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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA
“ACTIVACIÓN Y PRODUCCIÓN DE SUPERFICIES
SILANIZADAS PARA PEINADO MOLECULAR DE ADN”
Autor: Ana Joseth Rivera Quinteros
Informe Final de Investigación para optar por el Título Profesional de:
QUÍMICO
Tutor: Dr. Pablo Bonilla
QUITO, ABRIL 2016
ii
Rivera Quinteros, Ana Joseth. Activación y
producción de superficies silanizadas
para peinado molecular de ADN. Trabajo
de investigación para optar por el título de
Químico. Carrera de Química. Quito: UCE.
92 pág.
iii
DEDICATORIA
Al concluir este trabajo de investigación, mis metas alcanzadas y mis valores adquiridos a
lo largo de mi vida van dedicados a Dios y a mis padres Patricio Rivera y Gladis
Quinteros, quiénes me dieron la vida y han sido el pilar fundamental en mi formación,
amigos incondicionales que han sabido estar en cada momento para guiarme por el camino
del bien.
iv
AGRADECIMINETO
Es muy grato expresar mis agradecimientos a la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Central del Ecuador, la cual me brindó conocimientos en el transcurso de
estos años, mediante profesores, compañeros y amigos.
Un agradecimiento especial a mi tutor Dr. Pablo Bonilla y a mi co-tutora Dra. Ana Poveda,
quién mediante su amistad y conocimiento han sido los guía para culminar este proyecto
como buenos resultados. De igual manera al Dr. Ramiro Acosta y Dr. Klever Parreño que
con su paciencia y experiencia han aportado un granito de arena para el logro de éste
trabajo de investigación.
A mis padres y mi hermana Magali, quienes forman parte de mi vida y que nunca se han
alejado de ella, que siempre han estado ahí para apoyarme en los buenos momentos y
empujarme en los más difíciles para seguir en adelante. A mi sobrino Venhamin que es la
luz y la alegría que me brinda desde el momento que nació. A mi Israel López que desde
hace 4 años ha sido mi apoyo incondicional robándome una sonrisa cada día, mi amigo y
mi compañero inseparable.
A mis grandes amigos Yese, Katherine, María José, Laura, Giss, Angi, Daniela Jaramillo,
Daniela Maldonado, Diego, Francisco, Alejo y Klever. Personas amigables que gracias a la
universidad los he encontrado, ustedes que me han brindado sus conocimientos para
ayudarme a aprender y a culminar ésta carrera. Alegrías, tristezas y locuras que hemos
compartimos formando momentos inolvidables.
v
vi
AUTORÍA INTELECTUAL
APROVACIÓN DEL TUTOR
vii
INFORME DEL TRIBUNAL CALIFICADOR DE LA TESIS
viii
LUGAR DONDE SE REALIZARÁ LA INVESTIGACIÓN
Para la realización del estudio Activación y producción de superficies silanizadas para
peinado molecular de ADN, se procederá a trabajar en los siguientes laboratorios:
El tratamiento de limpieza y producción para la silanización de las superficies se realizará
en el Laboratorio de la unidad de DNA Replication & Genome Instability del Centro
Internacional de Zoonosis de la Universidad Central del Ecuador.
Para la caracterización de hidrofobicidad se realizará en el Laboratorio de Coloides de la
Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.
ix
ÍNDICE DE CONTENIDO
DEDICATORIA ................................................................................................................... iii
AGRADECIMINETO .......................................................................................................... iv
AUTORÍA INTELECTUAL ................................................................................................ vi
APROVACIÓN DEL TUTOR ............................................................................................. vi
INFORME DEL TRIBUNAL CALIFICADOR DE LA TESIS ......................................... vii
LUGAR DONDE SE REALIZARÁ LA INVESTIGACIÓN ............................................ viii
RESUMEN .......................................................................................................................... 17
ABTSTRAC ........................................................................................................................ 18
1. CAPÍTULO I .............................................................................................................. 19
1.1. Planteamiento del problema. ................................................................................. 19
1.2. Formulación del problema .................................................................................... 20
1.3. Hipótesis de trabajo .............................................................................................. 20
1.4. Objetivos ............................................................................................................... 20
GENERAL: ........................................................................................................... 20
ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 21
1.5. Importancia y justificación ................................................................................... 21
2. CAPITULO II ............................................................................................................. 22
2.1. Antecedentes. ........................................................................................................ 22
2.2. MARCO TEÓRICO. ............................................................................................ 23
2.2.1. Peinado molecular ......................................................................................... 23
2.2.2. Limpieza para silanización. ........................................................................... 25
2.2.2.1. Limpieza con soluciones ácidas. ............................................................ 26
2.2.2.2. Limpieza con plasma cleaner. ................................................................ 27
2.2.2.3. Método de limpieza UV/Ozono. ............................................................ 28
2.2.3. Funcionalización de la superficie silanizada. ................................................ 29
2.2.4. Métodos de silanización ................................................................................ 30
x
2.2.5. Superficies hidrofóbicas ................................................................................ 33
2.2.6. Determinación de la hidrofobicidad .............................................................. 33
2.2.7. Medición de ángulo de contacto .................................................................... 36
2.2.8. Método estático de la gota en reposo............................................................. 38
2.3. Marco legal ........................................................................................................... 39
2.3.1. Norma INEN 2266 transporte, almacenamiento y manejo de productos
químicos peligrosos. ..................................................................................................... 39
3. CAPÍTULO III ........................................................................................................... 42
3.1. Tipo de la investigación ........................................................................................ 42
3.2. POBLACIÓN Y MUESTRA. ............................................................................... 42
3.2.1. Población ....................................................................................................... 42
3.2.2. Muestra .......................................................................................................... 42
3.3. Diseño experimental. ............................................................................................ 42
3.3.1. Tratamientos y repeticiones ........................................................................... 44
3.3.2. Caracterización de las variables. .................................................................. 45
3.4. Diseño estadístico. ................................................................................................ 45
3.4.1. Descripción del diseño experimental estadístico ........................................... 45
3.4.2. Análisis de Varianza de DCA. ....................................................................... 47
3.4.3. Pruebas de rangos múltiples en DCA ............................................................ 48
3.5. MATERIALES Y MÉTODO. .............................................................................. 49
3.5.1. Materiales ...................................................................................................... 49
3.5.2. Método ........................................................................................................... 51
4. CAPITULO IV ........................................................................................................... 60
4.1. Resultados ............................................................................................................. 60
4.2. Resultados de pruebas previas. ............................................................................. 60
4.2.1. Resultados de primer ensayo con 5 tiempos diferentes de exposición del (7-
octen-1-il) trimetoxisilano ............................................................................................ 60
4.2.2. Resultados del segundo ensayo. .................................................................... 68
xi
4.3. Resultados de la experimentación. ........................................................................ 71
5. CAPITULO V ............................................................................................................. 80
5.1. Conclusiones. ........................................................................................................ 80
5.2. Recomendaciones. ................................................................................................ 81
6. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 83
7. ANEXOS ..................................................................................................................... 86
7.1. Anexo 1. Metodología de limpieza (pre-silanización) .......................................... 86
7.2. Anexo 2. Metodología de Silanización de cubreobjetos ...................................... 87
7.3. Anexo 3. Metodología post-silanización .............................................................. 88
7.4. Anexo 4. Imágenes de gotas formadas en superficies tratadas a 6h de exposición
de (7-octen-1-il) trimetoxisilano. ..................................................................................... 89
7.5. Anexo 5. Imágenes de gotas formadas en superficies tratadas a 7h de exposición
de (7-octen-1-il) trimetoxisilano. ..................................................................................... 90
7.6. Anexo 6. Imágenes de gotas formadas en superficies tratadas a 8h de exposición
de (7-octen-1-il) trimetoxisilano. ..................................................................................... 91
7.7. Anexo 7. Tabla de distribución de T de Student (Díaz & Fernández, 2007) ..................... 92
xii
ÍNDICE DE FIGURAS.
Figura 2. 1. Representación esquemática de pasos básicos para el peinado molecular del
ADN.. ................................................................................................................................... 24
Figura 2. 2. Funcionamiento de la velocidad del menisco.. ............................................... 25
Figura 2. 3. Equipo de plasma cleaner para eliminar residuos orgánicos. ....................... 27
Figura 2. 4. Trimetoxisilano estructura fundamental de compuestos sintéticos orgánicos
de silicio. .............................................................................................................................. 31
Figura 2. 5. Estructura de compuesto de silano ((7-octen-1-il) trimetoxisilano) utilizado en
el proceso de silanización en fase líquida.. ......................................................................... 31
Figura 2. 6. Estructura y alineación del (7-octen-1-il) trimetoxisilano sobre la superficie
del vidrio.. ............................................................................................................................ 32
Figura 2. 7. Unión de los extremos de las hélices del ADN con los grupos orgánicos de la
superficie silanizada. ........................................................................................................... 33
Figura 2. 8. Imágenes de diferentes ángulos de contacto de una gota de agua sobre una
superficie sólida. .................................................................................................................. 33
Figura 2. 9. Esquema de la representación del ángulo del contacto. ............................... 34
Figura 2. 10. Diferentes Ángulos de contactos A) comportamiento de la gota si la
superficie es hidrofilica y B) comportamiento de la gota si la superficie es hidrofóbica.. . 35
Figura 2. 11. Ángulo de contacto menor a 90°. .................................................................. 35
Figura 2. 12. Ángulo de contacto igual a 90°.. ................................................................... 35
Figura 2. 13. Ángulo de contacto mayor a 90°. .................................................................. 36
Figura 2. 14. Equipo para medición de ángulo de contacto.. ............................................ 37
Figura 2. 15. Equipo de visualización de ángulo de contacto adaptado por un microscopio
y estereoscopio.. .................................................................................................................. 38
Figura 2. 16. Determinación del ángulo de contacto mediante un software. .................... 39
Figura 3. 1. Cámara UV/ozono para eliminar residuos orgánicos, la cual consta de: 1)
caja de vidrio, 2) Tapa, 3) foco de luz UV de 254nm, 4) focos de luz UV de 180nm y 5)
Conducto de entrada. .......................................................................................................... 44
Figura 3. 2. Crear carpeta de archivo de captura. ............................................................. 54
Figura 3. 3. Funcionamiento de estereoscopio modificado ................................................ 54
Figura 3. 4. Mayor definición de gota en el computador ................................................... 55
Figura 3. 5. Forma de capturar la Imagen. ........................................................................ 55
Figura 3. 6. Herramienta Angle Tool en el software IMAGEJ.. ......................................... 56
Figura 3. 7. Selección de OPEN.. ....................................................................................... 57
xiii
Figura 3. 8. Imagen de estudio de IMAGEJ.. ..................................................................... 57
Figura 3. 9 Medición de ángulo de contacto. ..................................................................... 58
Figura 3. 10 Herramienta para obtener valores de ángulo de contacto. ........................... 58
Figura 3. 11.Tabla con valores del ángulo de contacto. .................................................... 59
Figura 4. 1. Comportamiento del ángulo de contacto promedio con respecto a los
diferentes tiempos de exposición en dos experimentaciones diferentes 67
Figura 4. 2. Comportamiento del ángulo de contacto sobre superficies con o sin
tratamiento post-silanización. ............................................................................................. 70
Figura 4. 3. Representación de las medias y de los efectos de los tratamientos en el DCA,
indicando que 𝜏1 = 0,245; 𝜏2 = 1,767; 𝜏3 = −2,012. ................................................... 76
xiv
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 3. 1.Ordenamiento de datos experimentales para el tratamiento estadístico ........... 46
Tabla 3. 2. Tabla de análisis de Varianza ANOVA de DCA ............................................. 47
Tabla 4. 1. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a un
tiempo de exposición de 2 horas y con luz UV de 254nm.
…………………………………………………………………………61
Tabla 4. 2. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a un
tiempo de exposición de 7 horas y con luz UV de 254nm. ................................................. 62
Tabla 4. 3. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a un
tiempo de exposición de 12 horas y con luz UV de 254nm. ............................................... 62
Tabla 4. 4. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a un
tiempo de exposición de 17 horas y con luz UV de 254nm. ............................................... 63
Tabla 4. 5. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a un
tiempo de exposición de 24 horas y con luz UV de 254nm. ............................................... 63
Tabla 4. 6. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a un
tiempo de exposición de 2 horas y con luz UV de 254nm y 180nm. ................................... 64
Tabla 4. 7. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a un
tiempo de exposición de 7 horas y con luz UV de 254nm y 180nm. ................................... 65
Tabla 4. 8. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a un
tiempo de exposición de 12 horas y con luz UV de 254nm y 180nm. ................................. 65
Tabla 4. 9. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a un
tiempo de exposición de 17 horas y con luz UV de 254nm y 180nm. ................................. 66
Tabla 4. 10. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 24 horas y con luz UV de 254nm y 180nm. ............................ 66
Tabla 4. 11. Ángulo de contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados sin
tratamiento pos-silanización. .............................................................................................. 69
Tabla 4. 12. Ángulo de contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados con
tratamiento pos-silanización. .............................................................................................. 69
xv
Tabla 4. 13. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 6 horas. Las imágenes captadas correspondientes a estos
valores se observan en el Anexo 4. ...................................................................................... 72
Tabla 4. 14. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 7 horas. Las imágenes captadas correspondientes a estos
valores se observan en el Anexo 5. ...................................................................................... 72
Tabla 4. 15. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 8 horas. Las imágenes captadas correspondientes a estos
valores se observan en el Anexo 6. ...................................................................................... 73
Tabla 4. 16. Ángulo de Contacto de agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados en
tres tratamientos diferentes. ................................................................................................ 74
Tabla 4. 17. ANOVA del DCA de los tiempos de exposición del (7-octen-1-il)
trimetoxisilano para la formación de cubreobjetos silanizados. ........................................ 76
Tabla 4. 18. Aplicación de la prueba LSD para los diferentes tiempos de exposición del (7-
octen-1-il) trimetoxisilano. .................................................................................................. 78
Tabla 4. 19. Valores de ángulos de contacto en los mejores tiempos de exposición del (7-
octen-1-il) trimetoxisilano, cubreobjetos silanizados de Francia y Cubreobjetos sin
tratamiento. ......................................................................................................................... 79
xvi
ÍNDICE DE ECUACIONES
Ecuación 1 ........................................................................................................................... 26
Ecuación 2 ........................................................................................................................... 26
Ecuación 3 ........................................................................................................................... 26
Ecuación 4 ........................................................................................................................... 28
Ecuación 5 ........................................................................................................................... 28
Ecuación 6 ........................................................................................................................... 29
~ 17 ~
RESUMEN
En el presente trabajo de investigación se estandarizó una metodología para la
activación y producción de superficies silanizadas para peinado molecular de ADN. La
metodología fue realizada mediante la activación de grupos OH de superficies de vidrio
(cubreobjetos) al ser eliminada la materia inorgánica con etanol y materia orgánica por
reacciones de oxidación, mediante la creación de una cámara de UV/ozono con dos
longitudes de onda una a 245nm y otra a 180nm. El proceso de silanización se lo realizó
a tiempos de exposición de 6h, 7h y 8h con (7-octen-1-il) trimetoxisilano/ n-heptano
o,oo3M sobre las superficies activadas. Al trascurrir este tiempo de reacción se eliminó
el exceso de reactivos con heptano y cloroformo. Con el método del ángulo de contacto
se determinó si las superficies son hidrofóbicas y aptas para la técnica de peinado
molecular. Debido a los datos obtenidos se puedo determinar que el tiempo de
exposición del reactivo si influye en la formación de superficies hidrofóbicas, siendo los
mejores resultados a tiempo de 7h.
Palabras clave: (7-octen-1-il) trimetoxisilano, silanización, hidrofóbico, ángulo de
contacto.
~ 18 ~
ABTSTRAC
In the present research work, a method for the activation and production of silanized
surfaces used in DNA combing was standardized. The methodology was performed by
activating OH groups on glass surfaces (coverslips) after eliminating all inorganic and
organic material with ethanol and by oxidation in a UV/ozone chamber with two
wavelengths (245nm and 180nm), respectively. The silanization process was done by
exposing the activated coverslips to (7-octen-1-yl) trimethoxysilane / n-heptane o,
oo3M for 6h, 7h and 8h. After the determined amount of reaction time all excess was
eliminated with heptane and chloroform. With the angle of contact method, we were
able to determine whether the silanized surfaces were apt for DNA combing. Because of
the data we determined that the amount of time that the coverslips are exposed does
have influence on the formation of hydrophobic surfaces, 7h giving the best results.
Key words: (7-octen-1-yl) trimethoxysilane, silanization, hydrophobic, angle of contact
~ 19 ~
1. CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN.
1.1. Planteamiento del problema.
Un reto importante en la investigación biomédica es entender el origen de la
inestabilidad genómica y los mecanismos por los cuales las células eucariotas detectan y
responden al estrés genómico. La inestabilidad genómica juega un papel central en el
desarrollo del cáncer y en otro tipo de enfermedades genéticas entre los cuales destacan
los denominados síndromes de inestabilidad genómica (Conti & Caburet, 2001). Para
poder entender estas alteraciones se han venido realizando varios estudios desde la parte
más central como es el ADN.
“El Centro Internacional de Zoonosis (CIZ) es un centro de excelencia, trans-
disciplinario e interinstitucional, encargado de dar respuesta a los problemas
relacionados con las enfermedades zoonóticas más importantes del país y de la Región
Andina” (CIZ-UCE, 2015). Parte de las investigaciones de este centro van orientadas a
comprender la replicación del ADN y los mecanismos que controlan el mantenimiento
de la estabilidad del genoma, usando la levadura Saccharomyces cerevisiae como
organismo modelo. Actualmente se están realizando esfuerzos para implementar la
técnica del peinado molecular en la unidad de ADN Replication & Genome Instability
(DR&GI) del Centro Internacional de Zoonosis. Esta técnica consiste en colocar fibras
del ADN sobre una placa de vidrio (cubreobjetos) estiradas y alineadas. Para ello es
necesario activar las superficies de vidrio con una solución de silano que hace que la
superficie del vidrio se vuelva hidrofóbica. En paralelo se prepara una solución de
ADN pH 5.6. En estas condiciones los extremos de ADN se encuentran
desnaturalizados, es decir, se rompen los puentes de hidrógeno que unen las bases
nitrogenadas en los pares de bases de los extremos de las fibras, quedando las bases
nitrogenadas en la solución acuosa. Al sumergir la superficie silanizada en la solución
de ADN, las bases nitrogenadas de naturaleza hidrofóbica van a tender a interaccionar
con la superficie silanizada, también de naturaleza hidrofóbica. Cuando se saca el
cubreobjetos a una velocidad lenta y constante, las moléculas del ADN quedan
dispuestas de manera lineal, perpendicular al eje de la fuerza de tracción.
~ 20 ~
Como se ha indicado anteriormente para realizar el peinado del ADN se requieren
cubreobjetos de vidrio silanizados. El problema radica que actualmente ninguna
empresa del País produce este tipo de cubreobjetos y su obtención es cara y limitada.
Alternativamente varios laboratorios a nivel mundial han desarrollado métodos para
poder producir sus propios cubreobjetos de vidrio silanizados. El objetivo de esta tesis
es la estandarización de un método sencillo que permita la producción de cubreobjetos
silanizados para realizar el peinado molecular, en la unidad de DR&GI del Centro
Internacional de Zoonosis a bajos costos. Para determinar que el proceso de silanizado
ha funcionado correctamente, la hidrofobocidad que adquiere la superficie del vidrio
será determinada por el método del ángulo de contacto. Este método consiste en medir
el ángulo de contacto que presenta la gota al colocarse en la superficie silanizada. Si
éste ángulo es 90° se dice que la superficie es hidrofóbica y si el ángulo es menor a 90°
la superficie es hidrofílica (Guard, 2015) (Pérez, 2013).
1.2. Formulación del problema
Para implementar la técnica de peinado molecular de ADN es indispensable
producir cubreobjetos silanizados de bajo costo en el Ecuador, con características de
una alta hidrofobicidad.
1.3. Hipótesis de trabajo
HI: La superficie hidrofóbica en la producción de cubreobjetos silanizados si
depende del tiempo de exposición al reactivo.
Ho: La superficie hidrofóbica de los cubreobjetos silanizados no depende del
tiempo de exposición del reactivo.
1.4. Objetivos
GENERAL:
Producir superficies silanizados con una capa hidrofóbica para la adhesión y
estiramiento de fibras moleculares de ADN, por medio de una limpieza UV/ozono y una
posterior reacción con el (7-octen-1-il) trimetoxisilano/ n-heptano.
~ 21 ~
ESPECÍFICOS
Crear un protocolo de limpieza para eliminar todos los residuos orgánicos e
inorgánicos de la superficie de los cubreobjetos de vidrio, para la posterior
formación de capa hidrofóbica.
Estructurar un método para silanizar la superficie de cubreobjeto de vidrio
determinando cual es el tiempo idóneo de exposición del silano, para la formación
de la mejor capa hidrofóbica y comprobar mediante el valor del ángulo de contacto.
1.5. Importancia y justificación
Una de las funciones de las células es la duplicación de la información genética
contenida en los cromosomas. El ADN está expuesto a una gran variedad de amenazas
que pueden alterar su integridad, por esta razón las células han evolucionado creando
diversos mecanismos para proteger, reparar y replicar el ADN. Cuando estos
mecanismos presentan un fallo se produce una mutación en el ADN que puede conducir
al desarrollo de cáncer y otras enfermedades genéticas. Por ello el estudio de los
procesos de replicación y protección del ADN es de suma importancia (Poveda, por
comunicación personal).
El peinado de ADN, es un proceso que permite la unión de moléculas de ADN
individuales en cubreobjetos de vidrio silanizados, dispuestas de manera lineal. La
característica de los cubreobjetos que permite esta alineación es la hidrofobocidad en la
monocapa creada en la superficial del vidrio por los grupos órgano-silanos que permite
la unión inespecífica de bases nitrogenadas de los extremos desnaturalizados del ADN.
De tal manera que se ha visto una necesidad de producir superficies silanizadas para
proyectos biológicos que se realizaran en el Centro Internacional de Zoonosis
presentando un trabajo multidiciplinario (Schwob, Renty, Coulon, & Gostan, 2009)
~ 22 ~
2. CAPITULO II
MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes.
Para poder llegar al objetivo de esta investigación se ha tomado en cuenta
publicaciones y trabajos similares que aportan con datos y conocimientos muy
importantes con la producción o formación de cubreobjetos silanizados para la
utilización en el peinado molecular el ADN.
Una de las primeras investigaciones que brindarán aportes científicos para éste
estudio es el trabajo que se realizó en ¨Use of DNA Combing for Studying DNA
Replication In Vivo in Yeast and Mammalian Cells, 2009¨estudio realizado por el
investigador Etienne Schwob y sus colaboradores, quienes realizaron un peinado de
ADN de levaduras y de células de mamífero usando cubreobjetos silanizados.
Realizaron un procedimiento de limpieza y activación de las superficies de vidrio con
una cámara UV/ozono, seguida de un procedimiento de adhesión de 7-
octenyltrichlorosilane. Obtuvieron una superficie hidrofóbica con buenas características
del peinado molecular de estos ADN, que han sido comprobada con microscopia,
concluyendo que la limpieza con UV/ozono es un buen método para la formación de
cubreobjetos silanizados (Schwob, Renty, Coulon, & Gostan, 2009)
En el documento: ¨An optimized easy method for preparing silanized surfaces for
FISH and replication mapping on combed DNA fibers¨ realizado por la investigadora
Hélène Labit (2008) y sus colaboradores, describen un método para la formación de
cubreobjetos silanizados en fase líquida utilizando una combinación nueva de silano /
disolvente que es 0,1% (7-octen-1 il) trimetoxisilano en n-heptano. Obtuvieron
cubreobjetos con las características necesarias para el peinado molecular del ADN. Este
nuevo método consiste en limpiar el vidrio con agua y cloroformo, seguido de un ataque
al vidrio con una solución ácida de peróxido de hidrógeno y ácido sulfúrico. Esta
~ 23 ~
solución ayuda a que el cubreobjetos quede totalmente activado con grupos –OH
expuestos que permiten la adhesión del (7-octen-1 il) trimetoxisilano (Labit, 2008).
En el documento: ¨Molecular Combing¨ investigado por Chiara Conti, (2001) y su
colaboradores, produjeron cubreobjetos silanizados mediante una limpieza con una
cámara de UV/ozono activando el vidrio para realizar una quimisorción con 7 –
Octenyltrichlorosilane, formándose la monocapa hidrofóbica. Se obtuvo buenos
resultados de peinado molecular y se comprobó que la limpieza con UV/ozono tuvo una
mejor reacción al colocar el oxígeno medicinal (Conti & Caburet, 2001).
2.2. MARCO TEÓRICO.
Por muchas razones, el ADN ha sido el centro de atención en estudios de genómica
y biomédica. La alineación de ADN en superficies sólidas permite determinar
diferentes aspectos de la replicación. Desde esta perspectiva, las estrategias que nos
permiten inmovilizar y enderezar ADN sobre un sustrato sólido serían de gran valor
(Nazari & Gurevich, 2013). En este trabajo nos centramos en elaborar superficies
silanizadas que presenten una capa totalmente hidrofóbicas para utilizarlas en el ADN
combing.
2.2.1. Peinado molecular
¨Esta técnica fue introducida por primera vez por Bensimon y Cols en 1994, que
también acuñó el nombre de peinado molecular¨ (Bensimon, 1994).
Peinado suele ser definido como un procedimiento en que a ciertas condiciones de
pH y fuerza iónica, las moléculas de ADN están unidos en uno o ambos extremos a la
superficie hidrofóbica y posteriormente alineados por la fuerza de atracción aplicada en
la interfase aire / agua. A pH 5,6 las moléculas de ADN se desnaturalizan o “abren” sus
extremos, quedando expuestas las bases nitrogenadas que forman el núcleo hidrofóbico
de la doble hélice del ADN, para interaccionar con la superficie del vidrio por medio de
~ 24 ~
interacciones de atracción. Una vez que se produzca ésta atracción, se mueve con una
brazo mecánico o menisco la interfase líquido-aire a lo largo del sustrato (cubreobjeto
silanizado) provocando el estiramiento de las moléculas del ADN con uno o los dos
extremos pegados a la superficie, como se puede observar en la figura 2.1. El proceso de
peinado molecular se rige por las fuerzas de tensión superficial existentes en la interfase
aire-agua. Este mecanismo tiene por ventajas el estiramiento de ADN sin la necesidad
de modificar los extremos (Nazari & Gurevich, 2013).
Figura 2. 1. Representación esquemática de pasos básicos para el peinado
molecular del ADN. A) Solución del ADN colocada sobre la superficie silanizada, B)
Se muestra la dirección a donde será estirado el ADN, C) Se comienza a desplazar la
gota de solución, que produce el estiramiento de las fibras de ADN D) Existe la
presencia de fuerzas de adhesión y la fuerza de estiramiento ejercida por el menisco, E)
ADN casi totalmente estirado y F) Se muestra claramente como el ADN queda peinado
en la superficie hidrofóbica. Por Nazari y Gurevich, 2013.
La velocidad del menisco es un movimiento que puede afectar a la calidad de
peinado. Esto podría ser controlado usando diferentes tamaños de un papel de filtro o un
~ 25 ~
aparato accionado por motor (figura 2.2). “Generalmente, la velocidad del menisco en el
rango de 300-500 micras / s es aceptable, pero los estudios sugieren que podría ser
también tan alto como 5 mm / s cuando se utiliza un papel de filtro con un tamaño de
poro de 11 micras a absorber la solución de ADN” (Nazari & Gurevich, 2013).
Figura 2. 2. Funcionamiento de la velocidad del menisco. Por Nazari y Gurevich,
2013.
Cuando el cubre-objetos se saca con una velocidad lenta y constante (v = 300
22micras s-1), el menisco del retroceso extiende las moléculas de ADN ancladas en el
cubreobjetos mediante una fuerza constante y perpendicular sobre ellos. Este rápido
proceso resulta en fibras de ADN reversiblemente fijadas (Labit, 2008).
2.2.2. Limpieza para silanización.
Para que un proceso de silanización se pueda dar correctamente, se debe tomar en
cuenta que la superficie del cubreobjeto debe estar completamente limpia y activada, es
decir, se debe eliminar todo tipo de residuos orgánicos e inorgánicos, para dejar
expuestos los grupos –OH de la estructura molecular del vidrio. De esta manera la
superficie queda activada para posteriores reacciones químicas. Existen varios métodos
de limpieza que eliminan la materia orgánica no deseada entre ellos tenemos: soluciones
~ 26 ~
ácidas, ataque de plasma de descarga de barrera energética y exposición a radiación
UV/ozono.
2.2.2.1. Limpieza con soluciones ácidas.
Uno de los métodos para una extensa limpieza de superficies de vidrio es la
presencia de ácidos fuertes como es la solución piraña que es una mezcla de ácido
sulfúrico 70% (99% p / v) y peróxido de hidrógeno 30% (35% p/ v) (Labit, 2008).
La eficacia de la solución piraña es la eliminación de residuos orgánicos debido a
dos procesos distintos. El primero y más rápido es la eliminación de hidrógeno y
oxígeno como unidades de agua porque la hidratación de ácido sulfúrico concentrado es
termodinámicamente favorable, con una ΔH de -880 kJ / mol, produciendo una ácido
llamado Caro, (ecuación1).
H2SO4 + H2O2 → H2SO5+ H2O (1)
El segundo proceso y más interesante es la eliminación de materia orgánica. La
transformación de deshidratación energéticamente favorable del peróxido de hidrógeno
forma iones hidronio, iones de bisulfato, y, transitoriamente oxígeno atómico,
provocando la eliminación de materia orgánica como CO2 y carbono elemental
(ecuación 2-3) (Biohacking, 2011).
( 2)
( 3)
La limpieza con soluciones ácidas es considerada una solución muy agresiva por
sus reacciones espontáneas e incluso explosivas. El trabajo con estas sustancias debe
realizarse dentro de una campana de ventilación y con todo el equipo adecuado.
~ 27 ~
2.2.2.2. Limpieza con plasma cleaner.
La limpieza con plasma implica la eliminación de impurezas y contaminantes de
las superficies mediante el uso de un plasma de descarga de barrera energética o
dieléctrica (DBD). El plasma es creado a partir de especies gaseosas como: argón,
oxígeno y mezclas como: aire e hidrógeno / nitrógeno. Elimina contaminantes
orgánicos por reacción química con los radicales de oxígeno altamente reactivos y la
ablación por iones de oxígeno energéticos. Existen varios equipos en el mercado que
realizan esta limpieza usando diferentes gases (figura 2.3) (Sung & Seung, 2014)
Figura 2. 3. Equipo de plasma cleaner para eliminar residuos orgánicos. Por Sung &
Seung 2014.
Beneficios de limpieza con plasma
Elimina el uso de solventes químicos, así como el almacenamiento y
eliminación de residuos de disolvente.
Limpieza de las superficies con una porosidad de microescala o microcanales no
adecuados para la limpieza solvente debido a las limitaciones de tensión
superficial.
~ 28 ~
Promueve la adhesión y mejorar la unión a otras superficies.
Prepara la superficie para su posterior procesamiento como deposición de
película o adsorción de moléculas.
Esteriliza y eliminar los contaminantes microbianos en la superficie.
Se puede tratar una amplia variedad de materiales, así como superficiales
complejas: Obleas, sustratos semiconductores (Si, Ge), portaobjetos de vidrio y
sustratos (Harrick, 2015)
2.2.2.3. Método de limpieza UV/Ozono.
“La limpieza UV / ozono es un método eficaz para eliminar una variedad de
contaminantes de las superficies. Es un proceso en seco fácil de usar que es barato de
instalar y operar” (Vig, 1984).
La capacidad de los rayos ultravioleta (UV) para descomponer las moléculas
orgánicas ha sido conocido durante mucho tiempo, pero es sólo durante la última década
que la limpieza de las superficies de UV/ ozono ha sido explorado. Los rayos UV
generan dos longitudes de onda de interés, 184.9 y 253.7 nm. La longitud de onda de
184,9 nm es importante porque es absorbida por el oxígeno, y por lo tanto conduce a la
generación de ozono. La radiación de 253,7 nm no se absorbe por el oxígeno; por lo
tanto, no contribuye a la generación de ozono. Sin embargo, se absorbe por la mayoría
compuestos orgánicos y también por ozono. Por lo tanto, cuando ambas longitudes de
onda están presentes, el ozono es formado y destruido continuamente. Un producto
intermedio de la formación y procesos de destrucción es el oxígeno atómico, que es un
agente oxidante muy fuerte, capaz de destruir o limpiar las impurezas orgánicas
existentes en la superficie del cubreobjeto (ecuación 4 – 5 y 6). La combinación de
longitudes de luz ultravioleta y ozono producen superficies limpias aproximadamente
200 a 2000 veces más rápido que la luz ultravioleta sola o el ozono solo (Vig, 1984)
(Wright & Cairns, 2005).
Ecuaciones de Formación:
𝑂2 + ℎ𝑣 (184,8 𝑛𝑚) → 𝑂 + 𝑂 ( 4)
𝑂2 + 𝑂 → 𝑂3 ( 5)
~ 29 ~
Ecuaciones de destrucción:
𝑂3 + ℎ𝑣 (253,7𝑛𝑚) → 𝑂2 + 𝑂 (𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑓𝑢𝑒𝑟𝑡𝑒) ( 6)
Los contaminantes inorgánicos tales como el polvo y las sales son eliminado con
etanol, metanol o acetona en un procedimiento previo a la limpieza de UV/Ozono,
debido a que la energía UV produce oxígeno atómico que es eficaz en la ruptura de
enlaces netamente orgánicos como: C-H, C-C, C = C, C-O, y C-N (Vig, 1984) (Schwob,
Renty, Coulon, & Gostan, 2009).
En la actualidad existen varios equipos como por ejemplo Low Cost UVO Cleaner
de la marca Jelight que es muy utilizado para producir rápidamente superficies
atómicamente limpias, en aire o en un sistema de vacío, a temperatura ambiente
(Schwob, Renty, Coulon, & Gostan, 2009). Para nuestra producción de superficies
silanizadas se tratará de construir un equipo similar al anterior, en una caja de vidrio
hermética y con adaptación de dos lámparas UV de diferente longitud de onda.
2.2.3. Funcionalización de la superficie silanizada.
En el procedimiento de silanización, la naturaleza del silano usado define el grado
de hidrofobicidad del sustrato que afecta directamente a la fuerza de la interacción del
ADN. Existen varios compuestos se silanos que presentan en sus estructuras grupos
orgánicos que proveen las características de hidrofobicidad, entre ellos tenemos al 7-
octeniltriclorosilano y al (7-octen-1-il) trimetoxisilano que son compuestos con
características de auto-asociación, es decir, tienen unidades moleculares ordenadas que
se forman por la adsorción espontánea (quimisorción) de un surfactante sobre un
substrato. Estos compuestos al quedar unidos con el sustrato presentan una alineación
de sus grupos orgánicos en la superficie del sustrato (Gómez, 2009). A más de
superficies de vidrio o silicio modificados con silanos existen superficies de polímeros
que dan características hidrofóbicas como: poliestireno, polimetilmetacrilato (PMMA),
polidimetilsiloxano (PDMS) que también presenta una alineación en los grupos
terminales siendo estos hidrofóbicos. El peinado molecular también se ha aplicado a los
experimentos realizados en superficies cargadas que van desde vidrio limpio a las
~ 30 ~
superficies modificadas con recubrimientos positivos, incluyendo grupos amino
terminales tales como polilisina y polihistadina, 3-aminopropiltrimetoxisilano y 3-
aminopropiltrietoxisilano, donde la interacción electrostática de la molécula de ADN
con la superficie juega papel importante de unión (Nazari & Gurevich, 2013).
2.2.4. Métodos de silanización
Existen varios métodos de silanización para las superficies, pero los métodos hasta
ahora más reproducibles para el peinado molecular, ha sido la silanización en fase
gaseosa y líquida. “La desventaja de la silanización en fase gaseosa es que requiere unas
condiciones anhidras en incubadoras especializadas, las cuales son difíciles de utilizar
en los laboratorios de biología comunes” (Labit, 2008). Por esta razón en la actualidad
se han venido probando métodos de silanización en fase líquida mejorada y
reproducible usando una combinación nueva de silano – solvente que es posible adquirir
en casi cualquier laboratorio, formando cubreobjetos silanizados muy similares a los
realizados en forma gaseosa.
Silanización en fase líquida.
Generalmente los compuestos de silano son compuestos análogos de los alcanos,
pero derivados del silicio. El trimetoxisilano es la estructura fundamental de
compuestos sintéticos orgánicos de silicio funcional (figura 2.4). Estos compuestos de
silano están sujetos a varias reacciones junto con polímeros de diferentes terminaciones
de enlaces etilénicos los cuales forman varios compuestos con distintas aplicaciones
como: adhesivos, recubrimientos, polímeros orgánicos de silicio modificados, reactivos
hidrogenación, tratamiento de superficies, entre otros (Guang, 2015).
~ 31 ~
CH3 O SiH
O
CH3
O
CH3
Figura 2. 4. Trimetoxisilano estructura fundamental de compuestos sintéticos
orgánicos de silicio. Por Rivera, 2015
En los procesos de silanización en fase líquida se ha determinado por estudios previos y
por sus propiedades de adhesión (Labit, 2008) que uno de los compuestos que mejor
resultado han dado es el (7-octen-1-il) trimetoxisilano, debido a su estructura de la
posición de sus grupos orgánicos insaturados y sus características de durabilidad,
flexibilidad y adherencia mecánica y química (figura 2.5). Al presentar grupos
orgánicos insaturados muestra una estructura hidrofóbica siendo no polares y por lo
tanto no son capaces de realizar enlaces de puentes de hidrógeno.
CH2Si
OCH3
OCH3
OCH3
Figura 2. 5. Estructura de compuesto de silano ((7-octen-1-il) trimetoxisilano)
utilizado en el proceso de silanización en fase líquida. Por Rivera, 2015.
Una mono o multicapa de moléculas de silano se adhiere sobre el cubreobjetos de
vidrio exponiendo un grupo vinilo, al ser llevados por un medio de solución de n-
heptano (figura 2.6). La diferencia de tamaño entre el n-heptano disolvente y el reactivo
(7-octen-1-il) trimetoxisilano permite crear una competencia entre las dos moléculas
para alcanzar la superficie. Por lo tanto la formación de la alineación del silano sobre la
superficie sigue una reacción de difusión limitada, es decir, que se expande a lo largo
del espacio activo del vidrio. (Labit, 2008). La perfecta combinación de composición
~ 32 ~
química y arquitectura o topografía de la superficie consigue que al colocar una gota de
agua no moje la superficie sino que sea repelida por ella, demostrando así un
comportamiento hidrofóbico.
Figura 2. 6. Estructura y alineación del (7-octen-1-il) trimetoxisilano sobre la
superficie del vidrio. Por Rivera, 2015.
La alineación del compuesto (7-octen-1-il) trimetoxisilano permite que los grupos
orgánicos queden totalmente expuestos para la producción de una interacción con los
núcleos hidrofóbicos (bases nitrogenádas) de la doble hélice del ADN (figura 2.7).
~ 33 ~
Figura 2. 7. Unión de los extremos de las hélices del ADN con los grupos orgánicos
de la superficie silanizada. Por Rivera, 2015
2.2.5. Superficies hidrofóbicas
El término hidrofóbico se aplica a aquellas sustancias que son repelidas por el agua
o que no se pueden mezclar con ella. Un producto con propiedades super-hidrofóbicas y
oleo fóbicas, cuya tecnología le permite repeler prácticamente cualquier líquido, aceite,
agua, barro e incluso cemento líquido, son repelidos totalmente sin posibilidad de
interactuar. El producto crea una barrera que impide que el líquido penetre o se adhiera
a algún poro de los materiales (Stgo, 2013).
2.2.6. Determinación de la hidrofobicidad
Las mediciones de ángulos de contacto es un método fiable para caracterizar la
interacción entre un líquido y una superficie, y por tanto determinar la hidrofobicidad
(Diaz, 2011). El ángulo de contacto se define como el ángulo que forma la superficie de
un líquido con una superficie sólida (figura 2.8). “Su valor depende principalmente de
la relación existente entre las fuerzas adhesivas que se presentan en la interfase entre el
líquido y el sólido y las fuerzas cohesivas del propio líquido” (Teran, 2013).
Figura 2. 8. Imágenes de diferentes ángulos de contacto de una gota de agua sobre
una superficie sólida. Por Fralis, 2011.
~ 34 ~
El ángulo formado entre la interfaz sólido/líquido y la interfaz líquido/vapor, cuyo
vértice está donde las tres interfases se encuentran, constituye el ángulo de contacto
(figura 2.9).
Figura 2. 9. Esquema de la representación del ángulo del contacto. Por Díaz 2011
Una superficie en la cual la gota forma un ángulo de contacto mayor que 90°, es
una superficie hidrofóbica. Esta condición implica que la mojabilidad, adhesividad y la
energía superficial del sólido son bajas. En cambio, si la superficie es hidrofílica, se
observará un ángulo de contacto menor a 90° y tanto la mojabilidad, adhesividad como
la energía superficial del sólido serán altas (Figura 2.10) (Diaz, 2011).
~ 35 ~
Figura 2. 10. Diferentes Ángulos de contactos A) comportamiento de la gota si la
superficie es hidrofilica y B) comportamiento de la gota si la superficie es
hidrofóbica. Por Díaz 2011.
“Ángulo de contacto menor a 90, predominan las fuerzas de adhesión entre el
líquido y el sólido, superficie liófila.
Figura 2. 11. Ángulo de contacto menor a 90°. Por Attension, 2010.
Ángulo de contacto igual a 90°, Las fuerzas adhesivas y cohesivas están en
equilibrio”.
Figura 2. 12. Ángulo de contacto igual a 90°. Por attensión, 2010.
~ 36 ~
Ángulo de contacto mayor a 90°, predominan las fuerzas de cohesión del
líquido, superficie liófoba (Attension, 2010)
Figura 2. 13. Ángulo de contacto mayor a 90°. Por Attension, 2010.
El resultado de tener superficies con un ángulo de contacto entre gota y superficie
superior a 150⁰ y que repelen totalmente el agua es que se obtienen superficies
autolimpiantes, antihumedad, antiadhesión, anticorrosión, resistentes a las manchas y a
la proliferación de organismos (Cañete & Fernández, 2013).
2.2.7. Medición de ángulo de contacto
En el mercado existen varios equipos para la determinación de la físico-química
superficial de diferentes productos. Estos equipos sobrepasan los 15000 dólares
dependiendo de sus características y de la versatilidad que tienen para realizar
determinaciones de ángulos de contacto (Teran, 2013). Existen varios métodos para la
determinación del ángulo de contacto como son los métodos dinámicos y los métodos
estáticos, como su nombre lo indica la diferencia radica que los unos utilizan gotas en
~ 37 ~
movimiento y los otros gotas en reposo. Para una fácil medición esta investigación está
encaminada a la medición estática.
Los equipos generalemnte consisten en un sitema óptico, una unidad de
dosificación automática y un software que permite medir ángulos de contacto entre
líquidos y sólidos (figura 2.11) (Roncero, 2015)
Figura 2. 14. Equipo para medición de ángulo de contacto. Por Roncero 2015.
En la medición de los ángulos de contacto en este trabajo se utilizó un equipo que
ha sido adaptado por un estereoscopio y un microscopio, el cual nos permite adquirir
una buena definición del contorno de la gota de agua sobre la superficie silanizada
(figura 2.12).
~ 38 ~
Figura 2. 15. Equipo de visualización de ángulo de contacto adaptado por un
microscopio y estereoscopio. Por Rivera, 2016.
2.2.8. Método estático de la gota en reposo
En este método las determinaciones se realizan mediante un goniómetro de ángulo
de contacto utilizando un sistema óptico para capturar el perfil de un líquido puro sobre
un sustrato sólido. El ángulo formado entre la interfase sólido/líquido y la interfase
líquido/vapor es el ángulo de contacto. Un sistema más antiguo utilizaba un sistema
óptico de microscopio con luz de fondo. Los sistemas de nueva generación emplean
cámaras de alta resolución y software actualizado para capturar y analizar los ángulos
de contacto.
Mediante este método el ángulo de contacto puede ser medido utilizando
inspección directa. Es la técnica goniométrica más sencilla de realizar, en la cual se
imprime la imagen del perfil de una gota y la superficie del sustrato y la tangente a la
interfase de la gota en la línea de contacto se dibujan utilizando líneas rectas. El ángulo
de contacto es, entonces, medido directamente utilizando un graduador. Un enfoque
alternativo podría ser el uso de software de imágenes digitales y dibujo para trazar la
superficie y la tangente y así poder determinar el ángulo de contacto (figura 2.13)
(Stacy, 2009) (Solano, 2009).
~ 39 ~
Figura 2. 16. Determinación del ángulo de contacto mediante un software. Por Stacy
2009.
2.3. Marco legal
Los productos químicos en su gran mayoría son considerados como productos
peligrosos para la salud humana y el medio ambiente. En este trabajo a realizarse se
tratará con varios productos químicos los cuales deben ser tratados y manejados
adecuadamente, por ello se debe tener en cuenta ciertas normas las cuales e indican a
continuación.
2.3.1. Norma INEN 2266 transporte, almacenamiento y manejo de productos
químicos peligrosos.
Esta norma establece los requisitos y precauciones que se deben tener en cuenta
para el transporte, almacenamiento y manejo de productos químicos peligrosos.
Art. 3.1.22 Producto químico peligroso: Todo producto químico que por sus
características físicoquímicas presentan o pueden presentar riesgo de afección a la salud,
al ambiente o destrucción de bienes, lo cual obliga a controlar su uso y limitar la
~ 40 ~
exposición a él. Producto sólido, líquido o gaseoso que puede ser: explosivo,
inflamable, susceptible de combustión espontánea, oxidante, inestable térmicamente,
tóxico, infeccioso, corrosivo, liberador de gases tóxicos o inflamables, y aquellas que
por algún medio, luego de su eliminación, puedan originar algunas de las características
anteriores.
Art. 6.1.1. Personal: Quienes transporten, almacenen y manejen productos
químicos y materiales peligrosos deben garantizar que todo el personal que esté
vinculado con los productos químicos y materiales peligrosos cuente necesariamente
con los equipos de seguridad adecuados, una instrucción y un entrenamiento
específicos, a fin de asegurar que posean los conocimientos y las habilidades básicas
para minimizar la probabilidad de ocurrencia de accidentes y enfermedades
ocupacionales.
Art. 6.8.1. Identificación del material: Es responsabilidad del fabricante y del
comercializador de productos químicos peligrosos, su identificación y etiquetado de
conformidad con la presente norma. Durante el almacenamiento y manejo general de los
productos químicos peligrosos no se debe mezclar los siguientes productos:
Materiales tóxicos con alimentos o semillas o cultivos agrícolas
comestibles.
Combustibles con oxidantes.
Explosivos con fulminantes o detonadores.
Líquidos inflamables con oxidantes.
Material radioactivo con otro cualquiera.
Art. 6.10.1 Manejo: Será tarea fundamental de todos los involucrados en el
manejo de productos químicos peligrosos el realizar acciones para prevenir accidentes.
Para esto se debe: Identificar y evaluar todos los riesgos, así como las zonas vulnerables
y de mayor fragilidad y determinar un plan de prevención de riesgos, seleccionando
alternativas que lo minimicen y un plan de acción o de actividades para controlarlos.
~ 41 ~
Normas de desechos químicos
Art: 6.11.1.1. Para la aplicación de las tecnologías apropiadas, la empresa debe
establecer su proceso de tratamiento y disposición final, objetiva, alcance, referencia de
normas, responsables, procedimientos, instructivos de trabajo y registro de los mismos
que estarán a disposición de la autoridad competente.
Art: 6.11.1.2 La empresa responsable de los residuos de productos químicos
peligrosos, envases, embalaje y productos caducados, debe establecer el proceso de
tratamiento y eliminación adecuado, considerando el reciclaje como primera alternativa,
basado en las normas vigentes, información técnica de los componentes del residuo a
tratar, caracterización del mismo. La empresa llevará un registro del volumen de los
residuos tratados que estará a disposición de la autoridad competente (INEM, 2000).
~ 42 ~
3. CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
3.1. Tipo de la investigación
La presente investigación tiene un enfoque cuantitativo, ya que se desea determinar
de forma experimental la producción de superficies silanizadas, para ello, seguirá el
nivel de tipo experimental y de campo al trabajar en un ambiente controlado
(Hernández, 2006) (Calderon M. , 2013).
3.2. POBLACIÓN Y MUESTRA.
3.2.1. Población
Debido a que la investigación es de tipo experimental y el objetivo es crear una
metodología nueva, no se tiene una población determinada, ya que los resultados
obtenidos es una mínima fracción del infinito número de análisis que se puede realizar.
3.2.2. Muestra
Para el caso de las muestras a escoger, debido a ensayos previos se ha visto que los
mejor tiempos de exposición son tres 6, 7 y 8 horas. Por esta razón se utilizará 21
cubreobjetos, es decir, se tomará 7 muestras o cubreobjetos por cada tiempo de
exposición al (7-octen-1-il) trimetoxisilano.
3.3. Diseño experimental.
Para el desarrollo de la presente investigación, se realizó la metodología que consta
de 2 grandes etapas para cumplir con los objetivos plantados, a continuación se puede
conocer más afondo sobre estas etapas:
~ 43 ~
En la primera etapa consta de la metodología que se siguió para la activación
superficies silanizadas que para nuestro estudio, estas superficies fueron
cubreobjetos de vidrio. La activación de los grupos OH del vidrio se produjo tras
la extructuración de un protocolo de limpieza creando una caja hermética con
componentes adecuados para su construcción, la que permitiera la eliminación
de residuos orgánicos, de una forma sencilla y eficiente.
En la segunda etapa se realizó una metodología para producir superficies
silanizadas de una manera adecuada y óptima, presentando características
hidrofóbicas al ser expuesta a soluciones acuosas las cuales se determinó
mediante la medición del ángulo de contacto.
Estas dos etapas de desarrollo sobre los cubreobjetos se realizaron con la finalidad
de poder crear una metodología para la formación y función del mismo y que puedan
realizarse por cualquier persona que siga los pasos especificados en la metodología
propuesta.
Ya que en la primera etapa se creó el equipo de activación de cubreobjetos, a
continuación se explicara más detalladamente su construcción.
Construcción de Caja UV/Ozono.
Para la presente investigación se necesitaba un equipo que nos brinde una alta
limpieza de materia orgánica sobre las superficies a tratar. En estudios anteriores como
¨Use of DNA Combing for Studying DNA Replication In Vivo in Yeast and
Mammalian Cells”, (Schwob, Renty, Coulon, & Gostan, 2009), trabajan con un
limpiador UV / ozono (Jelight ref 42-220; lámpara UV 28 W / cm a 254 nm) con
ventilador (BLW200-220) y entrada de ozono (OKL200-4). En éste trabajo diseñamos
un equipo que cumpla esta función y que abarate costos. Para su construcción
utilizamos una caja de vidrio de 60cm de largo, 15cm de alto y 10cm de ancho. En la
tapa se adaptó 3 focos de luz ultravioleta: un foco de 45cm, de longitud 254nm y de
~ 44 ~
15w y los otros dos focos de 20cm, de longitud 180nm y 8w. En la parte derecha
inferior se encuentra un conducto de entrada para el oxígeno industrial, (figura 3.1). Con
el equipo construido para su funcionamiento se adaptó una tela de color negro sobre
todo la caja para evitar que las longitudes de onda traspasen el vidrio y puedan afectar a
la salud del analista.
Figura 3. 1. Cámara UV/ozono para eliminar residuos orgánicos, la cual consta de:
1) caja de vidrio, 2) Tapa, 3) foco de luz UV de 254nm, 4) focos de luz UV de 180nm y
5) Conducto de entrada. Rivera 2016.
3.3.1. Tratamientos y repeticiones
¨El número de tratamientos es determinado por el investigador y depende del
problema particular de que se trata. El número de observaciones por tratamiento (n)
debe escogerse con base en la variabilidad que se espera observar en los datos, así como
en la diferencia mínima que el experimentador considera que es importante detectar.
Con este tipo de consideración n=10 cuando las mediciones tienen poca dispersión y
n=30 cuando las mediciones muestran bastante dispersión¨ (Gutiérrez & Vaca, 2008).
1
2
3
4
5
~ 45 ~
Gracias a análisis previos se obtuvo que los mejores tiempos de exposición del (7-
octen-1-il) trimetoxisilano sobre las superficies de vidrio previamente limpias son los
de 7 horas. Por esta razón se escogió trabajar con 3 tiempos de exposición o
tratamientos los cuales se encuentran alrededor de 7 horas como son 6 horas y 8 horas,
determinando de esta manera cual es el tiempo idóneo para producir cubreobjetos
hidrofóbicos, ya que si es menor el tiempo los gastos son menores. Una vez planteado el
número de tratamiento se siguió a determinar el número de repeticiones por cada
tratamiento. Debido a los costos de los materiales para realizar estos cubreobjetos
silanizados se determinó usar 7 repeticiones por cada tratamiento. Las repeticiones
fueron enumeradas del 1 al 21 y su tratamiento se lo realizó escogiendo números a lazar
para trabajar 7 muestras por día, para poder realizar nuestro diseño estadístico.
3.3.2. Caracterización de las variables.
Variable Independiente
Tiempo de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano
Variable Dependiente
Ángulo de Contacto
3.4. Diseño estadístico.
Se deseaba estandarizar un método para producir cubreobjetos silanizados y
determinar la hidrofobocidad mediante el tiempo de exposición frente al (7-octen-1-il)
trimetoxisilano, para ello se realizó un diseño experimental completamente aleatorizado
(DCA), mediante un análisis de varianza de ANOVA.
3.4.1. Descripción del diseño experimental estadístico
Se realizó un análisis de varianza del diseño completamente aleatorio DCA de un
solo factor (una sola variable) con 3 tratamientos diferentes, determinando la existencia
de diferencias significativas con un nivel de confianza del 95% entre las medias de los
tratamientos utilizando como variable el ángulo de contacto, él cual es respuesta a los
~ 46 ~
diferentes tratamientos de la reacción del (7-octen-1-il) trimetoxisilano sobre la
superficie del cubreobjeto.
Para obtener la respuesta a la variable independiente (ángulo de contacto) se
registró los valores calculados por el programa IMAGEJ en las siguientes tablas.
Tabla 3. 1.Ordenamiento de datos experimentales para el tratamiento estadístico
Ángulo de
contacto (°)
Tiempo de exposición del (7-
octen-1-il) trimetoxisilano (h)
6h 7h 8h
1 8 15
2 9 16
3 10 17
4 11 18
5 12 19
6 13 20
7 14 21
Promedio (°) ------- ------- -------
Desviación
estándar (°) ------- ------- -------
Varianza ------- ------- -------
Donde:
1,2,3……. = número de repeticiones, dando como respuesta ángulo de contacto
(°)
6h, 7h y 8h son los tiempos de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano
(tratamiento).
𝐇𝐨 = 𝐓𝟏 = 𝐓𝟐 = 𝐓𝟑
𝐇𝐚 = 𝐓𝟏 ≠ 𝐓𝟐 ≠ 𝐓𝟑
Donde:
~ 47 ~
T1: tiempo de exposición de (7-octen-1-il) trimetoxisilano a 6h
T2: tiempo de exposición de (7-octen-1-il) trimetoxisilano a 7h
T3: tiempo de exposición de (7-octen-1-il) trimetoxisilano a 8h
3.4.2. Análisis de Varianza de DCA.
Consiste en analizar los cocientes de las varianzas para probar la hipótesis de
igualdad o desigualdad entre las medias debidas a los tratamientos (Tiempo de
exposición de silano).
En el caso de DCA las fuentes de variación principales son las debidas a los
tratamientos y el error aleatorio.
𝜽 = 𝝁 + 𝑻 + 𝜺
𝜺 = 𝑬𝒓𝒓𝒐𝒓
𝑻 = 𝒕𝒓𝒂𝒕𝒂𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 (𝒕𝒊𝒆𝒎𝒑𝒐 𝒅𝒆 𝒆𝒙𝒑𝒐𝒔𝒊𝒄𝒊ó𝒏)
Con estas fuentes de variación se obtienen los cuadrados de las sumatorias de las
desviaciones, tanto del tratamiento como del error y se construye una tabla de ANOVA
(Clarichemo, 2009).
Tabla 3. 2. Tabla de análisis de Varianza ANOVA de DCA
Fuente de
variabilid
ad
Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad
Cuadrados
medios
F
calculado
Valor p
Tiempo
𝑆𝐶𝑇𝑅𝐴𝑇
= ∑ 𝑛𝑖(𝜃𝑖. − 𝜃𝑖..) 2
𝑘
𝑖=1
𝑘 − 1 𝐶𝑀𝑇𝑅𝐴𝑇 =
𝑆𝐶𝑇𝑅𝐴𝑇
𝑘 − 1
𝐶𝑀𝑇𝑅𝐴𝑇
𝐶𝑀𝐸
𝑃(𝐹 > 𝐹0)
Error 𝑆𝐶𝐸 = 𝑆𝐶𝑇 − 𝑆𝐶𝑇𝑅𝐴𝑇 𝑁 − 𝑘 𝐶𝑀𝐸 =
𝑆𝐶𝐸
𝑁 − 𝑘
Total. 𝑆𝐶𝑇 = ∑ ∑ (𝜃𝑖𝑗
𝑛𝑖
𝑗=1
𝑘
𝑖=1
− 𝜃..)2
𝑁 − 1
~ 48 ~
Donde:
𝒏𝒊 = 𝑇𝑎𝑚𝑎ñ𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑖 − é𝑠𝑖𝑚𝑜 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜.
𝜽𝒊𝒋 = 𝐿𝑎 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑖 𝑐𝑜𝑛 𝑙𝑎 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 á𝑛𝑔𝑢𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑐𝑎𝑡𝑜 𝑗.
𝜃𝒊. = 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑒𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑖.
𝜃.. = 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑔𝑙𝑜𝑏𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑡𝑜𝑑𝑎𝑠 𝑙𝑎𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑒𝑠.
𝑘 = 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜.
𝑁 = 𝑆𝑢𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑛𝑖 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑡𝑜𝑑𝑜𝑠 𝑙𝑜𝑠 𝑡𝑖𝑚𝑝𝑜𝑠.
Tiempo = tratamiento
3.4.3. Pruebas de rangos múltiples en DCA
Una vez que se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alternativa, se
debe investigar cuales tratamientos resultaron diferentes, o cuales tratamientos
resultados iguales, lo cual se puede realizar con diferentes métodos, uno de ellos es el
método de diferencia mínima significativa (LSD) (Medardo, 2008).
El problema es probar la igualdad de todos los posibles pares de medias con la
hipótesis:
𝐇𝐨 = 𝝁𝒊 = 𝝁𝒋
𝐇𝐚 = 𝝁𝒊 ≠ 𝝁𝒋
El estadístico de pruebas para cada una de las hipótesis dadas es la correspondiente
diferencia en valor absoluto entre sus medias muéstrales |𝜽�� − 𝜽��|. Se rechaza la
hipótesis nula si ocurre:
|𝜽�� − 𝜽��| > 𝒕𝒂𝟐
.𝑵−𝑲 √𝑪𝑴𝑬 {
𝟏
𝒏𝒊+
𝟏
𝒏𝒋} = 𝑳𝑺𝑫
Donde:
𝒕𝒂
𝟐.𝑵−𝑲 = t Student, se lee en las tablas de distribución con N-k grados de libertad.
𝑪𝑴𝑬 = Es el cuadrado medio del error que se obtiene en la tabla de ANOVA.
𝒏𝒊, 𝒏𝒋 = Son las observaciones para los tratamientos i y j
~ 49 ~
Significativo: Cuando el término de la izquierda es mayor a término de la
derecha.
La cantidad del LSD se la llama diferencia mínima significativa, ya que es la
diferencia mínima que debe existir entre dos medias muéstrales para considerar que los
tratamientos son significativamente diferentes.
3.5. MATERIALES Y MÉTODO.
3.5.1. Materiales
Equipos.
Cámara UV/Ozono: Caja de vidrio con tapa hermética de 60cm de largo, 15cm
de alta y 10cm de ancho, adaptada en la parte superior una lámpara UV de
254nm (1x40w/20w, G15t8/15W, 254nm), y dos lámparas UV de 180nm (110-
130V-60Hz). ELECA130-ELECT SOCKET.
Sorbona:
- Modelo:BJPX-D70
- Marca: BIOBASE.
- S/N: ZY31613091610
Procesador de ultrasonido:
- Modelo: GEX 130.
- Marca: DAIGGER-GEN
- S/N: 77002w-09-13.
Estereoscopio modificado.
- Modelo: LABOVAL 4
- Marca: Carl Zeiss Jena
Cámara fotográfica 640x480 VGA
- Modelo: MikrOkular-II.
~ 50 ~
- Marca: BRESSER
CPU clon, mouse, teclado y monitor marca AOpen A55P.
Materiales.
Cubreobjetos de 22 x 22 mm. Marca (LABORGLASS).
Pinza de teflón de 10cm.
3 Vasos de precipitación de 50ml.
3 Vasos de precipitación de 100ml.
Micropipetas de 1- 20ul.
Micropipeta de 20-200ul.
5 Cajas Petri de vidrio.
Caja de plástico de 17cm x 10cm con tapa.
3 cajas de plástico con divisiones pequeñas de 10cm x 3cm.
Desecador
Reactivos
Agua destilada: producida en los laboratorios del CIZ.
Jabón o detergente.
Cloroformo: Chloroform acs iso european pharmacopéia, FR 1000 ML, Sigma-
Aldrich.
Heptano: Heptane Gren Altermative anhydrous al 97%, ESPECTROCROM.
Etanol: ETHYL ALCOHOL ABSOLUTE 99,8% ACS, FR 1000 ML, Sigma-
Aldrich.
Oxígeno Industrial: Tanque de 9,5 m3, LINDE GAS AGA S.A. Ecuador.
(7-octen-1-il) trimetoxisilano: Trimethoxy (7-Octen-1-yl)silane technical al
100%, ESPECTROCROM. (Una vez abierto almacenar en un desecador para
evitar la degradación del reactivo).
~ 51 ~
3.5.2. Método
Para realizar la investigación se realizó en 4 grandes etapas: la primera fue la parte
de la limpieza de la superficie, la segunda la variación de tiempos de exposición del
reactivo silano, la tercera la eliminación del exceso de silano en el vidrio y la cuarta es
la medición del ángulo de contacto.
Para iniciar con los diferentes tratamientos se escogió al azar con la enumeración
indicada en la tabla 3.1, para tratar 7 cubreobjetos por día. La distribución aleatoria se
muestra a continuación.
Día 1: 8 – 20 – 11 – 2 – 18 – 5 – 19.
Día 2: 9 – 7 – 14 – 13 – 17 – 3 – 21.
Día 3: 10 – 12 – 1 – 4 – 6 – 15 – 16.
Cada día se trató 7 cubreobjetos con las 3 primeras etapas, es decir, se procedió a la
pre-silanización, silanización y a la post-silanización, dejando la etapa de la medición
del ángulo de contacto para cuando se ha tratado los 21 cubreobjetos a las diferentes
horas.
A. Metodología de limpieza (pre-silanización)
Para una máxima limpieza de materia inorgánica, se colocó un cubreobjeto
(22x22mm) en un recipiente limpio y se añadió una solución de jabón /agua, con
agitación constante durante 2min.
Se pasó a un vaso de precipitación con 20ml de agua destilada y se pasó
nuevamente a otro vaso de precipitación con 50ml de agua destilada para
eliminar todo el jabón.
Se enjaguó con 10ml de etanol en otro vaso de precipitación.
Se pasó a otro recipiente con 20ml de etanol y se dejó reposar durante 2min.
Se colocó en una superficie limpia y libre de impurezas para dejar secar.
~ 52 ~
Para eliminar la materia orgánica se traspasó dentro de la cámara de UV/Ozono.
Se repitió este proceso con los 7 cubreobjetos escogidos a lazar en el primer día.
Una vez que los 7 cubreobjetos se encontraron dentro de la cámara se cerró la
tapa y por el conducto de entrada se adaptó una bomba y se llevó al vacío.
Muy cuidadosamente se sacó la bomba y se colocó un globo con oxígeno
industrial en el mismo conducto y se prendió los focos de luz UV.
Para que la radiación no se disperse se tapó la caja con una tela negra y se
mantuvo la reacción durante 3 horas. Las imágenes con los pasos se muestran en
el (Anexo 1).
B. Metodología de Silanización de cubreobjetos
Se preparó tres soluciones en tres cajas petri. En cada caja petri se preparó una
solución de (7-octen-1-il) trimetoxisilano al 0,00399 M en heptano.
Se colocó 15ml de heptano y 15ul de (7-octen-1-il) trimetoxisilano en cada caja
de petri.
Se etiquetó cada caja de la siguiente manera: 1) tiempo 6h, 2) tiempo 7h y 3)
tiempo 8h.
Transcurrido el tiempo de la reacción de 3 horas en la cámara UV/Ozono, los
cubreobjetos se sacaron y se transportó hacia las cajas petri según la distribución
aleatoria iniciada anteriormente dejando reaccionar durante las horas
correspondientes.
Una vez culminada la reacción de silanización con una piza de teflón se sacó los
cubreobjetos uno por uno, a las cajas de plástico con divisiones, previamente
etiquetadas con la distribución a lazar.
Se trabajó todo el tiempo dentro de una Sorbona y con la ropa adecuada para
evitar accidentes (Anexo 2).
C. Metodología post-silanización
Para la eliminación del exceso de silano adherido a la superficie del cubreobjeto
se colocó un cubreobjeto dentro de un vaso de precipitación con 20ml de n-
heptano y se llevó al ultrasonido por 5 min.
~ 53 ~
Se traspasó a otro vaso de precipitación con 20ml de cloroformo y se llevó al
ultrasonido por 5 min.
Se guardó nuevamente a la caja de plástico etiquetada con cuidado y a
temperatura ambiente.
Se repitió este proceso con los 7 cubreobjetos (Anexo 3).
Es recomendable colocar las placas dentro de un desecador para que el tiempo
de duración sea mayor.
De esta manera se trató los 21 cubreobjetos en una forma ordenada en los tres
diferentes días.
D. Medición del Ángulo de contacto.
Para el caso de la medición del ángulo de contacto se ocupó “la técnica
goniométrica de gota yacente o “sessile drop” en donde una gota del fluido a analizar es
depositada de forma vertical sobre una superficie de análisis, debido a que ésta técnica
presenta mejores resultados al realizarse con volúmenes pequeños, y así, disminuir
posibles errores generados a causa de deformaciones de la gota por efecto de su tamaño”
(Teran, 2013).
Una vez terminado el proceso de producción de los cubreobjetos silanizados y
guardados adecuadamente en las cajas de plástico y etiquetados uno por uno, se
procedió a la medición del ángulo de contacto mediante un estereoscopio modificado
realizado en el Laboratorio de Coloides de la Facultad de Ciencias Químicas.
Cada cubreobjeto se colocó sobre la platina del microscopio del equipo
modificado y al lente ocular se acopló una cámara fotográfica 640x480 VGA, la
misma que ésta conectada a la computada por medio de un cable USV (Figura
2.12)
En la pantalla del computador se abrió el programa webcam.
Una vez dentro del programa en la parte superior, en el botón “Archivo” se da
clic en “crear la carpeta de archivo captura” (figura 3.2).
~ 54 ~
Figura 3. 2. Crear carpeta de archivo de captura. Rivera, 2016.
Se eligió la carpeta donde se desea guardar las capturas fotográficas
Se prendió el estereoscopio modificado y con una micropipeta se colocó 5ul de
agua bidestilada sobre la superficie del cubreobjeto con mucho cuidado y de tal
forma que la imagen generada en el computador tenga la mayor definición
posible de la gota y de la interfase, para ello se utilizó el lento ocular de 1,6
(figura 3.3 y 3.4).
Figura 3. 3. Funcionamiento de estereoscopio modificado. Rivera, 2016.
~ 55 ~
Figura 3. 4. Mayor definición de gota en el computador. Rivera, 2016.
Se capturó la imagen dando click en la aplicación “captura y snap shot” cómo se
indica en la figura 3.5.
Figura 3. 5. Forma de capturar la Imagen. Rivera, 2016.
En la carpeta de guardar la imagen ya se observa la misma y se procede a
cambiar el nombre por la etiqueta dada anteriormente.
Éste procedimiento se continuó realizando con todos los cubreobjetos tratados.
Una vez que se culminó con la toma de fotografías se procedió a medir el ángulo
de contacto.
Para procesar las imágenes de perfil de la gota se utilizó el software libre
ImageJ, “el cual es un programa Java de procesamiento y análisis de imágenes de
dominio público inspirado por NIH Image para Macintosh. Este programa se puede
~ 56 ~
utilizar online o descargando la aplicación en cualquier computador con un Java 1.5.
Este software puede mostrar, editar, analizar, procesar, grabar e imprimir imágenes
de 8-bits, 16-bits y 32-bits. Puede procesar varios formatos de imágenes incluyendo
TIFF, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS y ‘raw’ ” (Teran, 2013).
Una de las funcionalidades de su software ofrece es el uso de la aplicación
“Angle tool” que se encuentra en la barra de herramientas y que permite determinar
el ángulo que se forma en una interfase (figura 3.6). Por ésta razón se ha
seleccionado éste software ya que es de uso muy fácil y de descarga libre.
Figura 3. 6. Herramienta Angle Tool en el software IMAGEJ. Rivera, 2016.
A continuación se muestra el procedimiento para obtener el valor del ángulo
formado entre el vidrio del cubreobjeto y la solución acuosa.
Dar “click” en la opción “File” en la barra de tareas del programa,
seleccionar la opción “Open” ó “Ctrl+O” como se muestra en la figura 3.7,
abrir la carpeta que contiene las imágenes de las gotas y seleccionar la
imagen que se desea analizar, ésta aparecerá como se observa en la figura
3.8.
~ 57 ~
Figura 3. 7. Selección de OPEN. Rivera, 2016.
Figura 3. 8. Imagen de estudio de IMAGEJ. Rivera 2016.
En la barra de herramientas dar clic en la opción “Angle tool” el cual se presenta
de esta forma. . Con ésta herramienta colocamos el cursor en la foto donde
se observa la superficie del vidrio, se nos despliega unas líneas amarillas y con
el mouse se llevó a la intefase donde se quiere medir el ángulo (Figura 3.9).
~ 58 ~
Figura 3. 9 Medición de ángulo de contacto. Rivera, 2016.
Para obtener el valor del ángulo se da clic en “Analyze” y en “Measure” o “Ctrl
+ M” (figura 3.10) y podemos observar cómo se despliega un nuevo cuadro de
resultados con los valor del ángulo (figura 3.11).
Figura 3. 10 Herramienta para obtener valores de ángulo de contacto. Rivera,
2016.
~ 59 ~
Figura 3. 11.Tabla con valores del ángulo de contacto. Rivera, 2016.
Éste proceso se repite tanto para la medición del ángulo formado a lado
izquierdo como al derecho y de igual manera para las demás repeticiones de los
cubreobjetos tratados, obteniendo una lista con los valores de los ángulos.
Estos valores obtenidos se utilizaron para realizar la estadística planteada.
~ 60 ~
4. CAPITULO IV
ANÁLISIS Y DISCUCIÓN DE RESULTADOS
4.1. Resultados
A continuación se exponen los resultados de la metodología que se utilizó para la
realización de superficies hidrofóbicas mediante un tratamiento con (7-octen-1-il)
trimetoxisilano a diferentes tiempos de exposición, utilizando la comprobación del
ángulo de contacto y comparándolo con superficies tratadas en Francia al tomarlos
como referencia.
Para iniciar la exposición de resultados se ha visto la necesidad de presentar
pruebas previas que se realizaron a cubreobjetos. Se obtuvo información muy
importante para estandarizar la metodología actual.
4.2. Resultados de pruebas previas.
En el transcurso del desarrollo de la parte experimental de la investigación, se
realizó diferentes ensayos como son:
El primer ensayo se trabajó con la metodología descrita anteriormente en el
capítulo 3 apartado 3.5.2., con la diferencia que se hizo reaccionar a 5 tiempos
diferentes.
El segundo ensayo se trabajó para determinar si era o no necesario el tratamiento
de post-silanización de la metodología del apartado 3.5.2.
4.2.1. Resultados de primer ensayo con 5 tiempos diferentes de exposición del (7-
octen-1-il) trimetoxisilano
En estos ensayos previos se realizó dos experimentaciones con el mismo
tratamiento descrito en la metodología del capítulo 3 en el apartado 3.5.2., con la
diferencia que se trabajó a 5 tiempos diferentes de exposición del (7-octen-1-il)
~ 61 ~
trimetoxisilano (2h-7h-12h-17h y 14h) y con 4 repeticiones por cada uno de ellos. La
limpieza de la primera experimentación se realizó con un solo foco de luz UV de 254nm
en la cámara construida, mientras que en la segunda experimentación se utilizó los tres
focos de luz UV con las dos longitudes de onda 254nm y 189nm.
Experimentación 1:
A continuación se muestran los resultados del ángulo de contacto como respuesta a
la reacción de 5 tiempos diferentes (2h-7h-12h-17h y 24h) en la primera
experimentación, es decir, con la luz UV de 254nm.
Tabla 4. 1. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 2 horas y con luz UV de 254nm.
Repeticiones Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio (°)
1 61,475 62,436 61,956
2 60,989 61,216 61,103
3 63,065 62,593 62,829
4 61,015 61,002 61,009
Promedio (°) 61,724
Desviación
estándar (°)
0,851
Varianza 0,724
~ 62 ~
Tabla 4. 2. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 7 horas y con luz UV de 254nm.
Repeticiones Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio (°)
1 89,746 89,333 89,540
2 89,61 90 89,805
3 90,993 90,551 90,772
4 89,105 88,107 88,606
Promedio (°) 89,681
Desviación
estándar (°)
0,891
Varianza 0,794
Tabla 4. 3. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 12 horas y con luz UV de 254nm.
Repeticiones Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio (°)
1 74,612 80,115 77,364
2 79,433 74,16 76,797
3 80,2 76,535 78,368
4 77,312 79,417 78,365
Promedio (°) 77,723
Desviación
estándar (°)
0,778
Varianza 0,605
~ 63 ~
Tabla 4. 4. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 17 horas y con luz UV de 254nm.
Repeticiones Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio (°)
1 80,743 78,139 79,441
2 79,274 80,204 79,739
3 80,789 80,326 80,558
4 80,972 81,447 81,210
Promedio (°) 80,237
Desviación
estándar (°)
0,802
Varianza 0,643
Tabla 4. 5. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 24 horas y con luz UV de 254nm.
Repeticiones
Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio (°)
1 80,794 77,142 78,968
2 78,69 79,592 79,141
3 78,69 77,377 78,034
4 80,27 80,027 80,149
Promedio (°) 79,073
Desviación
estándar (°)
0,867
Varianza 0,751
~ 64 ~
Experimentación 2:
A continuación se muestran los resultados del ángulo de contacto como respuesta a
la reacción de 5 tiempos diferentes (2h-7h-12h-17h y 24h) en la segunda
experimentación, es decir, con la luz UV de 254nm y 180nm.
Tabla 4. 6. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 2 horas y con luz UV de 254nm y 180nm.
Repeticiones Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio (°)
1 64,736 63,963 64,350
2 62,856 64,012 63,434
3 63,975 64,783 64,379
4 64,754 64,643 64,699
Promedio (°) 64,215
Desviación
estándar (°)
0,544
Varianza 0,296
~ 65 ~
Tabla 4. 7. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 7 horas y con luz UV de 254nm y 180nm.
Repeticiones Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio (°)
1 92,073 92,781 92,427
2 91,973 91,539 91,756
3 92,642 92,852 92,747
4 92,843 92,884 92,864
Promedio (°) 92,448
Desviación
estándar (°)
0,497
Varianza 0,247
Tabla 4. 8. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 12 horas y con luz UV de 254nm y 180nm.
Repeticiones Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio (°)
1 79,782 80,013 79,898
2 79,953 79,751 79,852
3 79, 243 80,932 80,932
4 79,623 79,673 79,648
Promedio (°) 80,082
Desviación
estándar (°)
0,577
Varianza 0,333
~ 66 ~
Tabla 4. 9. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 17 horas y con luz UV de 254nm y 180nm.
Repeticiones Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio (°)
1 82,041 81,743 81,892
2 81,274 80,834 81,054
3 81,073 82,326 81,700
4 82,62 82,447 82,534
Promedio (°) 81,795
Desviación
estándar (°)
0,609
Varianza 0,371
Tabla 4. 10. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 24 horas y con luz UV de 254nm y 180nm.
Repeticiones Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio (°)
1 81,163 81,634 81,399
2 80,63 79,952 80,291
3 79,529 80,734 80,132
4 80,803 80,027 80,415
Promedio (°) 80,559
Desviación
estándar (°)
0,572
Varianza 0,327
~ 67 ~
En la gráfica que se presenta a continuación se puede observar como el ángulo de
contacto depende del tiempo de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano sobre la
superficie previamente limpia de materia orgánica e inorgánica en las dos diferentes
experimentaciones.
Figura 4. 1. Comportamiento del ángulo de contacto promedio con respecto a los
diferentes tiempos de exposición en dos experimentaciones diferentes. Por Rivera,
2016.
Con los datos obtenidos del ángulo de contacto a los diferentes tiempos de
exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano (figura 4.1), se puede observar que en las
dos experimentaciones el ángulo de contacto es mayor cuando se trata de un tiempo de
7 horas. En el experimento 1 alcanza un valor de 89,681° y en la experimento 2 alcanza
un valor de 92,448° estos valores nos indican que las superficies son hidrofóbicas a este
tiempo de exposición con (7-octen-1-il) trimetoxisilano, por lo cual es el más adecuado
2; 61,724
7; 89,681
12; 77,723 17; 80,237 24; 79,073
2;64,215
7; 92,448
12; 80,082
17; 81,795 24; 80,559
0,000
20,000
40,000
60,000
80,000
100,000
0 5 10 15 20 25 30
Án
gu
lo d
e co
nta
cto (
°)
Tiempo de exposición de
(7-octen-1-il) trimetoxisilano (h)
Tiempo de exposición de (7-octen-1-il) trimetoxisilano Vs
Ángulo de contacto
Exp1. Luz 254nm
Exp2. Luz 254nm y 180nm
~ 68 ~
para utilizar en la metodología propuesta. Además se observa que a partir del tiempo de
exposición de 12 horas con (7-octen-1-il) trimetoxisilano se muestra un
comportamiento lineal o constante de los valores del ángulo de contacto, esto puede
darse debido a que la formación de multicapas desordenadas no permite la formación de
superficies con comportamientos hidrofóbicos.
Otra observación en esta figura es cómo influye la luz UV en la limpieza de
materia orgánica y por lo tanto en la formación de superficies hidrofóbicas. La curva de
color rojo correspondiente a la experimentación 2 realizada con las dos longitudes de
onda de luz UV adquiere valores más altos que cuando la limpieza de materia orgánica
se realiza solo con una longitud de onda (experimento 1), por tal razón a una mayor
limpieza mayor será la hidrofobicidad de la superficie tratada. Esto se debe a que en el
experimento 1 no existe la formación y destrucción del ozono y del radical oxígeno el
cual es el agente oxidante para eliminar totalmente la materia orgánica y por lo tanto la
activación de los grupo OH no es la adecuada.
4.2.2. Resultados del segundo ensayo.
Uno de los pasos fundamentales de la metodología es la determinación de la
limpieza posterior a la silanización y gracias a la información que se obtuvo del primer
ensayo, que el mejor tiempo de exposición es de 7 horas, el segundo ensayo realizó dos
experimentaciones a éste tiempo y con 7 repeticiones cada una. La primera
experimentación fue determinar los ángulos de contacto sin realizar un tratamiento
posterior a la silanización, mientras, que la segunda experimentación se la realizó con
un tratamiento de limpieza de exceso de (7-octen-1-il) trimetoxisilano con heptano y
cloroformo. A continuación se pueden observar los datos obtenidos.
~ 69 ~
Tabla 4. 11. Ángulo de contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados
sin tratamiento pos-silanización.
Tiempo (h) Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio (°)
1 89,347 89,483 89,415
2 89,294 90,851 90,073
3 90,975 89,842 90,409
4 90,358 90,236 90,297
5 89,471 88,942 89,207
6 89,761 90 89,881
7 89,476 90 89,738
Promedio (°) 89,860
Desviación
estándar (°)
0,443
Varianza 0,196
Tabla 4. 12. Ángulo de contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados
con tratamiento pos-silanización.
Tiempo (h) Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio (°)
1 92,857 91,983 92,42
2 93,746 93,012 93,379
3 91,363 91,745 91,554
~ 70 ~
4 92,834 91,934 92,384
5 93,747 92,154 92,9505
6 91,263 93,674 92,4685
7 91,736 91,783 91,7595
Promedio (°) 92,417
Desviación
estándar (°)
0,631
Varianza 0,398
Figura 4. 2. Comportamiento del ángulo de contacto sobre superficies con o sin
tratamiento post-silanización. Rivera, 2016.
88,500
89,000
89,500
90,000
90,500
91,000
91,500
92,000
92,500
7
89,860
92,473
Án
gu
lo d
e C
on
tact
o (
°)
Tiempo de exposición del
(7-octen-1-il) trimetoxisilano (h)
Ángulo de contacto vs con o sin tratamieno post-
silanización.
Sin tratamiento
Con tratamiento
~ 71 ~
Como se puede observar en el diagrama de columnas (figura 4.2) los valores de los
ángulos de contacto obtenidos sobre las superficies con tratamiento post-silanización
son mucho más altos que los de sin tratamiento post-silanización. Éstos sobrepasan los
90° lo que indica que estas superficies son mucho más hidrofóbicas y por lo tanto
presentar una mayor funcionalidad para el peinado molecular. La diferencia se debe a
que en el tiempo de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano se pueden crear
posiblemente más de monocapa de silano sobre el vidrio determinando que la
superficies no es totalmente lineal y por lo tanto afecta al ángulo de contacto formado
en esta interfase. Cuando el exceso de capas de (7-octen-1-il) trimetoxisilano ha sido
eliminado de la superficie, ésta queda aproximadamente homogénea dejando los grupos
insaturados del (7-octen-1-il) trimetoxisilano en la parte superior de la superficie como
se muestra en la figura 2.6.
Con los datos que se mostraron anteriormente se pudo determinar que los tiempos
adecuados para analizar en la presente investigación deben estar cercanos de 7 horas ya
que el comportamiento de 2 y 12 horas son muy extensos entre sí, por lo tanto se
escogió los tiempos de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano de 6,7 y 8 horas.
4.3. Resultados de la experimentación.
Para expresar los resultados de hidrofobocidad de los cubreobjetos tratados con la
metodología propuesta en el capítulo 3 en el apartado 3.5.2, se lo realizó mediante un
diseño experimental completamente aleatorio (DCA) y prueba de rangos múltiples
como el método de la diferencia mínima significativa (LSD), cuyos resultados han sido
colocados tablas y gráficas que facilitan al observador entender de una forma fácil y
clara.
En las 3 tablas siguientes se muestras los valores de los ángulos de contacto
obtenidos en el programa IMAGEJ al ser tratados a 3 diferentes tiempos de exposición
del (7-octen-1-il) trimetoxisilano (6h, 7h y 8h).
~ 72 ~
Tabla 4. 13. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 6 horas. Las imágenes captadas correspondientes a estos
valores se observan en el Anexo 4.
Repeticiones
Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio
1 92,054 91,318 91,686
2 91,337 91,397 91,367
3 90,659 91,785 91,222
4 91,265 90,954 91,110
5 92,318 91,914 92,116
6 91,762 91,39 91,576
7 91,507 90,063 90,785
Promedio (°) 91,409
Desviación
estándar (°)
0,432
Varianza 0,187
Tabla 4. 14. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 7 horas. Las imágenes captadas correspondientes a estos
valores se observan en el Anexo 5.
Repeticiones Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio
8 93,611 93,24 93,426
9 91,569 92,637 92,103
~ 73 ~
10 93,013 93,574 93,294
11 92,936 92,454 92,695
12 93,576 92,621 93,099
13 93,252 92,42 92,836
14 93,053 93,066 93,060
Promedio (°) 92,930
Desviación
estándar (°)
0,442
Varianza 0,195
Tabla 4. 15. Ángulo de Contacto con agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados a
un tiempo de exposición de 8 horas. Las imágenes captadas correspondientes a estos
valores se observan en el Anexo 6.
Repeticiones Ángulo de
Contacto
Izquierdo (°)
Ángulo de
Contacto Derecho
(°)
Ángulo de
Contacto
Promedio
15 89,409 89,012 89,211
16 88,986 88,963 88,975
17 89,076 90,204 89,640
18 89,063 88,919 88,991
19 88,831 89,157 88,994
20 88,781 90,433 89,607
21 89,045 88,238 88,642
Promedio (°) 89,151
Desviación
estándar (°)
0,363
Varianza 0,132
~ 74 ~
A continuación las tablas 4.16 presenta los valores del ángulo de contacto
promedio entre la interfase vidrio silanizado y agua bidestilada de las 7 repeticiones y
de los 3 tratamientos diferentes (6h -7h - 8h), para proceder a realizar el ANOVA del
DCA.
Tabla 4. 16. Ángulo de Contacto de agua bidestilada sobre cubreobjetos silanizados en
tres tratamientos diferentes.
Tiempo de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano (h)
6h 7h 8h
91,686 93,426 89,211
91,367 92,103 88,975
91,222 93,294 89,640
91,110 92,695 88,991
92,116 93,099 88,994
91,576 92,836 89,607
90,785 93,060 88,642
Promedio (°) 91,409 92,930 89,151
Desviación
estándar (°)
0,432 0,442 0,363
Varianza 0,187 0,195 0,132
~ 75 ~
Debido a que el objetivo de análisis de varianza en el DCA es probar la hipótesis
de la igualdad de los tratamientos con respecto a la media de la correspondiente variable
de repuesta, es decir, si las media de los 3 tiempos de exposición del (7-octen-1-il)
trimetoxisilano son iguales mediante los datos obtenidos del ángulo de contacto, para
esto se planteó las siguientes hipótesis.
𝑯𝒐: 𝝁𝟏 = 𝝁𝟐 = 𝝁𝟑
𝑯𝒂: 𝝁𝟏 ≠ 𝝁𝟐 ≠ 𝝁𝟑
Donde
𝜇1 = Media del tratamiento a 6h
𝜇2 = Media del tratamiento a 7h
𝜇3 = Media del tratamiento a 8h
La cual se puede escribir en forma equivalente como:
𝑯𝒐: 𝝉𝟏 = 𝝉𝟐 = 𝝉𝟑 = 𝟎
𝑯𝒂: 𝝉𝟏 ≠ 𝟎; 𝝉𝟐 ≠ 𝟎; 𝝉𝟑 ≠ 𝟎
Donde 𝝉𝟏, 𝝉𝟐, 𝝉𝟑 es el efecto del tratamiento (tiempo de exposición del (7-octen-1-
il) trimetoxisilano) sobre la variable respuesta (ángulo de contacto). Si se acepta la Ho,
se confirma que los efectos sobre la respuesta de los tratamientos son estadísticamente
nulos, y en caso de rechazar se determina que al menos un efecto es diferente de cero.
Para ello se representó las medias y efectos de los tratamientos que están dados por
𝝉𝒊 = 𝝁𝒊 − 𝝁, en el siguiente gráfico característico del DCA (figura 4.3). Donde 𝝁𝒊 es la
media del tratamiento y 𝝁 es la media global.
~ 76 ~
Figura 4. 3. Representación de las medias y de los efectos de los tratamientos en el
DCA, indicando que 𝝉𝟏 = 𝟎, 𝟐𝟒𝟓; 𝝉𝟐 = 𝟏, 𝟕𝟔𝟕; 𝝉𝟑 = −𝟐, 𝟎𝟏𝟐. Rivera, 2016.
Mediante la figura anterior se determina que se rechaza la Ho, ya que se demuestra
que los tratamientos no son estadísticamente nulos, es decir, los efectos de los
tratamiento son diferentes a cero. Para entender de una mejor manera si los tratamientos
son diferentes entre sí se realizó un ANOVA de DCA.
Tabla 4. 17. ANOVA del DCA de los tiempos de exposición del (7-octen-1-il)
trimetoxisilano para la formación de cubreobjetos silanizados.
Fuente de
variabilidad
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrados
medios
Fo Valor-p
Tratamiento
(tiempo e
exposición del
(7-octen-1-il)
trimetoxisilano
50,613 2,000 25,307 147,768 0,000
Error 3,083 18,000 0,171
Total 53,696 20,000
0,245
1,767
[VALOR DE Y]
-2,500
-2,000
-1,500
-1,000
-0,500
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5
Me
dia
de
án
gulo
de
co
ntc
ato
(°)
Tiempo de exposición del
(7-octen-1-il) trimetoxisilano (h)
Efecto del tiempo de exposición (7-octen-1-il) trimetoxisilano
sobre el ángulo de contacto
Series1
~ 77 ~
Como se muestra el análisis de varianza del cuadro anterior, el valor-p =0,000 es
menor que la significancia prefijada de 𝛼 = 0,05, por lo tanto se rechaza la Ho y se
acepta que al menos un de los tiempos de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano
actúa de diferente manera en el proceso de silanización de cubreobjetos o superficies
hidrofóbicas. Además en la tabla 14 se observa que la variación total en 21 datos de
experimentación fue de 53,696, de la cual 50,613 se deben a los tiempos de exposición
del (7-octen-1-il) trimetoxisilano y 3,083 corresponde al error, el mismo que al ser
ponderado por los grados de libertad es de 0,171. Determinando de esta manera que el
valor de Fo =147,768 es muy alto lo que indica que las diferencias observadas por los
diferentes tiempos de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano son significativas y
que no se debe a pequeñas variaciones muéstrales de factores que no se pueden
determinar directamente.
Una vez que se concluyó que se rechaza la Ho y que si al menos un tiempo de
exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano actúa de diferente manera en la formación
de superficies hidrofóbicas, se determinó cuales tiempos son diferentes entre sí
mediante el método de la diferencia mínima significativa LSD de las pruebas de rangos
múltiples. Para ellos se probó la igualdad de todos los posibles pares de medias con las
hipótesis:
𝐻𝑜: 𝜇1 = 𝜇2; 𝜇1 = 𝜇3; 𝜇2 = 𝜇3
𝐻𝑎: 𝜇1 ≠ 𝜇2; 𝜇1 ≠ 𝜇3; 𝜇2 ≠ 𝜇3
Cálculo del valor del LSD
𝐿𝑆𝐷 = 𝑡𝑎2
.𝑁−𝐾 √𝐶𝑀𝐸 {
1
𝑛𝑖+
1
𝑛𝑗}
Donde el valor del 𝒕𝒂
𝟐.𝑵−𝑲 es obtenido en la tabas de distribución T de Student con N-k,
para nuestro caso es 1,734 con un α =0,05 (Anexo 7).
𝐿𝑆𝐷 = 1,734 √0,171 {1
7+
1
7}
~ 78 ~
𝑳𝑺𝑫 = 𝟎, 𝟑𝟖𝟑
El estadístico de pruebas para cada una de las hipótesis dadas es la correspondiente
diferencia en valor absoluto entre sus medias muéstrales del ángulo de contacto (θ)
|𝜃1 − 𝜃2
|.
Tabla 4. 18. Aplicación de la prueba LSD para los diferentes tiempos de exposición del
(7-octen-1-il) trimetoxisilano.
Diferencia poblacional Diferencia muestral en valor
absoluto
Decisión.
𝝁𝟏 = 𝝁𝟐 *1,521 > 0,383 significativa
𝝁𝟏 = 𝝁𝟑 *2,258 > 0,383 significativa
𝝁𝟐 = 𝝁𝟑 *3,779 > 0,383 significativa
Como todos los valores de las diferencias de medias muestrales son mayores al
valor del LSD se determina que todos los tratamientos son diferentes, es decir, que
todos los tiempos de exposición del (7-octen-1-il) trimetoxisilano si influyen en la
producción de superficies hidrofóbicas de cubreobjetos silanizados. Rechazando la
hipótesis Ho y aceptando la HI planteada en esta investigación.
Por lo tanto se determinó que los mejores tiempos de exposición del (7-octen-1-il)
trimetoxisilano para producir superficies hidrofóbicas en cubreobjetos silanizados son
los tiempos de 6 horas y 7 horas, ya que presenta los valores más altos del ángulos de
contacto formado en la interfase vidrio silanizado-agua bidestilada como se puede
observar en la tabla 4,16. Debido a que los cubreobjetos silanizados producidos en ésta
investigación tienen la funcionalidad de peinado molecular del ADN, se realizó un
comparación entre los ángulos de contacto formados a tiempos de 6h y 7h con
cubreobjetos silanizados importados desde Francia que ya tienen aplicación en el área
bioquímica como es el peinado molecular.
~ 79 ~
Tabla 4. 19. Valores de ángulos de contacto en los mejores tiempos de exposición del
(7-octen-1-il) trimetoxisilano, cubreobjetos silanizados de Francia y Cubreobjetos sin
tratamiento.
Cubreobjetos
tratados a 6h con
(7-octen-1-il)
trimetoxisilano
Cubreobjetos
tratados a 7h con
(7-octen-1-il)
trimetoxisilano
Cubreobjetos
silanizados de
Francia
Cubreobjetos sin
ningún tratamiento.
91,409° 92,930° 93,031° 54,930°
Mediante los valores de la tabla 4.19 podemos observar que la metodología que se
aplicó es muy buena ya que tanto los ángulos de tratamiento de 6h y 7h son muy altos a
comparación de un cubreobjetos normal o que no ha expuesto ningún tratamiento. Otra
observación es que el tratamiento de 7h adquiere un ángulo de contacto (92,930°) que se
acerca al valor del ángulo de contacto (93,031°) de los cubreobjetos silanizados en el
país de Francia (tomado como referencia). Mediante ésta observación se puede
determinar que la mejor metodología para formar cumbreobejtos silanizados con
funcionalidad para peinado molecular es la que se trata a 7h con (7-octen-1-il)
trimetoxisilano, sobre superficies totalmente limpia y posterior tratamiento de
eliminación de excesos de reactivo.
~ 80 ~
5. CAPITULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. Conclusiones.
Se concluye que se produjo superficies con buenas capas hidrofóbicas con (7-
octen-1-il) trimetoxisilano/ n-heptano, tras una minuciosa metodología, las
mismas que fueron comprobadas mediante la comparación de ángulos de
contacto con superficies silanizadas tomadas como referencia (Francia),
determinando así que las características de los cubreobjetos tratados en Ecuador
y en Francia son similares. Por ésta razón se confirma que los cubreobjetos
tratados en esta investigación tienen aplicaciones para el desarrollo del peinado
molecular de ADN.
Se creó un protocolo para la eliminación de residuos orgánicos de la superficies
de vidrio, mediante la construcción de una cámara UV/Ozono, la cual está
provista de tres focos de luz UV: un foco que presenta una radiación de luz UV
de 245nm (15w) y los otros dos focos que tiene una radiación de 180nm (8w).
La combinación de estas dos radiaciones y la entrada de oxígeno industrial
dentro de una caja de vidrio hermética, permite la formación y destrucción del
ozono, dentro del mismo proceso se forma el radical oxígeno el cual es una
agente oxidante muy fuerte eliminando de esta manera a la materia orgánica en
forma de CO2 y dejando a los grupos OH de la estructura del vidrio activados.
Se estructuró una metodología sencilla para producir superficies de vidrio
silanizadas con características hidrofóbicas y a bajos costos. Mediante los
análisis estadísticos se determinó que la mejor metodología a seguir será
mediante una reacción de 7 horas con (7-octen-1-il) trimetoxisilano una vez que
el vidrio presente los grupos OH activos y tras un posterior tratamiento de
eliminación de excesos de reactivo mediante la acción del ultrasonido en
heptano y cloroformo.
~ 81 ~
Se concluye que las superficies hidrofóbicas en la producción de cubreobjetos
silanizados para peinado molecular de ADN sí depende del tiempo de
exposición (7-octen-1-il) trimetoxisilano ya que mediante la comprobación del
ángulo de contacto formado en la interfase vidrio silanizado - agua bidestilada,
medido en un estereoscopio modificado es mayor a 90° cuando se trabajó a 6 y
7 horas, es decir, que se observa claramente que la superficies es hidrofóbica o
que repele a soluciones acuosas al tener fuerzas adhesivas y cohesivas que se
encuentren en equilibrio.
El software IMAGEJ siendo un programa que se los puede descargar libremente,
presentó aplicaciones de forma eficiente para le medición de ángulos de contacto
mediante la herramienta Angle Tool en la presente investigación, que en
conjunto con todo el equipo que se encuentra en el Laboratorio de Coloides la de
Facultad de Ciencias Químicas ha permitido obtener resultados claros, sin
esperar de la utilización de equipos caros y sofisticados.
La obtención se superficies hidrofóbicas con ángulos de contacto mayores a 90°,
requiere de superficies de vidrio completamente limpias. Se comprobó que una
mejor limpieza se da cuando la cámara UV/ozono presenta dos diferentes
longitudes de onda una de 254nm y el otra de 180nm, ya que la combinación del
oxígeno industrial y las dos longitudes de onda, crean el medio de reacción
adecuado para eliminar residuos orgánicos. En la construcción de la cámara
UV/Ozono se utilizó focos de 254 y 180nm muy cercanas a las recomendadas en
el marco teórico (253,7 y 184,9nm). Gracias a los buenos resultados obtenidos
se determinó que esta variación de longitud de onda no influye en la
metodología propuesta.
5.2. Recomendaciones.
Se recomienda probar la técnica de peinado molecular con los cubreobjetos
tratados a 6h y 7h en estudios posteriores, ya que en los dos casos presentan
características hidrofóbicas y determinar así si es conveniente utilizar
~ 82 ~
cubreobjetos silanizados a 6h ya que el tiempo es un recurso muy importante
dentro de una producción y de igual manera los costos serán menores.
Para la disminución de costos y para que la producción sea eficaz se recomienda
la construcción de vasos de precipitación o recipientes de vidrios con pequeñas
separaciones internas para ocupar en el momento de la eliminación de materia
inorgánica con etanol y la eliminación de exceso de reactivo en el ultrasonido
con heptano y cloroformo, ya que se los hace uno por uno alargando el tiempo
de producción.
Con respecto a la seguridad todo el tiempo se recomienda trabajar con el equipo
adecuado, es decir, con mandil, gafas de protección, guantes y bajo una campana
de ventilación, ya que se debe tener cuidado al tratar reactivos químicos.
Se recomienda realizar ensayos con las superficies expuestas al medio ambiente
tras la limpieza de la materia orgánica en la cámara UV/Ozono y hacer
reaccionar con el silano después de unos minutos u horas, debido a que en la
presente investigación este paso se lo realizó de inmediato. Ésta observación
ayudará a determinar si éste factor influye en la formación de superficies
hidrofíbicas, ya que los OH del vidrio pueden volver a inactivarse.
~ 83 ~
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30. Wright, H., & Cairns, W. (18 de Noviembre de 2005). DESINFECCION DE
AGUA POR MEDIO DE LUZ ULTRAVIOLETA. 3020 Gore Road.
Recuperado el 16 de Diciembre de 2015
~ 86 ~
7. ANEXOS
7.1. Anexo 1. Metodología de limpieza (pre-silanización)
Eliminación de materia inorgánica.
Cubreobjetos secándose sobre
superficies de plástico
Eliminación de materia orgánica en
cámara UV/Ozono
~ 87 ~
7.2. Anexo 2. Metodología de Silanización de cubreobjetos
En las dos fotos se
observa la formación de
la solución del (7-octen-
1-il) trimetoxisilano
sobre heptano.
Introduciendo los
cubreobjetos a la
solución de silano.
Proceso de silanización a
diferentes tiempos.
~ 88 ~
7.3. Anexo 3. Metodología post-silanización
Sonicación en Heptano y Cloroformo.
~ 89 ~
7.4. Anexo 4. Imágenes de gotas formadas en superficies tratadas a 6h de exposición de
(7-octen-1-il) trimetoxisilano.
~ 90 ~
7.5. Anexo 5. Imágenes de gotas formadas en superficies tratadas a 7h de exposición de
(7-octen-1-il) trimetoxisilano.
~ 91 ~
7.6. Anexo 6. Imágenes de gotas formadas en superficies tratadas a 8h de exposición de
(7-octen-1-il) trimetoxisilano.
~ 92 ~
7.7.Anexo 7. Tabla de distribución de T de Student (Díaz & Fernández, 2007)