Adenovirüs serotip 5 ve adenovirüs serotip36’nın Colo-320 hücre hattında adipojenik

etkilerinin gösterilmesi

Tamer Şanlıdağ1, Sinem Akçalı1, Seda Vatansever2, Candan Çiçek3,Murat Sayan4, Elçin Kal Çakmaklıoğulları1, Pınar Taşkıran Şen1

1. Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji AD, Manisa.2. Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji AD, Manisa.3. Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji AD, İzmir.4. Kocaeli Üniversitesi Tıp FakültesiHastanesi Merkez Laboratuvarı PCR Ünitesi, Kocaeli.

Adenovirüs serotip 5 (Ad-5) ve serotip 36’nın (Ad-36)(ATCC VR-1610) adipojenik etkilerinin Colo-320 hücre

hattında histokimyasal, immünohistokimyasal veelektron mikroskobik yöntemlerle gösterilmesi

Amaç

Adenovirüs serotip 5 (Ad-5) ve serotip 36’nın (Ad-36)(ATCC VR-1610) adipojenik etkilerinin Colo-320 hücre

hattında histokimyasal, immünohistokimyasal veelektron mikroskobik yöntemlerle gösterilmesi

Adenovirüs serotip 5 (Ad-5)- Hayvan obezitesiyle ilişkili – solunum yolu izolatı

Adenovirüs serotip 36 (Ad-36)- İnsan obezitesiyle ilişkili – Standart suş [ATCC VR-1610]

Adenovirüs serotip 8 (Ad-8)- Kontrol suşu – göz sürüntüsü izolatı

Gereç ve Yöntemler-1

Serotipler

Adenovirüs serotip 5 (Ad-5)- Hayvan obezitesiyle ilişkili – solunum yolu izolatı

Adenovirüs serotip 36 (Ad-36)- İnsan obezitesiyle ilişkili – Standart suş [ATCC VR-1610]

Adenovirüs serotip 8 (Ad-8)- Kontrol suşu – göz sürüntüsü izolatı

Gereç ve Yöntemler-2

Hücre hattı: Colo-320

• Hızlı üreme özelliği

• Barsak epitel hücre kökenli

• Proliferasyonlarının dışetkenlerden etkilenmemesi

• Hızlı üreme özelliği

• Barsak epitel hücre kökenli

• Proliferasyonlarının dışetkenlerden etkilenmemesi

• COLO-320 Primer insan kolon karsinomu hücre hattı(HTL95027, Interlab Cell Line Collection, Genova, Italy)

Medium:• RPMI-1640• %10 FCS• 2 mM L-glutamin

• %1 penisilin-streptomisin

10 gün (2 günde bir vasat değişimi) kültürHücreler konfluent olduktan sonra 6 gözlü plaklara pasaj

Gereç ve Yöntemler-3Hücre kültürü

• COLO-320 Primer insan kolon karsinomu hücre hattı(HTL95027, Interlab Cell Line Collection, Genova, Italy)

Medium:• RPMI-1640• %10 FCS• 2 mM L-glutamin

• %1 penisilin-streptomisin

10 gün (2 günde bir vasat değişimi) kültürHücreler konfluent olduktan sonra 6 gözlü plaklara pasaj

• COLO-320 Primer insan kolon karsinomu hücre hattı(HTL95027, Interlab Cell Line Collection, Genova, Italy)

• Ad-5, Ad-36 ve Ad-8 stok (10-4 dilüsyon)

200’ er μl inokülasyon

37 0C’ de %5 CO2’li ortamda 1 saat inkübasyon

Gereç ve Yöntemler-4İnokülasyon• COLO-320 Primer insan kolon karsinomu hücre hattı

(HTL95027, Interlab Cell Line Collection, Genova, Italy)

• Ad-5, Ad-36 ve Ad-8 stok (10-4 dilüsyon)

200’ er μl inokülasyon

37 0C’ de %5 CO2’li ortamda 1 saat inkübasyon

Süre sonunda hücreler;

Medium:• MEM• %10 FCS• 2 mM L-glutamin• %1 penisilin-streptomisin• %1 HEPES• % 0.1 gentamisin• % 0.4 Amfoterisin B

İçeren vasata alındıKültürün 1. ve 2. hf.larında histokimyasal,

immünohistokimyasal ve elektron mikroskobik analiz içinhücreler toplandı

Gereç ve Yöntemler-5İnokülasyonSüre sonunda hücreler;

Medium:• MEM• %10 FCS• 2 mM L-glutamin• %1 penisilin-streptomisin• %1 HEPES• % 0.1 gentamisin• % 0.4 Amfoterisin B

İçeren vasata alındıKültürün 1. ve 2. hf.larında histokimyasal,

immünohistokimyasal ve elektron mikroskobik analiz içinhücreler toplandı

Gereç ve Yöntemler-6Histokimya-Oil Red boyama

• % 4’ lük paraformaldehit 30 dk (fiksasyon)

• Agar (%2)• Rutin parafin takip• 5 µm’lik kesitler• Oil Red’le boyama

• % 4’ lük paraformaldehit 30 dk (fiksasyon)

• Agar (%2)• Rutin parafin takip• 5 µm’lik kesitler• Oil Red’le boyama

Gereç ve Yöntemler-7İmmünohistokimya-Leptin boyama

• % 4’ lük paraformaldehit 30 dk (fiksasyon)• % 3 lük hidrojen peroksit (H2O2) 5 dk• Permeabilizasyon için % 0.1 lik Triton-X 100 ile 15 dk• 1 saat bloking• Anti-leptin (Invitrogen, USA) 1 gece inkübasyon• İkincil antikorlar (85-9043, Histostain Kit, Zymed)

– Biotinlayted IgG (30 dk)– Streptavidin (30 dk)

• Diaminobenzidine (DAB) 5 dk• Olympus BX40 ile incelendi.

• % 4’ lük paraformaldehit 30 dk (fiksasyon)• % 3 lük hidrojen peroksit (H2O2) 5 dk• Permeabilizasyon için % 0.1 lik Triton-X 100 ile 15 dk• 1 saat bloking• Anti-leptin (Invitrogen, USA) 1 gece inkübasyon• İkincil antikorlar (85-9043, Histostain Kit, Zymed)

– Biotinlayted IgG (30 dk)– Streptavidin (30 dk)

• Diaminobenzidine (DAB) 5 dk• Olympus BX40 ile incelendi.

Gereç ve Yöntemler-8Elektron mikroskopi

• % 2.5 gluteraldehit 4 saat (fiksasyon)• % 1 osmik asit 1,5 saat (fiksasyon)• Agar• Epon 812• Yarı ince: Toluidin mavisi• İnce: Uranil asetat-kurşun sitrat• DEU Tıp Fakültesi Carl-Zeiss TEM-900 Elektron

mikroskopta incelendi(Doç. Dr. Alper Bağrıyanık, Dr. Serap Cilaker Mıcılı )

• % 2.5 gluteraldehit 4 saat (fiksasyon)• % 1 osmik asit 1,5 saat (fiksasyon)• Agar• Epon 812• Yarı ince: Toluidin mavisi• İnce: Uranil asetat-kurşun sitrat• DEU Tıp Fakültesi Carl-Zeiss TEM-900 Elektron

mikroskopta incelendi(Doç. Dr. Alper Bağrıyanık, Dr. Serap Cilaker Mıcılı )

Bulgular-1Colo 320 sitopatik etki

1. hafta

Bulgular-2Fotoğraf 1. Ad-36 ile infekte Colo-320 hücrelerinin Oil Red boyalı

preperatları

Oil Red

Boyama

Ad-36

Oil Red

Boyama

Bulgular-3Fotoğraf 2. Ad-5 ile infekte Colo-320 hücrelerinin Oil Red boyalı

preperatları

Oil Red

Boyama

Oil Red

Boyama

Ad-5

Bulgular-4Fotoğraf 3. Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinin Oil Red boyalı

preperatları

Oil Red

Boyama

Oil Red

Boyama

Ad-8

Bulgular-5Fotoğraf 4. Ad-36 ile infekte Colo-320 hücrelerinin immünohistokimyasal

boyalı preperatları

Leptin1. Hafta 2. Hafta

Ad-36 Ad-36

Bulgular-6Fotoğraf 5. Ad-5 ile infekte Colo-320 hücrelerinin immünohistokimyasal

boyalı preperatları

1. Hafta 2. Hafta

Ad-5 Ad-5

Leptin

Bulgular-7Fotoğraf 6. Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinin immünohistokimyasal

boyalı preperatları

1. Hafta 2. Hafta

Ad-8 Ad-8

Leptin

Bulgular-8

LV

Fotoğraf 7. Ad-36 ile infekte Colo-320 hücrelerinde lipid vakuollerinin EMgörüntüleri (1. hf)

Elektron mikroskopi

LV LV

LV

LV

LV

LV

Bulgular-9

LV

Fotoğraf 8. Ad-36 ile infekte Colo-320 hücrelerinde lipid vakuollerinin EMgörüntüleri (2. hf)

LV

LV

Elektron mikroskopi

Bulgular-10

Fotoğraf 8. Ad-5 ile infekte Colo-320 hücrelerinde lipid vakuollerinin EMgörüntüleri (1. hf)

Elektron mikroskopi

LV

LV

Bulgular-11

LV

Fotoğraf 9. Ad-5 ile infekte Colo-320 hücrelerinde lipid vakuollerinin EMgörüntüleri (2. hf)

Elektron mikroskopi

Bulgular-12

Fotoğraf 10. Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinde EM görüntüleri (1. hf)

Elektron mikroskopi

Bulgular-13

Fotoğraf 11. Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinde EM görüntüleri (2. hf)

Elektron mikroskopi

Bulgular-14

LV

LV

LV

Fotoğraf 12. Ad-36, Ad-5 ve Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinde EMgörüntüleri

LV

Elektron

mikroskopi

Ad-36

Ad-8 (K)

Ad-5

Araştırmamız sonucunda Ad-5 ve Ad-36 serotiplerinin Colo-320hücrelerinde lipid birikimine neden olarak adipojenik etkigösterdiği tespit edildi.

Çalışmamız, ülkemizde bu alanda yapılmış ilk araştırmaniteliğinde olup, sonuçlarımızın ülkemiz tıp literatürüne önemlikatkılar sağlayacağını beklemekteyiz.

Sonuç

Araştırmamız sonucunda Ad-5 ve Ad-36 serotiplerinin Colo-320hücrelerinde lipid birikimine neden olarak adipojenik etkigösterdiği tespit edildi.

Çalışmamız, ülkemizde bu alanda yapılmış ilk araştırmaniteliğinde olup, sonuçlarımızın ülkemiz tıp literatürüne önemlikatkılar sağlayacağını beklemekteyiz.