Bjørg Almås, Dr. scient, FoU-leder Hormonlaboratoriet (HUS)

1

Hormonmålinger

Analyseprinsipper, kvalitetskontroll

og referanseområder

2

Hormonlaboratoriet, Laboratoriebygget Haukeland Universitetsykehus

Hormonlaboratoriet, Haukeland Universitetsykehus

• Landets eldste Hormonlaboratorium

• Ca 50 forskjellige analyser

Rutineanalyser:

Seksjon for automat- og spesialanalyser

Seksjon for kromatografiske analyser og massespektrometri

• FoU• Hormoner og brystkreft• Fedme og metabolisme• Molekylær endokrinologi • Vitamin D, osteoporose og

hyperparathyroidisme

• Massespektrometri og steroidhormoner

• Utvikling av massespektrometriske analyser (LCMSMS).

3

4

Hormoner

• proteiner og peptider

• biogene aminer (aminosyreanaloger), metabolitter

• lipider; steroider, vitamin D

Det endokrine system

Analyseprinsipper, metoder

Immunokjemiske metoder

Analyse av:

• Proteiner, peptidhormoner, steroider

HPLC-metoder (high performanceliquid chromatography)

Analyse av:

• Biogene aminer og metabolitter, steroider

5

6

Komponenter i immunokjemiske teknikker

• Analytter– hormoner– proteiner, enzymer, vitaminer, medikamenter,

tumormarkører, virus og bakterier

• Antistoffer– polyklonale (Pab)– monoklonale (Mab)

– rekombinante

7

Produserer kjemiluminescens

Enzym: peroxidase eller alkalisk fosfatase

8

Immunoassay for intakt PTH(sandwich-metode)

PTH

***

Chemilumi-nescence

LabelPTH

antibody

CoatedBead

PTH

antibody

PTH

9

Kompetitiv metode

• Konsentrasjonen av antistoffet er begrensende

• Merket ”tracer” antigen tilsettes, bindingsetene på antistoffet mettes

• Umerket antigen (prøve) tilsettes; konkuranse mellom merket ”tracer” og umerket antigen

• Mengde ”tracer” bundet til antistoff minker med økende konsentrasjon av umerket antigen

Immunokjemiske analyser

• Automatiserte analyser(Immulite)

• F.eks fertilitet

Benkemetoder (RIA, ELISA)

• F.eks 1,25 (OH)2 vitaminD, TRAS, AMH

10

Immunokjemiske metoder

+

• Kan ofte måles direkte i prøve

• Automatisering og kort analysetid

• Godt antistoff = god analyse!!

÷

• Indirekte måleletode

• Kryssreaksjoner (nedsatt spesifisitet)

• Bindingsaffinitet til antistoff kan påvirkes av flere faktorer

11

Kromatografiske metoder

• Kromatografisk separasjon av analytter gjennom kolonne

• Analyttene vil ha ulik vandringshastighet gjennom kolonnen, avhengig av deres kjemiske egenskaper

Figur: Kromatografisk separasjon av komponenter i blekk

Forbehandling av prøven er ofte nødvendig

13

HPLC-systemHPLC: High Performance Liquid Chromatography

14

MS/MSTandem Mass Spectrometry

M+ F+

MS 1 MS 2

Kollisjons- quadrupol Nitrogen

++

+

+

+ + ++

+

+

Bare forbindelser med overgangen M+ F+ blir detektert

Multiple Reaction Monitoring (MRM)

15

Syntese av steroidhormoner i binyrebark

16

Kromatogram Steroidmetode LCMSMS

Paal Methlie sept 2010

Rutinemetoder LCMSMS

Planlagt

• Østradiol• Aldosteron• Steroidpanel i spytt

• Katekolaminer• Metanefriner (urin, plasma)

Nåværende metoder

• Kortisol spytt (2008)• Kortisol urin (2008)Serum:• 25(OH) VD (2009)• Testosteron (2011)• Androstendion (2012)• 11-DOC (2013)• 17-OH-progesteron (2013)• Progesteron (2013)• Kortisol (2013)

• 5-HIAA (døgnurin)

LCMSMS-metoder

++• Direkte målemetode• Gullstandard!!• Svært sensitiv og spesifikk• Standardisering mellom

laboratorier• Kan ofte måle flere analytter i

samme «run» (multipleksing, metabolomics)

• Økt kvalitet, pasientsikkerhet!!!!

÷• Dyrt utstyr• Lang metodeutvikling,

ressurskrevende• Kompleks metode (fire trinn,

kan være tidkrevende)

• Kompetansekrevende

18

19

Hva kan påvirke analysesvaret?

Interferens:

• ”Effekten av en substans som finnes i det analytiske systemet

og som forårsaker et avvik av målt verdi fra sann verdi.”

• Hook-effekt• Kryssreaktivitet• Heterofile antistoffer/autoantistoffer• Matrix-effekt

• Immunologiske metoder mest utsatt

: samspill mellom to eller flere bølgebevegelser

20

Matriks-effekter

• Matriks = omgivelser, miljø

• Matrikseffekt kan bl.a. forårsakes av:– Reagenser i målesystemet– Proteiner i blodprøven – Medikamentbruk (naturpreparater)– Antikoagulanter– Hemolyse, lipemi– Kosthold

Bindingsproteiner• Mange hormoner foreligger i serum bundet til spesifikke

transport/bindingsproteiner

• Øker løselighet av hormonet, modulerer levetid og biologisk effekt

• Kan interferere med assay og tolkning!

• Den frie, ubundne fraksjonen er den biologisk aktive (sant eller usant….?)

Hormonanalyse: beregning eller måling av fri fraksjon

Beregning av fri fraksjon:

• Eks: Testosteron/SHBG•Beregner indeks: ratio analytt/bindingsprotein

Formler som tar utgangspunkt i bindingsaffinitet (bindingskonstanter) mellom analytt og bindingsprotein

Måling i spytt?

Direkte måling av fri fraksjon:

Eks: fT4

Immunologisk assay for måling av FT4

Kvalitetssikring av hormonanalyser

• «Hormonlaboratoriet skal tilstrebe optimal kvalitet på de tjenestene som utføres, gjennom et systematisk og kontinuerlig arbeide med kvalitetsstyring og kvalitetssikring.»

• Kvalitetssystemer, kvalitetsmål (akkreditering)

• Kalibratorer• Kontroller (daglige, langtids)• Kontrolregler• Eksterne kontroller, Labquality• Statistikk, historiske data• Validering av prøvesvar

• Obs: de fleste feil i analysesvar skyldes preanalytiske forhold!

24

Referanseområder

• Framkommer ved analyse av antatt friske personer.

• Vanligst: det sentrale persentilintervallet som omfatter 95% av verdienes fordeling.

• Ved normalfordeling av analyseresultatene kan grensene settes som ± 2 SD

25

Bimodal/flermodal fordeling av måleverdier

• kan reflektere forskjeller mellom kjønn, alder, kosthold, døgn, årstid, etniske grupper, BMI…..

• Innen subgruppenkan verdiene være normalt distribuerte

26

Hvordan etableres et referanseområde?

• Anbefalt: 120 personer i hver distinkte subgruppe

• Forenklet: 60 personer i hver distinkte subgruppe

• Omfattende og ressurskrevende prosess!!

27

Pediatriske referanseområder• overførte referanseområder benyttes ofte pga vansker med å

innhente nok prøver til å etablere eller verifisere referanseområdet

• Vanskelig å innhente prøver fra friske barn• Mange subgrupper (alder, kjønn)• Volumproblematikk• større frekvens av hemolyse i prøver

• Annen sammensetning av matrix (bilirubin, lipider), ”voksne” referanseområder bør ikke brukes uten videre

• OBS! Mange referanseområder i bruk, spesielt for barn kan være utarbeidet på foreldete metoder!!!!

• What is CALIPER?

• CALIPER = Canadian Laboratory Initiative on Paediatric Reference Intervals Database

• A national initiative coordinated by clinical laboratories at The Hospital for Sick Children (SickKids, Toronto) and Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO, Ottawa).

• A research project among children’s hospitals across Canada including Toronto, Ottawa, Hamilton, Montreal, St. John’s, Saskatoon, and Vancouver.

• CALIPER purpose• The purpose of the project is to establish a current and accurate database of

reference intervals (normal values) that represent Canada’s children and youth -multi-ethnic, males and females, from birth to 18 years.

•

A sensitive and rapid mass spectrometric method for the simultaneous measurement of eight steroid hormones and CALIPER p ediatric reference intervals

L. Kyriakopoulou , M. Yazdanpanah , D.A. Colantonio , M.K. Chan , C.H. Daly , K. AdeliClinicalBiochemistry Volume 46, Issues 2013 642 - 651

• http://dx.doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2013.01.002

• Age- and sex-specific trends in pediatricreference values for steroid hormones. Scatter plots showing age-relateddistribution of androstenedione, corticosterone, 11-deoxycortisol, 17-hydroxyprogesterone, 21-hydroxyprogesterone and cortisol.

30

Rekvirering av prøver

• Kliniske opplysninger viktig for validerende leger!!!!!

31

Takk for meg!!!