Análise da Presença de Bombas de Efluxo e Mutações no Gene...

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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL – ULBRA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E TOXICOLOGIA APLICADA

Análise da Presença de Bombas de Efluxo e Mutações no Gene nat em Mycobacterium tuberculosis Resistentes a Isoniazida

Millene Borges Coelho

Orientadora: Dra. Maria Lucia Rosa Rossetti, PhD.

CANOAS 2008

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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL – ULBRA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E TOXICOLOGIA APLICADA


Millene Borges Coelho

Orientadora: Dra. Maria Lucia Rosa Rossetti, PhD.

CANOAS 2008

Dissertação de Mestrado submetida à avaliação, como um dos requisitos para a obtenção do Título de Mestre em Genética e Toxicologia Aplicada.

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FICHA CATALOGRÁFICA

Coelho, Millene Borges Análise da Presença de Bombas de Efluxo e Mutações no

Gene nat em Mycobacterium tuberculosis resistentes a Isoniazida / Millene Borges Coelho

Canoas, 2008. xx Dissertação (Mestrado em Genética e Toxicologia

Aplicada) – Universidade Luterana do Brasil, Pós Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada / Laboratório de Biologia Molecular, 2008

Orientadora: Maria Lúcia Rosa Rossetti

1. Bombas de Efluxo. 2. Resistência 3. Mycobacterium tuberculosis. 4. Arilamina N- acetiltransferase. 5. Mutações – Dissertações. Maria Lúcia Rosa Rossetti (Orient.). I

Universidade Luterana do Brasil. Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada. III. Título.

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RESUMO


É relatada que a resistência intrínseca de M. tuberculosis à diversos fármacos deve-se à sua exclusiva parede celular e outros determinantes genéticos. Foram analisados neste estudo 47 isolados, sendo 41 deles considerados resistentes a isoniazida (R-INH) e 06 sensíveis (S-INH) pelo método das proporções (MP-LJ). Dos 41 isolados R-INH, 68,29% deles não apresentaram mutações no códon 315 do gene katG e inhA, sendo considerados WT para ambos. E em 31,71% foi observada mutação pontual no códon 315 de katG. Do grupo de isolados WT para katG e inhA, foi observado um mecanismo de efluxo ativo em 14,29%, todos pertencentes à família genotípica “Latin Americam and Mediterranean” (LAM), enquanto em apenas 23,08% dos isolados com mutação em katG foi observado esse sistema, tendo perfis genotípicos definidos como subtipos LAM9, X2 e U. As inibições em ambos os grupos foram alcançadas com o uso de 2 inibidores, o CCCP (um desacoplador de prótons da membrana plasmática) e o verapamil (inibidor de proteínas transportadoras que utilizam a hidrólise de ATP), demonstrando assim, que proteínas transportadoras de famílias distintas estão envolvidas na resistência a INH. Todos os isolados tiveram o gene nat seqüenciado e em 9,76% foi observada a variante mutada 619-A NAT SNP dos R-INH e WT para katG, com perfis genotípicos caracterizados como subtipos LAM3 S/Convergente, T3 e um perfil “novo”, ainda não depositado no SpolDB4. Em nosso estudo, essa mutação não foi associada à família LAM e demais famílias (p=0,87 e OD=0,85 (0,07-9,76). Adicionalmente, foram identificadas 3 mutações sinônimas e 3 não-sinônimas ainda não descritas para nat de M. tuberculosis, sendo C276T, C375G, G501C e G202A, C373A e T503G respectivamente, caracterizados com perfis das famílias LAM, Beijing, T e um perfil novo. Essas novas mutações não mostraram associação com a família LAM e demais famílias (p=0,31 ; OD=0,52 (0,11-2,29). Dois isolados R-INH mutados em nat apresentaram simultaneamente um mecanismo de efluxo, sendo este o primeiro trabalho a fazer tal constatação. Enquanto 39,02% dos isolados foram considerados WT para todos os genes investigados e não apresentaram um mecanismo de efluxo, com genótipos das família LAM, U, Beijing, T, X, Haarlem e 3 perfis novos, sugerindo que outros genes ou mecanismos moleculares ainda não descritos podem estar envolvidos na resistência; De outro lado, 46,15% dos isolados com mutação em katG e WT para nat não apresentaram efluxo ativo, sugerindo que a resistência possa ser atribuída à alteração em katG, e em adição a isto, a presença de perfis Haarlem, LAM e um perfil novo, poderiam contribuir a este fato, via níveis distintos de resistência. A possibilidade de existência de clusters (agrupamentos) entre os isolados foi descartada pela presença de diferentes SIT's. Esses dados sugerem a importância da caracterização de outros genes ou mecanismos moleculares ainda desconhecidos, que podem contribuir com níveis de resistência do bacilo da TB ao tratamento com INH. Em estudo prospectivo, a atividade das isoformas de NAT serão investigadas, usando experimentos in silico, promovendo simulações de docking (acoplamento) da INH, por exemplo, a fim de predizer a afinidade do fármaco à estas estruturas mutadas.

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ABSTRACT

nat Gene Mutations and Efflux Pumps Presence Analysis in Isoniazid Resistant Mycobacterium tuberculosis

It’s been reported that intrinsics resistance of M. tuberculosis to a wide range of drugs happens due to its exclusive cell wall and others genetic determinants. In this study, were investigated 47 isolates, 41 considered isoniazid-resistant (INH-R) and 06 isoniazid-sensitive (INH-S) by the method of proportions (MP-LJ). In the INH-R group, 68,29% had no mutations at codon 315 in katG and inhA genes, being considered WT to both. And in 13 isolated INH-R (31,71%) was observed a punctual mutation at codon 315 of the katG gene. In 14,29% of the WT isolates group, were observed an active efflux mechanism and these isolates were defined as belonging to “Latin American and Mediterranean” (LAM) family by Spoligotyping, however only 23,08% of the isolates with punctual mutations showing an active efflux mechanism were defined as spoligotypes (LAM9, X2 and U). The inhibition of these systems in both groups occurred by using two efflux system inhibitors, CCCP and verapamil, showing that the transport proteins involved in the INH resistance belongs to different families. All the isolates had the nat gene completely sequenced, and the mutated variant 619-A NAT SNP was observed in 9,76% of the INH-R and WT for katG gene, characterized as LAM3 S/Convergent and T3 spolidotypes, and a new profile not registered in the SpolDB4 yet. In this study we did not find an association among this variant and the LAM or other families (p=0,87 ; OD=0,85 (0,07-9,76). Additionally, 6 new SNP's were identified, being 3 synonymous (C267T, C375G, G501C) and 3 non-synonymous (G202A, C373A, T503G) not described for nat of M. tuberculosis yet; defined as LAM, Beijing and T genotypes, besides a new profile. These new mutations did not show association with the LAM or other families (p=0,31 ; OD=0,52 (0,11-2,29). Two isolates INH-R did demonstrate mutation an efflux system in nat simultaneously, and this study was the first one to describe this phenomenon. Meantime, 39,02% isolates was considered WT for all investigated genes, and not showed efflux system with LAM, U, Beijing, T, X, Haarlem, and the 3 new genotype profiles; suggesting that other genes or unknown molecular mechanisms might be involved in the isoniazid-resistance; In other way, 46,15% of the isolates mutated for katG and WT for nat genes had no active efflux, suggesting that the resistance in these isolates might be ascribed to the katG mutation, meanwhile the Haarlem, LAM and the new profile might partly explain resistance levels. The clustering existence possibility among the isolates were discarded due to the different SIT's presence. These data evoke the importance in the characterization of unknown genes or molecular mechanisms, that might be involved in the TB bacillus resistance levels to the INH treatment. In a prospective study, the NAT isoforms activity will be investigated by using experiments in silico, for example, doing INH docking simulations to determine the drug affinity to these mutated structures.

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SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... .... ............16 1.1. Um breve histórico.............................................................................. ... . ............17 1.2. Epidemiologia da tuberculose............................................................. .................19 1.3. Mycobacterium tuberculosis.. ............................................................. .................20 1.4.Tratamento .......................................................................................... .................22 2.MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ........................................................... .................25 2.1. Resistência aos Antimicrobianos........................................................ .... ............26 2.1.1. Resistência do M. tuberculosis aos Antimicrobianos ............... .... ............27 2.1.1.1. Resistência Inata......................................................... .... ............27 2.1.1.2. Resistência Adquirida.................................................. .... ............27 2.1.2. Isoniazida (INH)........................................................................ .... ............28 2.1.2.1. Mecanismos de Ação e Resistência da INH................. .... ............28 2.1.2.2. O gene katG e a Resistência a INH.............................. .... ............30 2.1.2.3. O gene inhA e a Resistência a INH.............................. .... ............31 2.2. Sistema de Efluxo nas Bactérias...................................................... .... ............32 2.3. Arilamina N-acetiltransferase (NAT)................................................. .... ............39 2.3.1. Tríade Catalítica da NAT .......................................................... .... ............45 2.3.2. Ligação de isoniazida e coenzima-A com NAT ........................ .... ............46 3. JUSTIFICATIVA ....................................................................................... .... ............48 4. OBJETIVOS ............................................................................................ .... ............49 4.1.Objetivos Gerais................................................................................. .... ............49 4.2.Objetivos Específicos ......................................................................... .... ............49 5. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................ .... ............50 5.1. Critérios de Elegibilidade................................................................... .... ............50 5.2. Critérios de Exclusão......................................................................... .... ............50 5.3. Local de Desenvolvimento do Estudo ............................................... .... ............50 5.4. Número Amostral .............................................................................. .... ............51 5.5. Origem dos Isolados Investigados .................................................... .... ............51 5.6. Cultura de M. tuberculosis ................................................................ .... ............52 5.7. Estimativa da Concentração Mínima Inibitória (CMI) com Inibidores de Efluxo..53 5.7.1. Preparação dos Inóculos.......................................................... .... ............53 5.7.1. Montagem das Placas de 96 poços ......................................... .... ............53 5.8. Extração de DNA Genômico ............................................................. .... ............55 5.9. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)......................................... .... ............56 5.9.1. Genes katG e inhA ................................................................. .... ............56 5.9.2. Gene nat ................................................................................. .... ............57 5.10. Os fragmentos amplificados por PCR ............................................ .... ............58 5.11. Seqüenciamento de DNA................................................................ .... ............59 5.11.1. Genes katG e inhA.............................................................. .... ............59 5.11.2. Gene nat.............................................................................. .... ............59 5.12. Seqüenciamento dos fragmentos.................................................... .... ............60

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5.13. Análises das Seqüências Obtidas................................................... .... ...........60 5.14. Análise Estatística........................................................................... .... ...........62 5.15. Spoligotyping................................................................................... .... ...........63 6. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ................................................................... .... ...........62 7. RESULTADOS ........................................................................................ .... ...........65 7.1. Perfil de suscetibilidade dos isolados de M. tuberculosis.................. .... ...........65 7.2. Análise do sequenciamento de genes de M. tuberculosis associados à resistência a INH .......................................................................................... .... ...........65 7.3. Análise da presença de bomba de efluxo em isolados de M. tuberculosis........65 7.4. Análise do gene nat de isolados de M. tuberculosis ......................... .... ...........69 7.5. Genotipagem dos isolados de M. tuberculosis .................................. .... ...........74 7.6. Isolados WT no gene katG e efluxo ativo.......................................... .... ...........77 7.7. Isolados com mutação no gene katG e efluxo ativo.......................... .... ...........78 7.8. Isolados WT nos genes investigados e ausência de efluxo .............. .... ...........79 7.9. Isolados com mutação em katG e ausência de efluxo ...................... .... ...........81 7.10. Isolados com mutação em nat e presença de efluxo ...................... .... ...........82 8. DISCUSSÃO ........................................................................................... .... ...........83 9. CONCLUSÕES ....................................................................................... .... .........101 10. PERSPECTIVAS .................................................................................. .... .........103 11. ANEXOS ............................................................................................... .... .........104 11.1 Anexo 1 ............................................................................................ .... .........104 12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... .... .........106

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 As estruturas de isoniazida (1), radical hidrazil isonicotínico (2) e o radical acil isonicotínico (3). (Timmins & Derectic, 2006)

Pág. 29

Figura 2 Diagrama comparando as cinco famílias de proteínas de efluxo, adaptado de Piddock, 2006.

Pág. 35

Figura 3 Esquema que mostra a ativação e inativação da INH adaptado de Sandy et al., 2005b.

Pág. 40

Figura 4 Orientação da INH no sítio ativo da enzima NAT (Cys70 – His110 – Asp127). Figura gerada com o Programa DeepView 4.0.

Pág. 45

Figura 5 Mapa da América do Sul salientando a origem dos isolados selecionados para o estudo.

Pág. 52

Figura 6 Esquema da microplaca de 96 poços para a estimativa da CMI.

Pág. 55

Figura 7 Comparação entre eletroferogramas de um isolado com mutação no códon 315 do gene katG e o outro sem essa mutação.

Pág. 61

Figura 8 Comparação entre eletroferogramas de um isolado com mutação no gene nat (G619A) e o outro sem essa mutação.

Pág. 62

Figura 9 Microplaca de 96 poços para a investigação de CMI. Em

verde, poços com água, em azul, poços onde ocorreu inibição de crescimento, e em rosa onde ocorreu crescimento bacteriano.

Pág. 66

Figura 10 Seqüências nucleotídica e traduzidas do gene nat de M. Pág. 73

9

tuberculosis H37Rv.

Figura 11 Comparação das estruturas secundárias da NAT de M. tuberculosis H37Rv (selvagem) e com os resíduos de aminoácidos mutados.

Pág. 105

10

LISTA DE TABELAS Tabela 1 Esquemas de tratamentos da TB utilizados no Brasil desde

1979. ETH, etionamida; BEM, etambutol; SM, estreptomicina; PZA pirazinamida; RMP, rifampicina. Adaptado de Brasil, 2007.

Pág. 23

Tabela 2 Seqüência de oligonucleotídeos iniciadores utilizados nas

reações de PCR e Seqüenciamento dos genes investigados.

Pág. 57

Tabela 3 Resultados de CMI dos isolados de M. tuberculosis na

presença e na ausência de inibidores de sistema de efluxo. Pág. 68

Tabela 4 Mutações observadas no gene nat dos isolados de M.

tuberculosis. Pág. 70

Tabela 5 Perfil genotípico dos isolados de M. tuberculosis com a

variante mutada 619 A. Pág. 74

Tabela 6 Perfil genotípico dos isolados de M. tuberculosis com novos

SNPs em nat e sem mutação no códon 315 do gene katG. Pág. 75

Tabela 7 Perfil genotípico dos isolados de M. tuberculosis com novos

SNPs em nat e com mutação no códon 315 do gene katG. Pág. 77

Tabela 8 Genótipo dos isolados WT no gene katG e presença do

mecanismo de efluxo. Pág. 78

Tabela 9 Genótipo dos isolados com mutação no códon 315 do gene

katG e presença do mecanismo de efluxo. Pág. 79

11

Tabela 10

Genotipagem dos isolados WT para os genes investigados e ausência de mecanismo de efluxo.

Pág. 80

Tabela 11

Genotipagem dos isolados mutados no códon 315 do gene katG e ausência de mecanismo de efluxo.

Pág. 81

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LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES

Abreviatura Significado A Argentina Å Angstron ABC ATP Binding Cassette Ac-CoA Acetil Coenzima A ATB Antibiótico ATP Adenosina Tri-Fosfato ATS American Thoracic Society BAAR Bacilo Álcool Ácido Resistente BCG Bacilo de Calmette Guérin BiE Bioinformática Estrutural BK Bacilo de Koch BLAST Basic Local Alignment Search Tool CCCP Cianeto de Carbonila de M-Clorofenil Hidrazona CDC Centers for Disease Control and Prevention CDCT Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CE Ceará CMI Concentração Mínima Inibitória CMTB Complexo Mycobacterium tuberculosis CTAB Brometo Cetiltrimetilamônio DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucléico dNTPs Desoxinucleotídeos trifosfatos DRE-PCR Double-Repetitive-Element PCR EDTA Ácido Etileno diaminotetracético EMB Etambutol et al., e colaboradores ETH Etionamida FEPPS Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde FIOCRUZ Fundação Instituto Oswaldo Cruz FURG Fundação Universidade Federal do Rio Grande HIV Human Immunodeficiency Virus INH Isoniazida IOC Instituto Oswaldo Cruz IS Seqüência de inserção Kb Quilobase kDa Quilo Dálton Km Constante de Michaelis LACEN-RS Laboratório Central do Estado do Rio Grande do Sul LJ Löwenstein-Jensen M mol/L MG Minas Gerais Min minuto

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mM mmol/L MMNAT NAT de Mycobacterium marinum MP Método das Proporções MSNAT NAT de Mycobacterium smegmatis Mtb Mycobacterium tuberculosis = M. tuberculosis NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo NAT Arilamina N-acetiltransferase NCBI National Center for Biotechnology Information NMR Nuclear Magnetic Resonance Nt Nucleotídeo OADC Ácido oléico, albumina, dextrose e catalase OMS Organização Mundial da Saúde ORF Sequência aberta de leitura PA Pará paba Ácido para-aminobenzóico p-Abglu para-acetamidobenzoilglutamato PAS Ácido p-aminosalicílico Pb pares de bases PB Pares de bases PCR Reação em Cadeia da Polimerase PCT Programa de Controle da Tuberculose PDB Protein Data Bank PE Perú PEG polietilenoglicol PGRs Seqüências Polimórficas Ricas em G e C PPD Purified Protein Derivative PZA Pirazinamida q.s.p. Quantidade suficiente para REMA Resazurin Microtiter Assay RFLP Restriction Fragment Polymorphism RJ Rio de Janeiro RMP Rifampicina RNA Ácido ribonucléico RND Resistance-Nodulation-Cell Division Rpm rotações por minuto RS Rio Grande do Sul SDS Dodecil sulfato de sódio SM Estreptomicina SMNAT NAT de Salmonella typhimurium SMR Small Multidrug Resistence SMS-POA Secretaria Municipal de Saúde de Porto Alegre SNP Single Nucleotide Polymorphism SP São Paulo Spoligotyping Spacer Oligotyping Taq Thermus aquaticus

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TB Tuberculose TB-MDR Tuberculose Multirresistente TBNAT NAT de Mycobacterium tuberculosis TB-XDR Tuberculose Extensivamente Resistente TE Tris+EDTA TS-DOTS Tratamento Supervisionado U Unidade (atividade enzimática) UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro ULBRA Universidade Luterana do Brasil UV Ultravioleta Ver Verapamil X Vezes

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LISTA DE AMINOÁCIDOS Lista dos aminoácidos e os códons no código genético. Adaptado de Bruce et al., 1997. A Ala Alanina GCA GCC GCG GCU C Cys Cisteína UGC UGU D Asp Ácido Aspartico GAC GAU E Glu Ácido Glutâmico GAA GAG F Phe Fenilalanina UUC UUU G Gly Glicina GGA GGC GGG GGU H His Histidina CAC CAU I Ile Isoleucina AUA AUC AUU K Lys Lisina AAA AAG L Leu Leucina UUA UUG CUA CUC CUG CUU M Met Metionina AUG N Asn Asparagina AAC AAU P Pro Prolina CCA CCC CCG CCU Q Gln Glutamina CAA CAG R Arg Arginina AGA AGG CGA CGC CGG CGU S Ser Serina AGC AGU UCA UCC UCG UCU T Thr Treonina ACA ACC ACG ACU V Val Valina GUA GUC GUG GUU W Trp Triptofano UGG Y Tyr Tirosina UAC UAU

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1. INTRODUÇÃO

A Tuberculose (TB), considerando como único agente infeccioso, é a maior

causa de doença e morte, especialmente na África e Ásia. Globalmente 9,2 milhões de

novos casos e 1,7 milhões de mortes por TB ocorreram em 2006, dos quais 700 mil

casos e 200 mil mortes ocorreram em pessoas HIV-positivas (OMS, 2008 a).

O M. tuberculosis infecta um terço da população mundial. De acordo com os

últimos dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) em 2003, ocorreram

aproximadamente, 8 milhões e 800 mil novos casos de tuberculose e 1 milhão e 700 mil

mortes foram atribuídas à doença (Palomino, 2006).

O principal agente etiológico da TB é M. tuberculosis, mas outras espécies

dentro do Complexo M. tuberculosis (CMTB), tais como M. canettii (nome proposto), M.

africanum e M. bovis podem causar a TB em humanos (Lazzarini et al., 2007).

A doença ativa pode se desenvolver tanto devido a uma infecção recente (TB

primária ou doença rapidamente progressiva), quanto devido à reativação de uma

infecção latente, adquirida no passado (Sepkowits et al., 1995, Suffys et al., 1997). O

risco de infecção pelo bacilo é elevado, mas, em pessoas saudáveis, não ocorre a

manifestação de sintomas dessa infecção. Estima-se que em torno de 5 a 10% das

pessoas infectadas desenvolvem a doença dentro de um período de 2 anos (Rossetti &

Sperhacke, 2006).

A transmissão ocorre principalmente por via respiratória. Os doentes com a

forma pulmonar bacilífera, especialmente as cavitárias, constituem a principal fonte de

disseminação da doença, pois através da tosse, do espirro e da fala eliminam gotículas

que contêm bacilos (ATS, 2000). Na TB humana, as maiores populações estão nas

lesões cavitárias e há mais de meio século, sabe-se que a resistência é mais freqüente

durante o tratamento de formas cavitárias, quando comparadas às não-cavitárias

(Barroso et al., 2003).

Os principais sintomas da TB pulmonar, a forma mais comum da doença, são

tosse inicialmente seca que persiste por mais de três semanas e leva à formação de

uma secreção purulenta; perda de apetite e conseqüente emagrecimento; além de

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cansaço, febre baixa no final da tarde e sudorese noturna (Kritski, 2000). Nos casos de

TB extrapulmonar, os sinais e sintomas dependerão do órgão afetado. As localizações

mais feqüentes de infecção pelo bacilo são a pleura, linfonodos, sistema nervoso

central, rins e ossos (Rossetti & Sperhacke, 2006).

1.1. Um breve histórico

Há cerca de 5000 a.C., o homem domesticou o gado e estabeleceu as

modificações ambientais que propiciaram as condições adequadas para o

aparecimento de algumas enfermidades infecciosas. A TB provavelmente tenha surgido

nessa época. Acredita-se que o ancestral do bacilo causador da doença tenha passado

dos bovinos ou caprinos para o homem (Taylor et al., 1999; Gómez i Prat & Souza,

2003).

A existência de TB na era pré-colombiana foi sugerida por deformidades

compatíveis com TB óssea encontradas em esqueletos de pessoas que viveram na

região de Ohio em 1275, tendo sido confirmada recentemente mediante análise do DNA

obtido de lesões pulmonares típicas da tuberculose encontradas em múmias do Peru

que datam do ano 1000 (Daniel, 2000; Salo, 1994; Gómez i Prat & Souza, 2003).

O aumento da incidência da tuberculose começou lentamente, junto com o

crescimento da densidade populacional. A infecção se expandiu por todo o mundo,

como resultado das viagens dos exploradores europeus, que, infectados, disseminavam

o bacilo por vários lugares (Daniel, 2000).

A demonstração formal que a tuberculose era uma doença contagiosa foi feita

em 1865 por Jean Antoine Villemin (Beck, 2000) e em 1882 o microbiologista alemão

Robert Koch publicou um artigo que fazia referência ao descobrimento de Villemin

(Daniel, 2006). Neste artigo, Robert Koch descreveu o agente etiológico da tuberculose,

o Mycobacterium tuberculosis ou bacilo de Koch, e demonstrou que esse

microrganismo era a causa da doença (Kaufmann, 2003). Essa descoberta deu a

Robert Koch o Prêmio Nobel da Medicina em 1905. Os conhecimentos sobre o Bacillus

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anthracis e o Mycobacterium tuberculosis serviram para a elaboração do notório

Postulado de Koch (Bloom & Murray, 1992).

Ainda em 1882, Paul Ehrlich descobriu que o bacilo da tuberculose tinha a

propriedade de resistir à descoloração por uma solução de álcool-ácido. Ehrlich propôs

então um método de coloração que mais tarde foi melhorado por Franz Ziehl e

modificado novamente por Friedrich Neelsen, resultando no método de coloração

conhecido por Ziehl-Neelsen (Beck, 2000). Essa técnica é um método laboratorial que

ainda é usado para o diagnóstico da tuberculose (Silva et al,. 2003b).

No início do século XX, a busca de uma terapia eficiente ou de uma vacina

protetora fazia parte do conjunto de esforços que a comunidade científica realizava para

controlar a tuberculose. Como resultado disso, em 1906 Albert Calmette e Camille

Guérin desenvolveram uma vacina de uma cepa de M. bovis com virulência atenuada

(Daniel, 2006).

No século que se segue com a descoberta de Koch, testemunhou-se um firme

declínio da TB devido ao exame de raio-X em massa, o desenvolvimento da

quimioterapia, programa de imunização com BCG, melhorias nas condições

socioeconômicas e a pasteurização do leite. Estas novas tecnologias determinaram

uma sensível redução do número de casos de TB nos países economicamente

desenvolvidos. Entretanto, no final do século XX, houve um aumento no número de

casos da doença, mesmo nas regiões economicamente desenvolvidas, culminando

com a TB sendo considerada uma emergência global em 1993, pela Organização

Mundial da Saúde (Taylor et al., 2003).

As razões identificadas inicialmente para este aumento foram a epidemia do HIV,

o crescimento da pobreza nas grandes áreas metropolitanas e o aumento da imigração

(Raviglione, 2003). Cabe salientar que a TB jamais deixou de ser um problema de

saúde pública nas regiões em desenvolvimento, onde as condições sócio-econômicas

são muitas vezes piores do que aquelas observadas na Europa do século XIX (Silva et

al., 2003b).

Embora a tuberculose possa ser considerada uma doença reemergente em

alguns países europeus e nos Estados Unidos, no Brasil ela não é um problema de

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saúde pública emergente e tampouco reemergente; Ela é um problema presente desde

muito tempo. A partir da década de 40 começa a utilização de tuberculostáticos:

estreptomicina (SM), a partir de 1948; ácido paramino-salicílico (PAS), a partir de 1949

e isoniazida (INH), a partir de 1952. A partir da década de 60 começa efetivamente a

utilização de esquemas terapêuticos padronizados (Ruffino-Netto, 2002).

1.2. Epidemiologia da tuberculose

No Brasil e em outros 21 países em desenvolvimento, a tuberculose é um grande

problema de saúde pública. Nesses países, encontram-se 80% dos casos mundiais da

doença. Todos os anos, são registrados mundialmente cerca de 8 milhões de novos

casos, com quase dois milhões de óbitos (Brasil, 2008).

Estimativas apontam que mais de 60 milhões de pessoas estejam infectadas

pelo bacilo da tuberculose. Em 2005, foram registrados 80.603 casos novos da doença

que causa, em média, 5 mil óbitos por ano Brasil. Cerca de 70 % dos casos estão entre

315 dos 5.570 municípios brasileiros, sendo considerada a 9 causa de internações, 7

causa em gastos com internações no Sistema Único de Saúde (SUS) e 4 causa de

mortes por doenças infecciosas. No mundo, estima-se que ocorram cerca de 500 mil

casos novos de Tuberculose resistente à multidroga (TB-MDR) por ano, em 114 países

de todos os continentes (Brasil, 2008).

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), no ano de 2006 o Brasil

ocupava o 15º lugar no ranking entre os 22 países em desenvolvimento, tendo uma

incidência de 50/100.000 e de prevalência de 55/100.000. (OMS, 2008b).

Atualmente, o Brasil ocupa o 16 lugar no ranking mundial, tendo a Índia como

líder absoluto em número de casos, ocupando o 1 lugar do grupo (OMS, 2008b).

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No Rio Grande do Sul (RS), a incidência de TB varia conforme a região

geográfica. As taxas de TB registradas nas regiões norte e sul do estado são muito

diferentes e estão, provavelmente, relacionadas com a situação sócio-econômica da

população (Ott & Gutierrez, 1993).

Mais de 65% dos casos de TB ocorrem na região metropolitana de Porto Alegre,

onde a incidência é de aproximadamente 94/100.000 habitante. Na região sul do

Estado, as taxas variam entre 35,2 e 54,3/100.000 habitantes; na região central, entre

18,3 e 35/100.000 habitante; na região norte, entre 9,2 e 26.3/100.000 habitantes (SES-

RS, 2001).

Até o mês de fevereiro de 2008, Porto Alegre teve um total de 377 casos

investigados e confirmados, destes, 254 foram confirmados como casos novos (SMS-

POA-RS, 2008).

1.3. M. tuberculosis

A disponibilidade da seqüência genômica completa do M. tuberculosis (Mtb) e as

particularidades obtidas através das análises detalhadas de bioinformática têm nos

fornecido uma grande quantidade de novas informações, conhecimentos e

entendimentos da biologia deste patógeno humano (Cole et al., 1998).

O Mtb, também conhecido como Bacilo de Koch (BK), é um bacilo não formador

de esporos, sem flagelos, não produtor de toxina, espécie aeróbia estrita e intracelular

facultativo, de crescimento lento com tempo de geração de 15 a 20 horas, além de ser

uma micobactéria álcool-ácido resistente (BAAR). Devido a essas características, a

bactéria mostra preferência de ataque pelos pulmões devido à tensão de O2 existente

nestes órgãos (Castro & Trabulski, 1991, Barrera, 2007).

21

A análise do genoma do Mtb mostrou que o genoma compreende 4.411.529 pb,

com 3.924 proteínas e com um conteúdo G+C de 65.6%, sendo relativamente

constante em todo o genoma. Entretanto, diversas regiões apresentaram um conteúdo

de G+C maior que a média, as quais correspondem a seqüências pertencentes a

grandes famílias gênicas que incluem seqüências polimórficas ricas em G e C (PGRs)

(Cole et al., 1998, Ducati et al., 2006).

O Mtb, pertencente à família Mycobacteriaceae, é um dos componentes do

complexo M. tuberculosis, junto com outros cinco membros: M. bovis, M. bovis BCG, M.

microti, M. africanum e M. canetti. Todos os membros desse complexo são bactérias de

multiplicação lenta com um tempo de geração próximo a 24 horas e levam de 3 a 4

semanas para formar colônias em meios de cultura sólidos (Cole, 2002). Entretanto, é

importante chamar a atenção para as características que diferenciam M. tuberculosis

de qualquer outra bactéria: a presença de um genoma com aproximadamente 4000

genes, a maioria codificando para enzimas envolvidas na lipólise (para a sobrevivência

da bactéria no hospedeiro) e lipogênese (para a síntese do envelope celular) (Ducati et

al., 2006).

O M. tuberculosis é um patógeno intracelular e sua parede tem baixa

permeabilidade, já que possui uma estrutura e composição rica em lipídeos (De Rossi

et al., 2006). Essa baixa permeabilidade é devida à estrutura da parede celular

extremamente incomum. As micobactérias são caracterizadas por um envelope

altamente hidrofóbico que atua como uma barreira de permeabilidade para muitos

componentes e possui um sistema de efluxo de fármacos bem desenvolvido (Rossetti et

al., 2002).

O envelope é composto por uma membrana plasmática, uma parede celular e

uma cápsula externa. A membrana plasmática das micobactérias não parece ser

peculiar, exceto pela presença de alguns lipopolissacarídeos, que de alguma forma são

divididos por todos os actinomicetales. Essa membrana é rodeada por uma parede

celular que protege a célula, fornece apoio mecânico e é responsável pelas

características do formato da bactéria. Entretanto, essa parede é única entre os

22

procariotos. É formada por componentes não usuais como o arabinogalactano e ácidos

micólicos, que são tipicamente longos, formando cadeias com aproximadamente 60 a

90 átomos de carbono (Ducati et al., 2006, Barrera, 2007). As micobactérias possuem

proteínas de membrana que formam canais catiônicos seletivos chamados porinas, que

controlam ou retardam a difusão de pequenas moléculas hidrofílicas, conferindo baixa

permeabilidade à parede celular para os solutos hidrofílicos (Ducati et al.,2006).

M. tuberculosis tem a capacidade de entrar em períodos de latência com uma

atividade metabólica limitada, dificultando a ação dos antimicrobianos, contribuindo

para a natureza crônica da doença e impondo um regime de tratamento longo. Além

disso, existem, numa mesma infecção, populações de bacilos de comportamentos

diferentes em função de sua localização e atividade. Assim, os bacilos presentes nas

cavidades pulmonares multiplicam-se de forma ativa em um ambiente aeróbio, os

bacilos do interior dos macrófagos, o fazem em um ambiente microaerofílico, que induz

a latência, e os bacilos que se encontram no interior da lesão caseosa têm,

ocasionalmente, um ciclo replicativo. Por outro lado, se o Mtb pode multiplicar-se nos

tecidos, onde a penetração dos antibióticos é fácil, no material caseoso a penetração

dos antibióticos é mais difícil. Os fármacos antituberculosos apresentam um perfil de

atividade diferenciado frente a cada uma dessas localizações e populações, e é

necessário assegurar-se que o tratamento prescrito seja ativo contra todas elas (Coll,

2003).

O estado de dormência, no qual o bacilo permanece quiescente sem infectar os

tecidos, pode ser resultado da ação de mediadores celulares da resposta imune que

podem conter, mas não erradicar a infecção. Quando a imunidade diminui, as bactérias

dormentes reativam-se, causando a deflagração da doença, mesmo décadas após a

infecção inicial (Cole et al., 1998).

1.4. Tratamento

O tratamento da TB é realizado com cinco drogas de primeira linha: Isoniazida

(INH), Rifampicina (RMP), Pirazinamida (PZA), Etambutol (EMB) e Estreptomicina (SM)

23

(Zhang, 2005). Na tabela 1 são expostos os esquemas de tratamento da TB utilizados

no Brasil desde 1979.

Atualmente, o tratamento recomendado pela OMS consiste na administração

combinada de INH, RMP, PZA e SM ou EMB durante os primeiros 2 meses, seguidos

pela combinação de INH e RMP por, no mínimo, 4 meses adicionais podendo levar à

cura em aproximadamente, 95% dos casos de TB (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1997).

Tabela 1. Esquemas de tratamento da TB utilizados no Brasil desde 1979. ETH,

etionamida; EMB, etambutol; SM, estreptomicina; PZA, pirazinamida; RMP, rifampicina.

Adaptado de Brasil, 2007.

Esquemas de Tratamento da Tuberculose

Sem tratamento anterior, casos novos de

todas as formas exceto meningoencefalite

Esquema 1 2 meses: RMP / INH / PZA

4 meses: RMP / INH

Com tratamento anterior, casos de

retratamento em recidivas ou retorno após

abandono do esquema 1

Esquema 1

Reforçado

2 meses: RMP / INH / PZA / EMB

4 meses: RMP / INH / EMB

Meningoencefalite tuberculosa

Casos de meningite tuberculosa

Esquema 2 2 meses: RMP / INH / PZA

7 meses: RMP / INH

Falência do esquema 1 ou esquema 1

reforçado e casos de falência do 1, 1R ou 2

Esquema 3 3 meses: SM / ETH / PZA / EMB

9 meses: ETH / EMB

As drogas de primeira linha exibem atividade bactericida clara contra bacilos

metabolizadores ativos, e as drogas bacteriostáticas de segunda linha são reservadas

24

para fortalecer os tratamentos onde haja a presença de resistência, elas têm baixa

eficácia, e são geralmente mais tóxicas. Essas incluem o ácido p-aminosalicílico,

etionamida e cicloserina, entre outros (Ducati et al., 2006)

25

2. MECANISMOS DE RESISTÊNCIA

O aparecimento de resistência em cepas vem acontecendo desde a introdução

dos fármacos antituberculose no tratamento, decorrente de vários fatores,

principalmente a pressão seletiva exercida pelo uso inadequado dos fármacos (OMS,

1997), o que determina uma ameaça no controle da doença, tendo em vista a pequena

quantidade de fármacos eficazes disponíveis contra esse agente infeccioso.

Segundo OMS, uma cepa de Mtb é considerada resistente à múltiplas drogas

(MDR), quando apresentar resistência a isoniazida e a rifampicina simultaneamente

(Cole & Telenti, 1995).

Recentemente, o Centro de Controle de Doenças nos Estados Unidos/CDC-

USA, definiu uma nova classe de MDR, nomeada como TB-XDR (“Extensively Drug-

Resistant”), cujos isolados são resistentes a isoniazida, rifampicina e, no mínimo à 3

drogas das 6 principais classes de drogas de segunda linha (aminoglicosídeos,

polipeptídios, fluoroquinolonas, tionamidas, cicloserinas e ácido p-aminosalicílico)

(Ducati et al. 2006).

Os fatores que afetam negativamente o Programa de Controle da Tuberculose

(PCT) incluem a deficiência na implementação e manutenção de um esquema

terapêutico padronizado, a escassez no fornecimento dos fármacos em áreas com

recursos inadequados. A instabilidade política e o uso de fármacos de baixa qualidade

são preocupações adicionais. O desenvolvimento da resistência pode ser, também,

devido a uma escolha inapropriada do esquema terapêutico, algumas vezes por

desconhecimento de um tratamento anterior, ausência de esquemas terapêuticos

padronizados e erros como a prescrição de um único fármaco (OMS, 1997; Espinal et

al., 2001).

Outro fator muito importante é a não adesão do paciente ao tratamento prescrito,

o que, freqüentemente, é uma fonte de isolados resistentes a drogas. O tratamento tem

duração de 6 meses e é considerado longo se comparado com o tratamento de outras

infecções bacterianas como Helicobacter pylori e infecções por pneumococos, cujos

tratamentos não duram mais de uma ou duas semanas (Zhang, 2005).

26

O desenvolvimento de resistência pelos microrganismos é uma resposta

evolucionária à pressão seletiva dos antibióticos. De modo geral, os microrganismos

vêm desenvolvendo inúmeros mecanismos de resistência que impossibilitam a ação

dos medicamentos (McKeegan et al., 2003). Análises genéticas e moleculares de

bacilos resistentes, sugerem que a resistência é usualmente adquirida por alterações

no alvo do fármaco como conseqüência de mutações no gene que codifica esse alvo

(Rossetti et al., 2002).

2.1. Resistência aos antimicrobianos

As bactérias usam um grande número de estratégias relacionadas com a

resistência às drogas. Essas podem ser resumidas em cinco categorias (Nikaido, 1998;

Zhang & Telenti, 2000):

1) Degradação ou inativação de drogas, quando o microrganismo produz enzimas que

destroem a droga ativa, por exemplo, a inativação de antibióticos β-lactâmicos, como a

penicilina, é mediada por penicilinases que catalisam a hidrólise do anel β-lactâmico;

2) Modificação do alvo da droga ou nos ativadores dos pró-fármacos: ocorre quando o

microrganismo altera a estrutura alvo da droga ou que ativaria este fármaco, por

exemplo, rpoB e resistência a rifampicina;

3) Modificação de vias metabólicas envolvidas na ativação da droga: quando o

microrganismo desenvolve uma via metabólica alterada que transpassa a outra reação

necessária para a ativação da droga, por exemplo, katG e resistência a INH;

4) Envoltório celular como uma barreira à entrada de drogas, ocorre quando a célula já

possui uma barreira à entrada de drogas ou quando o microrganismo altera sua

permeabilidade, diminuindo a permeabilidade às drogas, aparentemente devido a uma

mudança na membrana externa, como por exemplo, a parede celular de Pseudomonas;

27

5) Mecanismos de efluxo: o microrganismo desenvolve resistência, em razão de,

proteínas de membrana que causam a extrusão de drogas, como por exemplo, a TetC,

uma proteína de membrana em Escherichia coli.

2.1.1. Resistência do M. tuberculosis aos Antimicrobianos

2.1.1.1. Resistência Inata

O M. tuberculosis é naturalmente resistente a muitos antibióticos, devido

principalmente, ao envelope altamente hidrofóbico, que atua como uma barreira para

muitos compostos. Muitos determinantes do potencial de resistência são também

codificados pelo genoma. Isso inclui enzimas hidrolíticas ou modificadoras de drogas,

como as β- lactamases, acetil-aminoglicosideo-transferases e bombas de efluxo de

drogas (Cole et al., 1998).

2.1.1.2. Resistência Adquirida

A resistência adquirida às drogas pelo M. tuberculosis desenvolve-se,

principalmente, por mutações em genes alvo dos fármacos ou em genes que codificam

ativadores dos pró-fármacos. As mutações espontâneas são causadas devido à taxa

natural de mutação do DNA genômico, sendo selecionadas por subdosagem. A

resistência a isoniazida e estreptomicina é encontrada na taxa de 10-7, enquanto que a

resistência a rifampicina desenvolve-se, freqüentemente, a 10-9. Isso implica que cada

paciente com tuberculose pode abrigar bacilos que são separadamente resistentes a

drogas antituberculosas. Por essa razão, a tuberculose deve ser tratada com terapia

28

multidroga (Gillespie, 2002). Nenhum plasmídeo ou transposon transmissível conferindo

resistência foi identificado neste microrganismo (Riska et al, 2000).

Não se conhece uma alteração genética capaz de dar origem ao fenótipo de

multiresistência. O fenótipo multidroga resistente (MDR) observado em isolados clínicos

deve-se à aquisição seqüencial de mutações em diferentes genes. A detecção precoce

da resistência aos fármacos antituberculosos é essencial para o correto controle da

tuberculose resistente (Coll, 2003).

2.1.2. Isoniazida (INH)

2.1.2.1. Mecanismo de Ação e Resistência da INH

A isoniazida ou hidrazida do ácido isonicotínico (INH), conforme mostrado na

figura 1, é o mais antigo fármaco sintético efetivo contra a TB e um dos principais

quimioterápicos de primeira linha no tratamento da doença, sendo reconhecida, já em

1952, como potente agente contra o M. tuberculosis (Zhang & Telenti, 2000, Rossetti et

al., 2002, Timmins & Deretic, 2006). A concentração inibitória mínima é muito baixa, o

que contribui para a eficácia (0,01 – 0,20 g/mL). O mecanismo de ação da INH, assim

como o que confere resistência, é complexo e ainda pouco entendido (Timmins &

Deretic, 2006).

29

Figura 1: Estruturas de isoniazida (1), radical hidrazil isonicotínico (2) e o radical acil

isonicotínico (3) (Timmins & Deretic, 2006).

A INH entra na célula por difusão passiva (Timmins & Deretic, 2006) e é ativa

somente nos bacilos em replicação ativa; é uma pró-droga que requer a ativação pela

enzima catalase-peroxidase da bactéria para gerar vários radicais reativos, que então

atuam em diversos alvos no bacilo (Zhang, 2005). Essa catalase-peroxidase é uma

enzima multifuncional que inclui outras atividades como peroxinitritase e NADH oxidase

(Timmins & Deretic, 2006).

O alvo mais conhecido da INH, é a via de síntese do ácido micólico da parede

celular, em que pelo menos duas enzimas, InhA e KasA, têm sido identificadas como

alvo da inibição pela INH (Zhang, 2005).

A INH tem múltiplos efeitos no bacilo da tuberculose e não é tarefa simples

localizar com precisão qual é o alvo mais essencial, cuja inibição levará a morte da

célula (Zhang & Telenti, 2000).

Isolados clínicos freqüentemente perdem a atividade da enzima catalase-

peroxidase e desenvolvem resistência a INH. Mutações no gene katG que codifica a

enzima catalase-peroxidase reduzem ou eliminam a habilidade de ativar a pró-droga

INH. Esse gene está localizado numa região altamente variável do genoma contendo

seqüências de DNA repetitivo que podem ser a causa da instabilidade desta região e

podem contribuir para a alta freqüência de mutações em katG em cepas resistentes a

INH (Zhang & Telenti, 2000).

30

A estrutura cristal da proteína KatG, e recentemente da variante S315T, forneceu

uma visão melhor do mecanismo de ativação da INH. O estreitamento do canal de

acesso ao sítio ativo na proteína, de 6 Å no tipo selvagem (WT) para 4,7 Å na variante

S315T, sugere que a diminuição do acesso da INH ao sítio oxidativo de KatG possa ser

a chave na resistência, de acordo com investigações espectroscópicas (Timmins &

Deretic, 2006).

Uma enzima envolvida na síntese do ácido micólico da parede celular que é

codificada por inhA é provavelmente o principal alvo da INH. Mutações na região

codificadora ou promotora do inhA estão relacionadas com resistência a INH em baixos

níveis. Alterações no gene kasA, que codifica uma enzima relacionada com a síntese

de lipídeos, também têm sido encontradas em cepas resistentes a INH (Rossetti et al.,

2002). Entretanto, o gene kasA não tem sido considerado um bom marcador de

resistência a INH, já que ele pode estar alterado, tanto em cepas resistentes quanto

sensíveis. No entanto, 20-30% de todas as mutações associadas com a resistência a

INH, não ocorrem nos genes katG e inhA, indicando que nesses isolados a resistência

pode ser de outra natureza, como indução de bombas de efluxo (Viveiros et al., 2003),

e/ou outros genes podem estar envolvidos na resistência a INH (Rossetti et al., 2002).

Estudos prévios demonstraram que mutações na região a montante do gene

inhA resultam em níveis elevados de expressão da proteína InhA, aumentando, assim,

o número de alvos para a droga, produzindo resistência a INH via mecanismo de

titração (Ramaswamy et al., 2003).

2.1.2.2. O Gene katG e a Resistência a INH

O gene katG está localizado em uma região altamente variável do genoma

contendo seqüências repetidas de DNA, o que pode ser a possível causa para a

instabilidade desta região, podendo contribuir para a alta freqüência de mutações neste

gene em cepas resistentes à INH (Zhang & Young, 1993).

31

A catalase-peroxidase (KatG) consiste de duas subunidades idênticas de 80 kDa

e, em Escherichia coli, desempenha um papel de proteção contra agentes oxidativos,

semelhante a H2O2, acumulado durante a respiração oxidativa. KatG, por ser uma

proteína com atividade catalítica bifuncional, converte 2H2O2 para 2H2O através de sua

função catalase. A atividade peroxidase parece necessária na ativação da INH para

uma substância tóxica à célula bacteriana, porém o mecanismo como isto acontece é

ainda pouco compreendido (Zhang & Young, 1993).

As duas mutações predominantes em katG são encontradas nos códons 315 e

463 (van Doorn et al. 2001). Entre 53% a 96% das mutações responsáveis pela

resistência a INH ocorrem no códon 315 do gene katG, envolvendo a substituição de

SerThr (SerinaTreonina : ST), (Höfling et al., 2005, van Doorn et al., 2006). Já no

códon 463, ocorre a troca de ArgLeu (ArgininaLeucina : RL), numa freqüência de

25 – 45 %, porém a presença desta mutação não é associada à resistência à INH. Essa

mutação deve ser considerada um polimorfismo sem relação à pressão seletiva

induzida pelo tratamento com drogas. A atividade da catalase não difere entre os

isolados de M. tuberculosis, tanto com o aminoácido arginina ou leucina no códon 463

(van Doorn et al., 2001).

Isolados com inserções e deleções perdem a atividade da catalase, e as

Concentrações Mínimas Inibitórias (CMI) destes isolados são freqüentemente as mais

altas, confirmando observações prévias sobre a perda da atividade da catalase e um

alto nível de resistência a INH (Ramaswamy et al., 2003).

2.1.2.3. O Gene inhA e a Resistência a INH

A enzima enoil-ACP redutase (ACP) envolvida na biossíntese do ácido micólico

(InhA) é uma proteína transportadora de grupamentos acil, codificada pelo gene inhA.

Essa proteína é indispensável para a síntese normal dos ácidos micólicos, e que pode

ser diretamente inibida por uma toxina derivada da INH (Dessen et al. 1995). A enzima

32

InhA, catalisa uma etapa primária na síntese de ácido graxo, e quando alterada em

conseqüência da mutação no gene, modifica a afinidade pelo cofator, resultando na

expressão de um fenótipo resistente a INH (Rossetti et al., 2002). Apresenta uma

homologia de mais de 40% com a proteína EnvM de Escherichia coli (Rattan et al.,

1998) e sendo 87% idêntica à proteína InhA de M.smegmatis (McMurry et al., 1999).

Mutações na região estrutural e promotora do gene inhA têm sido relacionadas

com a resistência. Aproximadamente 10 – 15% dos isolados resistentes a INH

apresentam mutações nesse gene (van Doorn et al., 2001).

A mutação mais freqüente, ocorre na posição S94A, trocando uma serina por

uma alanina na proteína, demonstrando níveis elevados de resistência a INH (McMurry

et al., 1999).

Geralmente, as mutações em inhA estão associadas com um baixo nível de

resistência a INH, ao contrário do que acontece com katG, onde as mutações podem

ser causadas tanto com um nível baixo ou alto de resistência, dependendo do efeito

das mutações na atividade da enzima catalase-peroxidase exigida para a ativação da

INH (Zhang & Telenti, 2000).

2.2. Sistema de Efluxo nas Bactérias

Bombas de efluxo são proteínas envolvidas na extrusão de substratos tóxicos de

dentro da célula para o meio externo incluindo, virtualmente, todas as classes de

antibióticos clinicamente relevantes. Essas proteínas são encontradas em bactérias

gram-positivas e negativas, assim como em organismos eucarióticos (Webber &

Piddock, 2003). Podem ser específicas para um substrato ou podem transportar uma

ampla gama de componentes estruturalmente similares (incluindo antibióticos de

múltiplas classes). Tais bombas podem estar associadas com a resistência MDR

(Piddock, 2006).

33

As micobactérias são, naturalmente, resistentes aos antibióticos mais

comumente utilizados devido à baixa passagem de drogas através de seu envelope

celular altamente hidrofóbico. A análise da seqüência genômica mostrou que as

micobactérias possuem múltiplas bombas de efluxo (Viveiros et al., 2003). Tem se

tornado evidente que a resistência intrínseca de muitas bactérias aos antibióticos

(ATB’s) depende da expressão induzida ou constitutiva de sistemas de efluxo ativos

(De Rossi et al., 2006) e evidências recentes sugerem que a resistência MDR de M.

tuberculosis se encaixa nesse perfil (Danilchanka et al., 2008).

O maior determinante na resistência intrínseca é a existência de uma membrana

externa única, a qual apresenta uma barreira na permeabilidade bastante eficaz, tanto

para solutos hidrofóbicos quanto hidrofílicos (Danilchanka et. al., 2008).

Os ATB’s podem servir como indutores, regulando a expressão dos sistemas de

efluxo em nível de transcrição de genes pela interação com os sistemas regulatórios.

Esses transportadores poderiam ser superexpressos como resultado de mutações

nesses reguladores e podem, entretanto, exercer um importante papel na resistência

intrínseca e adquirida (De Rossi et al., 2006).

Estudos sobre o mecanismo de regulação das bombas em mutantes de

laboratório, como por exemplo, E. coli, C. jejuni, P. aeruginosa e N. gonorrheae,

demonstram que os mecanismos de aumento de efluxo em isolados clínicos se

enquadram em quatro grupos: (1) mutações no gene repressor local, (2) mutações no

gene regulador global, (3) mutações na região promotora do gene transportador e (4)

elementos de inserção na região a montante do gene (Piddock, 2006).

É estimado que, aproximadamente 5 – 10% de todos os genes bacterianos estão

envolvidos em transporte, e uma grande parte desses genes codifiquem bombas de

efluxo (Webber & Piddock, 2003, De Rossi et al., 2006).

Os genes que codificam para as bombas podem ser encontrados nos

cromossomos, ou então, em elementos transponíveis, como os plasmídeos, como por

exemplo, os genes tet e qac, e grandes deleções têm sido preditas a render um

repressor inativo (Piddock, 2006).

34

As proteínas de transporte são agrupadas em famílias de acordo com a

homologia de seqüência de aminoácidos e similaridade de mecanismos (Moreira et al.,

2004).

Há essencialmente 5 famílias diferentes de proteínas de efluxo. Duas dessas

famílias são superfamílias de origem evolutiva antiga: ABC Superfamily (“ATP-binding

cassette”) e MFS (“Major Facilitator Superfamily”). As outras 3 famílias são menores e

evoluíram recentemente: SMR (“Small Drug Resistance Family”), RND (“Resistance-

Nodulation-Cell Division Family”) e a MATE (“The Multidrug and Toxic Compounds

Extrusion Family”). As proteínas das famílias MFS, SMR, RND e MATE são

transportadores secundários, nas quais o efluxo da droga é acoplado ao influxo de

prótons e íons sódio. Na figura 2, é mostrado um diagrama comparando o mecanismo

de ação das 5 famílias de proteínas de efluxo existentes. Nela são citados alguns dos

substratos utilizados por cada família, assim como seu mecanismo de ação. Essas

bombas utilizam, freqüentemente, a força motora do fluxo de prótons. Em contraste, os

membros da família ABC, que são freqüentemente consideradas transportadores

primários, fazem uso do ATP como fonte de energia. O genoma de M. tuberculosis

contém genes que codificam transportadores de efluxo de drogas de todas essas

famílias (http://www.membranetransport.org) (Webber & Piddock, 2003, Marquez,

2005, De Rossi et al., 2006, Piddock, 2006, Mahamoud et al., 2007).

As bombas das famílias MFS e RND são as mais abundantes. As MFS’s são

encontradas em bactérias gram-positivas e gram-negativas e são caracterizadas por um

espectro estreito, reconhecendo usualmente um ou alguns antibióticos de poucas

classes. Já as bombas RND são encontradas exclusivamente em bactérias gram-

negativas, e apresentam um amplo espectro de substratos (poliseletiva), incluindo não

apenas muitas classes de ATB’s, reconhecendo também, componentes antisépticos e

detergentes (Mahamoud et. al., 2007).

35

Figura 2: Diagrama comparando as cinco famílias de proteínas de efluxo, adaptado de

Piddock, 2006.

Estudos mostram que quando as bombas de efluxo são inibidas por seus

inibidores, o desempenho das drogas pode ser significativamente melhorado. É

esperado que a inibição de bombas de efluxo: (i) diminua o nível da resistência

intrínseca; (ii) reverta resistência adquirida significativamente; e (iii) diminua a

freqüência de emergência de mutantes altamente resistentes (Lomovskaya et al., 2001, Marquez, 2005).

O estudo das bombas de efluxo tem seguido duas estratégias principais. Na

primeira delas, estas proteínas têm sido caracterizadas individualmente por clonagem e

expressão dos genes em micobactérias de crescimento rápido, especialmente o

Mycobacterium smegmatis, cepa mc2 155. Alguns destes estudos têm mostrado que o

mecanismo de transporte ativo de drogas pode estar envolvido na resistência intrínseca

ou adquirida às drogas (Viveiros et al., 2003; Takiff et al., 1996). Nesse contexto, já

foram caracterizadas algumas bombas de efluxo em M. tuberculosis, que conferem

resistência a tetraciclina (Tap) (Ainsa et al., 1998), aminoglicosídeos e tetraciclina (P55)

(Silva et al, 2001), tetraciclina, eritromicina, etambutol, norfloxacina, estreptomicina,

cloramfenicol e antraciclinas (DrrAB) (Chouduri et. al, 2002), rifampicina e ofloxacina

(Rv1258c) (Siddiqi et al., 2004), ciprofloxacina (Rv2686c-Rv2687-Rv2688c) (Pasca et

al, 2004).

Múltiplas drogas

Acriflavina

Cloreto de benzalconio

Cetrimida

Aminoglicosídeos

Fluorquinolonas

Drogas catiônicas

Acriflavina

Cetrimida

Clorexidina


Múltiplas drogas

Acriflavina


Cetrimida

Aminoglicosídeos

Fluorquinolonas

Drogas catiônicas

Acriflavina

Cetrimida

Clorexidina

Cloreto de benzalconio Múltiplas drogas

Múltiplas drogas

Acriflavina


Cetrimida

Aminoglicosídeos

Fluorquinolonas

Drogas catiônicas

Acriflavina

Cetrimida

Clorexidina


Múltiplas drogas

Acriflavina


Cetrimida

Aminoglicosídeos

Fluorquinolonas

Drogas catiônicas

Acriflavina

Cetrimida

Clorexidina


Múltiplas drogas

Acriflavina


Cetrimida

Aminoglicosídeos

Fluorquinolonas

Drogas catiônicas

Acriflavina

Cetrimida

Clorexidina


Múltiplas drogas

Acriflavina


Cetrimida

Aminoglicosídeos

Fluorquinolonas

Drogas catiônicas

Acriflavina

Cetrimida

Clorexidina


36

Na segunda estratégia, os estudos têm utilizado uma abordagem indireta,

procurando caracterizar o efluxo como mecanismo relacionado a resistência intrínseca

e adquirida em micobactérias. Nestes experimentos foram utilizadas substâncias, tais

como verapamil, reserpina e o ionóforo cianeto de carbonila de M-clorofenil hidrazona

(CCCP), que atuam como inibidores dos sistemas de efluxo, e observou-se um maior

acúmulo de droga ou uma diminuição dos níveis de resistência (Levy, 1992; Markham, 1999; Choudhuri et al., 1999; Banerjee et al., 1996, Poole, 2000).

O verapamil (C27H38N2O4) é um bloqueador de canais de cálcio utilizado como

substância ativa de medicamentos para hipertensão, pois tem a capacidade de relaxar

vasos sanguíneos (veias e artérias), diminuindo a pressão sanguínea, o que reduz o

esforço para o coração bombear o sangue. Também é utilizado no tratamento de

angina (dor no peito) e para controlar alguns tipos de batimentos cardíacos irregulares

(Lüllmann et al., 2008). Tem sido utilizado como bloqueador de transportadores de

drogas, causando a inibição do sistema de efluxo e aumentando a concentração

intracelular da droga provocando a morte da célula bacteriana (Banerjee et al., 1996;

Markham & Neyfakh, 1996).

Sabe-se também que o verapamil é um inibidor de bombas MDR de células

cancerosas e parasitas e também melhora a atividade da tobramicina. O verapamil e a

reserpina, um outro inibidor, são rotineiramente utilizados para avaliar a atividade de

bombas de efluxo em bactérias gram-positivas (Mahamoud et al., 2007).

Bombas de efluxo multidrogas (MDRs) têm sido definidas como translocases de

membrana, com uma capacidade surpreendente de expulsar da célula uma variedade

de drogas não relacionadas (Moreira et al., 2004).

O CCCP vem sendo utilizado em estudos por dispersar o gradiente próton-motor

das membranas e por despolarizar a membrana energizada (Ainsa et al., 1998, Pasca

et al., 2004, Levy, 1992), inibindo assim as bombas de efluxo que utilizam a força do

próton-motor. Sua elevada toxicidade o torna inviável para o uso terapêutico (Diaz,

2003, Mahamoud et al., 2007). Ele tem sido utilizado em laboratório por abolir

totalmente o efluxo de vários tipos de moléculas. Esses componentes reduzem a

viabilidade da bactéria e causam a morte celular via dissipação da força próton-motora

da membrana. Conseqüentemente, há sempre a questão se, é devido ao seu efeito

37

sobre a bomba de efluxo, o que causaria um aumento da penetração do antibiótico, ou

se é devido a uma alteração do envelope celular que resulta na morte da bactéria

(Mahamoud et al., 2007).

Derivados sintetizados quimicamente e produtos naturais, como a berberina ou

5-metoxihidnocarpina, possuem atividade contra as bombas de efluxo. Problemas na

síntese, purificação, estabilidade e solubilidade, assim como, sua toxicidade potencial,

tem reduzido o interesse em pesquisas adicionais para o desenvolvimento desses

promissores inibidores de bombas de efluxo (Mahamoud et al., 2007).

Progressos recentes na análise estrutural de uma série de proteínas solúveis

multidroga transportadoras, demonstraram que elas possuem sítios de ligação

altamente hidrofóbicos aos seus substratos, por uma combinação entre interação

hidrofóbica e atração eletrostática, preferencialmente às ligações de hidrogênio e outras

interações específicas, o que é característica de enzima e receptores. A topologia dos

transportadores multidroga sugere sítios de ligação similares, com princípios

semelhantes de reconhecimento de substrato. Isto não explicaria somente a ampla

especificidade a substratos, mas também, sua relação evolucionária e aparente

multiplicidade em genomas de organismo de todos os reinos, embora estudos

adicionais sejam necessários para comprovar essa hipótese (Moreira et al., 2004).

A bomba de efluxo multidroga melhor caracterizada é a Glicoproteína-Permease

(P-gp), codificada pelo gene mdr1 (resistência multidroga), identificada em humanos e

roedores, responsável pela resistência de uma ampla gama de drogas citotóxicas via

efluxo dependente de ATP (Moreira et al., 2004).

Com o auxílio da bioinformática, foi revelada na seqüência genômica de M.

tuberculosis a presença de 13 proteínas transmembranares preditas a serem proteínas

transportadoras da superfamília RND. Desde então, essas proteínas que parecem fazer

parte das micobactérias, foram designadas como MmpL7 (proteínas de membrana

micobacteriana). A natureza hidrofóbica das proteínas MmpL e a íntima associação de

quatro dos genes delas com genes envolvidos no metabolismo de lipídeos, sugerem

que, elas possam estar naturalmente envolvidas no transporte de ácidos graxos. Dadas

às similaridades com outros transportadores RND, é possível que as proteínas MmpL

possam atuar no efluxo de drogas (Pasca et al., 2005).

38

Entretanto, até o momento, 26 transportadores completos, 11 incompletos da

superfamília ABC e 16 proteínas da famíla MFS foram identificados em M. tuberculosis

e o envolvimento de muitas dessas proteínas no transporte de aminoglicosídeos,

fluorquinolonas, cloranfenicol, isoniazida, rifampicina e tetraciclinas tem sido

demonstrado (De Rossi et al., 2006, Danichanka et al., 2008).

Pasca et al., (2005) investigaram o gene conhecido como MmpL7 na resistência

a INH, expressando-o em uma micobactéria de crescimento rápido e não patogênica, o

M. smegmatis. A sua superexpressão foi responsável pelo aumento da Concentração

Mínima Inibitória (CMI) para INH nessa micobactéria. Os níveis de CMI foram testados

na presença dos inibidores reserpina e CCCP. Quando adicionados ao meio,

apresentaram uma redução nos níveis da droga de até 8 vezes (512 g/mL versus 64

g/mL). Já o verapamil não apresentou redução, não tendo efeito na diminuição da

CMI. MmpL7 foi o primeiro exemplo de um transportador RND responsável pela

resistência a INH em M. smegmatis, e até então, essas proteínas haviam sido descritas

somente em bactérias gram-negativas (Pasca et al., 2005).

Observou-se em estudos de cultura celular que componentes das bombas de

efluxo RND são importantes na invasão, aderência e/ou colonização da célula

hospedeira. A diminuição da invasão celular foi observada com mutantes de

Pseudomonas aeruginosa PAO1 com a inativação da bomba conhecida por mexB.

Esses dados sugerem que, as bombas de efluxo têm um papel importante na mediação

da aderência e captação da bactéria dentro da célula hospedeira alvo, assim como na

sobrevivência às substâncias nocivas no ambiente local (Piddock, 2006).

A superexpressão de bombas de efluxo MDR, sozinhas, freqüentemente, não

causa altos níveis de resistência que sejam significativamente relevante aos ATB’s

(Webber & Piddock, 2003), sendo possível que o influxo/efluxo atue de forma sinérgica

com mecanismos alternativos na diminuição eficaz da concentração intracelular de

drogas (Danilchanka et al., 2008). Entretanto, tal bactéria pode ser considerada mais

equipada para sobreviver à pressão antibiótica e desenvolver mutações adicionais em

genes que codificam para sítios alvos dos ATB’s. Mutantes e isolados clínicos que

superexpressam essas bombas são estáveis e comumente isolados. Pode ser que tais

39

mutantes acumulem mutações compensatórias que permitam a eles crescer assim

como a bactéria selvagem (WT) (Webber & Piddock, 2003).

Em um estudo recente, uma nova bomba de efluxo MDR em M. tuberculosis foi

identificada. Ela foi nomeada como Rv0194, codificada pelo gene rv0194 e

considerada a primeira proteína de efluxo descrita em M. tuberculosis que envolvida na

resistência aos antibióticos -lactâmicos (Danilchanka et al., 2008).

Análises de alinhamento de seqüências nucleotídicas (Blast), revelaram que o

gene rv0194 codifica uma proteína transportadora pertencente à família ATP-Binding

Cassette (ABC) (Danilchanka et al., 2008).

2.3. Arilamina N-acetiltransferase (NAT)

As enzimas arilamina N-acetiltranferases (NATs) são enzimas citosólicas que

acetilam arilaminas e hidrazinas pela transferência do grupo acetil da acetil Coenzima-A

(acetil-CoA) para um o grupo amino livre formando uma acetilamida. As mesmas

enzimas são capazes de catalisar a transferência de um grupo acetil para o oxigênio de

uma aril-hidroxilamina (Payton et al., 1999, Upton et al., 2001a, Upton et al., 2001b,

Sandy et al. 2002, Kawamura et al. 2003, Sholto-Douglas-Vernon et al., 2005, Sandy et

al. 2005b). As enzimas NATs foram encontradas primeiramente em humanos como

uma enzima chave nas variações apresentadas no metabolismo da droga

antituberculose INH (Kawamura et al. 2003). De uma forma geral, variações

polimórficas de NATs podem ser encontradas tanto em organismos procariotos quanto

em eucariotos (Upton et al., 2001a, Upton et al. 2001b).

Tem sido descrito para a enzima NAT o mecanismo de acetilação do tipo bi-bi

ping-pong, em que um grupo acetil é transferido de uma Ac-CoA (doador) para a

enzima NAT, formando um intermediário acetilado e então para o substrato (aceptor)

(Brooke et al., 2003, Sandy et al., 2005b, Sim et al., 2007, Fullam et al., 2008).

40

É proposto que NAT em micobactérias possa atuar na acetilação de INH e, sua

conseqüente inativação, resultando assim, em cepas resistentes à droga (Payton et al.,

1999, Sim et al., 2000, Sandy et al., 2002, Sandy et al., 2005b). Se a INH for acetilada

pela enzima NAT, o produto acetilisoniazida não poderia ser oxidado à sua forma ativa

pelo produto de katG (Sandy et al., 2002, Sholto-Douglas-Vernon et al., 2005). Esse

mecanismo de ativação e inativação da INH, realizado pelas enzimas KatG e NAT,

respectivamente, é mostrado no figura 3, segundo Sandy et al., (2005b).

Em humanos, uma das duas isoenzimas identificadas, a NAT2, inativa a droga

antituberculose isoniazida (INH) (Brooke et al., 2003).

Figura 3: Esquema que mostra a ativação e inativação da INH adaptado de Sandy et

al., 2005b.

Foi reportado que a NAT1 (humana) pode existir numa forma acetilada estável

antes da ligação do substrato, e que o nível de conservação de seqüências ao longo da

família NAT, apóia um mecanismo comum em procariotos e eucariotos homólogos,

porém, ainda não há evidências diretas de que isto ocorra nas enzimas NATs em

procariotos (Sandy et al., 2005b).

Experimentos prévios com a enzima NAT de S. typhimurium demonstraram que a

hidrólise da Ac-CoA catalisada pela NAT não pode ser detectada ao menos que um

Inativa

Ativa

41

substrato da classe arilamina ou hidrazina esteja presente (Delgoda et al., 2003). Foi

sugerido que a região C-terminal da proteína seja muito importante no controle da taxa

de hidrólise da Ac-CoA em ausência da INH ou de qualquer outro substrato. Esses

achados sugerem que ocorra uma mudança conformacional na NAT pela ligação da

INH, o que promoveria uma hidrólise da Ac-CoA de forma eficiente, e então, a

transferência da acetila para o ligante arilamina/hidrazina. Os resultados fornecem

evidências diretas da ligação da INH antes da Ac-CoA na enzima NAT de S.

typhimurium (Delgoda et al., 2003).

A formação de um complexo entre a INH e a NAT na ausência de acetilação ou

da Ac-CoA, é entretanto, surpreendente, mas consistente com os experimentos de

Ressonância Magnética Nuclear com a enzima NAT de S. typhimurium e pode

representar tanto um complexo de inibição de substrato ou um complexo que exista

antes do início do mecanismo ping-pong (Delgoda et al., 2003, Sandy et al., 2005b).

O gene nat de M. tuberculosis, conhecido também como tbnat, possui 852 pb e

codifica uma proteína de 284 aminoácidos.

Ambos, M. tuberculosis (TBNAT) e M. smegmatis (MSNAT), possuem o gene

nat, com as duas seqüências codificantes compartilhando 60% de identidade, sendo

que ambas enzimas são capazes de acetilar a INH (Payton et al., 1999, Sandy et al.,

2002, Sandy et al., 2005b).

Há evidências sugerindo que o gene tbnat codifica uma proteína importante para

o crescimento e desenvolvimento da bactéria, assim como para a síntese normal de

ácidos micólicos e, conseqüentemente, outros componentes derivados da parede

celular (Sholto-Douglas-Vernon et al., 2005). É possível que essa função endógena da

NAT em micobactérias esteja relacionada ao metabolismo da acetil-CoA (Sandy et al.,

2002). De fato, estudos recentes indicaram que a enzima NAT é necessária para a

biossíntese da parede celular em M. tuberculosis (Madikane et al., 2007).

O genoma de M. tuberculosis codifica mais de 200 enzimas envolvidas no

metabolismo de lipídeos, sugerindo a importância desta rota neste organismo

(Madikane et al., 2007).

42

O gene tbnat recombinante de M. tuberculosis mostra-se eficiente na N-

acetilação de INH in vitro, e quando superexpresso em M. smegmatis, a resistência a

INH do organismo transformado aumenta em até 3 vezes. Esses resultados sugerem

que tbnat possa estar envolvido na suscetibilidade do bacilo à INH (Sholto-Douglas-

Vernon, et al. 2005).

É reportado que o gene nat faz parte de um operon envolvendo quatro outros

genes (Payton et al., 2001, Sholto-Douglas-Vernon et al., 2005). Um quinto gene foi

posteriormente, adicionado a este operon (Sholto-Douglas-Vernon et al., 2005). É

proposto que a região promotora situa-se a montante deste operon e que mais de um

fator esteja envolvido no controle da expressão de tbnat. Por exemplo, mais que um

promotor poderia estar envolvido na expressão de tbnat, assim como descoberto no

gene katG e operon de RNAr (Sholto-Douglas-Vernon et al., 2005).

Sabe-se que a NAT metaboliza a INH em organismos em crescimento (Upton et

al., 2001b, Sandy et al., 2005b).

Bhatka et al., (2004) investigaram o papel deste gene na síntese dos ácidos

micólicos, como mencionado anteriormente, um dos principais componentes da parede

celular micobacteriana. Para isso, disruptou-se esse gene num isolado de M. bovis

BCG, uma cepa de M. bovis atenuada utilizada na produção de vacinas. Os autores

estudaram o crescimento, a morfologia celular, a composição da parede celular lipídica

e descobriram que a enzima NAT é essencial para a síntese normal de ácidos micólicos

em M. bovis BCG, sugerindo que a biossíntese dos ácidos micólicos envolva a NAT

numa rota ainda não identificada. Ainda nesse trabalho, perceberam que a perda da

atividade da NAT resultou num aumento da morte intracelular de isolados de M. bovis

BCG pelos macrófagos e que o crescimento desta cepa é mais lento quando o gene é

ausente. Isto foi observado tanto em cultura sólida quanto líquida. Em ágar, as colônias

nas quais o gene foi disrupto começam a aparecer em torno de 28 dias; já na cepa

parental, em torno de 21 dias.

Em humanos, o gene nat está localizado no cromossomo 8p22, e apresenta 3

variantes: PNAT, NAT1 e NAT2. PNAT é um pseudogene e contém um códon de

parada que não é transcrito. NAT1 e NAT2 são funcionalmente polimórficos e os genes

43

são codificados num lócus multi-alélico. As proteínas NAT, em humanos, têm 290

aminoácidos cada e compartilham 87% de identidade entre elas, tendo porém, perfis de

substratos diferentes (Upton et al., 2001a).

Os substratos de NAT1 incluem ácido para-aminobenzóico (paba), que atua na

síntese do ácido fólico, ácido p-aminosalicílico (uma droga anti-TB da classe das

oxazolidinonas) e para-acetamidobenzoilglutamato (p-Abglu), um catabólito do folato.

Já os substratos de NAT2 incluem a droga antituberculose isoniazida e sulfametazina

(Upton et al., 2001a).

A N-acetilação de INH em humanos pela NAT2 produz um metabólito

terapeuticamente inativo, causando assim, uma excreção mais rápida (Upton et al.

2001b). Neste caso, a N-acetilação da INH em micobactérias pode competir com a

ativação da pró-droga pela catalase-peroxidase (produto do gene katG) (Payton et al.,

1999, Sandy et al., 2005b).

A ativação da INH pela catalase-peroxidase envolve a oxidação da hidralazina.

Essa reação não pode ocorrer se a hidralazina tiver participado de uma reação de N-

acetilação ou outras reações conjugadas. Conseqüentemente, as atividades

conjugadas da INH em M. tuberculosis, incluindo as atividades de N-acetilação,

previnem a ativação da INH (Upton et al., 2001b).

Quando um polimorfismo ocorre na região codificante do gene, pode afetar a

seqüência de aminoácidos da proteína e alterar a função da mesma. Assim, uma

variação na seqüência das bases nitrogenadas pode afetar tanto a estrutura da proteína

como suas propriedades físico-químicas ou, em alguns casos, alterar a síntese da

proteína envolvida no metabolismo do fármaco ou especificamente o próprio alvo do

fármaco, resultando em variação interindividual na resposta ao tratamento (Trotta et al.

2004).

Até o momento, dois polimorfismos de NAT são conhecidos: T529C e G619A

(Upton et al., 2001 a, Upton et al., 2001b, Sholto-Douglas-Vernon et al., 2005).

A presença de uma mutação no nucleotídeo 619 da ORF (“open reading frame”)

confere à bactéria a mudança de nucleotídeo G619A, ou seja, a troca de uma guanina

por uma adenina no nucleotídeo 619, responsável pela alteração de um resíduo de

44

glicina por um resíduo de arginina na posição 207 da cadeia polipeptídica.

Conseqüentemente, as duas variantes NAT são designadas 207G NAT e 207R NAT.

Foi observado que a mutação G207R altera a atividade enzimática da NAT para a INH,

provavelmente em decorrência de uma alteração na estabilidade ou na estrutura do

sítio ativo da enzima (Upton et al., 2001b, Pompeo et al., 2002).

Foi proposto que, embora a mutação não ocorra em uma região muito próxima

do sítio-ativo, a presença da arginina, mais volumosa que a glicina, é capaz de alterar a

posição do resíduo Phe204, diminuindo assim, a interação com o anel aromático da

INH. Isto explicaria porque o valor de Km para INH no mutante G207R é aumentado em

relação à proteína selvagem (WT) (Sholto-Douglas-Vernon et al., 2005).

Os resíduos de fenilalanina (Phe) são altamente conservados na família NAT.

Phe38 está localizado na região conservada compostas pelos resíduos prolina,

fenilalanina, ácido glutâmico, asparagina e leucina (PFENL) das NATs, enquanto Phe199

é conservada em todas as NATs com atividade de acetilação e o resíduo Phe125 é

encontrado na NAT1 humana e é altamente conservado em NATs de procariotos. Em

estudos de enzimas quiméricas NAT1 e NAT2, em humanos, mostrou-se que o resíduo

Phe125 tem sido relacionado como o causador de especificidade diferente de substrato

do aceptor entre as duas proteínas, e a presença do resíduo de Ser125 (serina) na NAT2

pode permitir a acetilação de substratos maiores, como sulfametazina e procainamida.

Foi proposto que os resíduos conservados de fenilalanina teriam a função de excluir as

moléculas de água do sítio ativo, previnindo assim a hidrólise do intermediário acetil-

cisteína (Brooke et al., 2003).

O gene nat em M. tuberculosis está sendo considerado como parte de um

agrupamento de genes que codificam enzimas envolvidas em reações de

desintoxicação (Upton et al., 2001b, Pompeo et al., 2002).

A NAT2 humana apresenta especificidade por um substrato similar ao da NAT

em M. tuberculosis, ou seja, metaboliza arilhidralazina e xenobióticos arilamina (Sim et

al., 2000, Upton et al., 2001b). Conseqüentemente, a NAT em micobactérias pode

metabolizar componentes similares nos pulmões ou macrófagos. Se o papel endógeno

da NAT de M. tuberculosis é importante na desintoxicação de tais componentes, logo, a

45

competição de INH com essa função pode diminuir as chances de sobrevivência da

micobactéria (Upton et al., 2001b).

Estudos filogenéticos das enzimas NAT de várias espécies, levaram a teoria de

que a NAT tenha evoluído de um ancestral comum. Entretanto, as NATs de procariotos

divergiram de forma marcante das NATs dos mamíferos. Postula-se que o papel da

NAT possa diferir dependendo do organismo na qual é encontrada (Fullam et al., 2008).

2.3.1. Tríade catalítica da NAT

O sítio ativo da NAT consiste de um resíduo de cisteína (Cys70), um de histidina

(His110) e outro de ácido aspártico (Asp127), formando uma tríade catalítica, que se

mostra bastante conservada em homólogos de NAT, tanto em eucariotos quanto em

procariotos (Sim et al., 2000, Sandy et al., 2005a, Sholto-Douglas-Vernon et al., 2005,

Sandy et al., 2005b). Na figura 4 é possível visualizar a tríade catalítica da TBNAT

gerada com o auxílio de Programa DeepView 4.0.

Figura 4: Orientação da INH no sítio ativo da enzima NAT (Cys70 - His110 - Asp127).

Figura gerada com o programa DeepView 4.0 (www.expasy.org/spdbv/).

Cys70

INH

His110

Asp127

46

Sandy et al., (2005a), investigaram, de forma individual a importância de cada

resíduo da tríade catalítica (Cys70, His110 e Asp127) para a ativiade de NATs de M.

smegmatis e S. typhimurium. Nenhuma das enzimas mutantes exibiu atividade de

acetilação, confirmando a importância destes resíduos para essa função.

Há quatro moléculas de água bem definidas dentro do sítio ativo da enzima, que

permanecem conservadas nas estruturas de apoenzima e cocristalizada da NAT. Cinco

outras moléculas de água que são vistas na estrutura apo estão ausentes na estrutura

cocristalizada. Quatro dessas moléculas ocupariam o mesmo espaço que a isoniazida.

As demais estão situadas adjacentes à cisteína do sítio ativo e é proposto que ocupe o

espaço do oxi-ânion (Sandy et al., 2002, Sandy et al., 2005b) encontrada em outras

cisteíno-proteases. Conseqüentemente, a ligação do substrato remove as moléculas de

água situadas na região do oxi-ânion, preparando a maquinaria catalítica para a reação

(Sandy et al., 2005b).

A cisteína é essencial para o sítio ativo da enzima. Experimentos de mutagênese

com a NAT1 humana sugeriram que este resíduo de cisteína possa existir numa forma

acetilada, embora nenhuma evidência tenha sido ainda encontrada nas NATs de

procariotos (Sandy et al., 2005a).

2.3.2. Ligação de isoniazida e coenzima-A com NAT

A INH liga-se numa fenda do sítio ativo adjacente ao resíduo de cisteína que é

fundamental para a atividade catalítica (figura 4). Essa ligação ocorre entre o átomo de

nitrogênio terminal do grupo hidrazil e o resíduo de cisteína (Cys70) à uma distância de

aproximadamente 2,4 Å da posição S desse resíduo (Sandy et al., 2005b).

A análise da INH ligado ao sítio ativo de NAT aponta para a formação de

interações hidrofóbicas do fármaco com a Phe38, Val95, Phe130 e Phe207. Também são

47

observadas ligações de hidrogênio entre o grupo carbonila da Thr109 e o grupo hidrazil

da INH (Sandy et al., 2005b).

Fullam et al., (2008) investigaram a orientação da ligação da CoA na enzima

NAT em Mycobacterium marinum (MMNAT) e verificaram que o grupo sulfidril terminal

da CoA fica posicionado há 2,8 Å da posição S da Cys70, resíduo que compõem a

tríade catalítica, num ambiente composto pelos resíduos aromáticos Phe38, Tyr69, Tyr71,

His110, Phe130 e Phe204. Esses resíduos hidrofóbicos contribuem parcialmente na

escolha dos substratos aceptores de acetila, sendo complementares na característica

dos substratos preferenciais por arilaminas e arilhidrazinas pela enzima NAT. Eles

também formam interações com o grupo 2-mercaptoetilamino ligado através de uma

ligação amida com radical pantoteinato da CoA.

A estrutura da MMNAT com a CoA ligada confirma que o resíduo de His110,

membro central da tríade catalítica, está bem posicionado para efetuar a protonação,

tendo NE2 de His110 a uma distância de de 6 Å do grupo sufidril da CoA (Fullam et al.,

2008).

Uma comparação das estruturas da MMNAT ligada à CoA com a MSNAT ligada

à INH ( código Protein Data Bank – PDB - 1w6f ), confirma que a INH divide um sítio de

ligação com o braço pantoteinico da CoA, assim a ligação produtiva da Ac-CoA e do

substrato aceptor da acetila parece ser mutualmente exclusiva, e isso explicaria a

cinética seqüencial da enzima. A superfície de ligação extendida entre a MMNAT e a

CoA, deixa aberta a possibilidade de que o grupo nucleosídeofosfato da CoA poderia

permanecer associado à MMNAT subseqüente à acetilação do resíduo da cisteína da

tríade catalítica, devendo o substrato apenas para deslocar o braço pantoteinico da

CoA para ter acesso ao intermediário acetilado (Fullam et al., 2008).

48

3. JUSTIFICATIVA

A TB tem se tornado um problema prioritário no Brasil contribuindo para que o

país parte faça parte do grupo de países responsáveis por 80 % dos casos mundiais da

doença.

Com o surgimento de isolados de M. tuberculosis com alta transmissibilidade e

virulência atribuídas a algumas famílias da bactéria, é de suma importância o

conhecimento dos mecanismos de ação e resistência de um dos fármacos mais

eficazes no tratamento da doença, a INH.

O conhecimento de tais mecanismos moleculares permitiriam a criação de

estratégias mais elaboradas de controle e desenvolvimento de kits de detecção mais

rápidos para o controle da doença, no auxílio no controle da disseminação de bacilos

resistentes, evitando gastos desnecessários para o sistema de saúde pública, assim

como, possíveis prejuízos à saúde do paciente.

49

4. OBJETIVO

4.1. Objetivos Gerais

Investigar a contribuição de sistemas de efluxo e de mutações no gene nat na

resistência a isoniazida (INH), em isolados de Mycobacterium tuberculosis.

4.2. Objetivos Específicos

Analisar por seqüenciamento as regiões dos genes katG, inhA e nat, envolvidas

com resistência a isoniazida em isolados clínicos de M. tuberculosis;

Avaliar a relação do sistema de efluxo como possível base molecular da

resistência a INH em isolados clínicos de M. tuberculosis utilizando inibidores

clássicos do sistema de efluxo, como verapamil e CCCP;

Estimar a Concentração Mínima Inibitória (CMI) de cepas de M. tuberculosis

frente à INH utilizando a técnica de Microdiluição com Resazurina (REMA);

Analisar o genótipo das amostras pela técnica de Spoligotyping;

Relacionar os dados obtidos do genótipo com a resistência a INH.

50

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1. Critérios de Elegibilidade

Foram consideradas elegíveis para esse estudo, as cepas de M. tuberculosis que

pelo método das proporções (MPLJ) mostraram-se resistentes a isoniazida em

concentração de 0,20 µg/mL.

5.2. Critérios de Exclusão

Os isolados que, devido a problemas técnicos ou de contaminação não tiveram

os resultados de CMI e/ou de seqüenciamento e/ou genotipagem, disponíveis para este

estudo.

5.3. Local de Desenvolvimento do Estudo

Este estudo foi realizado com parceria entre alguns Laboratórios.

O cultivo e a seleção dos isolados de M. tuberculosis, extração de DNA,

amplificação, seqüenciamento dos genes katG, inhA e “Spoligotyping” foram realizados

no Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, na Fundação Estadual de

Produção e Pesquisa em Saúde do Estado do Rio Grande do Sul – CDCT-FEPPS/RS,

em Porto Alegre. A estimativa da Concentração Mínima Inibitória (CMI) e a investigação

da presença de bombas de efluxo foram realizadas no Laboratório de Micobactérias da

Universidade Federal de Rio Grande – FURG, em Rio Grande, RS. O seqüenciamento

do gene nat foram realizadas no Laboratório de Biologia Molecular Aplicada as

Micobactérias, Departamento de Micobacterioses – IOC/FIOCRUZ, no Rio de Janeiro,

51

RJ, e as análises de Bioinformática e a Modelagem Molecular da enzima NAT,

selvagem (WT) e Isoformas, foram realizadas no Laboratório de Bioinformática

Estrutural (LaBie) da Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada da ULBRA,

em Canoas, RS.

5.4. Número Amostral

Foram utilizadas 47 amostras selecionadas por conveniência, a partir de um

banco de dados existente. Vinte e oito cepas selvagens (WT), ou seja, sem mutação

nos genes katG (códon 315) e inhA, 13 cepas mutadas no códon 315 do gene katG e

06 cepas sensíveis a INH.

5.5. Origem dos Isolados Investigados

Foram selecionados para este estudo, 3 isolados do Instituto MALBRAN na

Argentina; 15 isolados do LACEN no Ceará; 1 isolado do Hospital Universitário de Belo

Horizonte – UFMG, em Minas Gerais; 5 isolados do Instituto Evandro Chagas, no Pará;

3 isolados do Instituto Nacional de Salude no Peru; 10 isolados do Laboratório de

Micobacteriologia do Complexo Hospitalar HUCFF – IDT da UFRJ e do Laboratório

Nacional Hélio Fraga Filho, no Rio de Janeiro; 8 isolados do LACEN do Rio Grande do

Sul e 2 isolados do Instituto Adolfo Lutz, em São Paulo (figura 5).

52

Figura 5: Mapa da América do Sul salientando a origem dos isolados selecionados para

o estudo.

5.6. Cultura de M. tuberculosis

Os isolados de M. tuberculosis foram cultivados em meio Ogawa e incubados a

37oC de 4 a 6 semanas. Posteriormente, foram mantidos por aproximadamente 3

meses na geladeira antes de serem repicados. Todos os isolados foram estocados em

tampão de Soerensen, 20 % de glicerol a -70oC.

10 2

3 1

8

15 5

3

53

5.7. Estimativa da Concentração Mínima Inibitória (CMI) com Inibidores de

Efluxo

Para a estimativa da CMI foi utilizado o Método REMA (“Resazurin Microdiluition

Assay”) (Palomino et al., 2002), com algumas adaptações. Consiste numa diluição

seriada em microplacas estéreis de 96 cavidades, com tampas estéreis, e fundo chato,

utilizando a resazurina como indicador de viabilidade celular.

Para serem utilizadas neste teste, as cepas foram colocadas para crescer em

tubos contendo meio sólido Ogawa. Esses tubos permaneceram na estufa a 37C,

durante 28 – 30 dias.

5.7.1. Preparação dos Inóculos

Passado o período de crescimento, foram preparadas suspensões bacterianas,

chamadas inóculos. Tubos contendo pérolas de vidro foram pesados (peso inicial= PI).

Com o auxílio de palitos estéreis, foram adicionadas colônias de M. tuberculosis em

seus respectivos tubos com pérolas. Os tubos foram novamente pesados (peso final=

PF), e foi realizada a diferença PF-PI=PESO correspondente às colônias

acrescentadas, para cada 1,0 mg de colônias (PF-PI), foram adicionados 1,0 mL de

água destilada estéril. Primeiramente, foram adicionados 0,5 mL de água destilada

estéril, os tubos então, foram vortexados a fim de, desfazer os grumos. Logo após, foi

adicionado o restante da água completando o volume total. Esses tubos foram

vortexados novamente. A turbidez das suspensões foi equivalente à Escala 1,0 de

McFarland.

5.7.2. Montagem das Placas de 96 poços

54

Na figura 6 é mostrada em detalhes a montagem da placa.

Nos poços da periferia foram adicionados 200L de água destilada e estéril para

evitar a rápida evaporação do meio líquido 7H9 OADC na estufa. Essa água foi

previamente colorida com corante alimentício em pó, para melhor visualização dos

poços periféricos durante o experimento.

Em cada placa, foi feita uma coluna de controles, onde o controle negativo teve

como objetivo, certificar a esterilidade do meio líquido, e o controle positivo, a

viabilidade do inóculo. Foram adicionados 200 L de meio de cultivo nos poços para

controles negativos e 100 L nos demais poços.

Em seguida, cada cepa foi testada com 100L de meio em uma coluna, 100L

de meio e verapamil a 100mM em outra coluna, e com 100L de meio e CCCP a 5mM

em outra coluna. Após, foram adicionados 100L de isoniazida nos primeiros poços de

MIC (nas concentrações de 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 e 0,125 g/mL) , realizando

diluições seriadas 1:2 com o auxílio de uma pipeta multicanal, adicionando-se, em

seguida, 100L dos inóculos diluídos 1:20, nos devidos poços.

Depois de preparadas, as placas foram tampadas e incubadas na estufa a 37C

por 7 dias. No sétimo dia, foram adicionados 30L de resazurina 0,02%, e as placas

foram novamente incubadas, a 37C, por mais 2 dias. Passados os 2 dias de

incubação, foi feita a leitura das placas pela oxi-redução da resazurina. A mudança da

cor azul para rosa indica a redução da resazurina e, entretanto, o crescimento

bacteriano. Logo, se ficar rosa, houve crescimento bacteriano, a INH não foi capaz de

inibir o crescimento bacteriano nesta concentração, ou a partir dela (Resazurina

reduzida). Se ficar azul, não houve crescimento bacteriano, a INH foi capaz de inibir o

crescimento nesta concentração (Resazurina oxidada).

A CMI foi definida como a menor concentração de INH capaz de impedir a

mudança de cor, ou seja, inibir o crescimento celular. Em cada placa foi utilizada a cepa

padrão H37Rv, como controle.

55

Figura 6– Esquema da preparação da microplaca para realizar o método REMA para a

estimativa da CMI.

5.8. Extração de DNA genômico

O DNA foi isolado de culturas conforme metodologia descrita por van Soolingen

et al., (1994), cuja aplicação serve para o isolamento de DNA genômico de alto peso

molecular.

De um cultivo de M. tuberculosis em meio sólido foram retiradas colônias com

ajuda de palito estéril e colocadas em um tubo de 1,5 mL com 400 µL de TE 1X. Essas

colônias foram inativadas durante 30 min a 80oC e depois foram adicionados 50 µL de

lisozima 10 mg/mL e incubados pelo menos 2 h a 37oC (preferencialmente overnight).

Após adicionar 70 µL de SDS 10% e 5 µL de solução de proteinase K a 10 mg/mL, os

tubos foram agitados em vortex e incubou-se a 65oC durante 10 min, foram adicionados

100 µL de NaCl 5M e 100 µL de solução de brometo de cetiltrimetilamônio e cloreto de

7H9

7H9 + CCCP 5mM

7H9 + verapamil 100mM

controles

INH

água

Legenda

56

sódio (CTAB/ NaCl) (10% CTAB e 4% NaCl) e agitados até obter um aspecto leitoso.

Foram incubados 10 min a 65oC, após adicionar 750 µL de clorofórmio/ álcool

isoamílico, vórtex durante 10 s e depois centrifugados a 12000 rpm a temperatura

ambiente durante 5 min. O sobrenadante foi passado para um tubo novo e adicionados

0.6 volumes de isopropanol e deixados a -20oC por pelo menos 30 min. Após

centrifugar a 12000 rpm a temperatura ambiente por 5 min e eliminar o isopropanol

virando o tubo, foi adicionado etanol 70% gelado e misturado suavemente várias vezes

e centrifugado a temperatura ambiente a 12000 rpm por 5 min. O tubo foi vertido para

dispensar o sobrenadante, e seco à temperatura ambiente para a posterior

ressuspensão em 50µL de TE 1X. O DNA extraído foi mantido a 4oC por dois dias para

suspensão completa. Após a suspensão, o DNA genômico foi quantificado e em

seguida estocado a -20oC.

O CTAB serve para remover restos de parede celular, proteínas desnaturadas e

polissacarídeos complexos , enquanto retém os ácidos nucléicos em solução. Já a

solução clorofórmio/álcool isoamílico serve para remover o complexo CTAB-

proteínas/polissacarídeos, por isso, uma interface branca deve se visualizada após a

centrifugação.

5.9. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

5.9.1. Genes katG e inhA

Para a amplificação da região que possui o códon 315 do gene katG foram

utilizados os oligonucleotídeos iniciadores KatG FW_ 5’-CAT GAA CGA CGT CGA AAC

AG-3’ e KatG RV_ 5’-CGA GGA AAC TGT TGT CCC AT-3’, originando um produto

amplificado de 232pb. O gene inhA teve sua região estrutural (orf) e regulatória

amplificadas, com a utilização dos seguintes iniciadores: inhA (orf) FW _ 5’-GAA CTC

GAC GTG CAA AAC-3’ e inhA (orf) RV_ 5’-CAT CGA AGC ATA CGA ATA-3’, gerando

um produto de 206pb e inhA (reg) FW_ 5’-CCT CGG TGC CCA GAA AGG GA-3’ e inhA

57

(reg) RV_ 5’-ATC CCC CGG TTT CCT CCG GT-3’, que gera um produto de 248pb,

conforme citado na tabela 2. A reação de amplificação e os iniciadores utilizados para

katG e inhA foram feitos conforme descrito por Silva et al., (2003 a). O DNA foi

amplificado pela PCR em 50 µL de reação contendo; MgCl2 3mM; 0,2 mM de cada

deoxirribonucleosídeo trifosfato (dNTPs), 40 pmol de cada iniciador, 150 ng de DNA e

2,5 U de Taq DNA Polimerase.

As reações foram realizadas em um termociclador (MiniCycler TM - Hot Bonnet

PTC - 100/MJ Research, INC, USA) nas seguintes condições: 94°C por 2 min, seguido

de 55°C por 1 min e 72°C por 2 min, repetidos por 30 vezes.

5.9.2. Gene nat

Para a amplificação do gene nat foram utilizados 40 pmol de cada um dos

iniciadores nat1 F_ 5’-ATC GGT GCG ACA TAG TTG G-3’ e nat4 R_ 5’-GCC TTC TGC

TCA AAG TTG CT-3’ numa reação contendo: 2,5 mM MgCl2, 0, 2 mM dNTPs, 1U Taq

DNA polimerase (Invitrogen-Brasil), tampão 1X (10 mM Tris-HCl, 1, 5 mM MgCl2, 50

mM KCl, pH 8, 3), 10 % glicerol e 10 ng de DNA alvo, em um volume final de 100 µL.

As condições de amplificação foram respectivamente: uma desnaturação inicial a 95°C

por 5 min., seguidos por 40 ciclos de 95°C por 1min., 65°C por 1,30 min., 72°C por 1

min. e um ciclo de extensão final a 72°C por 4 min gerando um produto de 1069 pb,

conforme descrito por Vasconcellos (2007) (Tabela 2).

Tabela 2: Seqüência de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para as reações de

PCR e Seqüenciamento dos genes investigados.

Gene

Seqüência

Tamanho (pb)

Referência

KatG

katG F_ 5’-CAT GAA CGA CGT CGA AAC AG-3’

katG R_ 5’-CGA GGA AAC TGT TGT CCC AT-3

232 pb

Silva et al. 2003a

58

inhA (orf)

inhA (orf) F_ 5’-GAA CTC GAC GTG CAA AAC-3’

inhA (orf) R_ 5’-CAT CGA AGC ATA CGA ATA-3’

206 pb

Silva et al. 2003a

inhA (reg)

inhA F_ 5’-CCT CGG TGC CCA GAA AGG GA-3’

inhA R_ 5’-ATC CCC CGG TTT CCT CCG GT-3’

248 pb

Silva et al. 2003a

nat

nat1 F_ 5’- ATC GGT GCG ACA TAG TTG G-3’

nat4 R_ 5’-GCC TTC TGC TCA AAG TTG CT-3’

1069 pb

Vasconcellos, 2007.

nat

nat2 R_ 5’-GTC CTC GAG CCG ATA AGG GTT-3’

nat3 F_ 5’-CAC CGA CCT CAC CGC TTC-3’

74 pb

Vasconcellos, 2007.

5.10. Os fragmentos amplificados por PCR

Após uma eletroforese, os fragmentos amplificados foram visualizados em gel de

agarose 1,5%, corados com brometo de etidio (EtBr), sob iluminação ultravioleta. O

marcador de tamanho molecular utilizado foi o 100 pb ladder (Invitrogen™ Life

technologies).

Após a amplificação e checagem, os produtos dos genes katG e inhA foram

purificados, para retirada de excesso de iniciadores, pelo método PEG (Neisseria MLST

home page, http://pubmlst.org/neisseria/mlst-info/nmeningitids/pcr.shtml), que consiste

na transferência do conteúdo dos tubos de PCR para tubos de 1,5 mL, adição de 60 µL

de PEG 8000/ 2,5M NaCl. Incubação por 15 min a 37oC e, após esse tempo,

centrifugação na velocidade máxima por 10 min e descarte do sobrenadante com o

auxilio de uma pipeta. Adição de 500 µL de etanol 70% e centrifugação novamente na

velocidade máxima por 5 min. O sobrenadante foi descartado e o “pellet” secou no

termobloco a 90oC por 2 a 4 min e ressuspendido em 30 µL de água. Foi mantido a 4oC

por 2 dias para suspensão total e, em seguida armazenado a -20oC.

59

Para a purificação dos produtos amplificados do gene nat, a cada produto

amplificado foi adicionado 50 µL de acetato de amônia 7,5M e 150 µL de isopropanol, e

em seguida a mistura foi agitada vigorosamente e incubada por 10 min a temperatura

ambiente. Após a centrifugação por 10 min na velocidade máxima, o sobrenadante foi

cuidadosamente retirado e 400 µL de etanol 75% foram adicionados e submetidos à

nova centrifugação. Feito o descarte do sobrenadante, o DNA foi seco a temperatura

ambiente e ressuspendido em 30 µL de TE 1X (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0).

5.11. Seqüenciamento de DNA

5.11.1. Genes katG e inhA

Foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores conforme descrito por Silva et

al., 2003a (Tabela 2).

5.11.2. Gene nat

Foram utilizados os iniciadores descritos por Vasconcellos (2007) (Tabela 2).

Para o seqüenciamento do gene nat, devido ao tamanho da região de interesse,

dois pares de iniciadores foram utilizados. Um par flanqueando toda a região

codificante, 852pb sendo um direto, anelando no nucleotídeo 69 pb no gene Rv3566A

abaixo do sítio de iniciação da tradução ATG e um reverso, 110 pb acima do códon de

parada no gene spB (fragmento de 1069pb) e um par interno sendo um direto, anelando

nucleotídeo 401, e um reverso anelando no nucleotídeo 455 do gene nat de forma a

criar uma sobreposição entre os dois fragmentos e cobrir toda a região codificante. Os

iniciadores internos nat2 R_ 5’-GTC CTC GAG CCG ATA AGG GTT-3’ e nat3 F_ 5’-

CAC CGA CCT CAC CGC TTC-3’, foram usados na reação de seqüenciamento, para

garantir que todo o fragmento fosse seqüenciado.

60

5.12. Seqüenciamento dos fragmentos

A reação da PCR para o seqüenciamento dos genes investigados, foi realizada

utilizando-se BigDye® Terminator Sequencing Standard Version 1.1 (Applied

Biosystems).

Para um volume de 10 µL (uma reação) foram usados 0,5 µL de BigDye®; 1,5 µL

de tampão para diluição 5X (Applied Biosystems); 0,55 µL do iniciador (3,2 pmol/µL) e

200 ng de produto amplificado purificado dos genes katG e inhA e 5-20ng de DNA

purificado do gene nat e H2O q.s.p. 10µL. As condições da reação foram as seguintes:

96oC por 10 s (desnaturação), 50oC por 5 s para anelamento dos iniciadores, 60oC por

4 min para extensão, totalizando 40 ciclos.

Os produtos da reação de seqüenciamento foram precipitados com a adição de

30µl de isopropanol 75%. Após 15 min de incubação a temperatura ambiente, essa

mistura foi centrifugada a 4000 rpm por 45 min a 20oC. O sobrenadante foi desprezado

e, então foi adicionado a cada poço das placas 50 µl de etanol 75%. Logo após, foi feita

uma agitação e seguida de centrifugação a 4000 rpm por 15 min a 20oC. Após a

centrifugação, as placas foram invertidas em papel toalha para a retirada do

sobrenadante e submetidas à secagem em um bloco quente por 10 min a 60oC. Antes

do seqüenciamento, os DNAs referentes às diferentes amostras foram desnaturados

através da adição de 10 µl de formamida (Hi-Di TM Applied Biosystems), e incubação

em termociclador por 3 min a 95oC. Em seguida, foram rapidamente resfriados em gelo

até terem sido colocados no seqüenciador automático ABI Prism 3100 (Applied

Biosystems).

5.13. Análise das Seqüências Obtidas

As seqüências obtidas foram visualizadas no programa Chromas Lite 2.01, que

permite a visualização de arquivos dos cromatogramas (gráficos) gerados pelo

seqüenciador automático da Applied Biosystems. As seqüências encontradas para cada

isolado foram comparadas e alinhadas com a seqüência padrão de M. tuberculosis

61

H37Rv (GenBank AL 123456), por meio dos programas BLAST (“Basic Local

Alignment Search Tool”) (NCBI/Blast) que alinham a seqüência fornecida com

seqüências depositadas no GenBank (Figuras 7 e 8).

Na figura 7 podem ser visualizados eletroferogramas de dois isolados, um deles

apresenta a mutação no códon 315 do gene katG e outro apresenta o gene “wild type”,

ou seja, sem a mutação.

A- Eletroferograma de uma seqüência de nucleotídeos da região do códon 315 do gene katG, com mutação AGC-ACC

B- Eletroferograma de uma seqüência de nucleotídeos da região do códon 315 do gene katG, sem mutação (H37RV)

Figura 7 - Eletroferogramas de um isolado com mutação no códon 315 do gene katG e

outro sem essa mutação.

Na figura 8 podem ser visualizados dois isolados e um deles apresenta a mutação no

nucleotídeo 619 do gene nat e outro apresenta o gene “wild type”, ou seja, sem a

mutação.

62

A- Eletroferograma de uma seqüência de nucleotídeos com o SNP no nucleotídeo 619 do gene nat, com mutação GGA-

AGA

B- Eletroferograma de uma seqüência de nucleotídeos do gene nat, sem mutação (H37RV)

Figura 8 - Comparação entre eletroferogramas de um isolado com mutação no gene nat

(G619A) e outro sem essa mutação.

5.14. Análise Estatística

Para análise dos resultados foi utilizado o programa Epi Info 3.5.1.

5.15. Spoligotyping

A técnica foi realizada conforme Kamerbeek et al., (1997). A técnica denominada

“Spoligotyping” (de “Spacer Oligotyping”) é baseada no polimorfismo existente na região

63

DR (“Direct Repeat”) de M. tuberculosis. A região DR consiste de um número variável de

cópias de uma repetição direta de 36 pb, itercalada com seqüências específicas de

espaçadores de 35 a 41 pb.

Os oligonucleotídeos iniciadores DRa e DRb que anelam nas extremidades da

seqüência DR visando amplificar as seqüências espaçadoras entre duas DRs

(Kamerbeek et al, 1997) que foram utilizados são:

DRa: (5’biotinilado) – 5’ GGTTTTGGGTCTGACGAC 3’

DRb: 5’ CCGAGAGGGGACGGAAAC 3’

Os produtos amplificados foram hibridizados com um conjunto de 43

oligonucleotídeos imobilizados em uma membrana comercial previamente preparada,

cada um correspondendo a uma das seqüências únicas dos espaçadores dentro do

lócus DR (Isogen, bioscience BV, Holanda).

As amostras diluídas foram aplicadas em canais paralelos de um “miniblotter”

(Isogen, BioscienceBV, Holanda), de modo que ficassem perpendiculares às linhas de

oligonucleotídeos previamente imobilizados. A hibridização foi realizada por 60 min a

60oC em forno giratório (Hybaid Instruments, Holbrook, NY).

A detecção foi realizada pela sensibilização de um filme auto-radiográfico através

de uma reação de quimioluminescência, utilizando o Kit ECL™(Amersham Biosciences,

Inglaterra).

64

6. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

Este estudo foi avaliado e aprovado pelo Plenário do Comitê de Ética em

Pesquisa em Seres Humanos e Animais da Universidade Luterana do Brasil, sob o

número de parecer CEP-ULBRA 2007-353H, por estar de acordo com as normas

vigentes na Resolução n 196/96 do Conselho Nacional de Saúde/Ministério da Saúde,

e em suas complementares (Resoluções 240/97, 251/97, 292/99, 303/00 e 340/04 do

CNS/MS) que regulamentam a pesquisa envolvendo seres humanos.

65

7. RESULTADOS

7.1. Perfil de susceptibilidade dos isolados de M. tuberculosis

Dos 47 isolados de M. tuberculosis, 41 foram caracterizados como resistentes

(R) e 06 sensíveis (S) a isoniazida (INH), definidos pelo método das proporções (MPLJ),

conforme Canetti et al., 1969. Os 06 isolados sensíveis eram provenientes do Estado

do Rio de Janeiro e foram usados como controles.

7.2. Análise do seqüenciamento de genes de M. tuberculosis associados à resistência a INH

Dos 41 isolados resistentes, 28 (68,29%) deles não apresentaram mutações nos

genes katG e inhA quando seqüenciados, sendo considerados “wild type” (WT) nesses

dois genes, e 13 (31,71%) isolados apresentaram mutação pontual no códon 315 do

gene katG. Todos os isolados investigados já haviam sido caracterizados por

seqüenciamento quanto às mutações no gene ahpC em trabalho anterior (Dalla Costa

et al., 2008) e foram considerados selvagens (WT), ou seja, sem mutações neste gene.

7.3. Análise da presença de bomba de efluxo em isolados de M.

tuberculosis

Na figura 9 é mostrada a placa de 96 poços utilizada para a estimativa de CMI e

teste de mecanismo de efluxo ativo de 03 isolados ao mesmo tempo, sendo que para

cada um deles, foram utilizadas 3 colunas a fim de estimarmos a CMI na primeira

coluna, a possível inibição de efluxo com verapamil na segunda coluna, e na terceira, o

teste de inibição de efluxo com CCCP.

66

Nas cepas resistentes foi utilizado um ponto de corte (cut-off) de <0,20 g/mL

(Palomino et al. 2006).

Figura 9: Microplaca de 96 poços para investigação de CMI. Em verde, poços com

água, em azul, poços onde ocorreu inibição de crescimento, e em rosa onde ocorreu

crescimento bacteriano.

No grupo de 28 isolados sem mutação nos genes katG e inhA, foi possível

estimar a CMI em meio líquido com fármacos descritos como inibidores de sistema de

efluxo. Assim em 4 isolados distintos (14,29%) (um proveniente do Pará, um do Rio

Grande do Sul e dois isolados do Estado do Ceará) foi possível verificar a possibilidade

de um mecanismo de efluxo atuante. Os demais isolados desse grupo não

apresentaram modificação de CMI quando os inibidores de efluxo foram adicionados

(Tabela 3).

No isolado oriundo do Estado do Pará, a estimativa da CMI foi de 8 g/mL de

INH. Esse isolado não teve o sistema de efluxo inibido com a adição de verapamil a

100mM, continuando com a CMI no valor de 8 g/mL; porém, ao adicionar o outro

inibidor clássico desse sistema, o CCCP a 5mM, a estimativa da CMI diminuiu para o

valor referente à metade do valor da CMI do fármaco, ficando em 4 g/mL.

67

No isolado proveniente do Rio Grande do Sul, a estimativa da CMI foi de 4

g/mL, porém, esse isolado teve o mecanismo de efluxo atuante inibido com a adição

dos dois inibidores clássicos, o verapamil 100mM e o CCCP 5mM, apresentando assim

uma diminuição da CMI para 2 g/mL de INH.

Dois isolados do Ceará também demonstraram a possível inibição de sistema de

efluxo, no primeiro, a CMI foi estimada em 2 g/mL. Com a adição do verapamil, não foi

observada alteração quanto à CMI, permanecendo no mesmo valor; porém, ao

adicionar o CCCP, a CMI apresentou uma redução para 0,25 g/mL de INH. No

segundo isolado, a CMI foi estimada em 0,2 g/mL e teve o sistema de efluxo inibido

com a utilização dos dois inibidores, tendo a CMI estimada em 0,1 g/mL de INH.

Dos 13 isolados mutados no códon 315 do gene katG, apenas 03 apresentaram

1 possível sistema de efluxo ativo [23,08 % (03/13)], sendo 2 isolados do Ceará e 01 do

Rio de Janeiro.

No isolado do Rio de Janeiro, a CMI foi estimada em 4 g/mL. Quando testado

frente aos inibidores de bombas de efluxo, teve sua CMI mantida sem alterações com o

uso do verapamil, porém, houve uma redução frente ao CCCP, tendo a CMI observada

em 2 g/mL.

Os sistemas de efluxo nos isolados do Ceará apresentaram um comportamento

diferente um do outro. Nos dois isolados oriundos desse Estado, a estimativa da CMI foi

de 4 g/mL. Quando testados frente ao verapamil, tiveram a CMI estimada em 2 g/mL,

porém, o comportamento deles frente ao CCCP diferiu.

No primeiro isolado (CE-966), a CMI não sofreu alteração frente ao CCCP,

permanecendo em 4 g/mL, já para o segundo isolado (CE-2338), o CCCP se mostrou

mais eficiente, promovendo uma redução de CMI para 1 g/mL.

Dentre os isolados mutados no códon 315 do gene katG, 10 (76,92 %) deles não

apresentaram efluxo ativo (10/13), sendo 4 isolados do Ceará, 3 do Rio de Janeiro e 3

do Rio Grande do Sul. Desses, 9 isolados [90 % (09/10)] tiveram a CMI estimada em

2 g/mL de INH. Apenas um isolado proveniente do Rio Grande do Sul (RS-318)

apresentou uma CMI de 0,1 g/mL (Tabela 3).

68

Tabela 3: Tabela com os resultados de CMI dos isolados de M. tuberculosis na

presença e na ausência de inibidores de sistema de efluxo.

Isolado

katG

CMI g/mL

CMI+ Vera 100mM** (g/mL)

CMI+CCCP 5mM (g/mL)

A-6906 WT 0,25 0,25 0,25 A-6972 WT 0,125 0,125 0,125

A-7390 WT 0,25 0,25 0,25 CE-3785 WT 1 1 1 CE-4067 WT 4 4 4

CE-4211 WT 1 1 1

CE-3159 WT 1 1 1

CE-3161 WT >32 >32 >32 CE-3478 WT 1 1 1 CE-588 * WT 0,2 0,1 0,1

CE-1602 * WT 2 2 0,25

CE-3920 WT 1 1 1

RS-361 WT 2 2 2

RS-363 WT 0,5 0,5 0,5

RS-345 WT 0,5 *** ***

RS-305 WT 1 1 1

RS-366 * WT 4 2 2

PA-861 * WT 8 8 4

PA-727 WT 16 *** ***

PA-988 WT >32 >32 >32

PA-694 WT 1 1 1

PE-114 WT >32 >32 >32

PE-143 WT 1 1 1

PE-144 WT 4 4 4

PA-1114 WT 0,1 0,1 0,1

MG-1795 WT 0,125 0,125 0,125

SP-40 (13411) WT >32 >32 >32

SP-53 WT 0,5 0,5 0,5

RJ-3669 S315I 4 4 4

RJ-3745 S315I 0,8 *** ***

69

RJ-3674 S315I 4 4 4

RJ-3666 * S315T 4 4 2

RS-302 S315T 2 2 2

RS-311 S315T >32 *** ***

RS-318 S315T 1 1 1 CE-1759 S315T 2 2 2

CE-3778 S315T 2 2 2

CE-4080 S315T 8 8 8

CE-3064 S315T 2 2 2

CE-966 * S315T 4 2 4

CE-2338 * S315T 4 2 1

* Isolados que tiveram o sistema de efluxo inibido;

** Vera: verapamil (inibidor de efluxo);

*** Indeterminado.

Dentre os vinte e quatro isolados R-INH sem mutação no códon 315 do gene

katG 85,71 % (24/28) não apresentaram um sistema de efluxo ativo, permanecendo a

CMI sem alterações com a adição dos inibidores. Desses, 15 [62,50 % (15/24)] isolados

apresentaram a CMI em 0,2 g/mL de INH. (Tabela 3).

7.4. Análise do gene nat de isolados de M. tuberculosis

Os 41 isolados de M. tuberculosis resistentes e sensíveis a INH tiveram o gene

nat analisado por sequenciamento. Dos que eram WT nos genes katG e inhA, em 4

(9,75 %) foi identificada a variante mutada 619 A, onde há a substituição de uma

guanina (G) por uma adenina (A) no nucleotídeo 619 (Tabela 4). Esta é uma mutação

não sinônima, que promove a troca de um resíduo de glicina (G) por um resíduo de

arginina (R) na posição 207 da cadeia polipeptídica (G619A SNP : G207R; GlyArg :

GR). Foi identificada em dois isolados provenientes do estado do Pará, num isolado

oriundo do estado do Ceará e em outro isolado proveniente da Argentina.

70

A variante mutada 619 A não foi encontrada nos isolados considerados sensíveis

a INH pelo método das proporções. Neste trabalho, essa mutação não foi

observada em isolados com mutação pontual no códon 315 do gene katG.

Tabela 4: Mutações observadas no gene nat dos isolados de M. tuberculosis

Isolado

Sensibilidade

INH

Mutação

katG

Mutação

nat

Tipo de mutação

Códon

nat

Alteração nat

A-6972

R

WT

G619A

Mutação não-

sinônima

GGA/AGA

GlyArg : glicinaarginina

(G207R)

PA-727

R

WT

G619A

Mutação não-

sinônima

GGA/AGA


(G207R)

PA-

1114

R

WT

G619A

Mutação não-

sinônima

GGA/AGA


(G207R)

CE-588

R

WT

G619A

Mutação não-

sinônima

GGA/AGA


(G207R)

A-6906

R

WT

C276T *

Mutação

silenciosa

GCC/GCT

AlaAla :

alaninaalanina (A92A)

A-7390

R

WT

C373A *

C375G *

Mutação não-

sinônima

Mutação

silenciosa

CTC/ATG

AlaMet :

alaninametionina

(L125M)

71

CE-

3920

R

WT

C375G *

Mutação

silenciosa

CTC/CTG

LeuLeu :

leucinaleucina (L125L)

RS-345

R

WT

C375G *

T503G *

Mutação

silenciosa

Mutação não-

sinônima

CTC/CTG

ATG/AGG

LeuLeu :


MetArg :

metioninaarginina

(M168R)

RS-363

R

WT

T503G *

Mutação não-

sinônima

ATG/AGG

MetArg :

metioninaarginina

(M168R)

CE-

4080

R

S315T

C375G *

Mutação

silenciosa

CTC/CTG

LeuLeu :


RJ-3666

R

S315T

G501C *

Mutação

silenciosa

GCG/GCC

AlaAla : alaninaalanina

(A167A)

RJ-3669

R

S315I

G202A *

Mutação não-

sinônima

GGG/AGG


(G68R)

RJ-3745

R

S315I

G202A *

Mutação não-

sinônima

GGG/AGG


(G68R)

RS-311

R

S315T

C375G *

Mutação

silenciosa

CTC/CTG

LeuLeu :


72

* Novas mutações identificadas no gene nat de M. tuberculosis ainda não descritas na literatura.

Foram identificadas mutações sinônimas (silenciosas) e não sinônimas ainda não

descritas na literatura. Dentre as silenciosas, foram observadas as mutações C276T,

C375G e G501C. No que se refere às mutações não-sinônimas, foram identificados os

SNPs G202A, C373A e T503G (Tabela 4).

Nos isolados resistentes a INH e WT nos demais genes investigados, foram

identificados dois SNPs sinônimos, ou seja, não há troca de aminoácidos, e dois SNPs

não-sinônimos, que ocasiona a troca para um aminoácido diferente.

A mutação sinônina C276T (substituição de uma citosina por uma timina no

nucleotídeo 276) foi identificada em apenas um isolado (A-6906), e essa mutação não

promove a troca de aminoácidos (C276T SNP A92A ; AA : alaninaalanina).

A mutação C375G (substituição de uma citosina por uma guanina no nucleotídeo

375) também é considerada mutação silenciosa, pois não leva à troca de aminoácidos

na cadeia polipeptídica, tendo sido identificada em apenas dois isolados (CE-3920 e

RS-345).

No isolado A-7390 foram identificadas duas mutações simultâneas que

ocasionaram na troca de um resíduo de leucina por um resíduo de metionina na

posição 125 da cadeia polipeptídica, sendo a mutação não-sinônima C373A e a

mutação silenciosa C375G (C373A SNP + C375G SNP L125M ; LM :

leucinametionina).

Em dois isolados do Rio Grande do Sul (RS-345 ; RS-363) foi observada a

mutação não-sinônina T503G (substituição de uma timina por uma guanina no

nucleotídeo 503), a qual promoveu a troca de um resíduo de metionina por um resíduo

de arginina na posição 168 da cadeia polipeptídica (M168R ; MR :

metioninaarginina). Um deles (RS-345) apresentou a mutação sinônima C375G

simultaneamente à outra mutação.

Os isolados caracterizados como sensíveis a INH (S-INH) provenientes do Rio de

Janeiro, não apresentaram mutações no gene nat, sendo então, considerados

selvagens (WT) neste gene.

73

Nos isolados mutados no códon 315 do gene katG, foram identificadas duas

mutações silenciosas e uma mutação não-sinônima.

A mutação sinônima C375G (L125L) foi encontrada em dois isolados, um isolado

do Ceará (CE-4080) e o outro do Rio Grande do Sul (RS-311).

A outra mutação silenciosa foi observada em um isolado do Rio de Janeiro (RJ-

3666). A mutação G501C (substituição de uma guanina por uma citosina no nucleotídeo

501) não promoveu troca de resíduos de aminoácidos na cadeia polipeptídica (G501C

SNP; A167A).

Nos isolados RJ-3669 e RJ-3745 foi identificada uma mutação não-sinônima que

promove a troca de uma guanina por uma adenina no nucleotídeo 202, ocasionando a

troca de um resíduo de glicina por um resíduo de arginina na posição 68 da cadeia

polipeptídica (G202A SNP ; GlyArg : GR ; G68R). Essa mutação foi identificada nos

isolados nos quais foi observada a mutação S315I no gene katG, ou seja, com a troca

de um resíduo de serina por um resíduo de isoleucina na posição 315 da cadeia

polipeptídica.

Na figura 10 são mostradas as seqüências nucleotídica e traduzida do gene nat

de M. tuberculosis.

Seqüência traduzida : Arilamina N-acetiltransferase – NAT – 284aa – (wt)

MALDLTAYFDRINYRGATDPTLDVLQDLVTVHSRTIPFENLDPLLGVPVDDLSPQALADKLVLRRRGGYCFEHNGLMGYVLAELG

YRVRRFAARVVWKLAPDAPLPPQTHTLLGVTFPGSGGCYLVDVGFGGQTPTSPLRLETGAVQPTTHEPYRLEDRVDGFVLQAM

VRDTWQTLYEFTTQTRPQIDLKVASWYASTHPASKVTGLTAAVITDDARWNLSGRDLAVHRAGGTEKIRLADAAAVVDTLSERF

GINVADIGERGALETRIDELLARQPGADAP

Seqüência codificante ( exons ) :

gene nat - 852 nt – (wt)

ATGGCACTGGATCTGACCGCGTACTTCGATCGCATCAACTATCGCGGCGCTACCGATCCAACCCTGGATGTTCTGCAGGATCTGGTGACCGTGCACAGTCGAACGATTCCGTTCGAGAACCTCGACCCGCTGCTGGGGGTGCCGGTCGACGACCTCAGTCCACAGGCGCTGGCCGACAAGCTGGTACTTCGGCGCCGAGGCGGGTACTGCTTTGAGCACAACGGGCTGATGGGTTATGTGCTGGCCGAACTCGGCTATCGGGTGCGCCGATTCGCCGCCCGCGTCGTCTGGAAGCTCGCGCCGGACGCGCCCCTGCCGCCGCAGACGCACACCCTGCTGGGGGTCACGTTCCCCGGCTCGGGCGGATGCTATCTCGTCGACGTCGGATTCGGCGGCCAAACACCGACCTCACCGCTTCGCCTCGAAACCGGCGCCGTCCAGCCGACAACGCACGAACCTTATCGGCTCGAGGACCGCGTCGACGGCTTTGTCTTGCAGGCGATGGTCCGGGACACATGGCAGACACTGTACGAATTCACCACCCAGACCCGCCCGCAGATCGATCTGAAAGTGGCCAGCTGGTACGCCTCAACACACCCGGCATCGAAGTTCGTCACGGGACTGACCGCCGCGGTGATCACCGACGACGCCCGGTGGAACCTATCTGGCCGCGACCTTGCCGTTCACCGTGCCGGTGGTACCGAGAAGATCCGCCTTGCCGATGCGGCAGCGGTTGTCGACACCCTGAGCGAACGGTTCGGGATCAACGTGGCAGATATCGGCGAGCGCGGCGCGCTCGAGACGCGCATCGACGAGCTATTGGCTCGGCAGCCAGGAGCCGATGCGCCGTAA

74

Fonte:http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/tbdb/GeneDetails.html?sp=S7000000635253893 Figura 10: Seqüências nucleotídica e traduzida do gene nat de M. tuberculosis H37Rv.

Os nucleotídeos assinalados correspondem às mutações encontradas.

7.5. Genotipagem dos isolados de M. tuberculosis

Todos os isolados resistentes a INH com ou sem mutação no gene katG, tiveram

seu perfil genotípico analisado pela técnica de Spoligotyping. Essas análises permitem

verificar a existência de famílias já descritas na literatura como predominantes em

determinadas regiões geográficas e relacionadas com a resistência (Rastogi & Sola,

2007).

Nos isolados R-INH com a variante mutada 619 A, a família genotípica “Latin

Americam and Mediterranean family” (LAM) teve uma freqüência de 50 % (02/04),

sendo um isolado da Argentina (A-6972) e um isolado do Ceará (CE-588). Dois isolados

do Pará (PA-727; PA-1114) foram caracterizadas como pertencentes às famílias T3 e

um spoligotipo “novo”, ou seja, um perfil ainda não depositado no banco mundial de

spoligos SpolDB4. Dois isolados, um da Argentina (A-6972) e do Ceará (CE-588)

apresentaram o mesmo spoligotipo compartilhado internacionalmente (SIT), entretanto,

os outros dois isolados provenientes do Pará apresentaram SITs diferentes (tabela 5).

Tabela 5: Perfil genotípico dos isolados de M. tuberculosis com a variante mutada 619-

A.

Isolado

Sensibilidade INH

Mutação katG

Mutação nat

Spoligotyping

SIT

A-6972

R

WT

G619A

LAM3 S/ Convergente

4

R

WT

G619A

75

PA-727

T3 1655

PA-1114

R

WT

G619A

NOVO

Novo

CE-588

R

WT

G619A

LAM3 S/ Convergente

4

Nos 05 isolados R-INH sem mutação no códon 315 de katG, com novas

mutações identificadas em nat, ou seja, ainda não descritas, 4 famílias foram

observadas, entretanto, a família LAM foi a mais freqüente tendo (40 %)(Tabela 6).

Dois deles eram provenientes da Argentina (A-6906; A-7390) caracterizados

como pertencentes às famílias Beijing e um perfil genotípico “novo”, respectivamente.

Um isolado proveniente do Ceará (CE-3920) teve seu perfil genotípico definido como

LAM6.

Os isolados do Rio Grande do Sul apresentaram perfis genotípicos bem

diferentes um do outro. O isolado RS-345 teve o perfil definido como LAM9, enquanto o

isolado RS-363 apresentou o perfil da família T.

Tabela 6: Perfil genotípico dos isolados de M. tuberculosis com novos SNPs em nat

sem mutação no códon 315 do gene katG.

Isolado

Sensibilidade

INH

Mutação

katG

Mutação

nat

Tipo de mutação

Spoligotyping

SIT

A-6906

R

WT

C276T

Mutação silenciosa

BEIJING

1

A-7390

R

WT

C373A

Mutação não-

sinônima

NOVO

Novo

76

C375G


CE-

3920

R

WT

C375G


LAM6

64

RS-345

R

WT

C375G

T503G


Mutação não-

sinônima

LAM9

42

RS-363

R

WT

T503G

Mutação não-

sinônima

T4-

65

Os cinco isolados R-INH com mutação no códon 315 do gene katG, entre os

quais foram identificadas novas mutações em nat, pertenciam a duas diferentes

famílias, sendo que a família LAM foi a mais freqüente entre esses isolados (Tabela 7).

Os três isolados do Rio de Janeiro foram caracterizados com o perfil genotípico

referente à família LAM9, diferindo então, na mutação pontual no códon 315 do gene

katG e no gene nat. No isolado RJ-3666 foi observada a mutação S315T em katG

associada à mutação silenciosa G501C em nat, entretanto, nos outros 02 isolados RJ-

3669 e RJ-3745 foi observada a mutação S315I no gene katG associada à mutação

não-sinônima G202A no gene nat. Contudo, esses 2 isolados compartilharam o mesmo

SIT.

O isolado do RS-311 apresentou a mutação clássica em katG (S315T) e perfil da

família LAM5 e isolados CE-4080 apresentou perfil genotípico caracterizado como T1.

Apenas os dois isolados provenientes do Rio de Janeiro compartilharam o

mesmo SIT, os demais foram apresentaram SITs bem diferentes.

77

Tabela 7: Perfil genotípico dos isolados de M. tuberculosis com novos SNPs em nat

com mutação no códon 315 do gene katG.

Isolado

Sensibilidade INH

Mutação katG

Mutação nat

Tipo de mutação

Spoligotyping

SIT

CE-4080

R

S315T

C375G


T1

353

RJ-3666

R

S315T

G501C


LAM9

435

RJ-3669

R

S315I

G202A

Mutação não sinônima

LAM9

388

RJ-3745

R

S315I

G202A

Mutação não sinônima

LAM9

388

RS-311

R

S315T

C375G


LAM5

93

7.6. Isolados WT no gene katG e efluxo ativo

Dentre os 04 isolados sem mutação no códon 315 do gene katG e com

mecanismo de efluxo ativo, dois 02 eram provenientes do Estado do Ceará, 01 do Rio

Grande do Sul e 01 do Pará, sendo todos pertencentes família LAM. Dois isolados

compartilharam o mesmo SIT, um proveniente do Rio Grande do Sul (RS-366) e o outro

do Pará (PA-861), entretanto, os outros 2 isolados do grupo apresentaram SITs

diferentes. (Tabela 8).

78

Tabela 8: Genótipo dos isolados WT para o códon 315 do gene katG e presença de

mecanismo de efluxo.

Isolado

Mutação katG

CMI

g/mL

CMI+Vera 100mM*

(g/mL)

CMI+ CCCP 5mM

(g/mL)

Spoligotyping

SIT

CE-588

WT

0,2

0,1

0,1

LAM3

S/Convergente

4

CE-

1602

WT

2

2

0,25

LAM6

64

RS-366

WT

4

2

2

LAM3

33

PA-861

WT

8

8

4

LAM3

33

* Vera = verapamil (inibidor de efluxo).

7.7. Isolados com mutação no gene katG e efluxo ativo

No que se refere aos 13 isolados com mutação no códon 315 de katG, onde em

apenas 03 deles (23,08 %) foi observado um mecanismo de efluxo ativo, o perfil

genotípico foi caracterizado como pertencentes à 3 famílias distintas. Sendo um isolado

proveniente do Rio de Janeiro (RJ-3666) caracterizado como pertencente a família

LAM9, um isolado do Ceará (CE-966) caracterizado como X2 e outro também do Ceará

(CE-2338), como genotípico U.

Todos os isolados apresentaram SITs diferentes (Tabela 9).

79

Tabela 9: Genótipo dos isolados com mutação no códon 315 do gene katG e presença

de mecanismo de efluxo.

Isolado

Mutação katG

CMI g/mL

CMI+ Vera 100mM*

(g/mL)

CMI+CCCP

5mM (g/mL)

Spoligotyping

SIT

RJ-3666

S315T

4

4

2

LAM9

435

CE-966

S315T

4

2

4

X2

1341

CE-2338

S315T

4

2

1

U

1241


7.8. Isolados WT nos genes investigados e ausência de efluxo

Dezesseis isolados R-INH considerados “wild type” nos genes katG, inhA e nat e

sem mecanismo de efluxo ativo foram genotipados.

No grupo composto por 16 isolados, 06 eram provenientes do Ceará, 1 de Minas

Gerais, 2 do Pará, 3 oriundos do Perú, 2 do Rio Grande do Sul e 2 de São Paulo, e a

família LAM foi a mais freqüente [31,25 % (05/16)], entretanto, alguns isolados

apresentaram perfis genéticos bem diferentes de LAM. (Tabela 10).

Sendo que os 02 isolados provenientes do Pará (PA-694 ; PA-988) apresentaram

perfis “novos”, ainda não depositados no SpolDB4.

Apenas os isolados provenientes do Estado do Rio Grande do Sul

compartilharam o mesmo SIT. Os demais apresentaram SITs diferentes.

80

Tabela 10: Genotipagem dos isolados WT para os genes investigados e ausência de

mecanismo de efluxo.

Isolado

Mutação

katG

Mutação

nat

CIM

(g/mL)

CIM+vera 100 mM* (g/mL)

CMI+CCCP 5 mM (g/mL)

Spoligotyping

SIT

CE-3159

WT

WT

1

1

1

NOVO

2342

CE-3161

WT

WT

>32

>32

>32

LAM3

1354

CE-3478

WT

WT

1

1

1

LAM6

64

CE-3785

WT

WT

1

1

1

LAM5

93

CE-4067

WT

WT

4

4

4

U

1241

CE-4211

WT

WT

1

1

1

LAM9

4211

MG-1795

WT

WT

1

1

1

LAM5

176

PA-694

WT

WT

1

1

1

NOVO

20

PA-988

WT

WT

>32

>32

>32

NOVO

60

PE-114

WT

WT

>32

>32

>32

T1

53

PE-143

WT

WT

1

1

1

BEIJING

1

PE-144

WT

WT

0,125

0,125

0,125

T1

508

RS-305

WT

WT

1

1

1

X2

119

RS-361

WT

WT

2

2

2

X1

119

SP 40

(13411)

WT

WT

>32

>32

>32

Haarlem3

335

81

SP-53

WT WT 0,5 0,5 0,5 Haarlem3 50


7.9. Isolados com mutação em katG e ausência de efluxo

Seis isolados R-INH (46,15%), mutados no códon 315 de katG, sem alterações

observadas em outros genes, e com mecanismo de efluxo ausente, também foram

genotipados, sendo 3 deles eram provenientes do Ceará, 1 do Rio de Janeiro e 3 do

Rio Grande do Sul. Sendo, novamente a família LAM a mais freqüente, com os isolados

pertencendo a diferentes SIT (Tabela 11).

Tabela 11: Genotipagem dos isolados mutados no códon 315 do gene katG e ausência

de mecanismo de efluxo.

Isolado

Mutação

katG

Mutação

nat

CIM

(g/mL)

CIM+vera 100 mM * (g/mL)

CMI+CCCP 5 mM

(g/mL)

Spoligo

SIT

CE-1759

S315T

WT

2

2

2

Haarlem3

50

CE-3064

S315T

WT

2

2

2

LAM9

42

CE-3778

S315T

WT

2

2

2

LAM2

1691

RJ-3674

S315T

WT

4

4

4

LAM9

435

RS-302

S315T

WT

2

2

2

NOVO

novo

RS-318

S315T

WT

1

1

1

Haarlem3

50

*Vera: verapamil (inibidor de efluxo).

82

7.10. Isolados com mutação em nat e presença de efluxo

Em dois isolados foi observado os dois mecanismos, o efluxo ativo e mutação no

gene nat, sendo um proveniente do Ceará (CE-588) e outro do Rio de Janeiro (RJ-

3666).

No isolado CE-588, considerado WT para o códon 315 do gene katG, foi

identificada a presença da variante mutada 619-A e o mecanismo de efluxo. A inibição

desse sistema ocorreu com a adição dos 2 inibidores utilizados, o verapamil e o CCCP,

promovendo uma redução de CMI de 0,2 µg/mL para 0,1 µg/mL.

No entanto, no isolado RJ-3666 foram identificadas mutação em katG e nat, ou

seja, a alteração S315T e a mutação silenciosa G501C, respectivamente. A inibição do

efluxo ocorreu com o uso de CCCP, permanecendo a CMI sem alterações com o uso

do verapamil. Houve uma redução na CMI de 4 µg/mL para 2 µg/mL de INH.

83

8. DISCUSSÃO

Vários estudos têm sido conduzidos de forma a detectar mutações em genes

conhecidos ou mesmo outros genes envolvidos na resistência a INH, assim como a

descrição e pesquisa de outros mecanismos moleculares na resistência, como o

mecanismo de efluxo nas bactérias; entretanto, esses mecanismos ainda necessitam

de maiores estudos, mas sabe-se que alguns genes estão diretamente associados à

resistência a INH, como por exemplo, os genes katG, ahpC e inhA (Barnerjee et al.,

1994; Sherman et al., 1996; Wilson & Collins, 1996), gene nat (Payton et al., 1999,

Upton et al., 2001a, Upton et al., 2001b, Sandy et al. 2002, Kawamura et al. 2003,

Sholto-Douglas-Vernon et al., 2005, Sandy et al. 2005b) e extrusão do fármaco pelo

mecanismo de efluxo (Piddock, 2006).

Estudos demonstram que esta enzima pode acetilar a INH in vitro (Payton et al.,

1999, Upton et al., 2001a, Upton et al., 2001b Sandy et al. 2002, Kawamura et al. 2003,

Sholto-Douglas-Vernon et al., 2005, Sandy et al. 2005b), e, quando um isolado de M.

tuberculosis cresce in vitro na presença de INH, há um aumento significativo da

expressão deste gene. (Sholto-Douglas-Vernon et al., 2005). Recentemente, foi

observado o envolvimento do gene nat na síntese de ácidos micólicos e derivados da

parede celular micobacteriana (Bhakta et al., 2004, Madikane et al., 2007). Em

humanos, a enzima NAT2 é responsável pela inativação da INH através da acetilação

(Upton et al., 2001b).

Conseqüentemente, o objetivo deste estudo foi investigar o papel desses dois

mecanismos moleculares na resistência a INH, ou seja, a presença de um sistema de

efluxo ativo e mutações no gene nat, investigando uma possível extrusão do fármaco

INH do meio intracelular, por meio de proteínas transportadoras, e a presença de

mutações no gene nat, que em estudo prospectivo, levarão à investigação de possíveis

mudanças na conformação da estrutura da enzima, assim como, uma possível

alteração na taxa de acetilação da INH pela enzima NAT, através de simulações in

silico.

Para tanto, a possível presença de sistema de efluxo ativo foi investigada através

84

da estimativa da Concentração Mínima Inibitória (CMI) em meio líquido, na presença de

INH, com posterior teste de inibição do mecanismo de efluxo utilizando-se de inibidores

clássicos desse sistema, como o verapamil e CCCP para cada isolado, e em cada

isolado o gene nat foi completamente seqüenciado.

No intuito de identificar associações entre tais fatores, cada isolado considerado

resistente ao fármaco pelo método das proporções teve descrito as características

moleculares dos genes envolvidos com a aquisição de resistência a isoniazida, o códon

315 do gene katG e a região regulatória ou promotora e a seqüência aberta de leitura

(orf) ou estrutural do gene inhA, por meio do seqüenciamento de DNA, considerado

“padrão ouro”, assim como, seu perfil genotípico investigado pela técnica de

Spoligotyping.

O método de proporções (MP-LJ) (Canetti et al.,1969), é um método que

determina a relação proporcional de isolados resistentes e sensíveis, presentes numa

amostra clínica, através do cultivo em meio de cultura sólido com ou sem as drogas

usadas no tratamento da TB. Com base no número de unidades formadoras de colônia

no meio com droga em relação ao sem droga, se determina a fração da população

bacteriana resistente. Quando esse valor é maior do que a fração definida para a droga

(entre 1 e 10%), a população bacteriana é considerada resistente.

Para este estudo, foi selecionada uma população composta por 47 isolados de

M. tuberculosis, já caracterizados pelo método de proporções (MPLJ), sendo 41 deles

considerados resistentes e 06 sensíveis a INH. Os isolados sensíveis foram incluídos

para servirem como controle para a futura comparação com outros trabalhos

semelhantes.

Dentre os 41 isolados resistentes a INH (R-INH) pelo MPLJ, 28 isolados não

apresentaram alterações no códon 315 gene katG, sendo considerados então,

selvagens (WT); entretanto, em 13 deles foi observada a mutação pontual no códon

315 do gene katG, sendo que em 11 isolados ocorreu a troca de um resíduo de serina

por um resíduo de treonina (S315T) e em 02 isolados foi observada a mutação S315I,

ou seja, a troca de um resíduo de serina por um resíduo de isoleucina na cadeia

polipeptídica da enzima KatG.

85

Nenhuma mutação foi observada no gene inhA na amostragem de 41 isolados R-

INH.

Para a inferência das CMIs e investigação do mecanismo de efluxo dos 41

isolados R-INH investigados, foi utilizado o método REMA descrito por Palomino et al.,

(2002), em meio líquido.

A resistência devido ao efluxo é caracteristicamente dependente de energia, seja

aquela gerada pela força próton-motora ou da hidrólise de ATP (Silva et al., 2001),

portanto, dois inibidores clássicos de mecanismos de efluxo foram utilizados na

investigação, o CCCP e o verapamil, respectivamente.

Sabe-se que o CCCP atua inibindo proteínas de transporte que utilizam a força

próton-motora da membrana plasmática (famílias RND, SMR, MATE e MFS), enquanto

o verapamil, é considerado um inibidor mecânico, ou seja, atua inibindo bombas menos

seletivamente que o CCCP (De Rossi et al., 2006). Entretanto, é relatado na literatura

que o verapamil pode inibir bombas que utilizam a hidrólise de ATP (De Rossi et al.,

2006).

A primeira bomba de efluxo MDR caracterizada em humanos foi a Glicoproteína-

Permease (P-gp) e é considerada responsável pela resistência de uma grande

variedade de drogas citotóxicas via efluxo dependente de ATP. É classificada como

pertencente à família ABC, a única família cujo mecanismo utiliza a hidrólise de ATP

(Paulsen, 2003, Moreira et al., 2004) e o verapamil é um inibidor bem conhecido desta

bomba (De Rossi et al., 2006).

Os genes drrAB (do operon drrABC) de M. tuberculosis, da família ABC (ATP-

Binding Cassette) quando superexpressos em M. smegmatis, conferiram resistência à

uma gama de antibióticos clinicamente relevantes, incluindo, tetraciclina, eritromicina,

etambutol, norfloxacina, estreptomicina e cloranfenicol (Choudhuri et al., 2002).

Demonstraram ser possível reverter um fenótipo resistente com o uso de reserpina e

verapamil, sendo possível inferir que o verapamil atue, também, inibindo bombas MDR

dependentes de ATP (Choudhuri et al., 1999).

Neste estudo, dos 28 isolados R-INH sem mutação no códon 315 do gene katG

e inhA, apenas 04 deles apresentaram um mecanismo de efluxo, o que representou

14,29%. Um isolado (CE-588) mostrou uma redução na CMI de 0,2 µg/mL para 0,1

86

µg/mL de INH, com a utilização de ambos inibidores. Esses resultados sugerem que

exista neste isolado R-INH, uma possível participação de sistema de efluxo com

proteínas transportadoras via efluxo dependente de ATP e força próton-motora, ou seja,

possivelmente a participação de proteínas pertencentes a famílias diferentes, atuando

em sinergia.

Entretanto, outro isolado (CE-1602) apresentou um comportamento diferente,

demonstrando uma redução significativa de CMI somente na presença do CCCP, de 2

µg/mL para 0,25 µg/mL. Neste isolado é possível inferir que o sistema de efluxo atue

com o auxílio da força próton-motora, cuja inibição só poderia ocorrer com a

despolarização da membrana plasmática, o que é promovida pelo uso de CCCP.

Já o isolado proveniente do Rio Grande do Sul (RS-366) teve o mecanismo de

efluxo inibido com a utilização dos dois inibidores, apresentando uma redução de CMI

de 4 µg/mL para 2 µg/mL de INH, ou seja, inibindo mecanismos de efluxo que atuavam

via efluxo dependente de hidrólise do ATP e via força próton-motora.

Entretanto, para o isolado proveniente do Pará (PA-861), houve uma redução de

CMI apenas com a adição de CCCP, podendo inferir que neste isolado, o mecanismo

de efluxo era ativo via força próton-motora, descartando a possibilidade de que

proteínas transportadoras da família ABC estivessem atuando. É relatado que as

proteínas da família ABC, utilizam a hidrólise de ATP e são consideradas as mais

antigas evolutivamente (De Rossi et al., 2006, Piddock, 2006).

Percebe-se que 2 isolados (CE-1602 ; PA-861) tiveram o possível mecanismo de

efluxo inibido apenas com a utilização do ionóforo CCCP, e os outros 2 (CE-588 ; RS-

366), com o uso dos 2 inibidores (Choudhuri et al., 2002).

O comportamento dos isolados CE-1602 e PA-861 de nosso estudo, estão em

conformidade com os dados relatados por Pasca et al., 2005, em que foi verificado que

o verapamil não apresenta efeito na redução dos níveis de CMI para INH em isolados

de M. smegmatis com o gene MmpL7 de M. tuberculosis expresso, sendo atribuído à

essas proteínas, altos níveis de resistência a INH quando superexpressas em M.

smegmatis.

Demonstraram uma redução de 8 vezes na taxa de CMI frente ao uso de CCCP

e classificaram esse gene como responsável pelo efluxo de INH por um mecanismo

87

dependente de energia, pertencente à família RND, que até então, haviam sido

descritas somente em bactérias gram-negativas (Pasca et al., 2005).

Já os isolados (CE-588 ; RS-366), tiveram o possível mecanismo de efluxo

inibido com a ação dos 2 inibidores, apresentando um comportamento semelhante ao

relatado por Choudhuri et al., (1999).

Choudhuri et al., (1999), demonstraram num estudo que o acúmulo de INH em

M. smegmatis é aumentado pela adição de um desacoplador de força próton-motora, e

por um inibidor de efluxo dependente de ATP, fornecendo assim, evidências de que

ambos os mecanismos de efluxo, seja dependente de energia ou dependente de ATP,

podem estar envolvidos no efluxo de INH neste microrganismo.

De acordo com nossos dados é possível inferir, então, que nestes dois isolados,

as proteínas transportadoras pertencem a famílias diferentes, devido à inibição de CMI

com um mecanismo de ação diferenciado, o que tornou o bacilo da TB mais suscetível

à ação do fármaco.

Dentre os isolados com mutação no códon 315 do gene katG, em 23,08%

(03/13) deles foi observado um possível um mecanismo de efluxo, Nestes isolados foi

observada a alteração clássica no códon 315 da cadeia polipeptídica, onde há a troca

de um resíduo de serina por um resíduo de treonina.

O isolado proveniente do Rio de Janeiro (RJ-3666) apresentou sua CMI estimada

em 4 µg/mL de INH, e, com a adição do CCCP, foi observada uma redução para 2

µg/mL; entretanto, não houve alteração na CMI com o uso de verapamil, podendo inferir

que, neste isolado, as proteínas de extrusão de INH utilizam a força próton-motora para

atuar, porém, não é possível caracterizar uma família específica (famílias RND, SMR,

MATE e MFS).

No isolado CE-966, foi observado que o verapamil teve sucesso na inibição de

um possível mecanismo de efluxo, apresentando uma redução de 4 µg/mL para 2

µg/mL de INH, sendo provável que as proteínas de efluxo ativas neste isolado

pertençam à família ABC. Entretanto, no isolado CE-2338, o uso dos dois inibidores foi

eficaz, causando uma redução de CMI de 4 µg/mL para 2 µg/mL com o uso de

verapamil e, para 1 µg/mL com CCCP, sendo possível inferir, então, a participação de

88

várias proteínas de extrusão, estando mais uma vez em concordância com os dados

publicados por Choudhuri et al., (1999).

As mutações identificadas no gene katG, geralmente no códon 315 (S315T),

provocam uma diminuição na capacidade de ativar INH, ocorrendo assim, uma

diminuição na atividade da peroxidase (Wengenack et al., 1997). Entretanto, é relatado

que cerca de 30% a 40% da atividade inicial da catalase permanece mesmo quando

esta alteração é observada no gene katG (Rouse et al., 1996). Silva et al., (2003 a),

apontam a alteração S315T como a mais freqüentemente relacionada à resistência a

INH.

Sendo possível que esse percentual de atividade da enzima KatG ainda

permaneça ativando uma certa taxa de INH, o que tornaria o bacilo suscetível ao

fármaco, é possível pensar que esses isolados mutados no códon 315 do gene katG

que apresentaram um possível sistema de efluxo, tenham desenvolvido ou ativado esse

mecanismo ou superexpresso essas proteínas de extrusão na tentativa de proteger o

meio intracelular do bacilo de um ambiente hostil, já que a INH estaria inibindo em

parte, a síntese dos ácidos micólicos da parede. Isso poderia ocorrer até que o

microrganismo desenvolvesse ou ativasse outras formas mais rápidas de resistência.

Em geral, as bombas de efluxo de drogas conferem baixos níveis de resistência,

em contraste com os altos níveis de resistência conferidos por mutações em genes que

codificam os alvos primários desses agentes (De Rossi et al, 2002).

Contudo, no que se refere aos isolados sem mutação nos genes relacionados à

resistência a INH, porém resistentes pelo MP-LJ, seria aceitável pensar que esses

isolados utilizariam o mecanismo de efluxo para a sobrevivência, até que isolados

mutantes com mutações adicionais ou outros mecanismos moleculares desenvolvidos

ou ativados fossem selecionados, com o intuito de desenvolver níveis de resistência

clinicamente relevantes (Webber & Piddock, 2003).

Spies (2007) investigou a possível contribuição de sistemas de efluxo em

isolados de M. tuberculosis na resistência a estreptomicina (R-SM) e verificou que entre

isolados que apresentaram diminuição na CMI frente ao uso de inibidores, 61% deles

89

não apresentaram mutações nos genes rpsL e rrs relacionados à resistência à essa

droga e 39 % dos isolados possuíam mutações nesses genes.

Em nosso trabalho, dentre os isolados que diminuíram a CMI com o uso de

inibidor, observamos uma freqüência de 14,29% de isolados sem mutações nos genes

relacionados com a resistência a INH (katG e inhA) e de 23,08% dos isolados com

mutação no códon 315 do gene katG.

No que se refere aos isolados que não tiveram um mecanismo de efluxo

observado, Spies (2007) observou que 32 % deles não apresentavam mutações nos

genes relacionados à resistência a SM e em 68 % foram observadas mutações.

Em nosso estudo, 76,92 % dos isolados apresentaram alteração no códon 315

do gene katG e em 85,70 % dos isolados não foram observadas mutações.

Dentre os isolados WT para o códon 315 do gene katG e com um sistema de

efluxo inibido, a família “The Latin American and Mediterranean Family” (LAM) se

mostrou prevalente, o que era esperado já que a família LAM é considerada

predominante nas Américas (Gomes, 2006, Dalla Costa et al., 2008).

Os dois isolados provenientes do Ceará (CE-588 ; CE-1602) foram

caracterizados como pertencentes à família LAM, sendo classificados nos subtipos

LAM3 S/Convergente e LAM6, respectivamente. Entretanto, o fato de apresentarem

SITs (“shared international types”) diferentes deve ser levado em consideração.

O isolado CE-588 foi classificado como SIT 4 e o isolado CE-1602, como SIT 64.

Isso exclui a possibilidade de clonalidade entre esses dois isolados provenientes do

mesmo Estado.

Já os isolados RS-366 e PA-861 apresentaram o perfil genotípico do subtipo

LAM3 e compartilharam o mesmo SIT, número 33 e a possibilidade de clonalidade entre

eles deve ser investigada com o uso da técnica de DRE-PCR.

Os isolados com o mecanismo de efluxo inibido e mutação no códon 315 do

gene katG (S315T), foram classificados com perfis genotípicos e SITs totalmente

diferentes, excluindo qualquer possibilidade de clonalidade entre eles, sendo o isolado

RJ-3666 com perfil LAM9 e SIT 435, o isolado CE-966, com perfil da família X, subtipo

X2 e SIT 1341 e o CE-2338, com perfil genotípico característico da família U e SIT

90

1241.

Neste estudo, não foi possível inferir a associação entre o possível mecanismo

de efluxo ativo e um determinado perfil genotípico, ou família. Para maiores conclusões,

se faz necessário, uma investigação com amostragem maior, na tentativa de pesquisar

a freqüência de determinada família em isolados com esse sistema ativo.

Dezesseis isolados R-INH [39,02 % (16/41)] considerados WT nos genes katG,

inhA e nat. Quando testados frente aos inibidores de efluxo, mantiveram sua CMI sem

alterações. Esse grupo é composto por 6 isolados do Ceará, 1 de Minas Gerais, 2

isolados do Pará, 3 provenientes do Peru, 2 do Rio Grande do Sul e 2 de São Paulo e a

família LAM foi a mais prevalente neste grupo.

Os isolados foram genotipados e apresentaram SITs diferentes, o que excluiu a

possibilidade de clonalidade entre eles, entretanto, os dois isolados provenientes do Rio

Grande do Sul, SIT 119, devem ser investigados por um método com poder

discriminatório maior, como por exemplo, DRE-PCR.

Sabe-se que determinados genótipos têm sido associados à resistência aos

fármacos usados no tratamento da tuberculose, como por exemplo, os genótipos

Beijing/W e Haarlem (Marais et al., 2006). Os isolados da família Beijing são descritos

como tendo uma grande capacidade de se disseminar mais rapidamente do que outras

linhagens (Rad et al., 2003).

O isolado proveniente do Perú (PE-143), teve a CMI estimada em 1 µg/mL de

INH e perfil genotípico foi caracterizado como Beijing. Não foram identificadas mutações

em nenhum dos genes investigados, tampouco, um mecanismo de efluxo ativo,

contudo, o seu perfil Beijing poderia estar contribuindo na resistência a INH. Ainda

neste caso, não se pode excluir a possibilidade de outro mecanismo molecular ou

mutações em outros genes ainda não relacionados com a resistência a INH estarem

atuando.

Dois isolados apresentaram o perfil característico da família Haarlem,

compartilhando SITs diferentes, excluindo assim a possibilidade de clonalidade.

O isolado SP-40(13411) teve sua CMI estimada em > 32 µg/mL de INH, um nível

91

considerado alto para resistência à esse fármaco, já o isolado SP-53 teve a CMI

estimada em 0,5 µg/mL. Segundo Ritacco et al., (1997), o genótipo Haarlem parece

favorecer o aparecimento de linhagens TB-MDR, e foi associada com surtos na

Argentina. É possível que esse genótipo possa ter uma contribuição na resistência.

De acordo com Heifets (2000), isolados de M tuberculosis com CMI a partir de

2,5 µg/mL são considerados de alta resistência.

Em 3 isolados (CE-3159 ; PA-694 ; PA-988) cujas CMIs correspondem a 1, 1 e

> 32 µg/mL de INH, respectivamente, tiveram o perfil genotípico definido como um perfil

“novo”, ainda não depositado no SpolDB4, tornando difícil uma associação desse perfil

com a resistência nesse momento, já que não se têm informações acerca dele.

Entretanto, não podemos excluir a possibilidade deste genótipo novo ter a capacidade

de influenciar de certa forma, os níveis de resistência a INH.

Cinco isolados foram caraterizados como LAM, todos com SITs diferentes, sem a

possibilidade de serem clones. Cabe ressaltar que os isolados CE-3161 e CE-4211

tiveram as CMIs estimadas em >32 µg/mL e 1 µg/mL, respectivamente, o pode ser

considerado altamente resistente. Os demais do grupo ficaram em 1 µg/mL.

Lazzarini et al., 2007, identificaram uma região de deleção específica designada

RDRIO (Região de Deleção), considerada uma longa seqüência polimórfica (>26,3 kb),

que parece estar ligada a certos subtipos de família LAM, em isolados do Rio de

Janeiro, Brasil.

Sugerem que isolados portadores dessa região de deleção (RD) possam causar

uma forma de TB com uma apresentação clínica distinta, podendo estar relacionado

com alta virulência, transmissibilidade e/ou adaptação específica na população

hospedeira Euro-Latino-Americana. Ao interpretar os dados genéticos fornecidos, eles

sugerem que esse polimorfismo possa tornar o isolado de M. tuberculosis muito mais

patogênico e possivelmente mais infeccioso do que as cepas selvagens (Lazzarini et

al., 2007).

Dois isolados provenientes do Peru (PE-114 ; PE-144) com CMIs estimadas em

> 32 µg/mL e 0,125 µg/mL, respectivamente, sendo caraterizados como família T,

92

subtipo T1, porém compartiharam SITs diferentes, não sendo então considerados

clones. É considerada a família das cepas modernas de TB, entretanto, ainda não está

bem caracterizada, permanecendo com mais de 600 perfis (SITs) não agrupados. É

encontrada em quase todos os continentes, e quase 30 % das entradas no SpolDB4

são de isolados da família T (Brudey et al., 2006).

Dois isolados do Rio Grande do Sul (RS-305 ; RS-361) com CMIs estimadas em

1 µg/mL e 2 µg/mL de INH, respectivamente. Ambos os isolados foram agrupados na

família X, com subtipos X2 e X1. Segundo Rastogi & Sola (2007), a distribuição desta

família parece estar ligada aos países Anglo-Saxões. É altamente prevalente na África

do Sul e Estados Unidos da América.

Segundo Brudey et al., (2006), essa familia tem uma prevalência de 21,5 % nos

Estados Unidos e de 11, 9% na América Central.

Em estudo realizado no Brasil (Silva et al., 2003a), 12,5% dos isolados dados

como resistentes a INH pelo MP-LJ não apresentavam mutações nos genes

relacionados à resistência. Segundo Viveiros et al., (2003), de 20-30% de todos os

isolados resistentes podem não apresentar mutações nos genes katG e inhA, indicando

que nesses isolados a resistência pode ocorrer por indução de bombas de efluxo.

Nossos resultados sugerem neste caso, que a resistência desses isolados, não

pode ser atribuída às mutações clássicas, tampouco, um sistema de efluxo ativo.

Salientam a idéia de investigações maiores na tentativa de identificar outros genes ou

mecanismos envolvidos na resistência a INH, associados à pesquisa na área da

Epidemiologia Molecular.

Seis isolados com mutação no códon 315 do gene katG, não apresentaram

efluxo ativo, tampouco, mutações foram observadas nos outros genes investigados.

Isso correspondeu em 46,15 % dos isolados (06/13). Deste grupo fazem parte 3

isolados provenientes do Ceará, 1 do Rio de Janeiro e 2 do Rio Grande do Sul.

Silva et al., 2003 a, investigaram 69 isolados R-INH randomicamente

selecionados de 3 estados brasileiros, num período de 1996 a 1999, e observaram que

87,1 %, 60,9 % e 60 % de isolados, provenientes do RS, RJ e SP, respectivamente,

portavam a alteração S315T.

93

Os 3 isolados com perfil da família LAM (CE-3064 ; CE-3778 ; RJ-3674) tiveram

suas CMIs estimadas em 2 µg/mL, 2 µg/mL e 4 µg/mL de INH. Como citado

anteriormente, Lazzarini et al., (2007) sugerem que a presença da região de diferença

RDRIO pode estar associada ao desenvolvimento de altos níveis de resistência em

isolados do Rio de Janeiro. Seria de grande valia, investigar em estudo posterior, a

presença deste polimorfismo nestes isolados, já que entre eles, há um proveniente

daquele Estado, o qual apresenta a maior estimativa de CMI de seu grupo.

Dois isolados provenientes do Rio Grande do Sul (RS-302 ; RS-318) também

fazem parte deste grupo.

No isolado RS-302 além da alteração S315T, teve CMI estimada em 2 µg/mL e

foi caracterizado como um perfil genotípico “novo”. Entretanto, são necessários maiores

estudos a fim de atribuir, ou não, a resistência a INH observada neste isolado à esse

perfil. Dessa forma, poderíamos sugerir que, a resistência observada, pode ser

atribuída em parte à alteração S315T.

Entretanto, nos isolados CE-1759 e RS-318 foi observada a alteração S315T e

perfil Haarlem, simultaneamente, e como citado anteriormente, o perfil Haarlem está

associado à resistência aos fármacos anti-TB, em isolados de M. tuberculosis R-INH, o

genótipo Haarlem foi associado à alta freqüência de mutação no codón 315 (Marais et

al., 2006). Sugere-se, então, que nestes isolados esses dois mecanismos de

resistência, a alteração e o genótipo, estejam atuando sinergicamente.

Upton et al. (2001 a e b) investigaram o papel do gene nat (NAT2) em humanos e

perceberam se tratar de um gene polimórfico genética e funcionalmente, e a partir

disso, começaram a investigar polimorfismos no gene nat de M. tuberculosis e sua

possível relação com a resistência a INH. Observaram o SNP G619A numa

amostragem randômica de 73 isolados provenientes da África do Sul. Essa mutação

promove a troca de um resíduo de glicina por um de arginina na posição 207 da cadeia

polipeptídica (G207R), sendo observada uma freqüência de 18% (13/73) e sugerem

que essa mutação esteja associada a pequenas alterações na CMI (Upton et al., 2001 a

e b).

Sholto-Douglas-Vernon et al., (2005) também identificaram esse SNP numa

94

amostragem randômica de 468 isolados, com freqüência de 20% (193/468)

provenientes, também, da África do Sul.

Em nosso estudo, o SNP G619A foi identificado em apenas 04 isolados (04/41) e

considerando o número geral de isolados R-INH, corresponde a uma freqüência de

9,76%, sendo bem menor do que as freqüências observadas por Upton et al., (2001b) e

Sholto-Douglas-Vernon et al., (2005), que correspondeu a 18% e 20%,

respectivamente. Difere também, em relação à freqüência encontrada por Vasconcellos

(2007), que foi de 13,2%, numa amostragem de 443 isolados de M. tuberculosis,

contudo, essa diferença em nosso estudo pode ter ocorrido pelo critério de seleção da

amostragem ou pelo perfil genético da população.

Em nosso trabalho, os 04 isolados R-INH com a variante mutada eram

provenientes de 02 estados brasileiros (Pará e Ceará) e da Argentina, país vizinho da

América do Sul, sendo 01 isolado da Argentina (A-6972), 02 isolados do Pará (PA-727 ;

PA-1114) e 01 isolado do Ceará (CE-588), e, nesses isolados, não foram observadas

alterações nos genes katG e inhA, considerados “wild type” para esses dois genes.

Segundo Sholto-Douglas-Vernon et al., (2005), a mutação G619A é restrita à

duas famílias caracterizadas por RFLP (“Restriction Fragment Length Polymorphism”),

as famílias 3 e 28 (F3 e F28). Sugerem que a presença das variantes mutadas 529-C e

619-A poderiam ser usadas como marcadores moleculares em estudos

epidemiológicos, já que apresentam o mesmo perfil de RFLP IS6110.

À princípio, nossos resultados demonstram que a possibilidade de utilização do

SNP G619A como marcador molecular não é aplicável em nossa população.

Em nosso estudo, os isolados que apresentaram essa mutação representam 03

famílias bem diferentes, LAM, T e uma linhagem definida como ”nova” , ou seja, ainda

não foi depositado no banco mundial de spoligotipos, conhecido como SpoDB4, e

foram definidas como spoligotipos LAM3 S/Convergente (A-6972 ; CE-588), mostrando

uma freqüência de 50 % (02/04), T3 (PA-727) e um perfil genotípico definido como

”novo” (PA-1114), demonstrando assim, que a probabilidade da variante 619-A

pertencer a um cluster pode ser descartada.

Nossos dados estão em conformidade com os resultados obtidos por

95

Vasconcellos (2007), que ao analisar uma amostragem de 443 isolados de M.

tuberculosis, identificou em 20 deles a presença da variante mutada, em famílias

diferentes, e quando investigados quanto ao perfil genotípico, foram classificados em 5

famílias diferentes, definidas como spoligotipos LAM, T, X e Haarlem, assim como,

tendo 2 isolados com spoligotipos “novos”, cujos perfis genotípicos ainda não haviam

sido depositados no SpolDB4, descartando também a possibilidade de “cluster”, ou

seja, um agrupamento. (Vasconcellos, 2007).

A família “The Latin American and Mediterranean” (LAM) é definida pela

descoberta do desequilíbrio de ligação entre a ausência dos espaçadores 21-24 no

spoligotyping, sendo considerada a família mais diversa e mais complicada. É relatado

que as cepas pertencentes às famílias LAM3/F11 e S/F28 possuem spoligotipos

idênticos (tipo S.I.T. 4), revelando assim, a existência de convergência genética. O

clado LAM é freqüente nos países do Mediterrâneo e sua presença na América Latina

parece estar ligada à colonização Luso-Hispânica (Portugal-Espanha) (Brudey et al.,

2006, Rastogi & Sola, 2007).

Cabe ressaltar que, dois isolados com a variante mutada 619-A, um proveniente

da Argentina (A-6972) e outro do Ceará (CE-588), compartilharam o SIT 4, o que

segundo Rastogi & Sola (2007), os classificariam como pertencentes aos clados F11 e

F28, indicando uma possível convergência genética.

Levando-se em consideração os dados publicados por Sholto-Douglas-Vernon et

al., (2005) acerca da presença desta variante em 2 clados específicos (F3 e F28), seria

válido investigar um número maior de isolados R-INH num estudo prospectivo.

Sabe-se que, na América Latina o genótipo LAM parece ser dominante (Ferrazoli

et al., 2000, Gomes, 2006, Dalla Costa et al., 2008), sendo o genótipo Beijing menos

comum (1-5%) (Ferrazoli et al., 2000).

Gomes (2006) verificou que 46,5 % dos isolados brasileiros pertencem à família

LAM, seguidos da família T (19,5 %) e S (1,7 %), entretanto, Sholto-Douglas-Vernon et

al., (2005) não descreveram informações acerca do perfil genotípico dos isolados

investigados em seu trabalho, com o uso de ferramentas como Spoligotyping e PCR-

DRE, tendo essa última, um maior poder discriminatório.

96

A possível restrição da variante mutada à somente 2 clados, definidos por PCR-

RFLP por Sholto-Douglas-Vernon et al., (2005) precisa ser investigada com o auxílio de

ferramentas de epidemiologia molecular, no intuito de conhecer o verdadeiro perfil dos

isolados brasileiros resistentes a INH portadores dessa mutação, investigando assim,

sua ocorrência e associação com clados ou famílias específicas.

Em nosso estudo, não foi encontrada nenhuma associação entre a presença da

mutação G619A e genótipo LAM e outras famílias (p= 0,87 ; OD = 0,85 (0,07 – 9,76), o

que pode ser explicado pelo fato de que em nosso estudo, a maioria dos isolados

pertencem à família LAM, o que reflete dados já publicados que demonstram que no

Brasil e América Latina, em torno de 50 % das cepas circulantes pertencem à essa

família (Gomes, 2006, Dalla Costa et al., 2008).

Cabe ressaltar que, em nosso estudo, o isolado PA-727 teve a CMI estimada em

16 µg/mL. Este isolado não apresentou mutações nos genes associados à resistência a

INH e tampouco, um mecanismo de efluxo ativo. Porém, foi identificada a variante

mutada do gene nat 619-A. É possível que mutações em outros genes ou outros

mecanismos moleculares, ainda não descritos, porém, envolvidos na resistência a INH

estejam atuando, entretanto, é necessário uma investigação em amostragem maior ou,

um estudo enzimático neste isolado, a fim de excluir qualquer possibilidade desta

variante estar envolvida na resistência. Foi observado no isolado CE-588 um

mecanismo de efluxo ativo, assim como a presença da variante mutada,

simultaneamente. É possível que, esses dois mecanismos distintos estejam atuando em

sinergia, promovendo algum tipo de resistência. A identificação dos dois mecanismos,

num mesmo isolado, poderia sustentar a hipótese de que, de alguma forma a variante

619-A esteja ligada à resistência a qual seria amplificada quando somada à outro

mecanismo ou mutação.

Neste trabalho, foram identificadas mutações ainda não descritas no gene nat de

M. tuberculosis, sendo observadas 6 novas mutações, 3 silenciosas, sem troca de

aminoácidos e 3 não-sinônimas, onde ocorre a troca de aminoácidos na cadeia

polipeptídica.

Dentre as silenciosas, foram observadas as mutações C276T, C375G e G501G,

97

e para as não sinônimas, foram identificadas G202A, C373A e T503G, distribuídas em

10 isolados distintos.

Nos isolados R-INH considerados WT para os genes katG e inhA, foram

observadas 2 mutações silenciosas e 2 não-sinônimas.

A mutação C276T [troca de uma citosina (C) por uma timina (T) no nucleotídeo

276] foi identificada no isolado A-6906, proveniente da Argentina. Essa mutação não

promoveu troca de aminoácidos, permanecendo o resíduo de alanina (A) na posição 92

da cadeia; entretanto, foi caracterizada com o perfil Beijing, genótipo associado à

resistência aos fármacos usados no tratamento da tuberculose (Marais et al., 2006),

sugerindo, então, que esse genótipo possa estar influenciando o comportamento deste

isolado na resistência.

Um outro isolado, também proveniente da Argentina (A-7390) apresentou 2

mutações simultaneamente, C373A (não-sinônima) e C375G (silenciosa). Cabe

ressaltar que, a mutação C373A promove a troca de um resíduo de leucina (L) por um

resíduo de isoleucina (I), entretanto, a mesma ocorreu associada à uma mutação

silenciosa, promovendo então, a troca de um resíduo de leucina por um de metionina

na posição 125 da cadeia polipeptídica. Esse isolado teve seu genótipo definido como

“novo”, ou seja, ainda não depositado no SpolDB4.

Essa alteração ocorre próximo ao resíduo Asp127 da tríade catalítica do sítio

ativo da enzima NAT (Cys70 - His110 - Asp127).

A mutação C375G foi identificada em outros 2 isolados deste grupo (CE-3920 ;

RS-345), e foi considerada silenciosa por não promover troca de resíduo de leucina (L)

na posição 125.

O isolado CE-3920, teve sua CMI estimada em 1 µg/mL de INH, sem mecanismo

de efluxo e apresentou o perfil genotípico da família LAM, subtipo LAM6, já no isolado

RS-345, a mutação C375G foi observada associada a outra não-sinônima T503G,

também de genótipo LAM, subtipo LAM9.

Cabe ressaltar que a mutação T503G, foi identificada também no isolado RS-

363, esse, com perfil da família T, subtipo T4-CE1 ancestor?, não possibilitando a

98

inferência de que essa mutação ocorra com maior freqüência em isolados de uma

determinada família ou região geográfica, para isso, será necessária uma investigação

em amostragem maior.

Esse SNP promove a troca de um resíduo de metionina (M) por um de arginina

(R) na posição 168.

O mecanismo de resistência presente no isolado CE-3920 necessita de maiores

esclarecimentos, pois o mecanismo de ação e resistência da INH ainda não está

totalmente esclarecido. É possível que outros genes estejam envolvidos ou rotas

secundárias ainda não descritas.

Lazzarini et al., (2007) sugerem que, cerca de 2 % dos isolados do subtipo LAM6

provenientes do Rio de Janeiro com a presença do polimorfismo RDRIO, apresentam

uma acentuada transmissibilidade e esse processo permanece em atividade contínua.

Entretanto, não podemos excluir o fato de que existe um forte intercâmbio cultural e

turístico entre esses 2 estados, e a possível presença desse polimorfismo no isolado

CE-3920 confirmaria esta hipótese de transmissão.

Cinco isolados com mutação no códon 315 do gene katG foram observadas

novas mutações e a família LAM foi a mais freqüente, no entanto, em dois deles, a

mutação silenciosa C375G foi observada, sendo os isolados RS-311 e CE-4080. Neles

não foi observado um mecanismo de efluxo, e foram classificados como tendo perfis

LAM e T1, com CMIs estimadas em > 32 µg/mL e 8 µg/mL de INH, respectivamente.

Segundo Heifets (2000), isolados de M. tuberculosis com CMI a partir de 2,5 µg/mL são

considerados de alta resistência.

No isolado RJ-3666, foi identificada a mutação silenciosa G501C, sem troca de

resíduos de Ala167, entretanto, foi observado um mecanismo de efluxo, cuja inibição

ocorreu com o uso de CCCP de 4 µg/mL para 2 µg/mL.

Segundo De Rossi et al., (2002), as bombas de efluxo de drogas conferem

baixos níveis de resistência, sendo atribuída a resistência de alto nível à mutações em

genes alvos.

Seria aceitável a hipótese de que, no isolado RJ-3666 a resistência pode ser

99

atribuída à alteração clássica S315T, e a presença do efluxo atuaria como um

mecanismo compensatório de defesa na tentativa de ativar outros mecanismos

moleculares, a fim de desenvolver níveis clínicos mais relevantes de resistência

(Webber & Piddock, 2003).

Dois isolados com a mesma alteração em katG (S315I), apresentaram a mutação

não-sinônima G202A, promovendo a troca de um resíduo de glicina (G) por um de

arginina (R) na posição 68, e cabe ressaltar a importância deste resíduo na cadeia

polipeptídica, já que fica próximo ao resíduo de cisteína (Cys70) da tríade catalítica,

fundamental na formação do intermediário acetilado.

Esses isolados eram provenientes do Rio de Janeiro (RJ-3669 ; RJ-3745) e

tiveram suas CMIs em 4 µg/mL e 0,8 µg/mL, respectivamente. É possível inferir que a

resistência seja atribuída à troca de resíduos no códon 315, no entanto, foi verificado

que ambos os isolados pertencem ao subtipo LAM9, e de acordo com Lazzarini et al.,

(2007), 5 % isolados com o subtipo LAM9 e provenientes do Rio de Janeiro

apresentam a região de deleção RDRIO , o que torna esses portadores altamente

virulentos.

No entanto, a possibilidade de clonalidade entre esses 2 isolados deve ser

investigada, por meio de uma técnica com maior poder discriminatório, como por

exemplo DRE-PCR, já que ambos compartilharam o mesmo perfil, número 388 de

acordo com o SpolDB4.

No entanto, ainda não é possível atribuir à essas novas mutações em nat um

papel na resistência a INH, e de acordo com nossos dados não houve uma associação

entre a presença dessas novas mutações e a família LAM (p=0,31 ; OD=0,52 (0,11 –

2,29).

Para tanto, estudos in silico como simulações de docking (acoplagem) da INH

nas isoformas de NAT são necessárias, a fim de predizer a afinidade do fármaco à

NAT. É possível que esses níveis de resistência possam ter sido causados pela troca

de aminoácidos no códon 315 de katG, já que essa alteração foi apontada como a mais

freqüentemente relacionada à resistência a INH (Silva et al., 2003 a).

Nossos dados indicam como uma das limitações, a seleção de amostras

100

realizada por conveniência e o pequeno número amostral investigado, o que torna

imprescindível a realização de estudos prospectivos, a fim de conhecer a real

representatividade dos dados em isolados brasileiros de Mycobacterium tuberculosis.

Outra limitação é em relação à estimativa de CMI, já que não é um método

padronizado, podendo ocorrer diferenças significativas nas inferências de acordo com o

laboratório onde foi realizada a técnica ou o pesquisador que a realizou, o que torna

difícil uma possível argüição ou comparação.

101

9. CONCLUSÕES

Nossos dados salientam a idéia da necessidade de investigações maiores na

tentativa de identificar outros genes ou mecanismos envolvidos na resistência a INH,

associados à pesquisa na área da Epidemiologia Molecular.

Foram identificadas mutações ainda não descritas para o gene nat de M.

tuberculosis, demonstrando que esse gene é polimórfico.

No entanto, não é possível atribuir à essas novas mutações um papel na

resistência. Para tanto, são necessários maiores estudos, como por exemplo,

simulações de docking da INH frente às isoformas encontradas, com o auxílio de

ferramentas de Bioinformática e Modelagem Molecular, na tentativa de predizer a

afinidade do fármaco pelas outras formas de NAT, assim como identificar possíveis

alterações na estrutura do sítio ativo da NAT e o seu real papel na resistência.

Este foi o primeiro trabalho a identificar mutações no gene nat atuando

simultaneamente com o mecanismo de efluxo, o que ocorreu em 2 isolados R-INH.

No isolado CE-588 foi identificada a presença da variante mutada 619-A

associada ao mecanismo de efluxo inibido pelo CCCP e verapamil, e no isolado RJ-

3666, com mutação no códon 315 do gene katG, foi identificada a mutação silenciosa

G501C e o mecanismo de efluxo foi inibido apenas pelo uso do CCCP, despolarizando

a membrana plasmática.

Esses dados apoiariam a hipótese de que o mecanismo de efluxo atue como um

mecanismo compensatório da bactéria, até que a mesma possa ter desenvolvido

mutações ou um mecanismo eficiente, ao ponto de elevar os níveis de resistência em

taxas clinicamente relevantes, pois, o isolado RJ-3666 não precisou dispor de fontes de

energia, como o ATP para a extrusão do fármaco, já que possuía a mutação que o

tornaria mais resistente ao ambiente hostil, ocorreu apenas um mecanismo de

despolarização, sem gasto de energia, para a sobrevivência.

É possível notar a inibição do sistema de efluxo por parte dos dois inibidores,

cujos mecanismos de ação são diferentes, um atuando por despolarização de

membrana plasmática e outro por hidrólise de ATP.

102

Dessa forma, podemos inferir a participação de várias proteínas transportadoras,

de famílias diferentes, atuando na resistência a INH, tornando imprescindível que se

façam estudos posteriores, na tentativa de caracterizar essas proteínas envolvidas na

extrusão da INH, assim tornaria possível, futuramente, que moléculas inibidoras dessas

proteínas fossem modeladas.

103

10. PERSPECTIVAS

Os mecanismos moleculares de resistência à isoniazida se mostram complexos e

pouco entendidos.

A TB no Brasil é considerada endêmica, e é de suma importância o

conhecimento dos fatores genéticos envolvidos na aquisição da resistência à um

fármaco considerado de primeira linha no tratamento.

A investigação de genes que promovam adaptabilidade à ambientes hostis,

assim como, a identificação e caracterização de genes que codificam para bombas de

efluxo em isolados resistente a INH, realizando testes de inibição de efluxo com o uso

de outros inibidores, como por exemplo, a reserpina, e clonagem, em microorganismos

não-patogênicos.

A caracterização dessas bombas pode levar, em estudo prospectivo, à

construção de inibidores úteis.

De acordo com os dados obtidos no seqüenciamento do gene nat, se faz

necessário um estudo da atividade de acetilação das isoformas NAT identificadas, com

estudos in silico, como por exemplo, simulações de docking da INH em cada enzima

mutada (G68R ; L125M ; M168R), na tentativa de predizer a afinidade da INH para a

enzima e sua possível associação com a resistência.

Estudos de mutagênese sítio-dirigida nos resíduos mutados podem ser úteis, na

tentativa de investigar a atividade dessas isoformas.

104

11. ANEXOS

11.1. Anexo 1

Bioinformática e Modelagem Molecular de Proteínas

Estrutura secundária da proteína NAT de M. tuberculosis H37Rv.

Gly68

Leu125

Met168

105

Estrutura secundária da proteína NAT de M. tuberculosis com os resíduos mutados.

Figura 11: Comparação das estruturas secundárias da NAT de M. tuberculosis H37Rv

(selvagem) e com os resíduos de aminoácidos mutados, geradas com o auxílio do

programa DeepView 4.0 (www.expasy.org/spdbv/).

Arg168

Met125

Arg68

106

12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

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