Acidi nucleici – 5

presentazione del prof. Ciro Formica

Immagini e testi tratti dai website di: genome.wellcome.ac.uk, dnaftb.org, unipv.it, unimi.it, wikipedia.it, unibs.it, unina.it, uniroma2.it, nih.gov, zanichelli.it, sciencemag.org

1- La reazione a catena della polimerasi/Polymerase Chain Reaction – PCR2- Gli enzimi di restrizione3- L’estrazione del DNA eucariote

2

DNA polimerasiinnesco stampo allungamento

catenamonomeri

primer template 5’ 3’ dNTP

3

Kary Mullis, USA, 1944-vivente

4

Biochimico USA, Nobel per la Chimica nel 1993 per aver sviluppato e migliorato –nell’83- la tecnica PCR – Polymerase Chain Reaction, che era stata già introdotta da Khorana (Nobel ’68). Ha studiato e lavorato a Berkeley ed è considerato uno scienziato eccentrico.Beliefs (convinzioni): Science, like nothing else among the institutions of mankind, grows like a weed every year.

http://www.karymullis.com/pcr.shtml

Componenti della PCR (1986)

• DNA stampo; • tampone specifico di reazione contente sali; • primers (oligonucleotidi) specifici;• deossinucleotidi trifosfati (dATP, dCTP, dGTP e dTTP);• Taq polimerasi, enzima ad attività DNA Polimerasi ricavato da

Thermus aquaticus (Taq), attività 5’3’. Non ha attività esonucleasica 3’ 5’. Caratteristiche: termoresistenza, specificità, fedeltà (1 nt sbagliato ogni 2x104)

Thermus aquaticus batterio termofilo isolato per la prima volta nelle pozze di acqua calda del parco nazionale di Yellowstone, negli Stati Uniti.

La reazione avviene in un termociclatore con un blocco di alluminio che può essere riscaldato e raffreddato rapidamente

Taq Polymerase Il Grand Prismatic Spring nello Yellowstone Park (USA). Il colore si deve alla presenza dei batteri termofili

denat.T = 94°C

anneal.

exten.T = 72°C

nuovoDNA

II ciclo III ciclo

den

atu

razi

on

e

den

atu

razi

on

e

+

23 = 8

8 molecole di DNA in 3 cicli

I cicli della PCR

Schema generale della PCR8

Schema della PCR – Polymerase Chain Reaction

DNA stampo 1° ciclo 2° ciclo 3° ciclo 4° ciclo

2 copie 4 copie 8 copie 16 copie

Animazioni della PCR9

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

http://www.dnalc.org/view/15475-The-cycles-of-the-polymerase-chain-reaction-PCR-3D-animation-with-no-audio.html

Gli enzimi di restrizione

-rompono i legami fosfodiesterici tra i nucleotidi-riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio filamento. -le sequenze sono generalmente palindromi, cioè identiche se lette in direzione 5'--> 3' sia su un filamento che sull'altro.-servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile-sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti-riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4, 6 o 8 nucleotidi).

Il loro nome deriva dal batterio da cui sono stati isolati:EcoRI: E. coli sequenza GAATTC/CTTAAGBamHI : Bacyllus amyloliquefaciens: GGATCC/CCTAGG

Scoperta del primo enzima di restrizione (1970)prima molecola di DNA ricombinante, Paul Berg (1972)

11

Tipi di taglio

-BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO Es. SmaI 5’-CCC GGG-3’ 5’-CCC-3’ 5’- GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’ 3’-GGG-5’ 3’-CCC-5’

-STICKY ENDS O CODINE ADESIVE: -5’ PROTRUDING (5’ SPORGENTE) -3’ PROTRUDING (3’ SPORGENTE)

Es. Eco RI (5’ PROTRUDING) 5’-G/AATTC-3’ 5’-G-3’ 5’-AATTC-3’ 3’-CTTAA/G-5’ 3’-CTTAA-5’ 3’-G-5’

Es. Kpn I (3’ PROTRUDING) 5’-GGTAC/C-3’ 5’-GGTAC -3’ 5’-C-3’ 3’-C/CATGG-5’ 3’-C-5’ 3’-CATGG-5’

Estrazione del DNA eucariote13

Scopo dell’esperienza:

Estrarre il materiale genetico da un organismo vegetale

Materiale occorrente• Reagenti• Etanolo assoluto• Acido acetico glaciale• acido cloridrico diluito• cloruro di sodio• succo di ananas• rosso fenolo• blu di metilene/toluidina• 1-2 banane o kiwi• detergente liquido per piatti• ghiaccio

Estrazione del DNA: procedura14

1.Raffreddare con ghiaccio in becher da 1000 un volume pari a 100 mL di etanolo2.Miscela n. 1 (becher 100 mL): 10 g. NaCl, 10 ml detergente liquido, 90 ml acqua demineralizzata3.Miscela n. 2 (becher 100 mL): 5 mL di succo d’ananas, 95 mL acqua demineralizzata4. Sbucciare e tagliare kiwi o banane, pestarli nel mortaio, aggiungere 10 mL di soluzione 1, mescolare, versare in un becher da 100 – scopo: allontanare proteine e carboidrati5. Porre il becher a bagnomaria a 60°C per 15 minuti (termometro)6. Subito dopo porre in ghiaccio (becher da 1000) per 5 min con una bacchetta di vetro ridurre in poltiglia7. Filtrare e suddividere il filtrato in 3-4 provette8. Aggiungere a ciascuna provetta 3-4 mL di miscela 2. Scopo: la bromelina dell’ananas è una proteasi atta a demolire le proteine istoniche, il che favorisce la purificazione del DNA

1510 Aggiungere 10 mL di etanolo freddo. Si formeranno 2 fasi, da non

mescolare e far riposare per 10 min a temperatura ambiente

12 In etanolo a freddo precipitano gli acidi nucleici, che verranno estratti con la bacchetta di vetro e posti in un tubo

13 Per evidenziarli meglio si aggiungono 5 gocce di rosso fenolo, che farà colorare il materiale genetico

16

ingredienti

17

Bagnomaria e filtrazione

18

Fase finale: il DNA è estratto