ANALISIS DEL PERFIL DE PEQUEÑOS RNAs

REGULADORES EN LA PATOGENESIS DE LA LEUCEMIA LINFOIDE

CRONICA

TESIS DE MAESTRÍA

Lic. Soledad Marton

Institut Pasteur de Montevideo

MicroRNAs Pequeños RNAs de 21-25 nt Transcriptos a partir de genes endógenos Inhibidores post transcripcionales de la expresión génica

Unión: al extremo 3' UTR mRNA blanco imperfecta

MiRNAs y cáncero Gran parte de los genes de microRNA se encuentran en regiones

génicas alteradas en cáncer (Ej miR15a-miR16-1 en región 13q14)

o El perfil de expresión de miRNAs está alterado en algunos canceres.

o ~ 20 to 30% de los genes humanos son regulados por miRNA (100-200 mRNA por miRNA)

““ANTITARGETS”ANTITARGETS”

Involved in basic processes Involved in basic processes common to all cellscommon to all cells

““ANTITARGETS”ANTITARGETS”

Involved in basic processes Involved in basic processes common to all cellscommon to all cells

““TARGETS”TARGETS”Involved in develpmental Involved in develpmental timing, cell proliferation, timing, cell proliferation,

apoptosis, metabolism, cell apoptosis, metabolism, cell differentiation and differentiation and

morphogenesismorphogenesis

““TARGETS”TARGETS”Involved in develpmental Involved in develpmental timing, cell proliferation, timing, cell proliferation,

apoptosis, metabolism, cell apoptosis, metabolism, cell differentiation and differentiation and

morphogenesismorphogenesis

La selección positiva para evitar la regulación por microRNA divide a los mRNAs en dos grupos

o A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 2005 Jun 9;435(7043):828-33. o MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 2005 Jun 9;435(7043):834-8.

oncogenes(Cluster miR-17-92)

Genes supresores de

tumores(let-7 y miR15a y

miR16)

CANCER

mRNA Oncogenes

Familia RAS y Bcl-2

mRNA supresores de tumores

FT pro-proliferativo/pro-apoptotico E2F1,en altas

conc causa apoptosis

microRNA

McManus & MorrisSlowing down the Ras lane: miRNAs as tumor suppressors? Sci STKE. 2005 Aug 16;2005(297):pe41. Review.Kent OA, Mendell JT. Abstract A small piece in the cancer puzzle: microRNAs as tumor suppressors and oncogenes.Oncogene. 2006 Oct 9;25(46):6188-96. Review.

Leucemia Linfoide Crónica

• Desorden acumulativo (¿proliferativo?) de linfocitos B

• Leucemia más frecuente en occidente• Dos subgrupos :

– Buen pronóstico (Ig Mutada)– Mal pronóstico (Ig No Mutada)

Chiorazzi N, Rai KR, Ferrarini M. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2005 Feb 24;352(8):804-15. Review

OBJETIVO GENERAL

• Comprensión de la biología de la LLC-B

Objetivo Específico 1) Análisis por clonado molecular del perfil de

pequeños RNAs de células leucémicas de pacientes LLC-M y

LLC-NM

43 (15%)

157(55%)

28(10%

)

25(8%)

4(1.5%)

30(10.5

%)

287 (100%)

M

27 (11%)

132(55.5

%)

28 (12%

)

28 (12%)

1(0.5%)

21 (9%)

237 (100%)

NM

NDE RNAs estructurales

mRNATranscript

os sentido/antisentido

no codificante

s

Posibles

nuevosmiRNA

s

miRNAsconocid

os

Número total de

secuencias

clonadas

7p14.2 (-) 80

U CU U -GCCA UC A G GCUA UC CCUGA UUCUGAGCC AAUC CUU C |||| || ||||| ||||||||| |||| ||| CGAU AG GGACU AGGACUUGG UUAG GAG C C -- - GUUUA -- A A

CUCCUGAGCCAUUCUGAGCCUC

(22) M-17

12q14.1 (+)

100

C U U U UGU UGGC GAGGUAGUAGUUUGUGC GUU--------GG CGGGU G |||| ||||||||||||||||| ||| || ||||| AUCG-UUCCGUCAUCGAACGCG CAA UC-GCCCG AU UAGAGGUG UUA

CUGCGCAAGCUACUGCCUUGC

(21)M-64

14q11.2 (-)

53

AC U UGAAAU UAAGUCC -GUU GUUU AGUUUGC-CA GA GCAUGU GU UCAG-CU A||| ||||||| || || |||||| || |||| || AAA--UCAGACG GU-CU------CGUACA-------CA AGUC GA U A AAUU C C

CCUGAUUAAACACAUGCUCUGA

(22)M-84

17q21.32 (-)

82

U C-C A G GCAG CA AGC U CCU CCGG GCCA GAU CU AGCCAC AGGGUG U ||| |||| |||| ||| || |||||| |||||| U GGA GGUC CGGU UUA----GA UCGGUG UCUCGC A CGU G G CC ACU G

CCCGGAGCCAGGAUGCAGCUC

(21)NM-84

6q25.3 (+) 90

CUGCAGA UG A UG GA CU CCCUG GG CC GCU-GC--AG GGG GGCA GC A|||| || || ||| || || ||| |||| ||GGAC CC GG CGACCG UC CUC CCGU--CG G AAGAA-- GU A AU CU AC G

GUGCCAGCUGCAGUGGGGGAG

(21)M-94

Localización (DNA strand)

Hairpin

score Predicted hairpin

Cloned sequence (nt)

miRNA

Nuevos genes microRNAs(intrónicos)

mRNAs con sitios de unión a los posibles microRNA

M-94M-94M-94M-94M-94M-94

NM-84NM-84NM-84NM-84

PR domain-containing protein 16chromodomain helicase DNA-binding protein 5hairy/enhancer of split, drosophila, homolog of, 3runt-related transcription factor 3SRY-box 13wingless-type mmtv integration site family, member 3APR domain-containing protein 16chromodomain helicase DNA-binding protein 5hairy/enhancer of split, drosophila, homolog of, 3ephrin receptor EphB2

PRDM16CHD5HES3

RUNX3SOX13WNT3APRDM16

CHD5HES3

EPHB2

1p36.321p36.311p36.311p36.111q32.1

1q42.131p36.321p36.311p36.311p36.12

164415001467131912721239127710151003942

M-17M-17M-64M-64M-64M-64M-64M-84M-84M-84

miRNA candidato

hairy/enhancer of split, drosophila, homolog 3ephrin receptor (receptor tyrosine kinases; rtks)PR domain-containing protein 16: PR domainhairy/enhancer of split, drosophila, homolog 2wingless-type mmtv integration site family, member 3ASry-Box 11plexin A1chromodomain helicase DNA-binding protein 5glutathione s-transferase, Mu-1 regulator of G protein signaling 2

Nombre del gen Blancoa

HES3 EPHB2

PRDM16HES2

WNT3ASOX11

PLXNA1 CHD5

GSTM1RGS2

Símbolo del gen blanco

1p36.311p36.121p36.32 1p36.311q42.13

3q21.21p36.311p13.31q31.2

Localización

13591049859674584

498176148

Score

2p25.2 539

131

microRNAs clonados de las células

LLC-B

1-let7i 3pa

McNMb

2416

1315a

2-24

2-22

3-29a

3-26a

81142 3p

-330d

4-142 5p

44150

3

3

-191

-155

Obj E 2) Análisis del perfil de expresión de miRNAs por northern blot en forma comparativa entre ambos grupos de células leucémicas y linfocitos B normales.

En general se observa una sub-expresión de los miRNAs en las células LLC-B en relación a los linfocitos B normales (no miR-155)

No estaba descripta la baja expresión en los miRNAs miR-181a, miR-30d and let-7a. Los bajos niveles de let-7a y miR-181a sugieren fenotipo indiferenciado en células LLC-B. No está claro que significa la baja expresión de miR-30d en las células LLC-B.

eGFP5’ 3’

Pre-miR-181 miR-181

125 nt125 nt

pCMV EGFP XhoI / EcoR I5 1 8 2 b p

E G F P

K a n /N e o

C h im e r ic In tr o n K o za k

S V4 0 p o lyA

H SV TK p o lyA

S V4 0 p r o m o te r

C M V

f1 o r i

S V4 0 o r i

p U C o r i

X h o I ( 7 6 9 )

Eco R I ( 7 8 1 )

Obj E 3) Puesta a punto de sistema de expresión de microRNAs

Plásmido pCMV modificado.

Transfecciones (transitorias) por electroporación de células Daudi y

Jurkat

DAUDI

DAUDI

JURKAT

JURKAT

Línea Celular

50303,5pCMV

60303pCMV-181a

41867,4pCMV-181a

82513,1pCMV

Eficiencia %Viabilidad

%

Nº Total de celulas (x106)

Construcción

Control 181-0 181-40 181-125

Expresión ectópica de miR-181a induce una disminución en el conteo celular

Celulas transfectadas y cultivadas durante 15 días en presencia de neomicina

Perspectivas• Validación de los miRNA

“putativos” (RT-PCR)• Verificacíon experimental de mRNA

blancos de los miRNAs putativos• Identificación de blancos de miRNA

181a (co transfección)

FIN

Biogénesis

”MicroRNA function in animal development“ by Erno Wienholds and Ronald H.A. Plasterk, FEBS Letters, Vol 579, 5911-5922, Copyright 2005.

• Direccionamiento de los mRNA blancos a los cuerpos P

Zamore P D , H.B., Ribo-gnome: the big world of small RNAs. Science, 2005. 309(Review): p. 1519-24.

Obj E 1) Análisis del perfil de miRNA en LLC-M y LLC-NM

• Clonado de pequeños RNAs

Resultados del clonado molecular

43 (15%)

157(55%)

28(10%)

25(8%)

4(1.5%)

30(10.5

%)

287 (100%)

M b

27 (11%)

132(55.5%

)

28 (12%)

28 (12%)

1(0.5%)

21 (9%)

237 (100%)

NM a

NDE fnc RNAs e

mRNASens/

antisens non

coding RNA

transcripts d

Putative novelmiRNAs

c

Known miRNAs

Total Number

of Sequenced Clones

Objetivos Específicos

• Objetivo Específico 1) Análisis por clonado molecular del perfil de miRNA de células leucémicas de pacientes LLC-M y LLC-NM

• Objetivo Específico 2) Análisis del perfil de expresión de miRNAs por northern blot en forma comparativa entre ambos grupos de células leucémicas y linfocitos B normales.

• Objetivo Específico 3) Puesta a punto de un sistema de expresión de microRNAs (líneas celulares de estirpe linfocitaria y linfocitos B leucémicos provenientes de pacientes).

• Analizar el efecto de la sobre-expresión de miRNA específicos en la fisiología celular y el fenotipo tumoral.