Simona Astorino

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INDICE

Albumin-Cobalt Binding

Lavoro Di Diploma

Svolto da: Simona Astorino

Con la supervisione di:

Dr. Marco Balerna

SSMT, Locarno Giugno 2006

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Pagina

1. Riassunto/Abstract��������������������������.�2 2. Introduzione����������������������������...�3 2.1 Introduzione�����������������������������.�3 2.2 Albumina������������������������������..�4 3. La cardiopatia ischemica������������������������...5 3.1 Angina Pectoris�����������������������������5 3.2 Infarto del miocardio���������������������������5 4. Materiali e metodi���������������������������..6 4.1 Metodo��������������������������������.6 4.1.1 Christenson������������������������������..6 4.1.2 Baghavan�������������������������������..7 4.2 Materiale�������������������������������..7 4.2.1 Apparecchiatura����������������������������...7 4.3 Preparazione dei reagenti e delle soluzioni stock����������������8 4.3.1 Preparazione del tampone fosfato 12 mmol a pH 7.3��������������..8 4.3.2 Preparazione della soluzione di CoCl2 1 g/L�����������������...8 4.3.3 Preparazione della soluzione di DTT 1,5 g/L (C4H10O2S2)������������.8 4.3.4 Preparazione della soluzione madre di albumina concentrata 60 g/L��������..8 4.3.5 Preparazione della soluzione standard di albumina concentrata 50 g/L������......8 4.3.6 Preparazione della soluzione standard di albumina concentrata 40 g/L�������..8 4.3.7 Preparazione della soluzione standard di albumina concentrata 30 g/L������......9 4.4 Raccolta dei campioni�������������������������......9 4.5 Programmi statistici��������������������������...10 5. Risultati e Discussione�������������������������.11 5.1 Risultati ottenuti con gli standard di albumina���������������......11 5.2 Risultati ottenuti con i campioni di controllo�����������������14 5.3 Risultati ottenuti con i campioni di pazienti con sospetta cardiopatia ischemica���..17 6. Conclusione�����������������������������...20 7. Ringraziamenti����������������������������.21 8. Letteratura������������������������������22

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1. RIASSUNTO

Introduzione Il test dell�ACB (Albumin Cobalt Binding) si basa sull�osservazione dell�affinità del terminale NH2 dell�albumina umana per lo ione Co2+. Esso sembra ridursi in pazienti che presentano un�ischemia del miocardio. Il fenomeno fisiologico che porta ad una �albumina modificata a causa di ischemia� (IMA, Ischemia Modified Albumin) non è ancora stato chiarito. Obiettivi Scopo di questo lavoro di diploma è stato quello di dare base sperimentale ad un test manuale e di verificarne l�efficacia su dei campioni di controllo, rispettivamente su dei campioni provenienti da pazienti con sospetta cardiopatia ischemica. Materiali e Metodi I campioni raccolti vengono inizialmente incubati con una soluzione di cloruro di cobalto dopodichè si aggiunge un secondo reagente (DTT) che forma un complesso colorato con il cobalto in soluzione. Si aggiunge poi soluzione fisiologica e infine si legge l�estinzione del campione con un fotometro (Eppendorf, PCP 6121) a 492 nm. Risultati La curva ottenuta con le soluzioni standard di albumina rivela che si tratta di una reazione a segnale inversamente proporzionale: a concentrazione alta di albumina si ottiene un segnale basso, rispettivamente ad una concentrazione bassa di albumina si ottiene un segnale più alto. I risultati ottenuti dai campioni di controllo e dai campioni patologici hanno confermato la tendenza dell�albumina a legare meno cobalto se questa viene a trovarsi in un ambiente ischemico. Sembra inoltre esserci una relazione positiva tra l�estinzione del complesso cobalto-albumina e la Troponina I. Conclusione Considerando la scarsa conoscenza del fenomeno che porta ad un IMA (Morrow D.A., 2003), le difficoltà ottenute nella raccolta dei campioni e nell�allestire il test si può concludere che l�attendibilità del test ACB andrà ulteriormente verificata su un numero maggiore di campioni di controllo ma soprattutto su un numero maggiore di campioni patologici.

1. ABSTRACT Introduction The test of ACB (Albumin Cobalt Binding) is based on the observation of the affinity of the terminal NH2 of human albumin for the ion Co2+. It seems to be reduced in patients who present an ischemia of the myocardium. The physiological phenomenon that leads to a �modified albumin because of ischemia� (IMA, Ischemia ModifiedAlbumin) has not yet been explained. Objective The aim of this diploma study was to provide an experimental basis to a manual test and verify the effectiveness respectively on control samples and samples from patients with suspected ischemic cardiopathy. Materials and Methods The collected samples were initially incubated with a cobalt chloride solution, after which a second reagent (DTT) was added, which formed a coloured complex with the cobalt in solution. The physiological solution was then added, andfinally the extinction of the samples was read with a photometer (Eppendorf, PCP 6121) at 492 nm. Results The curve obtained with the standard solutions of albumin reveals that an inverse proportional reaction to the signal is involved: respectively, a high albumin concentration produces a low signal, while a low albumin concentration results in a higher signal. The results obtained from the control samples and from the pathological samples confirmed the tendency of albumin to bind less cobalt if in anischemic environment. It seems that there is moreover a positive relationship between the extinction of the cobalt-albumin complex and the Troponina I. Conclusion Considering the limited knowledge of the phenomenon that leads to IMA, the difficulties obtained in the collection of the samples and the preparation of the test, it can concluded that the reliability of the test ACB will be further verified on a greater number of control samples but above all on a greater number of pathological samples.

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2. INTRODUZIONE 2.1 INTRODUZIONE Il dolore toracico acuto rappresenta uno dei disturbi più frequenti tra quelli che richiedono una rapida valutazione diagnostica nel reparto di pronto soccorso e, idealmente, il medico dovrebbe poter identificare in modo affidabile i pazienti con una sindrome coronarica acuta (ACS, Acute Coronary Sindromes) conclamata dai pazienti senza ischemia coronarica, candidati quindi ad essere dimessi rapidamente. La pronta identificazione dei pazienti con un�ACS è una necessità dettata da scelte terapeutiche la cui efficacia è tanto maggiore quanto sollecitamente applicate. I marcatori biologici di una necrosi del miocardio (troponine, CK, CK-MB, mioglobina) sono una componente critica nell�accertamento di questi pazienti. Tuttavia il loro livello nel sangue aumenta secondo una cinetica propria in seguito a morte cellulare; essi non possono quindi essere impiegati per la veloce identificazione di una ACS. Il legame del cobalto all�albumina (ACB, Albumin Cobalt Binding) è stato recentemente proposto come test diagnostico rapido di ACS (Bar-Or et al, 2000). Esso si basa sull�osservazione dell�affinità del terminale NH2 dell�albumina umana per lo ione Co2+ che sembra essere ridotto in pazienti che presentano un�ischemia del miocardio. In una molecola di albumina umana, la regione N-terminale, composta dalla sequenza NH2-Asp-Ala-His-Lys-, si è dimostrata essere un sito di legame forte per gli ioni dei metalli di transizione, come per esempio il cobalto, il rame e il nichel (Bar-Or et al, 2001). La modifica del legame sembra avvenire nei minuti seguenti all�evento ischemico, ma i precisi meccanismi che portano alla formazione di �albumina modificata a causa di un�ischemia� (IMA, Ischemia Modified Albumin) non sono ancora ben spiegati. Si è ipotizzato che ciò sia dovuto all�azione dei radicali liberi, all�ipossia, all�acidosi e/o alla distruzione della pompa sodio-potassio (Christenson et al, 2001). Lo studio condotto da Christenson e collaboratori nel 2001 ha dimostrato che l�analisi dell� ACB offre un�alta sensibilità e una capacità di predire i risultati negativi o positivi del campione con 6-24 ore di anticipo rispetto alla troponina. Tuttavia il test ha una bassa specificità dimostrandosi inadatto a differenziare un�angina instabile da un infarto del miocardio con la possibilità, inoltre, di avere dei falsi positivi a causa di ischemie di qualsiasi organo vascolare (ischemia cerebrale, ischemia gastrointestinale�) o a causa di una mutazione del terminale NH2 dell�albumina responsabile di un legame con il cobalto ridotto (Bhagavan et al, 2003). A causa di questa sua bassa specificità il test non può essere considerato un �gold standard� per l�ischemia del miocardio, ma sarebbe utile nel senso di essere complementare alla clinica (dolore toracico e altri sintomi tipici della cardiopatia ischemica), all�ECG (elettrocardiogramma) ed altri marcatori biochimici. Infatti il test ACB, in combinazione con le troponine e l�ECG, aumenta notevolmente la sensibilità di diagnosticare precocemente un�ischemia del miocardio (Christenson et al, 2001). La Food and Drug Administration (FDA) nel 2003 ha autorizzato l�introduzione, nei laboratori, del test ACB nelle loro analisi di routine; esiste infatti in commercio almeno un kit in automatico per il test ACB della ditta Ischemia Technologies (Denver, USA). Il motivo che ci ha spinto a voler sperimentare il test manuale è dato dall�alto prezzo di questo kit (4'645 franchi per 100 test) e dalla sua ridotta stabilità nel tempo (2 settimane).

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Il presente lavoro si è occupato di dare base sperimentale al test (sotto forma di test manuale) e di verificarne l�efficacia 1) su campioni di siero di controllo (pazienti senza segni di ischemia) e 2) su sieri provenienti da pazienti con sospetto di patologia cardiaca. 2.2 ALBUMINA L�albumina è una proteina prodotta dal fegato ed ha un peso molecolare di circa 69 KDa. Essa rappresenta il 50-60% del totale delle proteine sieriche. Essa: 1) mantiene costante il volume plasmatico attraverso la regolazione dell'equilibrio idrico, definendo gli scambi di liquidi fra il sangue ed i vari tessuti del nostro organismo, 2) svolge un rilevante ruolo nel trasporto, attraverso il flusso ematico, di molecole idrofobiche endogene ed esogene, rendendole solubili (acidi grassi, ormoni, farmaci�), 3) è la principale riserva di aminoacidi contribuendo, in condizioni di emergenza, alla regolazione delle proteine indispensabili al mantenimento delle funzioni vitali. I suoi valori sierici normali sono compresi tra 35-50 g/L (valori di riferimento: laboratorio dell�Ospedale Civico Lugano): un suo aumento si osserva negli stati di emoconcentrazione (disidratazione, ustioni, perdite di liquidi biologici) mentre una diminuzione di albumina si osserva in casi di epatopatie, grandi emorragie, nefropatie.

Figura 1. Struttura tri-dimensionale dell�albumina

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3. LA CARDIOPATIA ISCHEMICA La cardiopatia ischemica è una situazione determinata da un ridotto apporto di sangue al cuore per l�ostruzione o il restringimento dei vasi che nutrono il muscolo cardiaco (miocardio). Le due forme principali di tale patologia sono: l�angina pectoris e l�infarto del miocardio. 3.1 ANGINA PECTORIS L�angina pectoris è determinata da una riduzione �transitoria� del flusso di sangue arterioso al cuore; ciò comporta uno stato di scarsa ossigenazione della zona di miocardio irrorata dalle coronarie (ischemia miocardica). Nella grande maggioranza dei casi tale evenienza si manifesta quando un vaso è parzialmente occluso da lesioni ateroschlerotiche. In condizioni di riposo esse possono anche non ostacolare il normale funzionamento cardiaco, ma sotto sforzo o stress impediscono di soddisfare completamente le richieste di ossigeno del muscolo cardiaco. La sintomatologia si presenta con dolori toracici retrosternali simili ad una sensazione di peso; il dolore dell�angina dura solo pochi minuti ed è alleviato dal riposo e dall�assunzione di nitrati. 3.2 INFARTO DEL MIOCARDIO L�infarto del miocardio è una situazione clinica conseguente all�occlusione improvvisa e prolungata di un ramo coronario che determina la necrosi ischemica delle cellule miocardiche. La causa più frequente dell�Infarto Miocardico Acuto è rappresentato dalla formazione di un trombo che, il più delle volte, si localizza su una placca ateromatosa preesistente, provocando la totale occlusione del vaso coronarico con conseguente arresto del flusso ematico e necrosi del tessuto miocardico a valle dell�interruzione trombotica. La sintomatologia di Infarto Miocardico Acuto si presenta con un dolore retrosternale acuto che non regredisce nè con il riposo nè con i nitrati. La diagnosi di cardiopatia ischemica si fa attraverso una minuziosa raccolta delle caratteristiche dei sintomi accusati dal paziente e dei fattori di rischio dello stesso. I primi esami da eseguire sono l�elettrocardiogramma al fine di individuare patologie già in atto rivelando alterazioni del tracciato cardiaco, la misura della pressione arteriosa e il dosaggio di certi marcatori cardiaci come la troponina, la mioglobina e/o le CK.

Figura 2. Rappresenta l�occlusione di un ramo coronarico, a causa di una placca ateromatosa, con la riduzione dell�apporto di sangue al miocardio.

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4. MATERIALI E METODI 4.1. Metodo In Letteratura si trovano due metodiche per il test ACB: quella descritta da Christenson e collaboratori (2001) e quella descritta da Baghavan e collaboratori (2003). 4.1.1 Metodo proposto da Christenson et al. (2001) Nella metodica descritta da Christenson et al., il campione viene inizialmente pre-trattato aggiungendo a 500 µl di siero o plasma eparina 0,45 g di CaCl2 e centrifugato per 10 minuti a 1000-1200 g. Questa procedura viene eseguita per rimuovere eventuali chelatori presenti nel campione derivanti da medicamenti. Del sovranatante ottenuto si prelevano 95 µl e si aggiungono 5 µl di cloruro di cobalto (CoCl2) 2,7 g/L (v. Tab. 1); si miscela e si incuba per 5 minuti. Questa è la fase in cui lo ione Co2+ si lega al terminale NH2 dell�albumina. Dopo l�incubazione si aggiungono 25 µl di ditiotreitolo (DTT) 1,3 g/L (v. Tab. 1), si miscela, si incuba e infine si misura l�assorbanza a 500 nm con un fotometro. Il DTT forma un complesso colorato (marrone) con il Co2+ libero (non legato all�albumina) e l�intensità del colore è direttamente proporzionale alla concentrazione dello ione in soluzione.

Soluzione Stock Soluzione Finale Rapporto di diluizione

CoCl2 MW 237,9

11,6 mM ~2,76 g/L

0,58 mM ~0,14 g/L

1:20

DTT MW 154,24

8,35 mM ~1,3 g/L

1,67 mM ~0,26 g/L

1:5

Tab 1 . Concentrazioni finali, della soluzione stock e il rapporto di diluizione di CoCl2 e del DTT nella metodica descritta da Cristenson e collaboratori.

Fig 3. Disegno che illustra il principio del test ACB nel misurare il cobalto non legato all�albumina

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4.1.2 Metodo proposto da Baghavan et al. (2003) Nella metodica descritta da Baghavan et al. il campione non viene pre-trattato. Inizialmente a 200 µl di siero si aggiungono 50 µl di CoCl2 1 g/L (v. Tab. 2), si miscela e si incuba 10 minuti. In seguito si aggiungono 50 µl di DTT 1,5 g/L (v. Tab. 2), si miscela e si incuba 2 minuti; dopodichè si aggiunge 1 ml di soluzione fisiologica (NaCl 0,9%). Infine si misura fotometricamente a 470 nm. Il bianco viene preparato seguendo la stessa procedura escludendo però il DTT.

Soluzione Stock

Soluzione Finale Rapporto di diluizione

CoCl2 MW 237,9

~4,2 mM 1 g/l

~0,8 mM 0,2 g/l

1:5

DTT MW 154,24

~9,7 mM 1,5 g/l

~1,6 mM 0,25 g/l

1:6

Tab 2 . Concentrazioni finali, della soluzione stock e il rapporto di diluizione di CoCl2 e del DTT nella metodica descritta da Baghavan e collaboratori.

Tenuto conto della semplicità e della rapidità di esecuzione, si è deciso di utilizzare la procedura secondo Baghavan e collaboratori (2003). 4.2. Materiale 4.2.1 Apparecchiatura Il fotometro utilizzato per la lettura delle estinzioni è il modello PCP 6121 della ditta EPPENDORF (Vaudaux AG, Schönenbuch CH). Considerando che questo fotometro ha delle lunghezze d�onda prestabilite, i campioni sono stati misurati a 492 nm, essendo la lunghezza d�onda che più si avvicinava a quella originale di 470 nm usata da Baghavan e coll. nel 2003. Questo ha introdotto uno spostamento di spettro che probabilmente ha portato ad una leggera ma costante riduzione dell�estinzione su tutti i campioni esaminati, in quanto non sono stati misurati nel picco massimo d�assorbimento.

Figura 4. Fotometro EPPENDORF PCP 6121

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4.3. Preparazione dei reagenti e delle soluzioni stock 4.3.1 Tampone fosfato 12 mmol/L a pH 7.3 Volume finale: 1 l. In un pallone tarato si sono versati 25 ml di tampone PBS (INOVA Diagnostics, San Diego, USA; lotto: 532185) concentrato 40 volte e si è portato a 1 litro con soluzione fisiologica (NaCl 0,9 %). 4.3.2 Soluzione di CoCl2 1 g/L Volume finale: 100 ml. Si sono pesati 100 mg di CoCl2 (Sigma-Aldrich, Steinheim, D; lotto: 033k3506) in un pallone tarato e si è portato a volume con acqua demineralizzata (NOION AQUA ultra pura, Renggli, Rotkreuz, CH). 4.3.3 Soluzione di DTT 1,5 g/L (C4H10O2S2) Volume finale: 100 ml. Si sono pesati 150 mg di DTT (Fluka Chemie, Buchs, CH; lotto: 454558/1) in un pallone tarato e si è portato a volume con tampone fosfato a pH 7.3. Dalle misure ottenute con gli standard di albumina (paragonando le estinzioni ottenute usando il reagente fresco e il reagente preparato e tenuto in frigo a 4 °C per 20 giorni) ci si è accorti che questo reagente è instabile in quanto va incontro ad un�ossidazione che porta ad una non formazione del complesso colorato con il cobalto. Per rallentare il processo ossidativo si è deciso di preparare una soluzione stock di DTT 10 volte più concentrata (15 g/L), aliquotarla, congelarla a -30 °C e poi diluirla al momento del bisogno. Inoltre, per avere un controllo sulla stabilità del DTT, prima di fare delle misure il reagente è stato provato su dei campioni già determinati e venivano poi confrontate le estinzioni (1 misura di prova su due diversi campioni). 4.3.4 Soluzione madre di albumina 60 g/L Volume finale: 10 ml. L�albumina utilizzata è una HSA (Human Serum Albumin) con una purezza del 96-99 % della ditta Sigma-Aldrich (Steinheim, D; lotto: 045k7535). Si sono pesati in un becher tarato 600 mg di albumina, si è aggiunto delicatamente qualche goccia di tampone e con un magnete si è fatto sciogliere lentamente l�albumina evitando la formazione di schiuma. Si è continuato ad aggiungere tampone finché l�albumina sia stata sciolta completamente e si è lasciato girare col magnete per circa 1 ora. Infine si è trasferito la soluzione di albumina in un cilindro graduato e si è portato a volume. Per evitare la crescita batterica la soluzione di albumina è stata filtrata sotto cappa sterile. Usando una siringa sterile la soluzione è stata aspirata lentamente evitando la formazione di schiuma, dopodichè è stata spinta fuori facendola passare attraverso un filtro avente dei pori di dimensione 0,8/0,2 µm e un diametro di 25 mm (Acrodisc, Pall Corporation, South Wagner Road, USA); infine la soluzione è stata raccolta in una provetta anch�essa sterile. 4.3.5 Soluzione standard di albumina concentrata 50 g/L. Si sono pipettati 1,67 ml di soluzione madre di albumina 60 g/L e si sono aggiunti 0,33 ml di tampone. 50 / 60 * 2 ml = ~1,67 ml 4.3.6 Soluzione standard di albumina concentrata 40 g/L. Si sono pipettati 1,33 ml di soluzione madre di albumina 60 g/L e si sono aggiunti 0,67 ml di tampone.

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40 / 60 * 2 ml = ~ 1,33 ml 4.3.7 Soluzione standard di albumina concentrata 30 g/L Si è pipettato 1 ml di soluzione madre di albumina 60 g/L e si è aggiunto 1 ml di tampone. 30 / 60 * 2 ml = 1 ml Le soluzioni standard sono state aliquotate e congelate a -30 °C e a -80 °C per consentire ulteriori misure e valutare così l�azione della temperatura di conservazione e dello scongelamento sul test. 4.4. Raccolta dei campioni I campioni di siero sono stati ottenuti dai vari Reparti di degenza dell�ospedale Civico di Lugano e dal Cardio Centro Ticino. I campioni sono stati lasciati coagulare per 20-30 minuti, centrifugati a 2000 g (3500 rpm) per 10 minuti con una centrifuga Eppendorf 5810R (Amburgo, D) e poi conservati a -30 °C per un intervallo di tempo minimo di due giorni fino a tre settimane massimo, dopodichè sono stati lasciati scongelare a temperatura ambiente (20-30 minuti), miscelati con un vortex e poi usati per le determinazioni. I campioni di controllo (provenienti da pazienti senza sintomo d�ischemia) sono stati scelti dalla ruotine giornaliera del laboratorio. Essi provenivano dai diversi Reparti e si presentavano con una Troponina I normale (< 0,10 µg/L) e una concentrazione di albumina nei limiti considerati normali dal laboratorio dell�Ospedale Civico di Lugano (35-50 g/L). Gli individui in questo gruppo sono costituiti da 20 donne (59 %) e da 14 maschi (41 %) in età compresa tra 17-85 anni. Da questo gruppo si sono esclusi i campioni provenienti dal reparto di nefrologia e oncologia, in quanto patologie renali e tumori possono causare un incremento di IMA e quindi dei falsi positivi (Apple et al, 2005). I campioni dei pazienti con sospetta ischemia del miocardio sono invece stati ottenuti dal Reparto di Pronto Soccorso dell�Ospedale Civico di Lugano e dal Cardio Centro Ticino. Alcuni sono stati raccolti con la collaborazione del Pronto Soccorso che suggeriva i pazienti che sospettava, dai segni clinici, essere dei soggetti a rischio per un ischemia. Altri invece sono stati scelti in base all�innalzamento dei marcatori cardiaci, soprattutto la Troponina I. Il gruppo ischemico è risultato essere costituito da 3 donne (33 %) e da 6 uomini (67 %) in età compresa tra 52-80 anni.

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Campione Cong. -30 °C Scongelamento Mixare Min 2-Max 21 giorni

200 µl siero 1 ml NaCl 0.9% 50 µl DTT 1,5 g/L 50 µl CoCl2 1 g/L Misura 5 minuti 2 minuti 10 minuti Estinzione a 492 nm Figura 5. Schema riassuntivo sui passaggi della pre-analitica e della misura del test 4.5 Programmi statistici I calcoli statistici sono stati effettuati con programmi: - Anayse-it (versione 1.73; Analyse-it Software Ltd; UK) - SYSTAT 11 (SYSTAT Software Inc; Richmond, USA) - Microsoft Office Excel 2003 (11.6355.6408, Microsoft Corporation, USA)

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5. RISULTATI E DISCUSSIONE 5.1. Risultati ottenuti con gli standard di albumina

Sol. albumina in t. fosfato a -80 °C

100

150

200

250

300

350

400

30 40 50 60Albumina (g/L)

Est

inzi

one

a 49

2 nm

E (5')E (10')E (15')E (25')

Fig 6. Estinzione degli standard di albumina conservati a -80 °C in funzione del tempo

Nella figura 6 si può osservare la curva standard ottenuta con le soluzioni di albumina sciolte in tampone fosfato a pH 7.3 e conservate per 20 giorni a -80 °C. In ascissa è data la concentrazione di albumina e in ordinata i valori di estinzione a 492 nm in funzione del tempo (vedi legenda). Come si può osservare nella figura 6, la retta è quella di una reazione indirettamente proporzionale, in quanto ad una concentrazione bassa di albumina (30 g/L) si registra un segnale alto, mentre ad una concentrazione alta di albumina (60 g/L) il segnale è più basso. Ciò è dovuto al fatto che, nel campione più concentrato, l�albumina lega una quantità maggiore di cobalto: si ha quindi meno cobalto in soluzione che può reagire con il DTT al momento del suo inserimento nella provetta a formare il complesso colorato. Un�altra considerazione che si può fare osservando la figura 6 è che la reazione non è stabile in funzione del tempo: l�estinzione che si misura dopo 5, 10, 15 e 25 minuti aumenta a causa di una cinetica propria della reazione. Questo fatto ha portato come conseguenza ad una modifica del protocollo di lavoro, in quanto da quello originale (Baghavan e coll. 2003) non dava nessuna informazione in questo senso.

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PROTOCOLLO ORIGINALE

PROTOCOLLO ADATTATO

200 µl di siero

200 µl di siero

50 µl di CoCl2 1 g/l ! 10 minuti

50 µl di CoCl2 1 g/L ! 10 minuti

50 µl di DTT 1,5 g/l ! 2 minuti

50 µl di DTT 1,5 g/L !2 minuti

1 ml soluzione fisiologica

1 ml di soluzione fisiologica ! 5 minuti

misura 470 nm

musura a 492 nm

Tab 3. Confronto tra protocollo originale e protocollo adattato

Sol albumina in t. fosfato a -30°C

100

150

200

250

300

350

400

30 40 50 60

Albumina (g/L)

Est

inzi

one

a 49

2 nm

E (5')E (10')E (15')E (25')

Fig 7. Estinzione degli standard di albumina conservati a -30 °C in funzione del tempo

Nella figura 7 si può osservare la curva standard ottenuta con le soluzioni di albumina sciolte in tampone fosfato a pH 7.3 e conservate per 20 giorni a -30 °C. In ascissa è data la concentrazione di albumina e in ordinata le rispettive estinzioni in funzione del tempo (vedi legenda). Anche in questo grafico troviamo una curva che indica una reazione a segnale inversamente proporzionale tra i valori di estinzione e la concentrazione di albumina.

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Confronto sol. albumina -30 °C/ sol. albumina -80 °C

100

150

200

250

300

350

30 40 50 60

Albumina (g/L)

Estin

zion

e a

492

nm

E (5') -30 °CE (5') -80 °C

Fig 8. Confronto delle estinzioni degli standard di albumina conservati a -30 °C con le estinzioni degli standard di albumina conservati a -80°C

Nella figura 8 sono rappresentate le due curve standard ottenute con le soluzioni di albumina conservate a diversa temperatura a confronto. In ascissa troviamo la concentrazione di albumina, mentre in ordinata troviamo le rispettive estinzioni misurate dopo 5 minuti. Con il grafico rappresentato nella figura 8 si voleva provare come la temperatura influenzasse il test; come si può notare, esistono delle differenze di estinzione tra la soluzione di albumina conservata a -30 °C e quella conservata a -80 °C. Si può ipotizzare che il motivo di queste differenze riguardino l�integrità dell�albumina, in quanto nella fase di congelamento e di scongelamento la proteina subisce degli stress fisico-chimici che portano ad una sua denaturazione, con un conseguente legame ridotto con il cobalto in soluzione. Si può quindi supporre che questi stress subiti dall�albumina (che portano al cambio conformazionale) siano di varia intensità a dipendenza della sua temperatura di congelamento. Le prove sperimentali eseguite sugli standard sono anzitutto servite a stabilire le modalità di esecuzione del test manuale prima di effettuare delle modifiche al protocollo di lavoro in base ai risultati ottenuti e infine di impratichirsi prima di passare ai campioni di controllo e a quelli patologici.

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5.2. Risultati ottenuti con i campioni di controllo Prima di passare ai risultati è importante fare la premessa che questo lavoro è uno studio particolare per le seguenti ragioni: 1. il metodo in quanto tale non esiste in routine e, a nostra conoscenza, non è usato per il momento né in Ticino né in Svizzera; 2. il metodo è di natura sperimentale per i seguenti motivi: - poca conoscenza della natura del fenomeno biologico che porta al legame tra Co2+ e albumina - difficoltà legate alla cinetica del processo e al ruolo dei rispettivi reagenti - un test sperimentale di questo tipo ha bisogno di essere verificato su un alto numero di controlli (pazienti senza patologia cardiaca) ma soprattutto su un gran numero di casi conclamati (patologia cardiaca con chiari segni clinici, di ecocardiogramma e/o di marcatori biochimici). Per tutta questa serie di ragioni il numero di dati raccolti, e quindi la possibile rilevanza biochimica e/o clinica dello studio sono purtroppo state fortemente limitate fornendo solo delle indicazioni procedurali per ulteriori esperimenti.

Tab 4. Risultati dei campioni di controllo

Numero [Albumina] [Troponina I] Estinzione 1 a 492 nm

Estinzione 2a 492 nm Media

1 38.6 < 0,10 540 508 524.02 45.0 < 0,10 369 395 382.03 45.7 < 0,10 422 395 408.54 33.9 < 0,10 568 546 557.05 40.4 < 0,10 533 605 569.06 37.3 < 0,10 563 485 524.07 41.9 < 0,10 400 498 449.08 48.3 < 0,10 314 367 340.59 46.6 < 0,10 432 482 457.0

10 46.4 < 0,10 282 294 288.011 35.7 < 0,10 327 316 321.512 31.2 < 0,10 560 525 542.513 30.5 < 0,10 543 529 536.014 44.1 < 0,10 570 510 540.015 38.1 < 0,10 725 810 767.516 45.9 < 0,10 560 578 569.017 45.2 < 0,10 744 675 709.518 42.1 < 0,10 548 510 529.019 45.6 < 0,10 462 485 473.520 33.2 < 0,10 780 760 770.021 43.8 < 0,10 695 620 657.522 43.9 < 0,10 605 535 570.023 44.5 < 0,10 334 290 312.024 50.4 < 0,10 353 390 371.525 40.3 < 0,10 525 580 552.526 49.3 < 0,10 355 380 367.527 49.3 < 0,10 424 415 419.528 41.3 < 0,10 461 465 463.029 43.7 < 0,10 457 447 452.030 47.6 < 0,10 415 422 418.531 40.7 < 0,10 513 500 506.532 39.1 < 0,10 593 560 576.533 45.0 < 0,10 438 441 439.534 41.9 < 0,10 480 450 465.0

Simona Astorino

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Fig 9. Distribuzione delle estinzioni ottenuti dal test ACB per i pazienti non ischemici in funzione dell�albumina

Nella figura 9 è rappresentato il grafico che mette in relazione l�estinzione del complesso Co2+-albumina (ordinata) e la concentrazione dell�albumina (ascissa). Si può osservare la retta della componente principale con ellisse di probabilità al 68%, la cui larghezza ci mostra la dispersione dei dati. Come si può osservare sia nella figura 9 che nella figura 10, ritroviamo la pendenza negativa che sta ad indicare la reazione inversamente proporzionale che si era già riscontrata con gli standard di albumina.

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Fig 10. Distribuzione dei risultati ottenuti per i pazienti ischemici e non ischemici attorno ad una retta di regressione non parametrica

Tab 5. Tabella riassuntiva dei dati, del loro rispettivo ρ di Spearman e del suo intervallo di confidenza al 95 % Nella figura 10 si può osservare la retta di regressione non parametrica dei campioni esaminati (n=43). In ascissa è indicata la concentrazione di albumina espressa in g/L e in ordinata la media delle estinzioni misurate in doppio. Per creare questo grafico si è usato come metodo di regressione quello di Passing & Bablock (i dati sono sostituiti dai loro ranghi nella serie2). Osservando ancora il grafico si può affermare che la relazione tra il complesso Co2+- albumina e la concentrazione di albumina è, come atteso, di tipo inversamente proporzionale. Gli n=43 dati sperimentali misurati mostrano tuttavia una dispersione delle misure la cui ragione non è facilmente spiegabile. Bisogna però ricordare che valori aumentati di IMA si riscontrano in pazienti con cancro, infezioni, malattie renali, malattie epatiche e ischemie cerebrali (Apple et al, 2005).

1 Coefficiente di correlazione per dati con sospetta distribuzione non-normale. 2 Il dato viene sostituito da un valore che indica la sua posizione in una serie.

Dati

N ρ di Spearman1 Intervallo di Confidenza 95%

Tutti i dati N=43 - 0,574 -0,75 � -0,33 Dati dei controlli N=34 - 0,533 -0,74 � -0,24 Dati dei campioni patologici

N=9 - 0,883 -0,98 � -0,53

Distribuzione dei dati attorno ad una retta di regressione

y = -20.952x + 1395.7

250

350

450

550

650

750

30 35 40 45 50

Albumina g/L

Med

ia e

stin

zion

e (4

92 n

m)

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Non conoscendo la storia clinica di ogni paziente e non conoscendo nei dettagli il fenomeno che porta alla modifica conformazionale dell�albumina, questa grande dispersione dei dati è di difficile interpretazione. Tuttavia i dati ottenuti da pazienti patologici danno una correlazione negativa (reazione inversamente proporzionale) migliore che non i dati dei controlli (vedi Tab 5), anche se con N=9 l�insicurezza statistica è molto alta. 5.3. Risultati ottenuti con i campioni di pazienti con sospetta cardiopatia ischemica

Numero [Albumina] [Troponina I] Estinzione 1 Estinzione 2 Media

1 38.9 2.68 597 564 580.50 2 42.8 < 0.10 451 474 462.50 3 50.2 < 0.10 351 349 350.00 4 46 0.47 480 489 484.50 5 49.4 1 474 471 472.50 6 38.3 6.26 646 580 613.00 7 38.8 3.65 604 550 577.00 8 39.5 1.04 609 603 606.00 9 42.7 0.35 517 582 549.50

Tabella 6. Risultati dei campioni provenienti da pazienti con sospetta patologia cardiaca

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Estinzione dei complessi Co2+-Albumina

200

300

400

500

600

700

800

Controllo Patologico

Tipo di campione

Estin

zion

e a

492

nm

Fig 11. Distribuzione dei risultati provenienti dai campioni di controllo confrontati a quelli provenienti dai campioni patologici

Il grafico comparativo descrittivo rappresentato nella figura 11 mette a confronto le estinzioni dei complessi Co2+- albumina dei campioni di controllo (N = 34) con quelle dei campioni patologici (N = 9). In ascissa è dato il tipo di campione, mentre in ordinata è data l�estinzione misurata a 492 nm. La figura mostra che, pur nei limiti del numero dei dati esaminati, il gruppo dei dati patologici mostra una tendenza verso un�estinzione maggiore del complesso Co2+- albumina. Dal grafico si nota dalla mediana che, nei dati dei campioni patologici, tende ad essere più alta rispetto ai dati dei campioni di controllo. Questo va in direzione di quanto messo in evidenza da Baghavan et al. (2003) con 92 campioni di controllo (pazienti senza ischemia) e, rispettivamente, 75 campioni patologici (pazienti con ischemia conclamata). La figura 11 indica inoltre che gli intervalli di confidenza sono piuttosto ampi a causa del ridotto numero di dati patologici. Risulta quindi senz�altro necessario ripetere queste determinazioni con un numero molto maggiore soprattutto di campioni patologici e rispettando strettamente le condizioni sperimentali: conservazione dei campioni, tempi dati dal protocollo di lavoro, preparazione e conservazione delle soluzioni stock.

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Relazione tra Troponina I ed estinzione del complesso Co2+-Albumina

y = 46.882Ln(x) + 533.47R2 = 0.6545

300

350

400

450

500

550

600

650

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00Troponina I (ug/L)

Estin

zion

e de

l com

ples

so C

o2+-

Alb

umin

a (4

92 n

m)

Fig 12. Distribuzione dei dati ottenuti dai campioni patologici attorno ad una curva logaritmica.

Il grafico rappresentato nella figura 12 mette in relazione la concentrazione di Troponina I espressa in µg/L (ascissa) e l�estinzione del complesso Co2+- albumina misurata a 492 nm (ordinata). Dalla figura 12 si può notare che la relazione positiva tra la quantità di complesso Co2+- albumina (estinzione) e la concentrazione di Troponina I sembra suggerire che i due marcatori indicano ambedue il danno ischemico. La relazione tra i due parametri potrebbe essere di tipo logaritmica. Con circa il 65 % della relazione spiegata dai dati sperimentali (R2= 0.6545) vi è da notare che il complesso Co2+- albumina rivela questo danno a tempi brevi mentre invece per la Troponina I bisogna attendere tempi più lunghi. Va rilevato tuttavia che il periodo di tempo tra il momento del danno ischemico, l�ottenimento del campione e il suo congelamento non sono stati rilevati.

Simona Astorino

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6. CONCLUSIONI

I risultati ottenuti con campioni di controllo (pazienti senza segni d�ischemia) e con campioni patologici (pazienti con sospetta cardiopatia ischemica) vanno in direzione di quanto ottenuto da Baghavan et al nel 2003: l�albumina quando passa da un tessuto ischemico (in questo caso il miocardio) cambia la sua conformazione modificando il suo sito di legame al terminale NH2 legando di meno ioni di transizione. L�importanza clinica di questo fenomeno è che sembra avvenire, come già detto, nei primi minuti che seguono l�evento ischemico per tornare alla normalità entro 5-6 ore, e ciò prima di qualsiasi altro marcatore di danno cellulare. Il presente lavoro ha comunque messo in evidenza la necessità di lavorare sotto strette condizioni sperimentali che, se non rispettate, modificano rapidamente le misure ottenute. Ciò è particolarmente dovuto all�instabilità delle soluzioni di DTT, della cinetica di reazione e dell�influenza del substrato (stabilità dell�albumina) sui risultati sperimentali. Il test ACB potrebbe essere di grande utilità nel reparto di Pronto Soccorso come analisi di �Point of Care�, venendo in supporto alla clinica e all�ECG come test d�urgenza al letto del paziente per delle diagnosi differenziali. Tuttavia la sua sensibilità e specificità ancora chiaramente da definire, nonchè la scarsa conoscenza dei fenomeni che portano alla modifica in vivo del terminale amminico, fanno dell�ACB un test non ancora applicabile in un laboratorio di routine ospedaliera. Va inoltre messo in evidenza che considerato le difficoltà ottenute nella raccolta dei campioni (nel reparto di Pronto Soccorso si prediligono campioni di plasma eparina per le analisi d�urgenza), dalla difficoltà nell�allestire il test e dalla scarsa conoscenza del fenomeno, il test ACB deve poter essere testato su molti più campioni di controllo ma, soprattutto, su molti più campioni patologici.

Simona Astorino

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7. RINGRAZIAMENTI

Vorrei qui ringraziare le seguenti persone: - il Dr. Marco Balerna che, con il suo aiuto e i suoi preziosi consigli, ha permesso la realizzazione di questo lavoro di diploma; - il laboratorio di fertilità di Locarno che mi ha messo a disposizione tempo e spazio per le misure e che ha permesso che usassi il fotometro per diversi mesi; - il capolaboratorio dell�Ospedale Civico di Lugano Marcello Niosi per la sua disponibilità, per il suo aiuto nell�allestire il test e nella raccolta dei campioni; - il laboratorio LIC di Bellinzona che mi ha messo a disposizione i reagenti e mi ha concesso lo spazio e gli strumenti per prepararli; - il direttore della SSMT di Locarno Andrea Boffini e le insegnanti Daniela Marcacci e Marci Sonja per il supporto metodologico. - l�insegnante Susan Gilbert per l�aiuto nel redigere l�abstract

Simona Astorino

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8. LETTERATURA

Apple S. F. et al./ Future Biomarkers for Detection of Ischemia and Risk Stratification in Acute Coronary Syndrome. Clinical Chemistry 2005, 51:5, 810-824 Bar-Or David et al./ Characterization of the Co2+ and Ni2+ binding amino-acid residues of the N-terminus of human albumin. Eur. J. Biochem. 2001, 268: 42-47 Bhagavan V. N. et al./ Evaluation of Human Serum Albumin Cobalt Binding Assay for the Assessment of Myocardial Ischemia and Myocaridial Infarction. Clinical Chemistry 2003, 49:4 581-585 Christenson H. R. et al./ Characteristics of an Albumin Cobalt Binding Test for Assessment of Acute Coronary Syndrome Patients: A Multicenter Study. Clinical Chemistry 2001, 47:3 464-470 Fagan Gary J. et al./ The Albumin Cobalt Binding Test: Analytical Performance of a New Automated Chemistry Assay for the Detection of Ischemia Modified Albumin (IMA). Journal of Clinical Ligand Assay 2002, 25:2 178-187 Lippi Giuseppe et al./ High-workload endurance training may increase serum ischemia-midified albumin concentrations. Clinical Chemistry 2005, 43:7 741-744 Morrow D. A. et al./ The search for a Biomarker of Caridiac Ischemia. Clinical Chemistry 2003, 49, 537-539 Sinha M. K. et al./ Role of � Ischemia Modified Albumin�, a new biochemical marker of myocaridial ischemia, in the early diagnosis of acute coronary syndromes. Bm Journals 2004, 21: 29-34 Van der Zee P. M. et al./ Ischemia-Modified Albumin Measurement in Synptom-Limited Ewercise Myocardial Perfusion Scintigraphy Reflect Serum Albumin Cencentrations but Not Myocardial Ischemia. Clinical Chemistry 2005, 51: 1744-1746 Anatomia e Fisiologia, Thibodeau Gary A., Patton Kevin T., Casa Editrice Ambrosiana, III edizione 2000, 588-590 http://www.medicinenet.com/heart_attack/article.htm http://www.en.wikipedia.org/wiki/Myocardial_infarction http://www.emedicine.com/EMERG/topic327.htm http://it.wikipedia.org/wiki/Infarto_del_miocardio Figura in copertina: www.immaginarioscientifico.it/ita/archivi/cartoline/meb_3.htm Figura 1: www2.hawaii.edu/~chungeun/hsa5.jpg Figura 2: www.en.wikipedia.org/wiki/Image:Heart_attack_diagram.png Figura 3: www.ischemia.co.kr