una cocción.[1] A su vez, lectinas que resisten estas duras
condiciones pueden unirse a los enterocitos intestinales, vía reconocimiento de carbohidratos
superficiales, e interferir en el metabolismo local.[3] Estudios en ratas, incluso han demostrado la
entrada al torrente circulatorio de un pequeño porcentaje de lectinas ingeridas, desencadenando
problemas sistémicos.[1] Estos problemas son fruto de la capacidad hemaglutinadora de las
lectinas, siendo ésta una propiedad a tener en cuenta a la hora de catalogar la toxicidad de una
lectina.
Todos estos hallazgos generaron el inicio de una corriente a finales de los 90, encabezada por
Peter J. D’Adamo, en la cual se defendía y se defiende la instauración de una dieta personalizada
basada en el tipo sanguíneo del individuo. D’Adamo argumenta que la secuencia de carbohidratos
expuesta por las células sanguíneas determina los alimentos a ingerir, dependiendo de las lectinas
mayoritarias en estos. De esta forma cataloga a los alimentos en tres grupos: muy beneficiosos,
neutros y no aconsejables.[4] Esta organización se basa en las posibles uniones lectina-eritrocito.
D’Adamo sostiene que parte de las lectinas ingeridas pasan a la sangre, donde pueden reconocer
específicamente el patrón glucídico expuesto en la superficie de los glóbulos rojos. Como este
patrón varía de uno a otro tipo sanguíneo, cada grupo debe adaptar su nutrición, evitando ciertas
lectinas. Pese a haber auto-publicado algunos ensayos en los que pone a prueba la dieta del tipo
sanguíneo, D’Adamo cuenta con detractores en el ámbito científico, ante la falta de pruebas
concluyentes sobre los beneficios reales de dicha dieta. Este debate quizá sirvió para que las
lectinas atrajesen la atención de la comunidad científica y es, en parte, un incentivo más para la
realización de este trabajo fin de grado.
Diversos estudios nutricionales, basados en la toxicidad de lectinas, han sido realizados desde
entonces. Un ejemplo de ello son los estudios que conciernen a la toxicidad de las alubias rojas,
especie Phaseolus vulgaris. Las alubias rojas son ampliamente consumidas a nivel mundial
debido a su alto contenido en proteínas y su valor nutricional. Sin embargo, existen casos
detallados en los que el consumo de alubias rojas desencadena efectos adversos como vómitos,
náuseas o diarrea.[1] Esto se achaca al alto contenido en lectinas presentes en la alubia roja. De
hecho, es en Phaseolus vulgaris donde la fitohemaglutinina (PHA) se encuentra en mayor
Introducción
2
cantidad. Estos elevados niveles de PHA en la alubia roja han hecho que países como Sudáfrica
prohíban la importación de este producto, debido a la recopilación de casos toxicológicos
registrados.[5] Además de PHA, lectina capaz de aglutinar células sanguíneas, en P. vulgaris han
sido descritas otras lectinas.[5] Aunque procesos de cocción suelen destruir gran parte de ellas,
algunas pueden conservar su funcionalidad. La capacidad de muchas de ellas de resistir las
condiciones estomacales hace que se puedan producir reacciones adversas tras la ingestión de
alubias. Entre estas reacciones adversas se encuentran la unión a enzimas digestivas,
inactivándolas; o la unión al epitelio de enterocitos, mermando la reparación de la membrana o
alterando el borde en cepillo con una consiguiente absorción de nutrientes irregular.[5] Estas
reacciones explican, en parte, los síntomas anteriormente descritos.
Por otro lado, es grande el potencial que se les intuye a las lectinas, en aspectos como su papel en
la respuesta a patógenos en plantas o su papel en microorganismos o animales. Este potencial,
junto a las complicaciones nutricionales, fuerza la necesidad de aislar lectinas de sus fuentes
naturales para facilitar su estudio. Sus condiciones de unión a carbohidratos las hacen idóneas
para su extracción y purificación mediante cromatografía de afinidad, donde una elución con
azúcares las liberaría de la matriz cromatográfica.
Para el aislamiento de lectinas mediante cromatografía de afinidad, en primer lugar, las lectinas
deben ser liberadas de su oclusión en la fuente natural. Para ello, métodos de lisis y homogenizado
suelen ser suficientes. La solución obtenida es, en ocasiones, tratada con diferentes tipos de
eritrocitos. Esta medida tiene como objetivo dilucidar la especificidad de las lectinas presentes en
el extracto, en base a la detección de actividad aglutinadora. Posteriormente, la solución con
lectinas es pasada a través de una resina, encargada de realizar la cromatografía. En las resinas
comerciales el agente adsorbente es usualmente un carbohidrato, ya sea mono-, di- o polisacárido.
Estos agentes adsorbentes se encuentran unidos covalentemente a matrices de carácter glucídico.
En ocasiones, estos enlaces se realizan mediante divinil sulfona o epóxidos como la
epiclorhidrina,[6] ambos compuestos empleados en este trabajo fin de grado. Comercialmente,
existen varias matrices de estas características (Sefarosa, Mini-leak agarosa, Toyopearl, Synsorb,
Seralosa y Spheron entre otras).
En algunos estudios son necesarias cantidades elevadas de lectina y los soportes comerciales,
cuando son aplicados a extracciones a gran escala, se convierten en una losa económica. Además,
en muchas ocasiones se desconoce la especificidad de algunas lectinas que se desean purificar, lo
que dificulta la elección de la resina a emplear. Esta dificultad es fruto de que la mayor parte de
las resinas comerciales exponen un limitado abanico de carbohidratos.
Ante esta problemática, nuevas alternativas son exploradas. Para una purificación a gran escala,
una matriz debe tener tres condiciones fundamentales: expresar una amplia diversidad de sitios
de unión con lectinas; ser económicamente asequible; ser almacenable a condiciones normales.[7]
Una buena alternativa, para lograr estos tres puntos, es el entrecruzamiento directo de
glicoproteínas. Entrecruzando glicoproteínas mediante la porción proteica, la resina o polímero
sintetizados lograrían exponer una amplia variedad de secuencias de carbohidratos. Esta
inespecificidad crearía un material polivalente que permitiría el aislamiento de lectinas no
descritas. Además se evita el uso de matrices comerciales, disminuyendo notablemente los gastos.
Una fuente barata de glicoproteínas es el huevo de gallina. La clara de huevo de gallina contribuye
en aproximadamente un 60% del peso total de un huevo, en ella hay del orden de un 13% de
Introducción
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proteína y un 1% de carbohidratos.[8] Es decir, en una clara de huevo de unos 36 gramos, puede
haber en torno a 5 gramos de glicoproteína.
Este trabajo se centra en la síntesis de polímeros a partir de las glicoproteínas presentes en la clara
de huevo. Estos polímeros permitieron un aislamiento selectivo mediante la elución con distintos
azúcares. Para la síntesis de los polímeros se emplearon, por lado, divinil sulfona y por otro
epiclorhidrina como agentes de entrecruzamiento. Posteriormente, los polímeros fueron
evaluados en búsqueda del más eficiente en la unión con lectina. El polímero elegido se empleó
para la búsqueda de lectinas resistentes a procesos de cocción en la alubia roja (Phaseolus
vulgaris). Las alubias rojas empleadas procedían de un plato precocinado y enlatado de fabada.
Objetivos
Objetivos
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2. Objetivos
El objetivo principal del trabajo realizado fue la detección de lectinas funcionales en alimentos
cocinados. Para alcanzar este objetivo principal fueron necesarios unos avances previos. Se podría
decir, por lo tanto, que los objetivos específicos fueron:
- Síntesis de polímeros polivalentes a partir del entrecruzamiento de glicoproteínas
presentes en la clara de huevo de gallina.
- Utilidad de estos polímeros ante la unión específica con un rango variado de lectinas.
- Aislamiento y detección de lectinas que resistan procesos de cocción, empleando uno de
los polímeros sintetizados.
Plan de trabajo
Plan de trabajo
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3. Plan de trabajo
El plan de trabajo se puede resumir en tres bloques principales, detallados a continuación por
orden cronológico.
1. Síntesis de polímeros a partir del entrecruzamiento de glicoproteínas presentes en la clara
de huevo.
1.1 Búsqueda de las condiciones óptimas para la síntesis.
En la búsqueda de las condiciones óptimas se probarían dos agentes de
entrecruzamiento y se variarían las condiciones de obtención para cada polímero.
Estos experimentos determinarían la mejor combinación pH, tampón y volumen de
reactivo.
2. Caracterización de los polímeros sintetizados.
2.1 Análisis elemental.
El análisis elemental tendría como fin conocer los componentes y su proporción en
los polímeros. Se podrían detectar posibles anomalías en la síntesis o se confirmaría
la correcta ejecución de éstas.
2.2 Espectro IR.
El espectro IR, además de caracterizar los polímeros, se podría usar para comprobar
las características de los mismos.
2.3 Medida de su funcionalidad mediante el uso de diferentes lectinas-HRP comerciales.
Este es el análisis que determinaría si los polímeros serían válidos para el bloque 3.
2.4 Análisis termogravimétrico.
El análisis termogravimétrico serviría como una medida más de caracterización de
los polímeros. Determinaría el grado de resistencia a la descomposición térmica. Esta
medida generaría un perfil único para cada polímero.
3. Aislamiento y detección de lectinas presentes en alimentos cocinados.
3.1 Incubación del mejor polímero sintetizado con extracto de alubias rojas (Phaseolus
vulgaris) procedentes de una lata de fabada “Litoral”. Tras incubación, elución
secuencial con soluciones de distintos azúcares.
3.1.1 Medida de la absorbancia de los eluatos a 280nm.
Un pico de absorbancia en el eluato de alguno de los azúcares determinaría
la presencia de lectina eluida.
Metodología
Metodología
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4. Metodología
4.1 Síntesis y extracción de los polímeros
Se emplearon huevos de gallina tamaño L, a los cuales se les extrajo la clara. La yema fue
desechada. En un matraz de fondo redondo se añadieron las claras y el tampón de reacción (Tabla
1). Se homogenizó en agitación hasta que la mezcla perdió el aspecto gelatinoso propio de la clara
de huevo. En uno de los casos este homogenizado fue calentado a 80ºC durante 30 minutos en un
baño de aceite. Posteriormente se añadió el reactivo de entrecruzamiento, divinil sulfona o
epiclorhidrina y se dejó reaccionando durante toda la noche en agitación.
Bajo las condiciones resumidas en la Tabla 1, se obtuvieron partículas insolubles en suspensión
en los dos primeros casos (polímeros D8 y D10). Se bloqueó con β-mercaptoetanol a razón 0,7
ml por ml de divinil sulfona en reacción. Para la extracción de las partículas insolubles, ambas
soluciones fueron tratadas con NaCl al 20% p/v. El material precipitado fue filtrado mediante
succión. Durante el filtrado se lavó el material con abundante agua hasta pérdida casi total de
absorbancia a 280 nm del líquido difundido. Posteriormente el material fue lavado con metanol y
éter. El material obtenido tras los lavados se introdujo en una estufa de ventilación forzada a
temperatura máxima de 45ºC y presión mínima de 150 mb, hasta su completo secado. En las otras
dos condiciones (E10 y E12) el volumen de reacción gelificó totalmente tras estar reaccionando
toda la noche. El material gelificado fue introducido directamente en la estufa de ventilación
forzada bajo las mismas condiciones que para D8 y D10.
Tras el secado, los materiales fueron pulverizados y caracterizados. La pulverización se llevó a
cabo con la ayuda de un mortero.
4.2 Caracterización de los polímeros
Se realizaron análisis elemental, espectroscopía infrarroja, análisis termogravimétrico y ensayo
frente a lectinas-HRP para la caracterización de los polímeros sintetizados.
4.2.1 Análisis elemental y análisis termogravimétrico
Ambos análisis fueron realizados por el centro de instrumentación científica de la Universidad de
Granada.
Tabla 1. Condiciones de reacción
Polímero Características homogenizado Reactivo V de reacción
D8
6 claras (256,5 g), 30 ml tampón HEPES 0,5M pH8.
Baño 80ºC 30 min.
Divinil sulfona (9 ml)
310 ml
D10 6 claras (270g), 500 ml tampón carbonato 0,3M
pH10.
Divinil sulfona (3 ml) 775 ml
E10 5 claras (227g), 250 ml tampón carbonato 0,3M
pH10.
Epiclorhidrina (22 ml) 480 ml
E12 5 claras (227g), 250 ml tampón carbonato 0,3M,
pH12.
Epiclorhidrina (22 ml) 480 ml
Metodología
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4.2.2 Espectro infrarrojo
Se realizó colocando una muestra de polímero pulverizado en el detector de un espectrofotómetro
infrarrojo Spectrum Two de Perkin-Elmer.
4.2.3 Medida de la funcionalidad del polímero frente a lectina-HRP comercial
4.2.3.1 Incubación
Se prepararon cuatro soluciones de concentración 1:1000 de cada una de las cuatro lectinas-HRP
a ensayar (ConA, PNA, UEA y WGA). Fueron empleadas lectinas-HRP comerciales de la casa
Sigma-Aldrich. Cada lectina poseía distinta especificidad por carbohidratos. La especificidad de
las lectinas queda reflejada en la Tabla 2. Se suplementó la solución de ConA con 1mM de iones
Ca2+ y Mn2+. Alícuotas de cada polímero fueron repartidos en cuatro tubos eppendorf, a los cuales
fueron añadidos 800 μl de solución de lectina-HRP. Se incubó durante toda la noche a temperatura
ambiente. Tras la incubación se centrifugó a 14000 r.p.m. durante 5 minutos y se recolectó el
sobrenadante. Se lavó dos veces añadiendo a cada tubo 1 ml de PBST, y dejando en agitación
durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó a 14000 r.p.m. durante 5 minutos en
cada ocasión y se midió la actividad del sobrenadante tras el segundo lavado, verificando la
ausencia de actividad peroxidasa.
4.2.3.2 Elución
Se prepararon soluciones de Manosa, Fucosa, N-Acetilglucosamina 0,5 M y Lactosa 0,25 M. La
solución de Manosa fue suplementada con 1mM de iones Ca2+ y Mn2+. Se añadieron 300 μL de
solución del azúcar correspondiente en cada tubo eppendorf y se incubó 25 minutos a temperatura
ambiente en agitación. Se centrifugó a 14000 r.p.m. 5 minutos y se recogió el sobrenadante.
4.2.3.3 Medida de la actividad peroxidasa
Se añadieron 50 μl de cada muestra a revelar en un microplaca de 96 pocillos. Se emplearon como
muestras a medir las cuatro soluciones de lectina-HRP a concentración 1:1000, los sobrenadantes
extraídos tras la primera incubación y los sobrenadantes extraídos tras la elución con soluciones
de azúcar.
Se preparó solución de revelado con 10 mL de tampón citrato, 5 mg de 1,2-fenilendiamina
dihidrocloruro y 30 μl de H2O2. Para el revelado se dosificaron 150 μl de esta solución de revelado
a cada pocillo. La medida de actividad se realizó a 492 nm mediante un lector de placas en 15
ciclos de 2 minutos desde adición de la solución de revelado.
Tabla 2. Especificidad lectina-azúcar
Lectina Azúcar más afín
ConA
Manosa
PNA Lactosa
UEA Fucosa
WGA N-Acetilglucosamina
Metodología
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4.3 Ensayo frente a fuente natural
4.3.1 Obtención del extracto de alubias
El extracto de alubias se obtuvo a partir de una lata de fabada asturiana cocinada “Litoral” de 435
gramos. Con la ayuda de una licuadora se produjo un homogenizado exclusivamente con las
alubias, eliminando todos los demás ingredientes. Para la homogenización se añadieron 200 ml
de tampón PBS. Se obtuvo un volumen de licuado de 300 ml. Este licuado se filtró mediante
succión. El líquido difundido fue el extracto empleado para el ensayo.
4.3.2 Incubación
Se introdujeron en dos tubos Falcon de 50 ml alícuotas de 1g de polímero E10. Las muestras de
polímero se lavaron 3 veces. Para su lavado se añadieron 45 ml de PBS a cada tubo y se mantuvo
en agitación durante 5 minutos. Se centrifugaron a 3000 r.p.m. durante 5 minutos eliminando el
sobrenadante y repitiendo el proceso hasta pérdida casi total de absorbancia a 280 nm de estos
sobrenadantes.
Uno de los tubos (control) se llenó con 45 ml de PBS, el otro tubo (problema) se llenó con 45 ml
de extracto de fabada. Al tubo problema se le añadieron iones Ca2+ y Mn2+ a razón 3 mM. Ambos
tubos se dejaron incubar durante 3 horas en agitación y temperatura ambiente. Tras el periodo de
incubación se centrifugaron a 3000 r.p.m. 5 minutos y se eliminaron los sobrenadantes.
Posteriormente se realizaron hasta un total de 6 lavados con 45 ml de PBS para eliminar posibles
contaminantes que no hubiesen hibridado con el polímero.
4.3.3 Eluciones
Tras la incubación, la extracción de las posibles lectinas presentes en el polímero se realizó
mediante eluciones con soluciones de azúcar. Las soluciones empleadas fueron N-
acetilglucosamina, Manosa, Glucosa, Fucosa, todas ellas a concentración 0,5 M y Lactosa a 0,25
M. Se realizaron periodos de incubación de 15 minutos en agitación, con 4 ml de cada solución
de azúcar. Se recogieron todos los eluatos para su posterior medida de absorbancia. Entre
incubaciones se lavó con 45 ml de PBS 2 veces, hasta pérdida de absorbancia a 280 nm. Todos
los pasos fueron mimetizados en el tubo control.
4.3.4 Medida a 280 nm
Se midió la absorbancia a 280 nm de los eluatos mediante un espectrofotómetro ultravioleta-
visible. La búsqueda de picos de absorbancia se realizó mediante la diferencia entre eluatos
problema y control.
Resultados y discusión
Resultados y discusión
13
5. Resultados y discusión
5.1 Síntesis de los polímeros
Se probaron dos reactivos de entrecruzamiento a diferentes condiciones. Divinil sulfona se
empleó por ser un reactivo común en el equipo de investigación en el que se realizaron los
experimentos. El uso de epiclorhidrina se sustentó en datos bibliográficos.[6, 9, 10]
5.1.1 Síntesis con divinil sulfona
El entrecruzamiento mediante divinil sulfona de las glicoproteínas presentes en la clara de huevo
demostró muy poco rendimiento. Este rendimiento fue superado en más de diez veces por los
polímeros sintetizados con epiclorhidrina (Tabla 3).
El rendimiento en la síntesis de D8 fue un 1% superior al alcanzado en la síntesis de D10. Se
intuye que la desnaturalización de las glicoproteínas de la clara en D8 antes de la reacción de
entrecruzamiento expuso en mayor medida los grupos reactivos de éstas. Sin embargo, se
hipotetiza que esta diferencia en el rendimiento, así como el bajo rendimiento de ambos en
comparación con E10 y E12, fue debido a las condiciones alcalinas del medio de reacción, pH 8
para D8 y pH 10 para D10. El pH alcalino era necesario para que se desarrollase la reacción
esperada (Imagen 1). Esta reacción consistía en la unión de los dos extremos de la molécula de
divinil sulfona a dos grupos amino de dos glicoproteínas diferentes, produciéndose así el
entrecruzamiento entre ambas. La unión de las glicoproteínas mediante grupos tiol o hidroxilo era
también contemplada. La alcalinidad del medio era necesaria para que los grupos amino, tiol o
incluso hidroxilo, procedentes de la proteína, adoptasen un carácter nucleofílico suficiente para
iniciar el mecanismo detallado abajo.
Imagen 1. Mecanismo de reacción con divinil sulfona esperado
La reacción (Imagen 1) transcurre gracias a la presencia de dos zonas con densidad de carga
positiva en los extremos de la molécula de divinil sulfona (1). La tendencia a la atracción de
electrones por parte del átomo de azufre hace que estos extremos (carbonos beta) sean
Tabla 3. Rendimiento de los polímeros sintetizados
Polímero Peso clara
(g)
Peso material
sintetizado (g)
Rendimiento
(%)
D8
256,5
4,1
1,59
D10 270 1,61 0,59
E10 227 40,4 17,79
E12 227 41,3 18,19
Resultados y discusión
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susceptibles al ataque de un nucleófilo. En medio básico, las aminas procedentes de las
glicoproteínas se desprotonan, convirtiéndose en buenos agentes nucleófilos. Estas aminas atacan,
por tanto, a estos carbonos beta electrón deficientes (1 y 3) de manera secuencial. Se producen
sendas adiciones nucleofílicas que originan la adhesión covalente de dos glicoproteínas al reactivo
de entrecruzamiento (2 y 4).
Sin embargo, al aumentar la alcalinidad del medio a valores de pH 8 o superiores, se intuye que
lo que sucedió mayoritariamente fue lo mostrado en la Imagen 2.
Imagen 2. Mecanismo de reacción con divinil sulfona a pH elevado
Al aumentar el pH del medio la amina secundaria, procedente de la glicoproteína que ha
interaccionado en primera instancia con la divinil sulfona, se torna muy reactiva. Esto hace que
el ataque nucleofílico intramolecular (b) sea más probable que un ataque nucleofílico
intermolecular, en el que se incorporaría una nueva glicoproteína al otro extremo de la molécula
de divinil sulfona. Como resultado se obtienen glicoproteínas cuyos grupos amino son bloqueados
con divinil sulfona, formando un compuesto cíclico muy estable, la tiomorfolina (c).
Este mecanismo intramolecular justificaría el bajo rendimiento obtenido en la síntesis de ambos
polímeros, ya que realmente son poco probables los entrecruzamientos intermoleculares entre dos
glicoproteínas en estas condiciones. A su vez, esta hipótesis también responde al mayor
rendimiento obtenido a pH 8, ya que a este pH las aminas secundarias no son tan reactivas como
a pH 10, con lo que las interacciones intermoleculares son algo más probables.
5.1.2 Síntesis con epiclorhidrina
Ante el bajo rendimiento obtenido con divinil sulfona, se optó por emplear epiclorhidrina como
agente de entrecruzamiento en la síntesis de otros dos polímeros, E10 y E12. Además de por
sustento bibliográfico en el uso de este reactivo para el entrecruzamiento de proteínas, el
mecanismo molecular de acción de dicho proceso con epiclorhidrina (Imagen 3) evitaba el
problema surgido con divinil sulfona.
En el rango de pH empleado para la síntesis de ambos polímeros, las aminas primarias presentes
en las glicoproteínas del huevo ejecutan un ataque nucleofílico sobre el carbono CH2 del epóxido
de la epiclorhidrina (1 – Imagen 3). Se genera un intermediario (2 – Imagen 3) en el cual se
produce un ataque nucleofílico intramolecular del grupo hidroxilo sobre el carbono unido al
átomo de cloro. Se genera así un nuevo epóxido (3 – Imagen 3) y se libera el átomo de cloro. El
carbono CH2 de este segundo epóxido es otro punto con densidad de carga positiva, por lo que es
susceptible al ataque por un nucleófilo (3 – Imagen 3). Sin embargo, en esta ocasión, la reacción
intramolecular llevada a cabo por la amina secundaria es muy poco favorable, debido a un fuerte
Resultados y discusión
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impedimento estérico (3 – Imagen 3). Por lo tanto, la adición nucleofílica por parte de una amina
procedente de una segunda proteína está mucho más favorecida. De esta manera, se genera un
entrecruzamiento entre dos proteínas (4 – Imagen 3).
Imagen 3. Mecanismo de reacción con epiclorhidrina
5.2 Extracción y secado de los polímeros sintetizados
Las reacciones de entrecruzamiento con divinil sulfona dieron como resultado soluciones de
aspecto mucilaginoso con partículas de polímero en suspensión. El filtrado por succión de estas
soluciones gomosas no dio resultado. Se empleó NaCl al 20% p/v para poder romper esa
estructura viscosa y al mismo tiempo precipitar el polímero. La elevada fuerza iónica aplicada
sobre la solución desestabilizó las estructuras de carácter glucídico, enlazadas no covalentemente,
desapareciendo el aspecto mucilaginoso. A su vez, la sal ejerció una competitividad por el soluto
(agua) con las proteínas que formaban el polímero. Esto provocó un descenso en la solubilidad
del polímero, que acabó precipitando. Este precipitado fue filtrado mediante succión. Abundantes
lavados con agua destilada fueron aplicados para la eliminación de las sales y las posibles
proteínas no entrecruzadas. Los lavados con metanol y éter eliminaron gran cantidad del agua
presente en los polímeros, acelerándose el posterior proceso de secado en la estufa.
Por otro lado, se produjo una gelificación en las reacciones con epiclorhidrina. La reacción
evolucionó con un alto rendimiento, por lo que no existían partículas en suspensión, como en los
casos con divinil sulfona. Ambos geles fueron introducidos directamente en la estufa de secado.
Una vez secos, conformarían los polímeros E10 y E12.
5.3 Caracterización de los polímeros sintetizados
La caracterización de los polímeros dio pruebas sobre su composición, propiedades y
funcionalidad. Se obtuvieron análisis elementales y termogravimétricos, se realizó un espectro IR
y para culminar se realizó un ensayo con lectinas-HRP.
Resultados y discusión
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5.3.1 Análisis elemental
Datos sobre la composición de los cuatro polímeros sintetizados fueron aportados por el análisis
elemental. En la Tabla 4 se recogen las cantidades proporcionales de Nitrógeno, Carbono y
Azufre que contenían los cuatro polímeros. También se muestran las relaciones
Nitrógeno/Carbono y Azufre/Carbono.
Las relaciones N/C revelaron una marcada similitud entre los cuatro polímeros. Al mismo tiempo,
valores que rondan el 0,2 en esta razón N/C, mostraron un indicio de la naturaleza proteica de los
materiales sintetizados. Por otro lado, las relaciones S/C presentaron marcadas diferencias entre
los polímeros sintetizados con divinil sulfona y los sintetizados con epiclorhidrina. Valores,
aproximadamente, 10 veces mayores fueron obtenidos para las relaciones S/C de los polímeros
D8 y D10 con respecto a las relaciones S/C en los polímeros E10 y E12. Esta diferencia demuestra
la presencia de divinil sulfona en los dos primeros polímeros, ya que como ha sido detallado
anteriormente (Imagen 1) este reactivo contiene un átomo de Azufre en su estructura molecular,
átomo que no se pierde en el proceso de entrecruzamiento. Al mismo tiempo, que el valor de esta
razón S/C sea mayor en el polímero D8 que en el D10 se justifica por el rendimiento sutilmente
superior (1%) obtenido en la síntesis del primero con respecto al obtenido en la síntesis del
segundo. Por lo tanto, al entrecruzar con divinil sulfona, cuanto más Azufre haya en el polímero
final, más entrecruzamientos se habrán producido, y por ello más pesará el material sintetizado.
Este peso aumentará en mayor medida que la cantidad de azufre ya que por cada átomo de Azufre
se suman dos proteínas al peso final.
En los otros dos casos (E10 y E12) la diferencia entre la relación S/C de uno y otro se debió a
condiciones experimentales. Al no ser polímeros entrecruzados con divinil sulfona, la cantidad
diferencial de Azufre corresponde a las características de las proteínas que los forman.
5.3.2 Espectro IR
La similitud general entre los espectros de polímero y el espectro de la BSA (Imagen 4) demostró
la naturaleza proteica de los polímeros sintetizados. El pico de absorción situado a la frecuencia
de 3279,7 cm-1 en el espectro de E10 se convierte en la diferencia más notable en esa región con
respecto a los demás espectros. En esta región situada entre los 3200 y los 3550 cm-1, es el lugar
del espectro donde absorben los grupos OH unidos a estructuras moleculares.[11] El amplio margen
entre la absorbancia de E10 en este punto y la absorbancia de los demás polímeros pudo ser un
indicio de una alta presencia de carbohidratos expuestos en la superficie de E10. Aunque es cierto
que a una frecuencia cercana (entre 3580 y 3650 cm-1) absorben también los grupos OH libres, y
que este pico se pudo deber a la presencia de agua en el polímero, la muestra empleada estaba
completamente seca, con lo que se asumió que E10 exponía muchos más carbohidratos que el
resto de polímeros, reuniendo las mejores condiciones para el aislamiento de lectinas.
Tabla 4. Resultados análisis elemental
Polímero Proporción elemental (mmoles/g) Relaciones
N C S N/C S/C
D8 9,75 38,13 1,3 0,25 0,034
D10 9,23 38,15 1,12 0,24 0,029
E10 6,95 34,69 0,17 0,2 0,004
E12 6,62 34,61 0,11 0,19 0,003
Resultados y discusión
17
Imagen 4. Espectros IR. En color negro se muestra el espectro de BSA. En morado y azul los espectros de E10 y E12
respectivamente. En naranja el espectro de D8 y en rojo el de D10. La similitud con el espectro de BSA demostró la
naturaleza proteica de los polímeros sintetizados. Los valores de transmitancia de los distintos espectros se muestran
normalizados para su comparación.
5.3.3 Análisis termogravimétrico
Se obtuvieron termogramas para cada polímero. Estos termogramas reflejan la descomposición
del material frente a un aumento de temperatura. La temperatura de oxidación (Tox) determina el
momento en el que la descomposición es más rápida. Variaciones en el valor de Tox (Tabla 5)
entre polímeros similares (E10-E12 y D8-D10) se deben al tamaño de pulverización con la que
se realizaron los análisis, ya que teóricamente, deberían ser casi idénticos.
Tabla 5. Tox polímeros
Polímero Tox (ºC)
D8 309,61
D10 292,54
E10 318,65
E12 320,64
En definitiva, el análisis termogravimétrico aporta información sobre la robustez del polímero
analizado, generándose una curva termogravimétrica característica de cada uno. Al mismo
tiempo, se suele representar también la curva DTG. Esta curva es la primera derivada de la curva
termogravimétrica frente al tiempo o a la temperatura, es decir, la velocidad de pérdida de peso
del material. La temperatura de oxidación se obtiene gracias a esta curva, siendo el punto de
temperatura donde existe un mínimo o un máximo en el parámetro que mide la velocidad de
descomposición del material. En la Imagen 6, la Tox se corresponde con un mínimo en la gráfica,
ya que la velocidad descomposición se representa como mg/min.
Resultados y discusión
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Imagen 5. Termograma de E10. En el eje x se representan el tiempo y la temperatura, en el eje y el peso del polímero.
Se observa que la pérdida de masa tiene una mayor velocidad entre los 300 ºC y los 500ºC, lugar donde se encuentra la
Tox (318,65 ºC).
Imagen 6. Curva DTG del polímero E10. Esta curva es resultado de la derivación de la curva TG (termograma). En
este caso se representa en el eje x la temperatura y el tiempo, mientras que en el eje y se representa la velocidad de
pérdida de materia como mg/min. El punto mínimo corresponde con la Tox, punto en el que la descomposición es más
rápida.
5.3.4 Ensayo con lectinas-HRP
Para evaluar la funcionalidad de los polímeros sintetizados, se realizó un ensayo con lectinas
comerciales unidas a la enzima peroxidasa de rábano picante (lectinas-HRP). De esta forma, la
interacción de la peroxidasa de estas lectinas con el peróxido de hidrógeno, presente en el medio
de revelado, generaría agentes oxidantes que atacarían al agente cromógeno (diclorhidrato de
fenilendiamina), tornándose la solución de un color detectable a 492 nm. Tras la primera
incubación entre estas lectinas-HRP y los polímeros sintetizados y una posterior centrifugación,
la medida de absorbancia del sobrenadante daría una impresión de la cantidad de lectina que se
había adherido específicamente a la matriz polimérica. Teniendo como referencia la absorbancia
de alícuotas de cada una de las lectinas-HRP, se pudo estimar el porcentaje de lectina que se unió
a cada uno de los polímeros.
Resultados y discusión
19
Imagen 7. Actividad peroxidasa procedente de lectina-HRP. En los gráficos se analizan 3 fracciones: el control de
lectina-HRP, el sobrenadante tras la incubación de los polímeros con lectina-HRP y la elución con solución de azúcar.
En los gráficos de la izquierda se muestra una comparativa entre la actividad peroxidasa del control (gris) y
sobrenadante (color). En los gráficos de la derecha se visualiza la actividad peroxidasa de los eluatos. La primera
comparativa permite saber qué porcentaje de lectina se ha unido específicamente a la resina, los gráficos de la derecha
revelan si existe lectina tras la elución de la resina. Las barras representan el error típico.
En la Imagen 7 se muestran gráficamente las absorbancias de tres fracciones, medidas en los
cuatro polímeros. La primera fracción fue la solución lectina-HRP empleada para la incubación.
La segunda, el sobrenadante tras la incubación y centrifugación del polímero. La tercera fracción
fue el eluato tras la incubación del polímero (unido a lectinas-HRP) con soluciones de
monosacárido. La comparativa entre las dos primeras fracciones reveló los porcentajes de
retención de lectina detallados en la Tabla 6.
Resultados y discusión
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Tabla 6. Capacidad de retención de los polímeros
Polímero % lectina-HRP retenida
ConA PNA UEA WGA
E10 78,76 90,95 89,54 92,54
E12 79,89 91,95 86,37 94
D8 79,88 79,28 66,91 87,88
D10 75,29 55,13 82,48 86,68
Estos porcentajes revelaron una mayor capacidad de retención de las lectinas PNA, UEA y WGA
por parte de los polímeros sintetizados con epiclorhidrina (E10 y E12), en comparación con los
dos sintetizados con divinil sulfona (D8 y D10). La unión de ConA resultó ser similar para todo
los polímeros. Esto último pudo deberse a la insuficiencia en el medio de iones Ca2+ y Mn2+,
necesarios para el correcto funcionamiento de esta lectina y que pudieron convertirse en factores
limitantes en la incubación con E10 y E12.
La medida de absorbancia en la tercera fracción sirvió para demostrar la presencia de lectina-HRP
en los polímeros. La elución secuencial con soluciones de azúcares hizo que estos se uniesen
específicamente a su lectina-HRP correspondiente, mediante una reacción de competición contra
los carbohidratos expuestos en la matriz polimérica. Esta unión (azúcar libre)-lectina-HRP
desencadenó el desprendimiento de las lectinas-HRP de los polímeros y la presencia de actividad
peroxidasa en el eluato.
5.4 Aislamiento y detección de lectinas en fabada cocinada
Ante los resultados obtenidos en la caracterización de los cuatro polímeros, se optó por E10 para
el ensayo frente a una fuente natural. El uso de uno de los polímeros sintetizados con
epiclorhidrina era una opción natural tras los resultados obtenidos en la interacción con lectinas-
HRP. Además, el hecho de poseer mucha más cantidad de estos dos materiales que de D8 o D10
decantó aún más la balanza. Seleccionar E10 en lugar de E12 tuvo que ver, en menor medida, por
el resultado obtenido en IR y en mayor medida por las condiciones a las que se obtuvo este
material. E10 se obtuvo a unas condiciones menos agresivas de pH que E12, lo que supone una
mayor economía atómica y un menor riesgo medioambiental, en caso de ser reproducido.
El uso de Phaseolus vulgaris, es objeto bibliográfico común en la detección y aislamiento de
lectinas, ya que existen varias lectinas descritas para esta especie. Sin embargo, el objetivo aquí
fue aislar lectinas funcionales que hayan resistido un proceso de cocción. Para ello se pensó en
las alubias rojas contenidas en una lata de fabada cocinada “Litoral”. El extracto obtenido de una
de estas latas fue puesto en contacto con E10 mediante una incubación a temperatura ambiente.
Posteriormente, eluciones secuenciales con distintos azúcares permitirían, no sólo averiguar si la
lata contenía lectinas funcionales, sino saber a qué azúcar eran específicas.
Para detectar la presencia de lectinas en el eluato, se midió la absorbancia de éste a 280 nm. Los
resultados quedan reflejados en los gráficos de la Imagen 8.
Resultados y discusión
21
Imagen 8. Densidad óptica a 280nm de los eluatos con cada uno de los cinco azúcares. Se encontró un pico de
absorbancia en el eluato de N-acetilglucosamina. Las barras representan el error típico.
La elución con N-acetilglucosamina presentó absorbancia a 280 nm, mientras que con el resto de
eluciones no se detectó densidad óptica. En vista de este resultado, se podría decir que se aislaron
uno o varios tipos de lectinas funcionales que se unen específicamente a N-acetilglucosamina.
Datos bibliográficos sustentan este hallazgo. En la especie Phaseolus vulgaris han sido
identificadas lectinas con especificidad por NAG.[12, 13, 14] Una búsqueda en la base de datos
LectinDB mostró, en concentro, las cuatro lectinas de unión específica a este azúcar. Estas lectinas
son Arcelin-5A, Arcelin-1, Alpha-AI-1 y PHA-L.
Arcelin-5A posee actividad defensiva[12] y Arcelin-1 incluso actividad insecticida.[14] Apha-AI-1
es una lectina inhibidora de la α-amilasa pancreática porcina[13] y PHA-L es la fitohemaglutinina,
proteína capaz de aglutinar células sanguíneas.[5] La búsqueda bibliográfica de estas lectinas en
Phaseolus vulgaris dio como resultado un caso de intoxicación por elevadas cantidades de PHA
en alubias rojas cocinadas inapropiadamente[1], reforzando los resultados obtenidos. La
fitohemaglutinina es un agente tóxico descrito en P. vulgaris.[5] Los síntomas de una elevada
ingestión de PHA son vómitos, náuseas y diarrea, síntomas que desaparecen a las horas de
haberlas consumido.[5] Una incorrecta desactivación de esta lectina (mediante altas temperaturas)
la hace convertirse en un alérgeno a tener en cuenta.[5]
En posteriores estudios, que escapan de los objetivos planteados para este trabajo fin de grado, se
podría producir una primera caracterización de las lectinas aisladas mediante una electroforesis
SDS-PAGE. Esta electroforesis permitiría la identificación del número de lectinas de diferente
peso molecular presentes en el eluato, así como su aislamiento. La banda o bandas reveladas en
la electroforesis se someterían a una nueva fase de estudio a fin de realizar una huella peptídica
de cada una de las lectinas aisladas. En la obtención de esta huella peptídica se realizarían,
mediante colaboración externa, una digestión con Tripsina y una posterior espectrometría de
masas de los fragmentos digeridos. Los espectros obtenidos para cada proteína se enfrentarían a
la base de datos Mascot. Esta base de datos se encarga de realizar análisis estadísticos
comparativos entre los espectros introducidos por el usuario y los espectros presentes en la base
Resultados y discusión
22
de datos. Los espectros contenidos en Mascot son los de proteínas ya conocidas. Por lo tanto, este
último paso revelaría si las lectinas aisladas son algunas de las descritas para Phaseolus vulgaris.
En caso de encontrarse la fitohemaglutinina (PHA) entre las lectinas eluidas, el respaldo
bibliográfico anteriormente mencionado haría suponer que la presencia funcional de esta lectina
en el plato precocinado y enlatado usado para este trabajo, sería el origen de posibles reacciones
adversas gastrointestinales tras su ingestión. Por otro lado, si las lectinas aisladas por el polímero
no se corresponden con ninguna presente en la base de datos, se podría concluir que son necesarios
más estudios en esta especie a fin de conocer las características de estas nuevas lectinas.
Conclusiones
Conclusiones
24
6. Conclusiones
La capacidad del material sintetizado, a partir de clara de huevo, de atrapar lectinas funcionales
presentes en un plato cocinado, aporta las siguientes conclusiones:
- La especie Phaseolus vulgaris posee lectinas de unión específica a NAG que resisten un
proceso largo de cocción. Aunque se requieren estudios más exhaustivos, la presencia
funcional de estas lectinas en alubias cocinadas podría tener que ver con posibles
reacciones gastrointestinales tras su ingestión.
- La síntesis de un polímero polivalente, para la unión específica de lectinas, a partir de las
glicoproteínas presentes en una fuente natural es sencilla y funcional. Podría constituir
una forma económica de obtención de polímeros universales. Polímeros aplicables a
multitud de estudios que se centren en el aislamiento y detección de lectinas.
- Ante la problemática en la obtención química de una resina universal para la extracción
de cualquier tipo de lectina, presente en una fuente natural, así como el elevado costo del
uso de estas resinas para una extracción a gran escala; el hecho de sintetizar un polímero
entrecruzando glicoproteínas supone el abordaje de un problema químico con
planteamientos biológicos, para su posterior aplicación en un campo bioquímico. Todo
esto es reflejo del actual flujo interdisciplinario de conocimientos en el método científico.
Este trabajo fin de grado es una pequeña muestra de que la línea que delimita a las
disciplinas científicas clásicas se estrecha ante el nacimiento de nuevas corrientes
experimentales más eclécticas.
Conclusions
The capability of synthesized material, from the albumen of hen eggs, to catch functional
lectins in a cooked meal contributes the following conclusions:
- Phaseolus vulgaris species has specific NAG bound lectins that resists a long boiling
process. Even though further studies are necessary, the functional presence of lectins in
cooked beans could be related to gastrointestinal reactions after consumption.
- Synthesizing a polyvalent polymer for a specific bound of lectins from glycoproteins
present in a natural source is easy and functional. It might be an economical way to
obtain universal polymers applied to different studies focused on isolation and detection
of lectins.
- Facing the problems of chemically obtaining a universal resin present in a natural
source, as well as the high expense of employing these resins at large-scale, synthesizing
a polymer by the crosslinking of glycoprotein means to deal with a chemical problem by
a biological approach for its subsequent application to a biochemical field. All this is a
reflection of the present interdisciplinary flow of knowledge in the scientific method. The
present work is a small sample showing that the defining line among different scientific
disciplines is narrowing as a result of eclectic, new-born experimental trends.
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