Transferencia de material genético Aislamiento de plásmidos.
AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS
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AISLAMIENTO DEPLÁSMIDOS
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ESTRUCTURA DEL ADNJames Watson y Francis Crick en 1953
demostraron que la estructura del ADN consiste en una doble hélice formada por dos cadenas.
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El ADN es un ácido nucleico formado por nucleótidos.
Cada nucleótido consta de tres elementos:
• Un azúcar: desoxirribosa• Un grupo fosfato• Una base nitrogenada (adenina
(A), guanina (G), citosina (C) y timina (T))
Los extremos de cada una de las hebras del ADN son denominados 5’-P (fosfato) y 3’–OH (hidroxilo) en la desoxirribosa
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Se replican independientemente del cromosoma del hospedero
Portan SOLO genes no esenciales Pueden ser circulares o lineales, de 1
kbp hasta de 1 Mbp Se encuentran superenrrollados,
que es la forma más compacta que existe de DNA
Se pueden encontrar desde 1 a 3 copias por célula o hasta 100.
Características de los plásmidos
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Conformaciones de un plásmido Linealizado: Es decir cuando se ha cortado
ambas cadenas del DNA sólo una vez. Parcialmente linealizado: Cuando se ha
cortado el DNA en una de las cadenas DNA relajado circular. DNA que no se ha
empacado. Superenrrolado: Covalentemente cerrado y
muy empacado Superenrollado desnaturalizado. Parecido al
anterior pero un poco menos empacado
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Superenrollamiento plásmido
Existen varias conformaciones de los plásmidos en el estado superenrollado.
Por lo que pueden migrar en un campo eléctrico de manera muy diferente cada uno a pesar de tener el mismo peso molecular
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Hay distintos procedimientos para la purificación de DNA plasmídico, aunque todos incluyen los tres pasos siguientes:
1. Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo de aquellas que llevan el plásmido.
2. Lisis de las bacterias para la liberación del plásmido
3. Purificación del DNA plasmídico
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DESNATURALIZACIÓN ALCALINA O METODO DE LISIS ALCALINA DE BIRNBOIM Y DOLY
Este método se basa en la diferente resistencia a valores de pH elevados del ADN plasmídico y cromosómico.
Explota las diferencias en las propiedades de desnaturalización y renaturalización entre el DNA plasmídico y el DNA cromosómico.
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DesnaturalizaciónLa alcalinización con NaOH en presencia de
un SDS, provoca la lisis celular, la desnaturalización del DNA cromosómico y la liberación de los plásmidos también desnaturalizados.
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Renaturalización
La neutralización del medio en presencia de una concentración alta de sal (acetato potásico), provoca:
A) que se cierre covalentemente el DNA plasmídico
B) y la precipitación del DNA cromosómico (por reasociaciones aleatorias intracatenarias).
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Los agregados insolubles de DNA cromosómico se separan por centrifugación del DNA plasmídico que queda en el sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa
El ADN plasmídico en el sobrenadante se concentra por precipitación con etanol.
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Los tres pasos para obtener el DNA plasmídico
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En la práctica:
1. Inocular 5mL de célulass transformantes en 5mL de medio LB+Kanamicina e incubar a 37◦C durante 12 h aprox.
2. Centrifugar el medio a 10000rpm por 1min a 4◦C y descartar el sobrenadante. El paquete celular queda en un microtubo.
3. Resuspender en 300µL de soln GTE fría, agitar en vortex e incubar a Tamb por 5min.
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4. Adicionar 300µL de soln de lisis (que contiene?) , mezclar por inversión e incubar en hielo por 5min.
5. Adicionar 300µL de soln fría de acetato de potasio (3M,pH=4.8) y mezcla por inversión e incubar en hielo por 5min.
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6. Centrifugar a 12000 rpm por 5min a 4◦C.7. Transferir sobrenadante a un tubo, adicionar
volumen igual de isopropanol frío e incubar por 20min a -20◦C.
8. Centrifugar a 12000 rpm por 5min a 4◦C.9. Eliminar sobrenadante y lavar con 1mL de etanol al
70%.10. Centrifugar a 12000 rpm por 5min a 4◦C11. Decantar sobrenadante y eliminar sobrante por
evaporación a Tamb.
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12. Resuspender con 30µL de agua estéril y guardar a -20◦C.
13. Cuantificar concentración mediante absorbancia a 260nm (considerar unidad de absorbancia=50µg/mL).
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BIBLIOGRAFIA
Cercenado Emilia, Procedimientos en Microbiología Clínica “ Métodos moleculares de tipificación epidemiológica en bacteriología”, SEIMC, http://www.clinicaelnazareno.org/biolab/sistema/archivos/18.%20metodos%20moleculares%20de%20tipificacion%20epidemiologica.pdf