Aislamiento de plásmidos. Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su...
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Transferencia de material genético II Aislamiento de plásmidos
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Transferencia de material genético II
Aislamiento de plásmidos
Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación del DNA
Realizar el aislamiento de DNA plasmídico
Objetivos
Estructura del ADNJames Watson y Francis Crick en 1953
demostraron que la estructura del ADN consiste en una doble hélice formada por dos cadenas.
DNA
La extensión de DNA que tiene cada organismo no es la misma.
El DNA a pesar de su extensión tiende a formar una estructura helicoidal compacta.
DNA
Doble hélice Estabilizada por
puentes de hidrógeno
En la célula generalmente superempacada o superenrollada
Estructura del DNA
Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez.
Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas
DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado.
Superenrrollado: Covalentemente cerrado y muy empacado
Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior pero un poco menos empacado
Conformaciones de un plásmido
Conformaciones distintas del DNA: Superenrollamiento
El superenrollado es más compacto y por tanto migra más rápido en el gel
Pero como vemos el superenrollamiento?
Abierto Relajado
Superenrollado
1. Induce cambios locales en el DNA que desestabilizan la doble cadena y esto afecta la transcripción o cambia la unión de proteínas al DNA.
2. Induce cambios globales en el DNA, los cual hace que secuencias de DNA distantes se acerquen y facilita la compactación del DNA y la recombinación sitio específica
¿Cómo afecta el superenrollamiento del DNA a la función de la célula?
DNA estructura helicoidal◦ Estructura estabilizada
por puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas (A=T; G≡C)
Superenrollamiento Desnaturalizar-
Renaturalizar: Romper y rehacer puentes de hidrógeno
Puentes de hidrógeno en el DNA
DNA se puede desnaturalizar
Calor, pH,↑ iones
se eliminan sus puentes de hidrógeno.
EFECTO HIPERCRÓMICO
Al monitorear su absorbencia a 260 m se observa que hay un aumento en está conforme alteramos o despegamos la doble hélice EFECTO HIPERCRÓMICO
Tm Temperatura
a la cual el 50% del DNA se encuentra en la forma desplegada.
El DNA se puede volver a re-naturalizar.
Hay que hacerlo en condiciones suaves para que el apareo de bases sea el correcto.
De no ser así se pueden producir agregados fácilmente precipitables.
La re-naturalización
Paso 1: Lisis celular
Generalmente se realiza con detergentes lleva detergentes para solubilizar la membrana
Obtención del plásmido
Paso 2: Precipitación de proteínas y desnaturalización del DNA
Se perturban los puentes de hidrógeno entre cadenas
Se añade generalmente NaOH
Obtención del plásmido
Paso 3: Renaturalización del DNA
Se neutraliza el pH de la solución y se renaturaliza el DNA, PERO NO TODO!!!
Obtención del plásmido
Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias del DNA plasmídico circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente.
En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solución y la fidelidad de la reasociación es substancialmente diferente para ambas macromoléculas.
Fundamento Lisis alcalina
Continuación... Paso 4: Separación del
DNA cromosomal del DNA plasmídico y su purificación
El DNA cromosomal está agregado y al centrifugar se queda en el botón
El DNA renaturalizado se queda en la solución, el sobrenadante
El experimento
Una vez que se tenga el plásmido purificado entonces:
A. Correr una muestra en un gel de agarosaB. Medir la absorbancia a 260 nm.C. Estimar la concentración.D. Guardar a –20°C para usar en la próxima
sesión
Cuantificación
Ensayo de restricción (2 h incubación de DNA con enzimas)
Corrimiento electroforético: Gel de agarosa (aprox 45 min)
Inducción de proteína recombinante (Alcanzar DO 0.6 en 1.5h; inducción 1.5h)
Corrimiento electroforético: Gel de poliacrilamida (45 min)
Siguiente sesión experimental
Continuamos con:
Preparación de un gel de agarosa para el corrimiento electroforético del plásmido y los productos de restricción
