AÇÃO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA NA PRODUÇÃO DE...
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UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA
IDÁLIA APARECIDA WALTRICK DE BRITO SIQUEIRA
DESENVOLVIMENTO DE MEMBRANAS POROSAS À BASE DE PDLLA/NANOTUBOS DE CARBONO: nHAp PARA REGENERAÇÃO ÓSSEA
São José dos Campos, SP 2015
IDÁLIA APARECIDA WALTRICK DE BRITO SIQUEIRA
DESENVOLVIMENTO DE MEMBRANAS POROSAS À BASE DE PDLLA/NANOTUBOS DE CARBONO: nHAp PARA REGENERAÇÃO ÓSSEA
Tese apresentada ao programa de Pós-graduação em Engenharia Biomédica, como complementação dos requisitos necessários para obtenção do título de doutora em Engenharia Biomédica.
Orientador: Prof.Dr. Anderson de Oliveira Lobo Co-orientador: Prof.Dra. Fernanda Roberta Marciano
São José dos Campos, SP 2015
IDÁLIA APARECIDA WALTRICK DE BRITO SIQUEIRA
DESENVOLVIMENTO DE MEMBRANAS POROSAS À BASE DE PDLLA/NANOTUBOS DE CARBONO: nHAp PARA REGENERAÇÃO ÓSSEA
Tese de Doutorado apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de
Doutor em Engenharia de Biomédica, do Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Biomédica, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade
do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora:
Presidente: Prof. Dra. Fernanda Roberta Marciano (UNIVAP)___________________
Orientador: Prof. Dr. Anderson de Oliveira Lobo (UNIVAP) _____________________
Membro Externo: Prof. Dr. José Evaldo Corat (INPE) _________________________
Membro Externo: Prof. Dr. Irimar de Paula Posso (USP) ______________________
Membro Externo: Prof. Dr. Koshun Iha (ITA) ________________________________
Profª. Drª. Sandra Maria Fonseca da Costa
Diretora do IP&D- UNIVAP
São José dos Campos, 24 de fevereiro de 2015.
Dedico o presente trabalho à minha família,
aos meus amigos e aos meus orientadores.
Agradecimentos
Agradeço a Universidade do Vale do
Paraíba pela oportunidade de
crescimento profissional.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Anderson
de Oliveira Lobo, pela confiança e
paciência, por proporcionar vivências
que contribuíram para meu
desenvolvimento profissional, pela
forma exemplar como conduziu esse
trabalho e pela oportunidade de
trabalhar ao seu lado.
Agradeço a minha co-orientadora,
Profª. Drª. Fernanda Roberta
Marciano, pela atenção, dedicação e
disponibilidade para ensinar.
Ao Prof. Dr. Evaldo José Corat, por
disponibilizar seu laboratório no
INPE para preparação dos
biomateriais.
Ao Prof. Dr. Marcus Corat, por toda
paciência e ensinamentos na cirurgia
e fisiologia de pequenos animais.
Aos Prof. Dr. Mario Ferreti Filho e
Profª. Drª. Eliane Antonioli, pela
colaboração e ensinamentos na
pesquisa para regeneração
osteocondral.
Ao Prof. Dr. Bruno das Neves
Cavalcanti, pela ajuda, colaboração e
ensinamentos nos ensaios celulares.
Ao prof. Dr. Airton Abrahão Martin,
pela ajuda e colaboração nas técnicas
de Raman Confocal e FTIR.
Aos Prof. Dr. Newton Soares da Silva
e Profª. Drª. Cristina Pacheco Soares
pela ajuda e colaboração nos ensaios
celulares e bactericidas.
Aos Profª. Drª. Rosário Elida Suman
Bretas e o Dr. Wilson Neto, pela
ajuda nas análises de Calorimetria
diferencial exploratória e revisão
dos artigos.
Ao Dr. Hudson Zanin, pela ajuda e
colaboração nos artigos
complementares a tese.
Às Profª. Drª. Luana Marotta Reis
Vasconcellos e Profª. Drª. Yasmin
Rodarte Carvalho pelos ensinamentos
de histologia.
Ao Prof. Dr. João Paulo B. Machado
pelos ensinamentos de Difração de
Raio X.
Aos Prof. MSc. José Benício de
Almeida e Profª. Drª. Emília Angela
Loschiavo Arisawa, pela oportunidade
de monitoria de docência no curso de
enfermagem da Faculdade de Ciências
da Saúde-UNIVAP.
Ao Prof. Dr. Irimar de Paula Posso,
pelo auxílio e toda colaboração na
fase inicial do doutorado.
À Profª. Drª. Maria Belén Salazar
Posso, pela amizade, pelos conselhos
pessoais e profissionais.
Aos Prof. Dr. José Carlos Cogo e
Prof. Dr. Wellington Ribeiro pela
orientação na fase inicial do
doutorado e pelos ensinamentos na
pesquisa com animais.
Às Profª. MSc. Ana Lúcia G. de G.
Sant’Anna e Profª. MSc. Vânia de
Araújo Giaretta, minhas orientadoras
na graduação, pela amizade, apoio e
incentivo sempre.
Aos Prof. Dr. Marco Antonio de
Oliveira e Profª. Drª. Josane Mittman
pela amizade e pela disponibilidade
em ensinar sempre.
Aos meus pais, Eloir e Brito (in
memorian), meu infinito
agradecimento. Foram as pessoas que
me ensinaram valores e também me
ensinaram a ousar, questionar e ter
curiosidade. Obrigada pelo exemplo
pessoal e profissional.
Ao meu amor e melhor amigo, Pablo,
por toda dedicação, por sempre estar
ao meu lado: você sabe como é
importante para mim!
Aos meus colegas e amigos da UNIVAP,
Carla, Marcele, Lívia, Felipe,
Marina, Tayra, Lilian, Tati, Aline,
Letícia, Amanda, prof. Toni, Luciana,
Roberta, Edvana, Patrícia, Ingrid,
Thiago, Cristiane, Isabela, profª.
Luciene, Ciliana, Marcos, pela
companhia e obrigada por tornarem os
meus dias de trabalho melhores.
Em especial, à minha amiga Juliana
Guerra, pela companhia, por sempre me
escutar e dividir comigo todos os
momentos. Desde o mestrado, nos
tornamos mais que amigas, somos irmãs
de coração.
À Beatriz que se mostrou uma grande
amiga, presente em todos os momentos.
E para a Nelly, que foi uma das
pessoas que eu mais gostei de
trabalhar junto, divertida, animada e
que me fez companhia até nos meus
experimentos em São Paulo.
Aos funcionários da UNIVAP, pelo
comprometimento e dedicação.
Às CAPES, FAPESP (2011/17877-7 e
2011/20345-7), CNPq (474090/2013-2) e
FVE pelo apoio financeiro.
À Purac, que gentilmente cedeu os
polímeros para a realização desta
pesquisa.
À TA Instruments, pela análise de
TGA.
“Tenha a coragem de te servir de teu próprio entendimento. Eis a divisa das luzes.”
Kant
DESENVOLVIMENTO DE MEMBRANAS POROSAS À BASE DE PDLLA/NANOTUBOS DE CARBONO: nHAp PARA REGENERAÇÃO ÓSSEA
RESUMO
O estudo da produção e aplicação biológica de materiais bioreabsorvíveis é de grande relevância, pois o emprego destes biomateriais apresenta vantagens médicas e econômicas para a prática ortopédica. Neste estudo apresentamos a incorporação de nanopartículas no polímero biorreabsorvível a fim de melhorar significativamente as propriedades de superfície, consequentemente a interação com o meio biológico e promover a osseointegração. Para tanto, as membranas porosas de estruturas "do tipo colméias" com a incorporação de hidroxiapatita/nanotubos de carbono de múltiplas paredes verticalmente alinhados superhidrofílicos (VACNT-O:nHAp) foram produzidas com condições de umidade controlada. As nanopartículas VACNT-O:nHAp dispersas no polímero foram obtidas por duas diferentes metodologias: eletrodeposição e imersão em fluido corporal simulado (SBF). Um simples e rápido tratamento de superfície com plasma de oxigênio foi realizado para melhorar as propriedades hidrofílicas. O nanocompósito foi caracterizado por microscopia eletrônica de varredura, perfilometria óptica, ângulo de contato e espectroscopia de reflexão total atenuada no infravermelho com transformada de Fourier (ATR-FTIR). Os nanocompósitos PDLLA/VACNT-O:nHAp apresentaram modificações de superfície, como textura, aumento da rugosidade e característica hidrofílica. O método de imersão em fluido corporal simulado (SBF) foi utilizado para avaliar as propriedades de bioatividade e a biomineralização, assim como a cultura de osteoblastos humanos e defeitos ósseos foram realizados para avaliar a regeneração óssea. Os nanocompósitos de PDLLA/VACNT-O:nHAp são biocompatíveis, promovem osseointegração e melhoraram as propriedades de biomineralização. A técnica de espectroscopia Raman confocal e histologia confirmaram o alto potencial deste biomaterial como arcabouço para a regeneração óssea. Palavras-chaves: Nanotubos de Carbono. Nanohidroxiapatita. SBF. Regeneração
óssea. PDLLA e cultura de osteoblastos.
DEVELOPMENT OF POROUS SCAFFOLDS BASED IN PDLLA/CARBON NANOTUBES: nHAp FOR BONE REGENERATION
ABSTRACT
The study of production and biological application of bioresorbable materials has been important due to medical and economic advantages for the use in orthopedic practice. In this study, we produced polymer membranes with incorporation of nanoparticles in order to improve the surface properties and the interaction with the biological medium, as well as promote osseointegration. For this, PDLLA honeycomb films with incorporated hydroxyapatite/superhydrophilic vertically-aligned multiwalled carbon nanotube (VACNT-O:nHAp) composites was produced by controlled humidity. The VACNT-O:nHAp dispersed in the polymer was obtained by two different syntheses: electrodeposition and immersion in simulated body fluid. A simple and fast oxygen plasma treatment was performed to improve hydrophilic properties. The nanocomposite characterizations were performed by scanning electron microscopy, profilometry, contact angle, and attenuated total reflective Fourier transform infrared spectroscopy. PDLLA/VACNT-O:nHAp nanocomposites improve the texture and increase the surface roughness, and the oxygen plasm treatment gives the material a hydrophilic characteristic. In vitro bioactivity and biomineralization was evaluated and the Human osteoblast cell culture and bone defects were used to evaluate the bone regeneration. nHAp/carbon nanotubes/PDLLA scaffolds are biocompatible, induce bone remodeling and the increase of biomineralization properties. The confocal Raman spectroscopy and histological results, confirmed high potential as scaffolds to bone tissue regeneration Key-words: Carbon nanotubes, nanohydroxyapatite, SBF, bone regeneration,
PDLLA and osteoblast culture.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3D - Estrutura tridimensional
Ag - Prata
ATR-FTIR – Espectroscopia de
reflexão total atenuada no
infravermelho com transformada de
Fourier
BMP- Proteínas morfogênicas do osso
BRU - Unidade de remodelamento
Ca2+ - Cátions de Cálcio
CaCO3 - Carbonato de cálcio
fosfato
CaCl2.2H2O- Cloreto de cálcio
CCD - Dispositivo de carga acoplada
CEMIB- Centro Multidisciplinar para
investigação biológica na área da
ciência em animais de laboratório
UNICAMP-Universidade Estadual de
Campinas
CH4 - Metano
CO2- Gás carbônico
CNT - Nanotubos de carbono
DSC- Calorimetria diferencial
exploratória
EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-
acético
FDA- Administração de alimentos e
medicamentos
FT-Raman-Espectroscopia Raman
com transformada de Fourier
GPa - GigaPascal
HAp – Hidroxiapatita
HCl- Ácido clorídrico
HMDS - Hexametildisilazano
nuclear
i.p- Intraperitonial
INPE-Instituto de Pesquisas Espaciais
Kappa β nuclear
LAS-Laboratório de Associado de
Sensores e Materiais
LEVB-Laboratório de Espectroscopia
Vibracional Biomédica
M-CSF- Fator estimulador de colônia
as macrófagos
MEV - Microscopia eletrônica de
varredura
MET - Microscopia de transmissão
Mg2+ - Cátions de Magnésio
MgCl2-Cloreto de magnésio
MWCVD-Microwave Plasma Assisted
Chemical Vapor Deposition
NaCL-Cloreto de sódio
NaOH - Hidróxido de sódio
NaHCO3-Bicarbonato de sódio
Na2HPO4.2H2O- Fosfato dissódico
NCP- Proteínas não colágenas
nHAp - Nanohidroxiapatita
nHAp1- Nanohidroxiapatita produzida
por eletrodeposição
nHAp2 - Nanohidroxiapatita produzida
pela imersão em SBF
INPE-Instituto de Pesquisas Espaciais
OPG - Osteoprotegerina
PBS - Solução salina tamponada com
fosfato
PDLA- Poli (D-ácido láctico)
PDLLA - Poli (DL-ácido láctico)
PDLLA/VACNT-O:nHAp - Compósitos
à base de Poli (DL-ácido láctico),
nanotubos de carbono de múltiplas
paredes e nanohidroxiapatita
PCL - Poli (ε-caprolactona)
PGA - Poli (ácido glicólico)
pH- Potencial Hidrogeniônico
PLA – Poli (ácido láctico)
PLLA - Poli (L-ácido láctico)
PLGA – Poli (ácido lactico-co-glicólico)
PTH - Paratormônios
RANK- Receptor ativado do fator
RANKL- RANK ligante
ROG - Regeneração ósseo guiada
rpm- Rotações por minuto
SBF - Fluido corporal simulado
sccm - Centímetros cúbicos padrão
por minuto
SUS - Sistema Único de Saúde
SWCNT - Nanotubos de carbono de
paredes únicas
VACNT - Nanotubos de carbono de
múltiplas paredes
VACNT-O:nHAp - nanohidroxiapatita/
Nanotubos de carbono verticalmente
alinhados de múltiplas paredes
superhidrofílicos
TGA - Análises termogravimétrica
TGβ - Fator de crescimento β
UNESP-Universidade Estadual
Paulista
UNIVAP-Universidade do Vale do
Paraíba
v.o- Via oral
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Organização do tecido lamelar. ................................................................ 23
Figura 2 - Lâmina mostrando tecido ósseo primário (OP) e periósteo (P) (100x). .... 25
Figura 3 - Lâmina mostrando tecido ósseo primário - osteoblastos (seta) e trabéculas com osteócitos (T) (100x). ......................................................................................... 25
Figura 4 - Lâmina mostrando Tecido ósseo primário - osteoblasto (seta) e osteóide (O) (400x). ................................................................................................................. 26
Figura 5 - Lâmina mostrando tecido ósseo primário: osteoblasto (Ob) e osteócito em formação (seta) (400x). ............................................................................................. 26
Figura 6 - Lâmina mostrando osteoclasto (Oc) e osteoblasto (seta) (400x). ............. 27
Figura 7 - Desenho esquemático de uma fibra de colágeno mineralizada. Cristais de nanohidroxiapatita (verde) incorporados entre as triplas hélices de colágeno (cilindros brancos). .................................................................................................... 29
Figura 8 - Esquema simplificado de remodelamento ósseo. ..................................... 32
Figura 9 - Mecanismo de Remodelamento ósseo. .................................................... 33
Figura 10 - Mecanismo de remodelamento ósseo, ação antagonista da OPG. ........ 34
Figura 11 - Ilustração de como os conhecimentos de materiais, biologia, medicina e engenharia devem ser integrados para alcançar a regeneração de tecidos. ............ 38
Figura 12 - Estereoisômeros do ácido láctico............................................................ 40
Figura 13 - Fórmula do polímero PDLLA. .................................................................. 40
Figura 14 - Rota metabólica de bioreabsorção do PDLLA. ....................................... 41
Figura 15 - Esquema de um nanotubo de parede múltiplas. ..................................... 44
Figura 16 - Micrografia de apatitas globulares produzidas pela precipitação em SBF. .................................................................................................................................. 45
Figura 17 - (a) seção transversal, detalhes de nanocristais de nHAp. (b) detalhes de nanocristais nHAp do tipo placa após o processo de eletrodeposição. ..................... 46
Figura 18 - Perspectiva da aplicação in vivo de membranas desenvolvidas nesta tese. .......................................................................................................................... 52
Figura 19 - Ilustração do conjunto do reator de microondas de alumínio anodizado.54
Figura 20 - Diagrama esquemático do reator para crescimento dos VACNT. ........... 54
Figura 21 - Reator de plasma de O2. ........................................................................ 55
Figura 22 - Montagem do anodo para eletrodeposição de HA. ................................. 56
Figura 23 - Ilustração da célula de deposição de fosfato de cálcio. .......................... 57
Figura 24 - Potenciostato utilizado no processo de eletrodeposição. ........................ 58
Figura 25 - Shaker utilizado para incubação das amostras durante o processo de biomineralização. ...................................................................................................... 60
Figura 26 - Equipamento de ultrassom (SONICS, VCX500W) utilizado na dispersão das nanopartículas. ................................................................................................... 61
Figura 27 - Esquema da produção das membranas. ................................................ 63
Figura 28 - Plaqueamento para os ensaios celulares (a) e Marcação para SRB (b). 71
Figura 29 - Ilustração de região de implante de PDLLA/VACNT-O:nHAp em osso interparietal de camundongos. .................................................................................. 74
Figura 30 - Micrografias coletadas, a partir de (a) VACNT-O, detalhes da esfoliação do VACNT-O (a.1) e VACNT-O, verticalmente alinhado (a.2); (a) micrografias coletadas por MEV. (a.1 e a.2) micrografias coletadas por MET. ............................. 78
Figura 31 - Micrografias coletadas a partir de (b) nHAp1 (eletrodepositadas), detalhes da morfologia de placas (b.1 e b.2). (b e b.1) micrografias coletadas por MEV. (b. 2) micrografias coletadas por MET. ............................................................ 79
Figura 32 - Micrografias coletadas a partir de (c) nHAp2 (imersão em SBF), detalhes da morfologia globular (c.1 e c.2). (c e c.1) micrografias coletadas por MEV. (c. 2) micrografias coletadas por MET. ............................................................................... 80
Figura 33 - Micrografias (MEV) e perfilometria das membranas antes e depois das nanopartículas incorporadas. (a) PDLLA, (b) PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e (c) PDLLA/VACNT-O:nHAp2, sendo que (1) perfilometria. ............................................ 82
Figura 34 - Análise de ângulo de contato de todas as membranas produzidas com e sem nanopartículas incorporadas. O PDLLA sem nanopartículas foi utilizado como controle. Os dados foram coletados a partir de 3 amostras (n=3). ............................ 84
Figura 35 - Espectros FTIR-ATR de membranas PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/ VACNT-O:nHAp2. Todos os espectros foram coletados em três pontos diferentes................................................................................................................... 85
Figura 36 - Os termogramas obtidos por calorimetria diferencial exploratória das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2........ 87
Figura 37 - Análise termogravimétrica das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2. ...................................................................... 90
Figura 38 - Micrografia de varredura eletrônica de estruturas de (a) PDLLA, (b) PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e (c) PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após o processo de biomineralização. ...................................................................................................... 91
Figura 39 - Espectro de FTIR coletados de membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após imersão em solução que simula o fluído corporal (SBF) por 14 dias. ....................................................................................... 92
Figura 40 - Difratograma de Raios X da superfície de membranas (a) PDLLA e (b) PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e (c) PDLLA/VACNT-O: nHAp2 imersas em SBF durante 14 dias. ...................................................................................................................... 93
Figura 41 - Análise de viabilidade celular de osteoblastos cultivado por 5 dias sob membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2, sendo que * indica p<0,05.................................................................................................... 95
Figura 42 - Análise da fosfatase alcalina de osteoblastos cultivado por 5 dias sob membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e PDLLA/VACNT-O: nHAp2, sendo que *•□♦ indicam p< 0,05. ............................................................................... 96
Figura 43 - Fotomicrografia de lâminas histológicas que identificam a regeneração óssea após quatro meses de implante em grupos; (a) A regeneração óssea após o implante das membranas de PDLLA como controle (H&E, 40x); (a.1) detalhes em círculos (H&E, 100x); região de interface entre o primeiro e o osso (*) e seta indica fibroblastos. (b) a regeneração de osso após o implante PDLLA/VACNT-O: nHAp1 (H&E, 40x); (b.1) região de interface entre o polímero e o osso (*), células gigantes fagocitárias em setas (H&E, 100x). (c) regeneração completa de defeito ósseo após a implantação de PDLLA/VANCT-O: nHAp1 (H&E, 40x). (c1) MB indica a formação de medula óssea (H&E, 100x). .................................................................................. 99
Figura 44 - Micrografias do osso na região de estudo mostram a regeneração óssea após quatro meses de implante em grupos; (a) a regeneração óssea após a implantação das membranas de PDLLA como controle; (a.1) detalhes em círculos da região de interface entre o polímero e oso (*) e a seta indica fibroblastos. (b) a regeneração óssea após a implantação das membranas PDLLA/VACNT-O nHAp1; (b1) detalhes de polímero parcialmente degradado. (*) e camada de hidroxiapatita carbonatada em setas. (c) regeneração óssea completa após a implantação de PDLLA/VACNT-O: nHAp2. (c1) detalhes de osteoblastos nos quadrados e a camada de hidroxiapatita carbonada indicada pelas setas. .................................................. 100
Figura 45 - Um espectro representativo de Raman coletado de seção óssea após quatro meses da implantação das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2. .................................................................................... 101
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição química da solução para eletrodeposição ........................... 57
Tabela 2 - Concentrações dos reagentes para solução de SBF 5x .......................... 59
Tabela 3 - Análises da rugosidade de superfície das diferentes membranas porosas produzidas. Dados expressos em média de 3 membranas (n = 3) ........................... 82
Tabela 4 - Componentes de energia de superfície e livre interfacial de adesão das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2........ 86
Tabela 5 - Parâmetros Térmicos de membranas de PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp ..................................................................................................................... 87
Tabela 6 - Relação carbonato/fosfato coletadas a partir de espectros FTIR em PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 ................................ 92
Tabela 7 - O tamanho de cristalito de nHAp formados na superfície de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após imersão em SBF durante 14 dias ....................................................................................................................... 94
Tabela 8 - Comparação de valores de picos FWHM de fosfato e carbonato com PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (FWHM; R-quadrado: 0,99) recolhidos de seção osso extraído após quatro meses. Os grupos são significativamente diferentes, p <0,05 (One Way Anova) .......................................................................................... 102
Tabela 9 - Comparação da razão de fosfato/prolina; fosfato/amida III; fosfato/amida I e carbonato/amida I de membranas de PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (FWHM; R-quadrado: 0,99) recolhidos de seção óssea extraída após quatro meses. Os grupos são significativamente ................................................................................. 103
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19 1.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 21 1.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 21 2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 22 2.1 Tecido ósseo: aspectos morfológicos e histofisiológicos ............................ 22 2.1.2 Osseointegração ............................................................................................ 30 2.2 Biomateriais reabsorvíveis: um desafio para a aplicação ortopédica .......... 35 2.2.1 Polímeros Bioreabsorvíveis: PDLLA ............................................................ 38 2.2.2 Nanocompósitos poliméricos: PDLLA, Nanotubos de Carbono e Hidroxiapatita .......................................................................................................... 42 3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 53 3.1 Produção das nanopartículas para dispersão ................................................ 53 3.1.1 Síntese dos nanotubos de carbono de múltiplas paredes verticalmente alinhados (VACNT-O) .............................................................................................. 53 3.1.2 Síntese de VACNT-O:nHAp1 por eletrodeposição ...................................... 56 3.1.3 Síntese de VACNT-O:nHAp2 por imersão em SBF ...................................... 58 3.1.4 Dispersão de nHAp/VACNT-O em PDLLA .................................................... 60 3.1.5 Esquema da produção das membranas ....................................................... 62 3.2 Ensaio de bioatividade in vitro ......................................................................... 64 3.3 Caracterização das Membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp ......................... 64 3.3.1 Microscopia eletrônica de Varredura e Transmissão.................................. 64 3.3.2 Perfilometria óptica ........................................................................................ 65 3.3.3 Análise da porosidade ................................................................................... 65 3.3.4 Calorimetria diferencial exploratória ............................................................ 65 3.3.5 Termogravimetria ........................................................................................... 66 3.3.6 Espectroscopia de reflexão total atenuada no infravermelho com transformada de Fourier (ATR-FTIR) ..................................................................... 66 3.3.7 Análises de ângulo de contato ...................................................................... 67 3.4 Caracterização da Bioatividade ....................................................................... 69 3.4.1 Microscopia eletrônica de varredura ............................................................ 69 3.4.2 Espectroscopia de Infravermelho por transformada de Fourier utilizando reflectância total atenuada (ATR-FTIR) ................................................................. 69 3.4.3 Difração de Raios X ........................................................................................ 70 3.5 Ensaios biológicos in vitro ............................................................................... 70 3.5.1 Cultura de células........................................................................................... 70 3.5.2 Ensaio de citotoxicidade ............................................................................... 71 3.5.3 Ensaio de fosfatase alcalina .......................................................................... 72 3.6 Estudo in vivo .................................................................................................... 72 3.6.1 Animais ........................................................................................................... 72 3.6.2 Acondicionamento dos animais ................................................................... 73 3.6.4 Anestesia e Defeito ósseo ............................................................................. 73 3.6.5 Eutanásia ........................................................................................................ 74 3.6.6 Retirada do tecido ósseo ............................................................................... 75 3.6.7 Análise espectroscópica ............................................................................... 75 3.6.8 Análise histológica ......................................................................................... 76 3.6.9 Microscopia Eletrônica de Varredura ........................................................... 76 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 77 5 CONCLUSÕES .................................................................................................... 106 6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS .................................................. 107
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 108 ANEXO A –CARTA DE ACEITE DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA COM ANIMAIS ................................................................................................................. 130 ANEXO B- ARTIGOS PUBLICADOS ..................................................................... 131 ANEXO C- ARTIGO ACEITO ................................................................................. 132 ANEXO D - ARTIGOS E RESUMOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSOS SOBRE O TEMA ..................................................................................................... 133 ANEXO E - ARTIGO PREMIADO EM CONGRESSO ............................................ 135
19
1 INTRODUÇÃO
Novas tecnologias para o desenvolvimento de biomateriais tem proporcionado
uma revolução na prática médica. Atualmente, estima-se que o mercado mundial de
biomateriais envolverá aproximadamente 88,4 bilhões de dólares em 2017, com uma
taxa de crescimento anual média de 15%, estes dados são resultado do aumento de
incentivos governamentais, avanços tecnológicos e o aumento das atividades de
pesquisa nesta área (MARKETS; MARKETS, 2013).
Pesquisas apontam que no Brasil, o mercado de biomateriais atingirá a 1,7
bilhões de dólares em 2015, sendo somente na área de materiais ortopédicos uma
progressão estimada de 17,2% de 2010 para 2015 (MARKETS; MARKETS, 2013).
Segundo os dados obtidos pelo DATASUS, são altos os gastos com órteses,
próteses e materiais especiais em 2014, até o mês de novembro (BRASIL, 2014).
Estes valores refletem a necessidade de pesquisas para o desenvolvimento de
materiais com melhor custo e efetividade.
Dentre os biomateriais, as membranas poliméricas têm sido pesquisadas como
substitutos ósseos devido às vantagens da biocompatibilidade, reabsorção,
bioestimulação do osso e também porque não há a necessidade de uma intervenção
cirúrgica para a remoção do implante (AN; WOOLF; FRIEDMAN, 2000; MEROLLI et.
al, 2001; LIM, AURAS; RUBINO, 2008; BEACHLEY; WEN, 2010; TIAN et al., 2012).
O Poli (DL-ácido láctico) (PDLLA) é um polímero biocompatível e biodegradável,
com um tempo de degradação rápido e controlável (MEROLLI et. al, 2001;
BEACHLEY; WEN, 2010; ZOU et. al, 2012). No entanto, este polímero tem
propriedade hidrofóbica (CHEN et al, 2003; ALVES et al, 2008), que compromete as
interações primárias com o meio biológico. Além disso, o polímero tem uma baixa
resistência mecânica (NAIR; LAURENCIN, 2007), o que limita a aplicação na
medicina regenerativa óssea, por conseguinte, a formação de nanocompósitos
poliméricos podem melhorar a interação de células e as propriedades mecânicas.
A resposta fisiológica aos biomateriais depende das propriedades físico-
químicas, bem como o local de implante e a interação com o meio biológico. Durante
este processo, o tecido conjuntivo pode ser formado na superfície do material e este
tecido pode comprometer a formação de osso, portanto faz-se necessário a
20
implantação de um biomaterial osteocondutor que promova a osseointegração
(EGGERS; MEEDER, 1994; NADE, 1994).
Com o objetivo de promover a osseointegração, vários estudos investigaram
como implementar propriedades osteocondutoras nos biomateriais, tais como a
incorporação de nanopartículas osteoindutivas e tratamentos de superfície, sendo
que a dispersão de nanotubos de carbono (CNT) e hidroxiapatita (HAp) na matriz
polimérica é uma alternativa para melhorar as características físico-químicas do
polímero e biomimetizar o tecido ósseo (URAL et al., 2000; ZHENG et al., 2006;
FENG et al., 2008; SPITALSKY et al., 2010; SHAO et al., 2011; LIU et al., 2012).
Lobo et al. (2010) desenvolveram nanopartículas biomiméticas e estas foram
avaliadas em cultura de células. Por exemplo, nanotubos de carbono
superhidrofilicos verticalmente alinhados (VACNT-O) são promissores para
aplicações biomédicas, por suas propriedades de resistência mecânica, elevada
estabilidade química e funcionalização (FENG et al., 2008; SPITALSKY et al., 2010;
SHAO et al., 2011). A produção de nanofibras com CNT dispersos em matriz de Poli
(L-ácido láctico) (PLLA) resultou em um arcabouço condutor elétrico que melhorou a
interação com osteoblastos (SHAO et al., 2011). Além disso, as nanopartículas
osteoindutivas como nanohidroxiapatita (nHAp) podem ser depositadas sobre
VACNT-O por métodos de baixo custo, tais como a eletrodeposição e a imersão em
solução de SBF (LOBO et al., 2010; LOBO et al., 2011b), afim de melhorar as
propriedades osteoindutoras e de bioatividade. Um método rápido e homogêneo
para produzir nanocompósitos de VACNT-O:nHAp foi demonstrado por Lobo et al.
(2010), este biomaterial apresentou propriedades interessantes de biomineralização
e de adesão dos osteoblastos humanos assim como a formação de osso lamelar in
vivo (LOBO et al., 2010; LOBO et al., 2011a; LOBO et al., 2013).
O processo de biomineralização de VACNT-O foi investigado por Marsi et al.
(2012), como resultados foram obtidos nanocristais de apatita sobre a superfície dos
VACNT-O após a imersão em solução de fluido corporal simulado (SBF) (MARSI et
al., 2012; BARRERE et al., 2002a). Os dados mostraram a formação de uma
camada densa de nHAp com uma morfologia semelhante a nHAp globular biológica,
além da adesão e proliferação celular na superfície (MARSI et al., 2012). Também
foi demonstrado que nHAp obtidas pelo método de eletrodeposição são
21
biocompatíveis, bioativas e ainda melhoram a adesão de osteoblastos, por
consequente a regeneração óssea in vivo (LOBO et al., 2013).
Neste estudo, apresentamos duas novas metodologias simples e de baixo custo
para obtenção de membranas porosas parcialmente hidrofílicas de PDLLA, ambas
apresentaram o aumento de rugosidade a partir da incorporação de nanopartículas
de VACNT-O:nHAp na matriz polimérica. Para tanto, o método para obter estruturas
do “tipo colmeias” (do inglês honeycomb) com condição de umidade controlada foi
utilizado para produção de poros na superfície das membranas. Estes novos
nanocompósitos foram funcionalizados por tratamento com plasma de oxigênio para
obtenção das propriedades de hidrofilicidade em sua superfície. Estas propriedades
foram relacionadas com a bioatividade in vitro, com o processo de biomineralização,
adesão das células e a osseointegração.
1.1 Objetivo Geral
O objetivo principal dessa tese é o desenvolvimento de membranas porosas
biocompatíveis a base de PDLLA/VACNT-O:nHAp com propriedades de bioatividade
para a osseointegração.
1.2 Objetivos Específicos
-Produzir e caracterizar membranas porosas parcialmente hidrofílicas de
PDLLA/VACNT-O:nHAp.
-Verificar a citocompatibilidade e biomineralização das membranas porosas de
PDLLA/VACNT-O:nHAp utilizando osteoblastos humanos. -Avaliar a osseointegração das membranas porosas de PDLLA/VACNT-O:nHAp
no processo de reparo do tecido ósseo em um modelo de defeito na calvária de
camundongos por meio da espectroscopia Raman e Histologia.
-Caracterizar por meio de espectroscopia Raman os componentes minerais e
orgânicos do preenchimento do tecido ósseo após implante do biomaterial em
modelo de defeito na calvária de camundongos.
22
2 REVISÃO DE LITERATURA
Neste capítulo é apresentada a fundamentação teórica referente ao presente
estudo, abordando seções teóricas sobre o sistema esquelético e tecido ósseo, sua
morfologia e estrutura, remodelamento e osseointegração, assim como a motivação
para o estudo e aspectos relacionados ao desenvolvimento do biomaterial.
2.1 Tecido ósseo: aspectos morfológicos e histofisiológicos
O tecido ósseo possui grande capacidade regenerativa, composto de células
ativas e matriz mineralizada, apresenta funções de sustentação, auxílio na
mobilidade física, depósito de cálcio e fósforo, hematopoiese e proteção para os
tecidos moles (DÂNGELO; FATTINI, 2006; LAFITA, 2003; PARK et al., 2009). O
conjunto de ossos e cartilagens denominado esqueleto, possui um sistema de
alavancas que associado ao sistema muscular permite o deslocamento (DÂNGELO;
FATTINI, 2006).
A renovação óssea não acontece de maneira uniforme em todo o esqueleto, este
é dividido em apendicular e periférico. O esqueleto apendicular é constituído
principalmente de ossos corticais compactos, que formam os membros do corpo,
enquanto que o esqueleto axial é composto por ossos da cabeça, pescoço e tronco
(tórax e abdome), que contém trabéculas dentro de um córtex fino (DÂNGELO;
FATTINI, 2006).
O osso trabecular lembra a forma de uma colmeia, a medula óssea e lipídeos
estão entre interstícios intratraberculares, o tecido ósseo é revestido por uma
camada de tecido conjuntivo e células pavimentosas denominada endósteo. A
renovação celular no osso axial é facilitada devido à superfície mais densa e a
presença de células precursoras da medula óssea (GILMAN et al., 2006; DÂNGELO;
FATTINI, 2006; KIERSZENBAUM, 2004).
O tecido ósseo é classificado macroscopicamente em esponjoso ou compacto. O
osso esponjo é a região trabecular enquanto o osso compacto aparece como uma
massa sólida. Microscopicamente, a matriz extracelular é dividida em osso lamelar
(secundário) maduro com lamelas concêntricas dispostas ao redor de um canal
vascular e osso não lamelar (primário) em desenvolvimento, com disposição
23
irregular, não organizada das fibras colágenas e menor quantidade de cristais de
hidroxiapatita (KIERSZENBAUM, 2004; COTRAM; KUMAR; COLLINS, 2005;
SOLTAN; SMILER; CHOI, 2009).
Na figura 1, observa-se o osso lamelar que é constituído por matriz óssea e
osteócitos, apresenta os sistemas harvesianos ou osteons consistem em um
conjunto de lamelas dispostas ao redor de um canal vascular. Estes canais
vasculares podem ter duas orientações, quando transversais são denominados
canais de Volkmann (KIERSZENBAUM, 2004; SOLTAN; SMILER; CHOI, 2009).
As fibras colágenas mineralizadas formam as lamelas (3-7mm de largura), estas
podem se agrupar em arranjos de 3-8 lamelas em camadas concêntricas em torno
do sistema harversiano. Este sistema aparece como um cilindro de 200-250mm de
diâmetro. As lamelas também podem revestir o osso em arranjos de camadas
espessas circunferenciais externas em empilhamento (150-300mm) (RHO; KUHN-
SPEARING; ZIOUPOS, 1998).
Figura 1 - Organização do tecido lamelar.
Fonte: Adaptado de Kierszenbaum, 2004.
24
O osso é revestido pelo periósteo composto por duas camadas, interna
osteogênica e externa de fibras colágenas, vascularizadas e fibras colágenas que
penetram até as lamelas circunferenciais externas, as chamadas fibras de Sharpey,
conforme pode ser visto na figura 1 (KIERSZENBAUM, 2004).
O tecido ósseo é um tecido conjuntivo especializado formado por três tipos
celulares e um material mineralizado, a matriz óssea. Este conjunto forma um tecido
de sustentação resistente à pressão resultante dos componentes da matriz óssea
(STEVENS; LOWE, 2000).
Os tipos celulares osteoblastos, osteócitos, osteoclastos, as células progenitoras
de tecido ósseo e a matriz óssea mineralizada são constituintes do tecido ósseo
(LAFITA, 2003). Descritos cada um a seguir:
Osteoblastos: Células mononucleadas, núcleo esférico e citoplasma basófilo. São
as células responsáveis pela formação de colágeno, proteoglicanas e glicoproteínas,
formam o osteóide da matriz óssea e bem como sua mineralização. Também são
precursores dos osteócitos e participam ativamente no processo de remodelamento
ósseo (ROSS; ROMRELL, 1993; SILVA, 2009), conforme Figuras 2, 3 e 4.
Após a formação da matriz orgânica pelos osteoblastos, os osteoblastos fixos
nesta matriz emitem vesículas, estruturas arredondadas produzidas a partir da
membrana plasmática dos osteoblastos, liberadas e aderidas na matriz orgânica.
Estas vesículas são os sítios de nucleação da nHAp, são encontradas isoladas na
matriz, contém glicoproteínas e apresentam marcação para fosfatase alcalina.
Entende-se que a fosfatase alcalina hidrolisa os fosfatos disponibilizando para o
interior das vesículas e a concentração de cálcio aumenta através dos fosfolipídios
de membrana. Assim quando estas vesículas se rompem, ocorre a mineralização
extensa da matriz orgânica (MANOLAGAS, 2000; KATCHBURIAN; CERRI, 2002).
25
Figura 2 - Lâmina mostrando tecido ósseo primário (OP) e periósteo (P) (100x).
Fonte: Rheingantz e Machado, 2015.
Figura 3 - Lâmina mostrando tecido ósseo primário - osteoblastos (seta) e trabéculas com osteócitos (T) (100x).
Fonte: Rheingantz e Machado, 2015.
Osteócitos: Células derivadas dos osteoblastos, que se comunicam entre si,
localizadas nas trabéculas, responsáveis pela secreção de substâncias para a
manutenção do tecido (ROSS; ROMRELL, 1993; SILVA, 2009), conforme Figuras.3,
4 e 5.
Os osteócitos são o tipo celular mais encontrado no tecido ósseo, são menores e
tem formato elíptico, tem prolongamentos que situam nos canalículos ósseos e
26
estabelecem junções do “tipo gap” entre as células. Estas junções permitem a
sinalização celular das células da superfície e a manutenção do tecido ósseo
(MANOLAGAS, 2000; KATCHBURIAN; CERRI, 2002; CERRI, 2005).
Estas são células essenciais para a manutenção óssea e o remodelamento, já
que a apoptose dos osteócitos pode estimular a atividade de osteoclastos
(BOABAID; CERRI; KATCHBURIAN, 2001; CERRI, 2005).
Figura 4 - Lâmina mostrando Tecido ósseo primário - osteoblasto (seta) e osteóide (O) (400x).
Fonte: Rheingantz e Machado, 2015.
Figura 5 - Lâmina mostrando tecido ósseo primário: osteoblasto (Ob) e osteócito em formação (seta) (400x).
Fonte: Rheingantz e Machado, 2015.
27
Osteoclastos: Células multinucleadas com atividade fagocitária, responsáveis pela
degradação do tecido ósseo, formam as lacunas de Howship, área de reabsorção
óssea (ROSS; ROMRELL, 1993; SILVA, 2009; KOLLET; DAR; LAPIDOT, 2007). Os
osteoclastos emitem uma borda pregueada adjacente ao osso, secretam enzimas e
ácidos dissolvendo a matriz óssea e os sais, englobando os fragmentos e
devolvendo-os como produtos no sangue (SALGADO; COUTINHO; REIS, 2004;
GUYTON; HALL, 2011), Figura.6.
Os osteoclastos formam escavações na superfície óssea, denominadas lacunas
de Howship, a membrana celular exibe invaginações que são compartimentos com
borda em escova e zona clara, que promovem a desmineralização através da
liberação de enzimas em ambiente ácido (MANOLAGAS, 2000, KATCHBURIAN;
CERRI, 2002; KIERSZENBAUM, 2004; NOVACK; TEITELBAUM, 2008). Além disso,
alguns estudos sugerem que os osteoclastos tem atividade fagocitária de restos
celulares e/ou de osteócitos e osteoblastos em apoptose (BOABAID; CERRI;
KATCHBURIAN, 2001; CERRI; BOABAID; KATCHBURIAN, 2003).
Figura 6 - Lâmina mostrando osteoclasto (Oc) e osteoblasto (seta) (400x).
Fonte: Rheingantz e Machado, 2015.
A matriz óssea é constituída de duas partes: região mineralizada e região
orgânica (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). A fase mineral do osso compreende
aproximadamente 60 a 70% do peso total do osso seco, enquanto que o restante é
constituído por matéria orgânica (POSNER et al., 1984).
28
Da matriz orgânica, cerca de 90% a 95% são fibras colágenas, constituída de
colágeno tipo I, e o restante é substância fundamental composta principalmente de
glicoproteínas, proteoglicanas, condroitinos e ácido hialurônico. A matriz óssea
possui depósitos de grandes quantidades de sais de cálcio. O cálcio e o fosfato dão
origem aos cristais semelhantes à HAp cuja fórmula é Ca10(PO4)6(OH)2,
predominantes na matriz óssea, porém há presença de outros íons como potássio,
sódio, citrato, magnésio e potássio, em menor proporção conjugados aos cristais de
hidroxiapatita. (SILVA, 2009; GUYTON; HALL, 2011).
Os cristais de HAp são unidos à fibra colágena e conferem ao osso a força tensil
e compressível (NIG; GRIMSTRON, 1994; GUYTON; HALL, 2011), conforme figura
7.
A nanoestrutura do osso, compreende o colágeno fibrilar e os cristais
incorporados. O tamanho dos cristais de nHAp carbonatada variam de 50nm de
comprimento e 25nm de largura, e alguns são 2-3nm de espessura enquanto que as
várias formas de colágeno são fibrilas 1,5-3,5nm e fibras de 50-70nm (ZIV; WEINER,
1994; RHO; KUHN-SPEARING; ZIOUPOS, 1998).
Os cristais de nHAp são em formato de placas e podem estar dispostos dentro
dos espaços entre as fibrilas de colágeno. A primeira mineralização é intrafibrilar e
posteriormente interfibrilar, ou seja, entre as fibras, o colágeno é mineralizado até
preencher um espaço de 50 a 60% nos ossos humanos (LEES; DAVIDSON, 1977).
29
Figura 7 - Desenho esquemático de uma fibra de colágeno mineralizada. Cristais de nanohidroxiapatita (verde) incorporados entre as triplas hélices de colágeno (cilindros brancos).
Fonte: Adaptado de: Rho, Kuhn-Spearing e Zioupos, 1998; Huster e Pretzsch, 2008.
Existem proteínas não colágenas (NCPs) na matriz óssea, secretadas pelos
osteoblastos e incluídas na mesma. A função destas proteínas ainda não é bem
conhecida, porém acredita-se que desempenham função na sinalização celular,
interação com fatores de crescimento e citocinas. A proteína osteonectina tem
função específica por ter afinidade com o colágeno, ligando-se à apatita óssea
participando da mineralização da matriz óssea na presença de colágeno
(MACDONALD; GOWEN, 1993; SOMMERFELDT; RUBIN, 2001; BOIVIN;
MEUNIER, 2003).
Estas proteínas, incluindo fosfoproteínas, tais como osteopontina, sialoproteína,
osteonectina, e osteocalcina, podem ter um papel na regulação do tamanho, da
orientação e da cristalinidade da hidroxiapatita. Por meio destas proteínas, pode
ocorrer a quelação de cálcio ou a liberação enzimática de fósforo, ou seja estas
proteínas podem servir como um reservatório de cálcio ou fosfato de íons para
formação mineral (RHO; KUHN-SPEARING; ZIOUPOS, 1998).
Os osteoblastos secretam moléculas de colágeno e proteoglicanos, gerando o
tecido osteóide, o qual os sais de cálcio se precipitam formando os cristais de
hidroxiapatita. Os primeiros cristais são amorfos e por reações de adição de átomos,
reabsorção e reprecipitação dão origem aos cristais de hidroxiapatita (HEIMANN,
2002; GUYTON; HALL, 2011).
30
2.1.2 Osseointegração
O tecido ósseo tem grande potencial regenerativo porque os osteoblastos e
osteoclastos mantêm atividade permanente. O processo ósseo regenerativo
apresenta a fase temporária de trabéculas imaturas onde as fibras colágenas se
entrelaçam, após ocorre à modelação do osso primário que dá origem ao osso
lamelar. Vários fatores de crescimento estão envolvidos neste processo, como por
exemplo: a proteína morfogênica do osso (BMP) que induz a diferenciação celular
do tecido conjuntivo em células osteoprogenitoras que formam o tecido ósseo
(MONTENEGRO; FRANCO, 2004; HERNÁNDEZ et al., 2012).
O processo de regeneração óssea visa o estabelecimento da organização da
anatomia e funcionalidade do tecido lesado. Este processo depende de diversos
fatores como a migração de células osteoprogenitoras, a liberação de fatores de
crescimento que induzem o remodelamento ósseo, a angiogênese, fatores físicos e
mecânicos (ALDECOA, 2001; HERNÁNDEZ et al., 2012). A principal estratégia da
engenharia de tecidos compreende a utilização de suportes para crescimento celular
e/ ou a associação de fatores de crescimento (CARANO; FILVAROFF, 2003).
A osteogênese está relacionada à angiogênese, sendo que o tecido ósseo é um
tecido altamente vascularizado. No processo de angiogênese, os macrófagos e
células gigantes nucleadas secretam os fatores pró-angiogênicos, na resposta
imediata após implantação do biomaterial. Por meio da vascularização, as células
recebem os fatores de crescimento, portanto o comprometimento na angiogênese
limita a regeneração óssea (SANTOS; REIS, 2010; GHANAATI et al., 2011).
As BMPs são glicoproteínas responsáveis pela sinalização de células
osteoprogenitoras para as regiões de formação óssea. São proteínas reguladoras da
reparação óssea da família do fator de crescimento transformador β (TGFβ),
estimulam a diferenciação de células mesenquimais em células especializadas
(WOZNEY, 1998; SOMMERNAN et al., 1983; SANTOS et al., 2005).
Na reparação de um defeito ósseo, o tecido conjuntivo pode dificultar a formação
óssea, neste caso é indicado o tratamento com enxertia óssea, que consiste no
preenchimento do defeito com material osteoindutivo (EGGERS; MEEDER, 1994;
NADE, 1994). E o implante com osso autógeno possui desvantagens como
comprometimento da região doadora e da recuperação do paciente, assim como
31
escassez de fonte (OHTSUKI; KAMITAKAHARA; MIYASAKI, 2007; MACHADO,
2008). Devido a estas desvantagens, os biomateriais tem sido a alternativa mais
promissora para reconstrução de tecidos e órgãos afetados por alguma doença,
atualmente as técnicas de produção permitem a manipulação da estrutura e das
características de superfície para melhorar a interação do biomaterial com os
sistemas vivos (ORÉFICE; PEREIRA; MANSUR, 2012).
Bränemark (1983) estudando implantes de titânio definiu o conceito de
osteointegração como a região de adesão entre o tecido ósseo e a superfície de um
bioimplante.
O mecanismo de reparação do tecido ósseo pela osteointegração é dividido em
três fases: osteoindução, neoformação e remodelamento. A osteoindução baseia-se
na migração para diferenciação das células na superfície do implante. A
neoformação resulta em uma matriz mineralizada disposta sobre a superfície do
implante. A capacidade de ancoragem, ou seja, da adesão celular depende das
propriedades do bioimplante. E a remodelação cria a interface osso-implante que
consiste na formação do novo tecido ósseo (DAVIES, 1998).
Após a implantação do biomaterial, uma série de eventos ocorrem na superfície
do implante. A interação inicial e a formação óssea dependem das características de
superfície do biomaterial (LEMONS, 2004).
Primeiro ocorre à interação do implante com o sangue, as proteínas são
dinamicamente adsorvidas e inicia um processo inflamatório, que é seguido pela
formação óssea, por meio do recrutamento e migração de células osteogênicas para
a superfície do implante (DAVIES, 2003; WILSON et al., 2005; DAVIES, 2007).
A cascata biológica inicia na osteocondução, a superfície do implante deve
promover a estabilização de um coagulo de fibrina que garante a fixação das células
osteoprogenitoras. A formação óssea ocorre quando estas células diferenciam e
secretam a matriz formando um osso novo. A última fase, o remodelamento é uma
fase mais lenta e organiza o tecido ósseo que teve a formação aleatória (DAVIES,
2003; DAVIES, 2007).
Os osteoblastos sintetizam e depositam a matriz extracelular à matriz orgânica
não mineralizada do osso e controlam a mineralização do osteóide. Com isso, seus
principais produtos são colágeno tipo I, osteocalcina, osteopontina, sialoproteína e
fatores de crescimento membros da família das BMPs. Este tipo celular em atividade
32
de formação óssea é reagente para fosfatase alcalina, esta reação cessa quando se
encontra na forma de osteócitos na matriz (KIERSZENBAUM, 2004).
O processo de remodelamento ósseo consiste na renovação do tecido ósseo,
com participação dos osteoblastos e osteoclastos, exercendo funções antagônicas.
(MANOLAGAS, 2000; KODAMA et al., 1991; FIRESTEIN, 2003; LAFITA, 2003;
GILMAN et al., 2006; YASUDA et al., 1998; HOFBAUER et al., 1999; CHAPPARD et
al., 2003; RAISZ; RODAN, 2003; TANAKA et al., 2005; SILVA, 2009).
Os osteoclastos são originados da diferenciação de monócitos provenientes de
vasos sanguíneos, esta diferenciação é regulada por fatores liberados pelos
osteoblastos e pelas células do estroma da medula óssea. Estas células são
responsáveis pelo ambiente ácido de reabsorção, que favorece a dissolução de
componentes inorgânicos por ação enzimática (trifosfatase de adenosina) e pela
degradação da matriz orgânica pela ação da protease lisossomal, a catepsina K,
seguida da substituição com um novo tecido ósseo pelos osteoblastos
(KIERSZENBAUM, 2004; NOVACK; TEITELBAUM, 2008), conforme figura 8.
Figura 8 - Esquema simplificado de remodelamento ósseo.
Fonte: Adaptado de Seeman e Delmas, 2006.
O processo de remodelamento ocorre em regiões denominadas BRUs, acrônimo
do idioma inglês, cuja sigla significa Bone Remodeling Units, nas superfícies ósseas
(MANOLAGAS, 2000; KODAMA et al., 1991; FIRESTEIN, 2003; LAFITA, 2003;
GILMAN et al., 2006; YASUDA et al., 1998; HOFBAUER et al., 1999; CHAPPARD et
al., 2003; RAISZ; RODAN, 2003; TANAKA et al., 2005; SILVA, 2009). Células
33
osteoblásticas produzem o fator M-CSF (Fator estimulador de colônias de
macrófagos) que atua na diferenciação dos monócitos em osteoclastos (BOYLE;
SIMONET; LACEY, 2003).
O receptor ativado do fator Kappa β nuclear (RANK) está presente na superfície
dos osteoclastos e o ligante deste fator (RANKL) é encontrado em osteoblastos.
Com a ativação da ligação RANK com RANKL, ocorre à maturação dos precursores
de osteoclastos e a migração para a formação de lacunas de Howship, onde ocorre
a reabsorção óssea. A ligação do fator e receptor estimula a função dos osteoclastos
e a diferenciação destes (Figura 9) (KODAMA et al., 1991; GILMAN et al., 2006;
YASUDA et al., 1998; HOFBAUER et al., 1999; MANOLAGAS, 2000; FIRESTEIN,
2003; LAFITA, 2003; CHAPPARD et al., 2003; RAISZ; RODAN, 2003; TANAKA et
al., 2005; SILVA, 2009).
Figura 9 - Mecanismo de Remodelamento ósseo.
Fonte: Adaptado de Souza, 2009.
A proteína osteoprotegerina (OPG) sintetizada pelos osteoblastos é um regulador
antagonista das ações da ligação RANK-RANKL, é uma proteína com afinidade para
RANKL e impede a interação RANK-RANKL, inativando os osteoclastos (Figura.10).
Sendo que as interleucinas, a prostanglandina e fator de necrose tumoral estimulam
34
as atividades de reabsorção óssea, enquanto que o fator de crescimento β (TGβ)
aumenta a apoptose dos osteoclastos. E os hormônios tireoidianos inibem a
secreção de OPG, enquanto o estrógeno aumenta os níveis de OPG, inativando
osteoclastos e aumentando a produção de TGβ, enquanto que a calcitonina também
participa da regulação do processo, inibindo os osteoclastos. Além disso, os
paratormônios (PTH) regulam a concentração de cálcio no líquido extracelular,
recrutam células precursoras de osteoclasto para formar as BRUs e aumentam a
expressão do RANKL favorecendo a osteoclastogênese (KODAMA et al., 1991;
GILMAN et al., 2006; YASUDA et al., 1998; HOFBAUER et al., 1999; MANOLAGAS,
2000; FIRESTEIN, 2003; LAFITA, 2003; CHAPPARD et al., 2003; RAISZ; RODAN,
2003; KIERSZENBAUM, 2004; TANAKA et al., 2005; SILVA, 2009).
Figura 10 - Mecanismo de remodelamento ósseo, ação antagonista da OPG.
Fonte: Adaptado de Souza, 2009.
Há a necessidade de mais estudos para compreensão do processo de
osteointegração, pois se acredita que as propriedades de um biomaterial interfiram
diretamente na qualidade do osso formado, ou seja, as características de superfície
como hidrofilicidade, rugosidade, porosidade e bioatividade são fatores que
35
determinam a formação óssea, assim como o metabolismo do paciente também
interfiram neste processo (MACHADO, 2008; THELEN; BARTHELAT; BRINSON,
2004; VANDROVCOVÁ; BAČÁKOVÁ et al, 2011; BACAKOVA et al., 2011; BAUER
et al., 2013; WU et al., 2014).
2.2 Biomateriais reabsorvíveis: um desafio para a aplicação ortopédica
A substituição total ou parcial de tecidos vivos por biomateriais depende das
interações físicas, químicas e biológicas. Sendo assim, o desenvolvimento de um
biomaterial reabsorvível implica no ajuste das características e propriedades de
superfície para obter uma interface biologicamente ativa. Este ajuste é um desafio
para a ciência dos materiais, visto que há uma série de fatores que interferem no
processo de regeneração do tecido biológico, como a composição do biomaterial,
características físico-químicas, propriedades de superfície e arquitetura do
arcabouço (BACAKOVA et al., 2011; ORÉFICE; PEREIRA; MANSUR, 2012).
Porém, a principal dificuldade para osseointegração consiste no acúmulo de
tecido conjuntivo na região lesada, impedindo a osteogênese, além do que a maioria
dos biomateriais desenvolvidos não tem a capacidade de promover a vascularização
e maturação osteogênica, assim como a baixa resistência mecânica para aplicação
óssea (CAFFESSE et al., 1990; ARMENTANO et al., 2009; SANTOS; REIS, 2010;
BOSE; ROY; BANDYOPADHYAY, 2012).
O implante ósseo ideal deve ser biocompatível, biorreabsorvível e mimetizar a
estrutura porosa do osso esponjoso para facilitar a rápida vascularização e
substituição progressiva do tecido recém-formado e deve-se moldar as dimensões
da lesão e manter o formato até a reabsorção total (TATAKIS; PROMSUDTHI;
WIKESJÖ, 1999; BRYDONE; MEEK; MACLAINE, 2010; HANNOUCHE; PETITE;
SEDEL, 2001).
Com isso, estratégias têm sido utilizadas para biomimetizar a composição
orgânica e inorgânica do osso, e obter os processos de mineralização naturais (LIU
et al., 2012). Pesquisas com materiais poliméricos mostraram que os mesmos
apresentam biocompatibilidade, neoformação óssea, além das vantagens de
reabsorção com transferência gradual de carga, sendo desnecessária uma segunda
cirurgia para remoção do implante (LIM et. al, 2008; MEROLLI et al., 2001;
36
BEACHLEY; WEN, 2010; JIN et al., 2013). Os substitutos ósseos devem preencher
o espaço e promover uma degradação controlada com a recuperação do tecido
lesionado, garantindo a estabilidade, a arquitetura e a função fisiológica (DAMIEN et
al., 2003; WALSH et al., 2003).
Materiais poliméricos são amplamente utilizados como biomateriais devido à
composição química e estrutura bem definidas. Materiais não degradáveis são
vantajosos porque podem manter sua integridade estrutural e suportar altas cargas
mecânicas, porém podem apresentar uma resposta fibrótica devido a incapacidade
de interagir com o tecido biológico e sofrer a longo prazo a deterioração natural que
pode acarretar resposta inflamatória. Em contraste, materiais bioreabsorvíveis são
vantajosos porque a degradação pode ser controlada, porém ainda assim os
subprodutos podem gerar resposta inflamatória que deve ser avaliada inclusive para
as células vizinhas (TAYLOR et al., 1994; LAGARON; LOPEZ-RUBIO, 2011;
HALLAB, 2012; JIN et al., 2013).
Materiais poliméricos degradáveis que mantêm as propriedades por períodos
prolongados, possuem degradação in vivo muito lenta, em geral, mais de três anos,
este é o aspecto desfavorável, pois não há evidências de que, depois de tanto
tempo, o espaço ocupado pelo bioimplante será substituído por osso recentemente
formado. Um bioimplante polimérico ideal seria aquele que degrada em poucos
meses (MEROLLI et al., 2001; WILDEMANN et al., 2005).
Os tratamentos cirúrgicos também incluem o transplante de osso autógeno, que
apesar da ausência de reações inflamatórias, compromete a recuperação do
paciente e tem uma alta taxa de complicações pós operatórias (MISCH, 2006).
Outros dispositivos para próteses compreendem os materiais metálicos e cerâmicos,
que não modelam com o tempo, não podem acompanhar o crescimento do paciente
e nem mudar a forma de acordo com a carga aplicada no local (PUPPI et al., 2010).
Biomaterial reabsorvível são totalmente eliminados por vias metabólicas e geram
subprodutos que não causam citotoxidade (VERT; LI; GARREAU, 1992). Este
conceito foi introduzido a partir das primeiras suturas biodegradáveis na década de
40 e a partir disto têm sido constantes as pesquisas para substituição de tecidos
biológicos por estes materiais.
Atualmente polímeros reabsorvíveis são utilizados para diversas aplicações
biológicas, como fios de sutura, arcabouços para engenharia de tecidos, implantes e
37
revestimentos em cirurgias ortopédicas e odontológicas e mais recentemente como
membranas para regeneração ósseo guiada (ROG).
Os primeiros estudos sobre regeneração ósseo guiada foram conduzidos por
Campbell e Basset, tratava-se da separação dos espaços lesionados para
regeneração seletiva de nervos periféricos por meio de materiais filtros (CAMPBELL;
BASSETT, 1956). Esta técnica compreende a aplicação de uma barreira de
membrana entre o tecido ósseo e o periósteo a fim de isolar o crescimento de tecido
conjuntivo e selecionar as células do endósteo para promover a osteogênese no
interior da membrana, esta técnica é possível para cirurgias de reconstrução óssea
(DAHLIN et al., 1990 SILVA, 2005; LACERDA; LACERDA, 2010).
Para a regeneração óssea bem sucedida, faz-se necessário que o biomaterial
promova além da seleção tecidual, a ausência de resposta inflamatória e promoção
da angiogênese (DAHLIN et al., 1988; SCHENK et al., 1994; HERNÁNDEZ et al.,
2012). Biomateriais poliméricos devem apresentar interação biológica, viabilidade
celular, biocompatibilidade, favorecer a regeneração tecidual e manuseio clínico
adequado (SCANTLEBURY, 1993; ZHANG et al., 2014).
Recentes avanços no desenvolvimento e funcionalização de materiais poliméricos
biocompatíveis, consistem em tecnologias de processamento capazes de produzir
uma estrutura com características específicas, como porosidade e
biodegradabilidade, bem como os requisitos específicos associados com local do
implante, como forma e tamanho (PUPPI et al., 2010).
Para o desenvolvimento de um biomaterial, diversas disciplinas como ciências
dos materiais, engenharia, ciências biológicas e medicina unem-se para garantir
todas as características apropriadas que devem integrar o projeto do novo
biomaterial, estes fatores são mostrados na figura 11 (SEAL; OTERO; PANITCH,
2001).
38
Figura 11 - Ilustração de como os conhecimentos de materiais, biologia, medicina e engenharia devem ser integrados para alcançar a regeneração de tecidos.
Fonte: Adaptado de Seal, Otero e Panitch, 2001.
Do ponto de vista tecnológico, o grande desafio consiste em projetar um
arcabouço com porosidade e estrutura adequada para substituir o tecido por um
período prolongado até a regeneração total. Em particular, polímeros reabsorvíveis
com cerâmicas bioativas em estruturas 3D são promissores para atender estes
requisitos (PUPPI et al., 2010; PINA; OLIVEIRA; REIS, 2015).
2.2.1 Polímeros Bioreabsorvíveis: PDLLA
Polímeros são macromoléculas formadas por cadeias longas de meros que são
unidades repetidas e que são unidas por ligações covalentes, apresentam
sequências de átomos de carbono com ou sem heteroátomos de oxigênio e
nitrogênio em sua estrutura (CALLISTER JUNIOR, 2002; ORÉFICE; PEREIRA;
MANSUR, 2012).
O peso molecular, a cristalinidade e as transições térmicas são as características
primordiais para caracterização. A cristalinidade dos polímeros influencia
diretamente na aplicação e pode ser obtida por diferentes métodos: calorimetria
diferencial exploratória, difração de raio X e espectroscopia de infravermelho
(MANO; MENDES, 2001; CARNEVAROLO JUNIOR, 2003; ARMENTANO et al.,
2010; ORÉFICE; PEREIRA; MANSUR, 2012).
39
O polímero cristalino é utilizado para a prática ortopédica, pela resistência
mecânica mais elevada do que os polímeros amorfos que geralmente tem função na
liberação de fármacos (MANO; MENDES, 2001; ORÉFICE; PEREIRA; MANSUR,
2012).
Nos últimos anos, polímeros biodegradáveis tais como poli (ácido glicólico), poli
(L-ácido láctico) e copolímeros como poli (ácido L-láctico-co-glicólico) tem sido
pesquisados para aplicações como matriz extracelular em implantes (HUTMACHER
et al., 2000; AGRAWAL; RAY, 2001; BARBER; DOCKERY; COWDEN, 2013; LI et al,
2013; PATRASCU et al., 2013; BAO et al., 2014).
O copolímero PDLLA pertence à família dos poliésteres alifáticos da classe dos
poli (alfa hidroxiácidos) (BARBANTI; ZAVAGLIA; DUEK, 2005; SARAVIN et al.,
2008).
O PDLLA foi aprovado como implante pelo FDA (Food and Drug Administration)
nos Estados Unidos, trata-se de um polímero racêmico que não mostra atividade
óptica, totalmente amorfo, apresenta Tg na faixa de 50º a 60ºC, módulo de
elasticidade de 1,9 GPa e tempo de degradação de 12-16 meses (MIDDLETON;
TIPTON, 2000; ELKE; ROLF-JOACHIM; WOLF-DIETER, 2003; GUPTA; KUMAR,
2007; OKAMOTO; JOHN, 2009; REDDY et al., 2013). As propriedades mecânicas
são inferiores em relação ao PLLA, um polímero semicristalino. Devido à estrutura
amorfa do PDLLA, a água tem maior facilidade de difusão e absorção, resultando
em degradação mais rápida do que a do PLLA (MIDDLETON; TIPTON, 2000;
GUTWALD et al, 2002).
Este copolímero possui dois isômeros (L e D) estes dois homopolímeros formam
o copolímero poli (ácido D,L-Láctico), na figura 12, esta mistura racêmica não forma
uma estrutura organizada cristalina e consequente este polímero é amorfo (DOI;
STEINBÜCHEL, 2002; GUPTA; KUMAR, 2007).
40
Figura 12 - Estereoisômeros do ácido láctico.
Fonte: Adaptado de Textos Científicos, 2015.
O PDLLA pode ser obtido por policondensação direta do dímero cíclico do ácido
lático levando a formação de produto de baixo peso molecular ou por polimerização
por abertura do anel do dímero cíclico do ácido láctico, que resulta em um produto
de alta massa molecular, o produto obtido tem a fórmula apresentada na figura 13
(LUNT, 1998; GARLOTTA, 2001). Figura 13 - Fórmula do polímero PDLLA.
Fonte: Barbanti, Zavaglia e Duek, 2005.
O tempo de biodegradação depende do peso molecular, cristalinidade e tamanho
do material. A degradação do PDLLA ocorre por hidrólise, sendo que polímeros
amorfos degradam com mais facilidade, mas também apresentam propriedades
mecânicas inferiores (MIDDLETON; TIPTON, 2000; GUTWALD et al, 2002).
Inicialmente o PDLLA sofre hidratação, em seguida ocorre hidrólise das ligações
ésteres originando monômeros solúveis atóxicos. O ácido lático é um produto
gerado da degradação hidrolítica do poli (L-ácido láctico), este produto é
metabolizado pelo ciclo do ácido carboxílico. Após a hidrólise segue o processo de
oxidação do ácido lático que são convertidos a ácido pirúvico. Na presença de Acetil
41
Coenzima A, ocorre a liberação de CO2 e a decomposição de citrato que será
incorporado no ciclo de Krebs e eliminado como dióxido de carbono e água,
conforme demostrado na figura 14 (ALI et al., 1993; MANO; MENDES, 2001; ELKE;
ROLF-JOACHIM; WOLF-DIETER, 2003; ARMENTANO et al., 2010). Figura 14 - Rota metabólica de bioreabsorção do PDLLA.
Fonte: Adaptado de Barbanti, Zavaglia e Duek, 2005.
As propriedades de superfícies de biomateriais influenciam diretamente o
comportamento celular, uma estrutura 3D promove uma regeneração diferenciada
sendo comprovada na organização da estrutura da neoformação e influencia
diretamente na vascularização (BERNER et al., 2014).
Poliésteres, incluindo poli (ácido D, L-láctico) (PDLLA) e poli (ácido glicólico)
(PGA), são amplamente utilizados na Engenharia de tecidos, principalmente por
causa de sua boa biodegradabilidade (SAHOO; PANDA; LABHASTWAR, 2005;
BARBER; DOCKERY; COWDEN, 2013; LI et al, 2013; PATRASCU et al., 2013; BAO
et al., 2014). Polímeros derivados a partir de ácido láctico têm mostrado, uma
resposta clínica melhor do que os derivados de ácido glicólico, uma das primeiras
substâncias a serem testadas clinicamente e para o qual havia sido documentada
uma série de reações inflamatórias adversas (BÖSTMAN, 1992). No entanto,
devido à sua natureza hidrofóbica, a biocompatibilidade destes materiais ainda
permanece como um problema para aplicação biológica (CHEN et al., 2003).
42
Uma eficiente abordagem para regeneração óssea consiste no desenvolvimento
de scaffolds poliméricos com cerâmicas osteoindutoras biomiméticas, com nano a
microporosidade, bioativas e bioreabsorvíveis (WOODRUFF et al., 2007; RAI et al.,
2010; LAGARON; LOPEZ-RUBIO, 2011).
2.2.2 Nanocompósitos poliméricos: PDLLA, Nanotubos de Carbono e
Hidroxiapatita
A regeneração de tecidos implica a interação bem sucedida entre células,
sinais biológicos e biomateriais. Com o advento da nanotecnologia, avanços têm
sido feitos no campo de biomateriais, vários biomateriais incluindo nanocristais,
nanofibras, nanoesferas e nanoporos, têm sido desenvolvidos para as mais diversas
aplicações biológicas. Nanocompósitos que mimetizam a composição e estrutura de
tecidos mineralizados e simulam a estrutura da matriz extracelular, tem sido
estudados para proporcionar a regeneração tecidual. Nanopartículas quando
incorporadas em polímeros em estruturas 3D oferecem uma liberação controlada de
moléculas osteoindutoras que são responsáveis pela sinalização celular para o
reparo tecidual (SCHUCH; BEVILAQUA; FAGAN, 2007; WEI; MA, 2008; LAGARON;
LOPEZ-RUBIO, 2011).
Pesquisas vêm sendo realizadas visando modificações de características dos
biomateriais poliméricos, tais como propriedades mecânicas, tempo de degradação,
molhabilidade e topografia após a incorporação de nanopartículas em matriz
polimérica (ZHENG et al., 2006; HABRAKEN; WOLKE; JANSEN, 2007; JENSEN et
al., 2010; LIUYUN et al., 2012; PÉREZ et al., 2013). As características da superfície
do material podem contribuir de forma eficaz para a adesão celular e a superfície
porosa favorecem as interações celulares (HUTMACHER, 2001; ZHAO et al., 2009;
PÉREZ et al., 2013), que também dependem da rugosidade de superfície (ENGEL et
al., 2008; BAUER et al., 2013; WU et al., 2014).
O PDLLA tem sido muito pesquisado para arcabouço celular devido à sua
biocompatibilidade e rápida degradação in vivo (SACHLOS; CZERNUSZKA, 2003;
HASEGAWA et al., 2005; ZHANG et al., 2006; ALVES et al., 2008; WU et al., 2008;
HELEN; GOUGH, 2008; YUNOS et al., 2013).
43
No entanto, a interação célula com o biomaterial é limitada pela hidrofobicidade
dessas membranas (CHEN et al., 2003; NAIR; LAURENCIN, 2007).
Estudos recentes de nanocompósitos a base de PDLLA e nanopartículas
apresentaram bons resultados como arcabouço para a regeneração de osso e
cartilagem (HASEGAWA et al., 2005; WU et al., 2008; HELEN; GOUGH, 2008;
YUNOS et al., 2013). A incorporação de nanopartículas, tais como nanotubos de
carbono (CNT) e nHAp na matriz polimérica pode ser uma alternativa para melhorar
as características físicas do PDLLA.
Os CNT são estruturas estáveis que podem ser associadas a outras moléculas e
apresentam várias aplicações, devido às suas propriedades físico-químicas
(WEBSTER et al., 2004; KLUMPP et al., 2006; SCHUCH; BEVILAQUA; FAGAN,
2007; HARRISON; ATTALA, 2007; AOKI et al., 2008; ABARRATEGI et al., 2008;
LAREDO et al., 2010; LOBO, 2011).
Alguns autores relataram efeito citotóxico dos CNT, este efeito deve-se a
hidrofobicidade e presença de componentes metálicos no processo de produção
(HURT; MONTHIOUX; KANE, 2006). Os CNT desenvolvidos por Lobo, 2011, pela
técnica de deposição química a partir da técnica de fase de vapor assistida por
microondas (MWCVD) são biocompatíveis e não apresentam citotoxicidade. A
característica hidrofílica dos nanotubos de carbono, desenvolvidos por Lobo, 2011,
facilita a superfície de contato com as proteínas de adesão devido à molhabilidade,
sendo esta característica importante para os processos de adesão, proliferação e
diferenciação celular (LOBO, 2011). Estas nanopartículas são uma forma alotrópica
do carbono, a alotropia é definida como a capacidade de um átomo apresentar
várias estruturas cristalinas. Existem 4 formas alotrópicas do carbono: diamante,
grafite, fulerenos e nanotubos (SCHUCH; BEVILAQUA; FAGAN, 2007;
NASCIMENTO, 2008).
Existem dois tipos de CNT: de paredes múltiplas (MWCNT) com diâmetros de 2–
100 nm e de paredes simples (SWCNT) com diâmetros de 0.4–2 nm (IIJIMA, 1991;
WANG et al., 2000; LIN et al., 2004; CHEN et al., 2006). Os MWCNT mostrados na
figura 15, possuem duas ou mais camadas simples de grafite fechadas nas
extremidades, garantindo estabilidade (LOBO, 2011).
44
Figura 15 - Esquema de um nanotubo de parede múltiplas.
Fonte: Ferreira e Rangel, 2009.
Lobo et al. (2011) apresentaram a adesão celular e o teste imunocitoquímico de
fibroblastos cultivados sobre VACNT-O, estas nanopartículas favorecem a adesão e
espalhamento celular, assim como a formação de monocamada em seis dias de
cultura.
Em estudo comparativo sobre o tamanho das nanopartículas e os efeitos
celulares, os osteoblastos tiveram uma melhor resposta de adesão e proliferação
celular em CNT do que em grafeno, porque os CNT apresentam uma estrutura de
nanomalha porosa onde as células podem receber fatores de crescimento e
nutrientes com facilidade (WATARI et al., 2009).
Estas nanopartículas tem capacidade de biomimetizar os tecidos por serem
análogos aos compostos da matriz extracelular e são promissoras alternativas para
medicina regenerativa (KLUMPP et al., 2006; HARRISON; ATTALA, 2007;LAREDO
et al., 2010; LEE et al., 2011; LOBO et al., 2011). A associação de HAp e CNT tem
sido pesquisada, devido às suas propriedades de condutividade elétrica
(MACDONALD et al., 2005; HARRISON; ATTALA, 2007; LOBO et al., 2011) a
capacidade de ancoragem e sustentação celular que influência a regeneração (LEE
et al., 2011; LOBO et al., 2011).
A nHAp é um mineral biocompatível, que é bioativo na formação de matriz
mineralizada em tecido ósseo. A imersão de VACNT-O em fluido corporal simulado
(SBF) a 37°C, promove o desenvolvimento de apatitas biológicas na superfície do
45
material, com características de formato globulares, conforme visto na figura 16
(LOBO et al., 2010; IRINEU et al., 2012).
Figura 16 - Micrografia de apatitas globulares produzidas pela precipitação em SBF.
Fonte: Marsi, 2012.
O método de imersão em SBF imita a formação in vitro da apatita biológica em
camada que atua como uma ponte para a fixação e crescimento das células no
biomaterial (KOKUBO; TAKADAMA, 2006). Por conseguinte, a capacidade para
formar apatita sobre a superfície é um resultado significativo na determinação do
grau de bioatividade do material como um implante ósseo. O processo de
biomineralização é acelerado por imersão das amostras em solução de SBF (5×) a
pH 7,4 (BARRERE et al., 2002b), mas este método pode favorecer a precipitação de
carbonato de cálcio (OYANE et al., 2003). A concentração de magnésio na solução
proposta por Barrere et al. (2002b) minimiza tal precipitação e favorece o
revestimento homogêneo. Os resultados demonstraram a formação de uma camada
globular nanométrica indicando uma apatita nanocristalina amorfa e carbonatada na
superfície dos VACNT-O. Resultados semelhantes foram obtidos por Barrere sobre
substratos de revestimento de titânio. A nucleação da apatita é obtida pela
hidrofilicidade dos VACNT-O, pela técnica de plasma de superfície (WANG et al.,
2009a; PRASERTSUNG et al., 2010) que incorpora grupos carboxílicos polares na
superfície do material. Os íons catiônicos são atraídos para a superfície dos VACNT;
Íons Ca2+ são combinados com grupos de ácido carboxílico polares (LI et al., 2010),
46
tais como grupos COOH, que estão expostas na superfície do material, favorecendo
a deposição de hidroxiapatita. Os íons Mg2+, inibem a formação de cristais maiores
(BARRERE et al., 2002a) e promovem a deposição homogênea de estruturas
globulares de tamanho nanométrico.
Os íons Ca2+ liberados a partir de partículas CaCO3- reage com e
para formar nHAp e agem como sítios ativos para a formação de cristais de calcita.
Esta camada é produzida por uma reação de dissolução-precipitação que promove a
nucleação de cristais, por conseguinte, estas nHAp promovem a adesão das células
na superfície do biomaterial (ABBONA; BARONNET, 1996; GUO et al., 2009).
Diversos métodos foram descritos para a produção de HAp na superfície de
nanotubos de carbono como revestimentos por eletroforese, deposição
eletroquímica, imersão em SBF, sol-gel, aerossol e pulverização de plasma spray.
Ainda assim, com todas estas técnicas, há uma dificuldade descrita na literatura
sobre a produção de HAp cristalina, estequiométrica (Ca/P de 1,67) e homogênea
(KAR; RAJA; MISRA, 2006).
Lobo et al. (2010) relataram um novo método para obter cristais nHAp em forma
de placa sobre VACNT-O usando a eletrodeposição direta e demonstraram que
osteoblastos humanos proliferam para a formação de osso na superfície dessas
amostras. As vantagens deste método de produção consistem na obtenção de um
filme fino, cristalino e uniforme por meio de um processo rápido, eficiente e de baixo
custo. A figura 17 mostra a morfologia dos nanocristais obtidos por Lobo et al.
(2013).
Figura 17 - (a) seção transversal, detalhes de nanocristais de nHAp. (b) detalhes de nanocristais nHAp do tipo placa após o processo de eletrodeposição.
Fonte: Lobo et al., 2013.
47
Nesta tese avaliamos o comportamento das nHAp produzidas por eletrodeposição
e imersão em SBF em matriz polimérica objetivando um material que ofereça uma
regeneração óssea mais rápida com total reabsorção do polímero. Além disso, este
biomaterial foi produzido por meio de uma técnica de produção simples, baixo custo
e flexível para utilização em diversas situações ortopédicas e com aplicação em
larga escala pela indústria.
O maior componente inorgânico do osso é a HAp, mas apenas biocerâmicas ou
polímeros isolados parecem não atender todos os requisitos para regeneração
óssea principalmente em grandes perdas ósseas. Sendo assim, uma alternativa
promissora é um nanocompósito de polímeros com HAp, porque a HAp tem
propriedade de osteocondutividade e o polímero oferece a estrutura porosa ideal
para a ancoragem das células. A nHAp quando incorporada na matriz polimérica
oferece um aumento de rugosidade de superfície e hidrofilicidade que favorecem a
adesão e proliferação celular (WEBSTER et al., 2000; LEGEROS, 2002;
LEWANDROWSKI et al., 2000; WOODRUFF et al., 2007; RAI et al., 2010; WANG et
al., 2011; PÉREZ et al., 2013; KHOULENJANI et al., 2013; WU et al., 2014).
De fato, estes biomateriais têm mostrado excelentes resultados na aplicação
biológica in vitro e in vivo.
Moreira et al. (2008) relataram, em estudo in vivo utilizando ratos, que os
osteoblastos interagem com a HAp sintética, preenchendo os espaços destinados à
aplicação do biomaterial. Além disso, diversos estudos empregando diferentes
modelos experimentais relataram que há adesão e proliferação celular sob CNT
(DUARTE et al., 2004; GABAY et al., 2005; MACDONALD et al., 2005; GIANNONA
et al., 2007; ZANELLO; ZHAO; HADDON, 2006).
Recentemente, Lobo et al. (2013), demostraram que os condrócitos cultivados
sobre membranas de VACNT-O/poli (metacrilato de metilo) mantiveram o nível de
expressão de RNAm, Agrecan, Colágeno tipo II e do fator de transcrição SOX-9.
Todos estes são considerados marcadores de função celular (ANTONIOLI et al.,
2013).
A incorporação de HAp e CNT na matriz de polímero PDLLA é uma característica
importante para induzir a diferenciação de células e ossificação. Estudos recentes
do nosso grupo de pesquisa mostraram a biocompatibilidade de nHAp obtida pelo
método de imersão em SBF e eletrodeposição (MARSI et al., 2012; LOBO et al.,
48
2013). Nosso estudo recentemente publicado, mostrou que nHAp promove a
regeneração óssea com formação de osso lamelar após nove semanas (LOBO et
al., 2013).
O arcabouço polimérico deve ter permeabilidade para permitir a migração de
fatores de crescimento e citocinas a partir de fluido biológico para a regeneração de
tecidos, que promove a diferenciação das células (PONTE et al., 2007; RINGE et al.,
2007), permitindo a adesão de células, a morfologia e função das células
(GOESSLER; HÖRMANN; RIEDEL, 2004).
Pesquisas sobre nanocompósitos de PDLLA/HAp foram desenvolvidas por
diferentes processos de síntese (IKADA, 1994; TENG; REN; GU, 2007; REN et al.,
2008; ZOU et al., 2012; DEPLAINE et al., 2013; RONCA; AMBROSIO; GRIJPMA,
2013); bem como de Wang e Wang (2012), desenvolveram um arcabouço de PDLLA
incorporando Ca-P e BMP-2, e foram capazes de demonstrar efeito osteoindutor e
osteocondutor com a degradação controlada dos polímeros. Ronca, Ambrosio e
Grijpma (2013) produziram arcabouços de PDLLA/nHAp por dispersão em
sonicação para aplicação em micro-estereolitografia afim de obter um biomaterial
poroso com melhores características mecânicas e térmicas.
Zou et al. (2012) relataram a produção de nanofibras de PDLLA preparadas por
eletrofiação e a modificação de superfície com enxertos de gelatina para controlar a
nucleação e o crescimento de HAp.
Teng et al. (2007) preparam um biomaterial poroso de PDLLA/HAp com a técnica
polimerização in situ e o agente porogênico foi NaCl utilizado em reator de CO2.
Todas estas tecnologias tem sido empregadas para melhorar as características
físico-químicas do PDLLA, a fim de imitar a estrutura óssea. No entanto, apenas a
presença de HAp na estrutura do polímero não é suficiente para melhorar a
resistência mecânica igual ao osso. Por conseguinte, a incorporação de CNT pode
ser uma solução para melhorar a resistência mecânica. Com isso, a incorporação de
HAp e CNT na matriz de polímero PDLLA é uma característica importante para
induzir a diferenciação de células e ossificação e proporcionar resistência mecânica
ao novo tecido (LOBO et al., 2010).
Devido às forças de Van der Waals é difícil obter dispersões homogêneas de CNT
e HAp na matriz polimérica. Uma alternativa é a técnica de “melt mixing”, que
49
melhora a dispersão das nanopartículas e consiste em uma técnica de baixo custo e
que pode ser empregada em larga escala na indústria (ARJMANDA et al., 2011).
Pitois e François (1999a) mostraram que os filmes porosos podem ser obtidos
pela condensação do vapor de água induzida pela rápida evaporação dos solventes
voláteis que resulta na formação de gotículas de água encapsuladas no polímero,
comportamento semelhante ocorre com partículas sólidas. Vários autores relataram
que as soluções homogêneas de solvente orgânico imiscível, tal como clorofórmio,
na presença de umidade elevada favorece a formação de estruturas do tipo
colmeias (honeycomb). Karthaus et al. (2000), relataram que as estruturas
hexagonais constituídas sobre a superfície polimérica não é devido à presença de
uma solução de polimérica, mas pelo uso do clorofórmio que origina estruturas
hexagonais, atribuído à presença de vapor de água em condições experimentais.
Desde então, a utilização de água por evaporação em umidade controlada e de
arrefecimento para a produção de membranas porosas foi estudada para polímeros,
devido à ampla aplicabilidade destas estruturas (PITOIS; FRANÇOIS, 1999b;
KARTHAUS et al., 2000; NISHIKAWA et al., 2002; SUNAMI et al., 2005; XU; KADLA,
2013). Sunami et al. (2005) relataram sobre o comportamento celular na superfície
de uma estrutura honeycomb, a superfície modula positivamente e influencia o
comportamento celular sobre o biomaterial.
Interações com o ambiente biológico ocorrem na superfície biomaterial; portanto,
qualquer alteração na superfície pode influenciar na resposta celular. A literatura
descreve que uma superfície porosa contribui para uma melhor interação com o
meio biológico (HUTMACHER, 2001; SACHLOS; CZERNUSKA, 2003; CHEN et al.,
2003; JI et al., 2012).
Porém outro fator que interfere na adesão e proliferação celular é a molhabilidade
do biomaterial. Tal análise é importante por causa do comportamento de uma célula,
quando em contato com a superfície do biomaterial (BUSER et al., 2004; RUPP et
al., 2006; KENNEDY et al., 2006). Quanto menor for o ângulo de contato, maior é a
capacidade de molhabilidade, em outras palavras, o ambiente biológico tem uma
maior capacidade de se espalhar sobre a superfície do material.
Estudos demonstraram que a molhabilidade da superfície e a porosidade
influencia no comportamento de adesão celular e rediferenciação celular (ELBERT;
HUBBELL, 1996; PHAM; SHARMA; MIKOS, 2006; LI; JIANG; TUAN, 2006;
50
YAMANE et al., 2007; LIEN; KO; HUANG, 2009). Essa interação de células com o
biomaterial é um resultado de um reconhecimento específico entre os receptores de
adesão da superfície celular, que são integrinas e proteínas (ECM) da matriz
extracelular (fibronectina, vitronectina, colágeno) (DOBKOWSKI et al., 1999).
A hidrofilicidade do material melhora a interação com o meio biológico, porém a
obtenção desta propriedade com métodos químicos é muito difícil porque grupos
funcionais estão ausentes no PDLLA e a única técnica que não modifica as
propriedades de massa do polímero consiste no tratamento a plasma. A técnica de
plasma trata as superfícies incorporando grupos funcionais, isto melhora a afinidade
celular (WADE; MAMMODE; BINDER, 1991; LOH, 1999; FAVIA; D´AGOSTINHO,
1998; YANG; BEI; WANG, 2002).
Desta forma, Cai et al. (2002) mostraram que a hidrofilicidade favorece a
biocompatibilidade e a aplicação de membranas de PDLLA como suporte para
cultura de células, com bons resultados como arcabouço para tecido ósseo.
Nesta tese, apresentamos duas novas metodologias para obtenção de
membranas porosas de PDLLA parcialmente hidrofílicas com estruturas honeycomb
e com aumento de rugosidade superficial por meio da incorporação de
nanopartículas de VACNT-O e nHAp. Uma correlação entre as nanopartículas e a
umidade foi apresentada para melhorar as características de superfície. Estas novas
metodologias propostas consistem em: (i) nanocristais de nHAp diretamente
eletrodepositados em VACNT-O (nHAp1) e depois dispersos em solução de PDLLA
com umidade controlada; (ii) VACNT-O imersos em solução de SBF para produzir
nanocristais de nHAp (nHAp2) e em seguida dispersos em solução de PDLLA em
umidade controlada para a produção de membranas com estruturas honeycomb.
Propriedades de hidrofilicidade foram obtidas por tratamento com plasma de
oxigênio, anteriormente descrito por Lobo et al. (2010).
A Figura 18 mostra uma possibilidade para aplicação biológica do biomaterial
desenvolvido nesta tese como implante ósseo. As membranas poliméricas podem
envolver os ossos longos para promover a osseointegração. O osso fraturado é
envolvido com a membrana polimérica e fixado por uma haste de metal e parafusos
nas extremidades, que garante a sustentação (1). Esta membrana tem a função de
promover a regeneração óssea, a partir de nanopartículas osteoindutoras que
favorecem a liberação de fatores que promovem a regeneração óssea (2).
51
A membrana polimérica promove a formação de uma camada de apatitas
biológicas pelo processo de biomineralização, a adesão e proliferação celular,
enquanto que a matriz orgânica é mimetizada pela estrutura do polímero. Este
biomaterial promove a completa e organizada osseointegração do osso fraturado (3).
52
Figura 18 - Perspectiva da aplicação in vivo de membranas desenvolvidas nesta tese.
Fonte: Autora.
53
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Produção das nanopartículas para dispersão
3.1.1 Síntese dos nanotubos de carbono de múltiplas paredes verticalmente
alinhados (VACNT-O)
A técnica de produção de VACNT utilizada nesta tese foi descrita por Lobo
(2011), o procedimento foi realizado no Laboratório Associado de Sensores e
Materiais (LAS) no Instituto de Pesquisas Espaciais (INPE) sob responsabilidade do
nosso colaborador professor Dr. Evaldo José Corat. Para a produção dos VACNT, foram utilizadas amostras de titânio quadradas de
10mmx10mmx1mm, lixadas e colocadas em banho de ultrassom com álcool
isopropílico, por 5 minutos. Após, as amostras foram aquecidas a uma temperatura
de 400ºC ao ar para a formação de uma camada de nitreto/óxido de titânio
(TiN/TiO2). Estas amostras foram dispostas em evaporadora de feixe de elétrons
(Auto 306-EB3 Mutlihearth Electron Beam Source), para deposição de uma camada
de 10nm de catalisador (Fe) (LOBO et al., 2010).
Os VACNT foram produzidos pela técnica de deposição química via fase vapor
assistida por plasma de microondas (MWCVD, acrônimo do idioma inglês, cuja sigla
significa Microwave Plasma Assisted Chemical Vapor Deposition). A figura 19 mostra
o esquema do conjunto do reator de microondas, cuja câmara é de alumínio
anodizado e pode-se observar que existem janelas de quartzo na altura do porta
amostra para visualização da amostra e do plasma. O reator é conectado a uma
bomba mecânica de Edwards e aos sistemas de tubulações de gases utilizados no
processo de crescimento dos VACNT. O controle de pressão procede-se pelo
sensor Barocel e a entrada de gases é monitorada por um controlador de fluxo de
massa (MKS-247C), conforme pode ser visto na figura 20 (LOBO et al., 2010; LOBO
et al., 2011b).
54
Figura 19 - Ilustração do conjunto do reator de microondas de alumínio anodizado.
Fonte: Lobo, 2011b.
Figura 20 - Diagrama esquemático do reator para crescimento dos VACNT.
Fonte: Lobo, 2011b.
O processo de crescimento de VACNT em reator MWCVD ocorre após a
preparação da amostra com uma camada de catalisar metálico particulado e numa
atmosfera de gases de hidrocarbonetos em temperaturas elevadas.
55
A deposição ocorre em duas etapas, pré-tratamento e deposição. Na primeira
etapa criam-se nanoilhas do material catalisador, a partir dos quais os VACNT foram
nucleados, em que ocorre a inserção dos gases H2/N2 (10/90 sccm), em pressão
constante e aquecimento do porta-amostra de 760ºC, com duração de 5 minutos. Na
etapa de deposição, o gás CH4 (14 sccm) é adicionado, como fonte de carbono, e a
temperatura atinge cerca de 800ºC, esta etapa tem duração de cerca de 1 a 2
minutos, com uma pressão controlada de 30 Torr.
A superhidrofilicidade do biomaterial é adquirida por tratamento em reator de
plasma de O2, o reator pode ser visto na figura 21. Este reator foi ajustado para
utilizar a técnica de plasma de descarga de corrente pulsada, onde uma fonte
chaveada pulsada e bipolar com características especiais de pulsos de saída é
utilizada para geração do plasma. O tempo de tratamento a plasma teve duração de
2 minutos, com uma tensão aplicada de -700 V, taxa de fluxo de 1sccm e pressão de
85 mTorr, com frequência de 20kHz, sendo que a hidrofilicidade da superfície foi
adquirida pela a incorporação dos grupos carboxílicos polares na superfície do
material (LOBO et al., 2011a). Figura 21 - Reator de plasma de O2.
Fonte: Autora.
56
3.1.2 Síntese de VACNT-O:nHAp1 por eletrodeposição
A eletrodeposição de nHAp1 foi realizada no laboratório de Nanotecnologia
Biomédica na Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) sob responsabilidade do
professor Dr. Anderson de Oliveira Lobo. Como anodo foi utilizado amostras de VACNT-O2 crescidos sobre substrato de
Ti. As dimensões de cada anodo foram de 10mm x10mm x1mm. A Figura 22 mostra
a montagem do anodo, em cachimbo porta-eletrodo de teflon, a área exposta para
deposição é um círculo de 0,27cm2.
Figura 22 - Montagem do anodo para eletrodeposição de HA.
Fonte: Autora.
Como eletrólito utilizou-se a mistura de soluções nas quantidades mostradas na
tabela 1. Durante o processo o pH da solução permaneceu a 4,8, sob agitação
contínua, com auxílio de agitador magnético.
57
Tabela 1 - Composição química da solução para eletrodeposição
REAGENTE CONCENTRAÇÃO QUANTIDADE
Ca(NO3)2 .4.H2O 2,5mM 50mL
NH4H2PO4 1,5mM 50mL
Fonte: Autor.
A eletrodeposição é um método não espontâneo e necessita de uma fonte de
corrente contínua para direcionar o fluxo de íons. O sistema tende a manter-se
termodinamicamente estável e para isto, ocorre o fluxo de íons positivos contidos no
eletrólito para a superfície do anodo (cargas negativas). Além desta, outra camada
de íons envolvidos por moléculas de água se aproxima por atração eletrostática da
superfície do anodo, a chamada camada externa de Helmholtz. O processo promove
o aumento do pH no local, que favorece a precipitação de íons cálcio e fosfato que
revestem a superfície (LOBO, 2011a), conforme figura 23.
Figura 23 - Ilustração da célula de deposição de fosfato de cálcio.
Fonte: Lobo, 2011a e Adaptado de Groove, 2002.
58
A figura 24, mostra o potenciostato da marca AUTOLAB, modelo PGSTAT302
que foi utilizado no procedimento, o eletrodo de referência de Ag/AgCl e o contra-
eletrodo utilizado foi de platina. Os nanocristais de nHAp1 foram produzidos pela
aplicação de um potencial constante de -2.0 V durante 30 minutos e a temperatura
da solução foi mantida a 70°C em um agitador magnético, conforme Lobo et al.,
2011a. Figura 24 - Potenciostato utilizado no processo de eletrodeposição.
Fonte: Autora.
3.1.3 Síntese de VACNT-O:nHAp2 por imersão em SBF
A biomineralização das amostras de VACNT-O foi realizada no laboratório de
Nanotecnologia Biomédica na Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) sob
responsabilidade do professor Dr. Anderson de Oliveira Lobo.
59
As amostras de VACNT-O foram biomineralizadas por imersão em solução de
SBF (5x). A solução consiste em uma mistura de íons em água destilada, preparada
sob a agitação, com pH 7,4 em temperatura de 28°C. O ajuste do pH foi realizado
com adição HCl e NaOH, sendo que os reagentes estão indicados na tabela 2
(BARRERE et al., 2002).
Tabela 2 - Concentrações dos reagentes para solução de SBF 5x
Reagentes Concentrações
NaCl 40g/L (733,5 mM)
MgCl2 1,52g/L (7,7 mM)
CaCl2.2H2O 1,84 g/L (12,5 mM)
Na2HPO4.2H2O 0,89 g/L (5,0 mM)
NaHCO3 1,76 g/L (21,0 mM) Fonte: Barrere et al., 2002b.
As amostras de VACNT-O foram dispostas em placas Petri e levadas à câmara de
fluxo laminar com irradiação ultravioleta (UV) (modelo BioProtector-12 Plus VECO)
por 30 minutos. Após este período, com o auxílio de uma pinça, todas as amostras
foram colocadas em tubos corning separadamente, onde foram adicionados 13
mLde SBF (5x) e acondicionadas em incubadora refrigerada de bancada (marca
Cientec, modelo CT-713), visto na figura 25.
60
Figura 25 - Shaker utilizado para incubação das amostras durante o processo de biomineralização.
Fonte: Autora.
Os tubos foram agitados na incubadora à 75 rpm, em temperatura de 36,5°C pelo
período de 21 dias. Após a incubação, as amostras foram retiradas da solução de
SBF, lavadas em água deionizada a 80ºC e levadas à estufa (modelo sp400
SPLABOR) a 50°C para secagem por 1 h. Estas amostras foram nomeadas como
VACNT-O:nHAp2
3.1.4 Dispersão de nHAp/VACNT-O em PDLLA A produção das membranas porosas de PDLLA/VACNT-O:nHAp foi realizada no
laboratório de Nanotecnologia Biomédica na Universidade do Vale do Paraíba
(UNIVAP) sob responsabilidade do professor Dr. Anderson de Oliveira Lobo. As amostras foram removidas dos respectivos substratos e misturadas em
solução de copolímero L-Lactide/D-Lactide (PDLLA), Purasorb® PLD-9655; Purac
biochem, Holland, diluído em clorofórmio 10% m/v sob agitação constante por 120
min (CAI et al., 2002). A dispersão dos nanocompósitos foi realizada em ultrassom
de ponta (SONICS, VCX500W), conforme figura 26, com energia de 819 J mL-1 e P
16W para VACNT-O:nHAp1, 1210J mL-1 e P 16W para VACNT-O:nHAp2 e
temperatura da suspensão mantida sempre abaixo de 40°C. Em cada 20ml de
61
clorofórmio, 10% (m/v) de PDLLA em solução com o teor de 0,3% (m/v) de nHAp1 e
nHAp2, a dispersão com sonificação teve duração de 3 min. As soluções foram
inseridas em formas circulares de 0,5 mm de diâmetro e mantidas em temperatura
ambiente para evaporação lenta com umidade controlada do ar 70% a 80%
(SUNAMI et al., 2005) por 12 horas.
Figura 26 - Equipamento de ultrassom (SONICS, VCX500W) utilizado na dispersão das nanopartículas.
Fonte: Autora.
A hidrofilicidade do biomaterial foi adquirida por tratamento em reator de plasma
de O2, com os seguintes parâmetros: tempo de tratamento a plasma: 2 minutos,
tensão aplicada: - 700 V, taxa de fluxo: 1sccm, e pressão: 85 mTorr, frequência de
20kHz, a hidrofilicidade da superfície foi adquirida pela a incorporação dos grupos
62
carboxílicos polares (LOBO et al., 2010). Membranas porosas sem tratamento a
plasma foram utilizadas como controle.
3.1.5 Esquema da produção das membranas
A figura 27 mostra um esquema da produção das membranas. Número (1)
descreve a produção dos nanotubos de carbono verticalmente alinhados (VACNT) e
funcionalização. Número (2) descreve a eletrodeposição de cristais de nHAp em
VACNT-O (nHAp1). Número (3) mostra a produção de VACNT-O: nHAp pelo método
de imersão em fluido corporal simulado (nHAp 2). As nanopartículas (nHAp 1 e
nHAp 2) foram removidas de seus respectivos substratos e transferidas para uma
solução de clorofórmio (4). Número (5) mostra as nanopartículas nHAp1 nHAp2
dispersas sob irradiação de ultra-som em clorofórmio, e em seguida, a solução
polimérica foi homogeneizada sob agitação constante durante 120 min (6). O
número (7) mostra a solução polimérica inserida no molde redondo com 0,5 mm de
diâmetro e a evaporação lenta do solvente em temperatura ambiente por 12 h em
umidade controlada de 70-80%. Número (8) mostra o tratamento com plasma de
oxigênio para incorporação de grupos carboxílicos polares.
63
Figura 27 - Esquema da produção das membranas.
Fonte: Autora.
64
3.2 Ensaio de bioatividade in vitro
O ensaio de bioatividade das membranas porosas de PDLLA/VACNT-O:nHAp foi
realizado no laboratório de Nanotecnologia Biomédica na Universidade do Vale do
Paraíba (UNIVAP) sob responsabilidade do professor Dr. Anderson de Oliveira Lobo. Avaliou-se a precipitação nHAp carbonatada em membranas de PDLLA/VACNT-
O:nHAp em imersão em solução SBF (5x) (pH = 7,4) por 14 dias. Para a preparação
da solução SBF (5x) foram utilizados os reagentes: NaCl: 733,5 mM; MgCl2.6H2O:
7,5 mM; CaCl2.2H2O: 12,5 mM; Na2HPO4.2H2O: 5,0 mM; NaHCO3: 21,0 mM)
(BARRERE et al., 2002b). As membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp foram
colocadas em tubos de ensaio e expostas à luz ultravioleta na câmara de fluxo
laminar (bioprotetor-12 Plus VECO) durante 30 min. Em seguida, foram adicionados
13 ml de uma solução de SBF nos tubos de ensaio e armazenados numa
incubadora refrigerada (Cientec, CT-713), em agitação constante a 75 rpm e a
36,5°C por 14 dias. Após o tempo de incubação, lavou-se as amostras com água
deionizada e as amostras foram secas em estufa (SP400, SPLABOR) a 50°C por 1h.
3.3 Caracterização das Membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp
3.3.1 Microscopia eletrônica de Varredura e Transmissão
As técnicas de microscopia eletrônica de varredura e transmissão foram
utilizadas para caracterização morfológica dos biomateriais, sendo que a
microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada para apresentar os detalhes das
nanopartículas (CARNEVAROLO JUNIOR, 2003; ORÉFICE, PEREIRA, MANSUR,
2012).
Neste estudo, as micrografias foram obtidas pelos Microscópio Eletrônico de
Varredura de alta resolução e um Microscópio Eletrônico de Transmissão (EVO
MA10 Carl Zeiss e HR-TEM, JEOL 3010, localizados na Universidade do Vale do
Paraíba e na Universidade Federal de São Carlos, respectivamente) para
caracterizar as propriedades morfológicas e estruturais das amostras.
65
3.3.2 Perfilometria óptica
A técnica de perfilometria é utilizada para medir as dimensões, profundidade e
rugosidade de superfícies (COSTA, 2008).
O perfilômetro óptico (WYKO NT 1100 series Optical Profiling System) foi usado
para topografia e medições de rugosidade, este equipamento está localizado no
Instituto de Pesquisas Espaciais.
3.3.3 Análise da porosidade
Análises de porosidade foram realizadas com o método de imersão, esta análise
foi realizada no Laboratório de Nanotecnologia Biomédica (UNIVAP). Para tal
análise, as membranas foram imersas em n-butanol durante 2h. Depois o excesso
de reagente foi removido com papel filtro e as amostras foram pesadas em balança
de precisão (WANG et al., 2009b). Calculou-se a porosidade usando a equação 1:
, (Equação 1)
Onde, ∈ é a porosidade, mb é a massa absorvida de n-butanol, mp é a massa da
membrana e ρb é a densidade de n-butanol e ρp é a densidade de PDLLA (WANG
et al., 2009b).
O Image J® foi utilizado para calcular o número de poros na superfície das
membranas poliméricas.
3.3.4 Calorimetria diferencial exploratória
A análise de calorimetria diferencial exploratória foi realizada Departamento de
Engenharia de Materiais da Universidade de São Carlos (DEMA-UFSCAR) sob
responsabilidade da professora Dra. Rosário Elida Suman Bretas. O comportamento térmico de 5 mg de cada amostra foi estudado por calorimetria
diferencial exploratória (DSC) (TA Instruments, modelo Q100). O aquecimento foi
realizado a partir de 25 a 200°C, a 10°C min-1, para todas as amostras. A partir do
66
calor de fusão, a quantidade de cristalinidade (% C) foi calculada pela seguinte
equação:
0
%H
HHC ccm
∆∆−∆
= , (Equação 2)
onde ΔHcc é a entalpia de cristalização a frio (quando presente), ΔH m é a entalpia
de fusão da amostra e ΔH 0 é a entalpia de fusão de uma amostra 100% cristalina.
Para o PDLLA, ΔH0 foi 93 J.g-1 (RIBEIRO NETO et al., 2012).
A quantidade de solvente residual (quando presente) foi calculada a partir da
equação 3:
).( LTcmHV +∆=∆ , (Equação 3)
onde ΔHv é a endotérmica de vaporização, m é a massa do solvente residual
vaporizado (kg), c é o calor específico do solvente, Δ T=(temperatura final
vaporização - temperatura inicial vaporização) e L é o calor latente de vaporização
do solvente. A porcentagem de solvente residual (%SR) foi calculado a partir da
equação 4 (RIBEIRO NETO et al., 2012):
100.%Tm
mSR = , (Equação 4)
onde a massa, mT = massa da amostra DSC (kg).
3.3.5 Termogravimetria
As análises termogravimétricas (TGA) foram realizadas pela empresa TA
Instruments, utilizando um analisador térmico (TA instruments, modelo TGA Q500).
As análises foram realizadas em 20°C min-1-800,0 °C. As medições foram feitas
usando uma massa de amostra de ± 5 mg para todas as membranas produzidas.
3.3.6 Espectroscopia de reflexão total atenuada no infravermelho com
transformada de Fourier (ATR-FTIR)
Esta análise foi realizada no laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica
na Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) sob responsabilidade do professor
Dr. Airton Abrahao Martin.
67
A Espectroscopia de Infravermelho por transformada de Fourier por reflectância
total atenuada (ATR-FTIR) foi utilizada para confirmar a hidrofilicidade do material
antes e após a funcionalização com plasma de O2 e a biomineralização. Coletamos
os dados no intervalo de 4000-700 cm-1, 3 pontos para cada amostra, utilizando um
espectrofotômetro equipado com detector MCT operando em refrigeração por
nitrogênio líquido (Spotlight Spectrum 400 FT-IR, Perkin Elmer).
3.3.7 Análises de ângulo de contato
Esta análise foi realizada no Laboratório Associado de Sensores e Materiais
(LAS) no Instituto de Pesquisas Espaciais (INPE) sob responsabilidade do nosso
colaborador professor Dr. Evaldo José Corat.
As propriedades de superfície do material e a interação com o meio biológico são
fatores determinantes para o sucesso do implante. A primeira interação do meio
biológico com o implante corresponde à adsorção de proteínas, a adesão e o
espalhamento celular, sendo que a molhabilidade, energia superficial e força
interfacial de adesão são determinantes para a interação biológica (VAN OSS;
GOOD; CHAUNDHURY, 1986; SCHENDER, 1996; ELIAS et al., 2008).
Para as medidas de ângulo de contato (AC) foi utilizado o método de Gota séssil
com água deionizada (2 µL) e diiodometano (2 µL) em temperatura e pressão de
atmosfera controlada. O goniômetro KrÜss, modelo EasyDrop Contact Angle
Measuring Instrument (EasyDrop DSA 100) foi utilizado para aquisição das medidas
de ângulo de contato. Neste equipamento há uma câmera que grava a imagem da
gota, que por meio de um tratamento algoritmo determina o ângulo de contato.
Foram realizadas medidas, imediatamente após a deposição de gotas sobre a
superfície para evitar perturbações por evaporação ou adsorção. Como método de
aquisição utilizou-se o método de gota séssil. Para a interpretação dos resultados
utilizou-se o software Drop Shap Analysis 4 (KRÜSS) para o ajuste do método
variável do ângulo de contato, utilizando como linha de base o método de
Young-Laplace. Os dados foram apresentados na forma de média e desvio padrão
e foram coletados com um intervalo de confiabilidade de 99,1% baseado no valor da
medida de tensão superficial da água e do diiodometano. Depois disso, calculou-se
a energia de superfície de cada grupo de amostras, pela metodologia proposta por
68
Owens (OWENS; WENDT, 1969). Esta energia de superfície descrita como a soma
das componentes dispersiva (d) (associada a grupos não polares presentes) e polar
(p) (associada aos grupos polares presentes na superfície). O caráter hidrofóbico ou
hidrofílico pode influenciar a adesão celular no biomaterial.
A estatística para comparação entre os grupos foi realizada usando Origin®
versão 8.5, para rugosidade, porosidade e hidrofilicidade, teste de Tukey (n=3).
A energia de superfície é composta por componentes polares e dispersivas das
amostras avaliadas pela medição de AC. A tensão interfacial entre as duas fases
condensadas pode ser determinada pela equação de Young, conforme equação 5:
SLSVLV cos γγθγ −= , (Equação 5)
onde θ é o Angulo de contato mensurado entre o líquido e o sólido, γLV, γSV, e γSL
são energias interfaciais de líquido/vapor, sólido/vapor e inferfaces sólido/líquido,
respectivamente. Esta equação pode ser reescrita como a equação de Young-Duprè
(Equação 6):
( ) SLSVLVa cos1W γγθγ −=+= , (Equação 6)
onde Wa é a energia de adesão por unidade de área das superfícies sólidas e
líquidas. Sob a forma geral da equação (5), (6), em seguida, pode ser escrita
(Equação 7):
( ) DS
DL
pS
pLLV cos1 γγγγθγ 22 +=+ , (Equação 7)
onde γpL e γp
S são os componentes polares da energia superficial de líquidos e de
fase em fase sólida, respectivamente, enquanto γDL e γD
S são os componentes
dispersivos da energia de superfície da fase líquida e sólida, respectivamente.
Desde γDL e γp
L foram publicados para muitos líquidos, é possível aproximar γDS e
γpS a partir de uma única medida de θ pela utilização da equação (6). Assim, por
meio da medição dos ângulos de contato de dois líquidos diferentes (água destilada)
e diiodometano, componentes polares e dispersivas da energia de superfície.
Termodinamicamente, a adesão de bactérias e de células numa superfície sólida
pode ser descrito por meio do equilíbrio de energia livre interfacial pela seguinte
equação 8 (VAN OSS; GOOD; CHAUNDHURY, 1986):
, (Equação 8)
69
Onde, ΔFAdh é a energia livre interfacial de adesão, SC é a energia livre interfacial
de células sólida, e SL é a energia livre interfacial sólido-líquido, e CL é a energia
interfacial da célula-líquido.
A força de adesão é termodinamicamente favorável quando o resultado é positivo. A
energia livre interfacial de adesão é determinada pela seguinte equação 9 (VAN
OSS; GOOD; CHAUNDHURY, 1986; SCHENDER, 1996):
−−−−
+++
++
=∆
Lp
CDS
DC
pS
LWC
LWS
pL
DC
DL
pC
LWL
LWC
pL
DS
DL
pS
LWL
LWS
AdhF
γγγγγγγ
γγγγγγ
γγγγγγ
2 , (Equação 9)
3.4 Caracterização da Bioatividade
3.4.1 Microscopia eletrônica de varredura
Neste estudo, as micrografias foram obtidas pelo Microscópio Eletrônico de
Varredura de alta resolução, modelo EVO MA10 Carl Zeiss, para caracterizar as
propriedades morfológicas e estruturais das amostras. Este microscópio está
localizado no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento na Universidade do Vale do
Paraíba.
3.4.2 Espectroscopia de Infravermelho por transformada de Fourier utilizando
reflectância total atenuada (ATR-FTIR)
Esta análise foi realizada no laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica
na Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) sob responsabilidade do professor
Dr. Airton Abrahao Martin. Espectroscopia de Infravermelho por transformada de Fourier no modo de
reflectância total atenuada (ATR-FTIR) foi utilizada para caracterizar grupos de
carbonato e fosfato, formados na superfície das membranas poliméricas após
biomineralização de 14 dias. Os espectros foram obtidos no intervalo de 1000-700
70
cm-1, técnica pontual (n=3), utilizando Thermo Scientific (Nicolet modelo IS 5)
equipado com resolução 4 cm-1.
3.4.3 Difração de Raios X
Esta análise foi realizada no Laboratório Associado de Sensores e Materiais
(LAS) no Instituto de Pesquisas Espaciais (INPE) sob responsabilidade do nosso
colaborador professor Dr. João Paulo Barros Machado.
O equipamento utilizado para a caracterização estrutural das amostras foi o
difractômetro de Raio-X de alta resolução utilizando radiação Cu K-α gerada a 40 kV
e 50 mA (Marca Philips X´Pert MRD). As medidas foram realizadas no modo de
ângulo rasante quando necessário; o espectro de refletividade foi ajustado com uma
varredura de w/2Q entre w=0,05º e w=7º.
As indexações dos picos de difrações e análises foram realizadas com o software
X´pert highscore (disponível em: www.panalytical.com) e as fichas cristalográficas da
base de dados do Joint Commitee on Power Diffraction Standards. Todos os
resultados foram comparados com padrão da amostra de HAp (ficha cristalográfica
00-019-0272 para hidroxiapatita carbonatada) e sendo a equação de Scherrer foi
aplicada para a determinação do tamanho médio dos cristalitos.
3.5 Ensaios biológicos in vitro
Os experimentos in vitro foram realizados no Departamento de Odontologia
Restauradora da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP)
sob responsabilidade do professor Dr. Bruno das Neves Cavalcanti.
3.5.1 Cultura de células
Todos os experimentos foram realizados sob a aprovação do Comitê de Ética e
Pesquisa da Unesp (nº46420) e foram repetidos 3 vezes para assegurar a
reprodutibilidade. Osteoblastos humanos normais foram obtidos de Lonza (CC-2538,
Lonza, Walkersville, USA) e cultivados em meios de crescimento específico (OGM,
71
CC-3207, Lonza). As células foram utilizadas entre o terceiro e quinto dia de
diferenciação em todos os experimentos.
3.5.2 Ensaio de citotoxicidade
O teste de SRB baseia-se na coloração das proteínas pelo corante sulforodamina
B, este possui dois grupos sulfônicos que se ligam as proteínas das células fixadas
na placa, precipitadas pelo ácido acético, de modo que fornece uma correlação
direta entre a quantidade de proteínas e do número de células.
As células foram semeadas em placas de 24 poços (1x104 células/poço),
conforme figura 28a. Os grupos de controles foram estabelecidos: um controle
negativo (apenas meio de cultura de células, sem células) e um controle positivo
(células cultivadas em meio de cultura normal). As amostras foram colocadas
diretamente no meio, sem contato com as células, a fim de que os seus produtos de
degradação fossem capazes de induzir citotoxicidade. Após 5 dias, as membranas
foram removidas, as células foram lavadas em solução salina tamponada com
fosfato (PBS, Gibco, Carlsbad, EUA) e fixadas com ácido tricloroacético a 10% (1
hora a 4 °C). Após lavagem e secagem, as células foram coradas com uma solução
sulforodamina B 0,4% em ácido acético a 1% (SRB, Sigma, St. Louis, EUA) durante
30 minutos à temperatura ambiente, conforme figura 28b.
Figura 28 - Plaqueamento para os ensaios celulares (a) e Marcação para SRB (b).
Fonte: Autora.
As células foram lavadas com ácido acético a 1% para remover o corante não
ligado e secas. O corante ligado foi solubilizado em 1 mM de base Tris (Sigma), e a
solução foi agitada e transferida para uma placa de 96 poços, de modo a ser lida a
72
570 nm. Os dados foram normalizados pelo grupo controle positivo. Os dados foram
normalizados conforme a fórmula especificada na equação 10:
( )100Branco do aAbsorbânci– Positivo Controle Células de aAbsorbânci
branco do aAbsorbânci– amostras das Células das aAbsorbânci=celular eViabilidad %
(Equação 10)
3.5.3 Ensaio de fosfatase alcalina
Mineralização funcional foi observada pela atividade da fosfatase alcalina (ALP).
Esta atividade foi avaliada utilizando fosfato de p-nitrofenilo (pNPP) como o
substrato colorimétrico nº 83369, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Os grupos de
controle foram estabelecidos como descrito para o ensaio de citotoxicidade e a
eficácia do ensaio foi avaliada pela adição de um grupo experimental com meios
regularmente suplementados por dexametasona e beta-glicerophosphate (CC-4194,
Lonza), bem conhecido por induzir a mineralização. Após incubação durante cinco
dias, o sobrenadante foi recolhido e adicionado (50 µL) em triplicata, numa placa de
96 poços. O substrato foi adicionado a cada poço e foram preparados para leitura
num leitor de microplacas a 405 nm. Os dados foram apresentados como nmol de
atividade por poço, de acordo com os valores obtidos para a curva padrão. Utilizou-
se o controle negativo para normalização dos dados. Os dados foram analisados
usando o software Origin 8.5® por one-way Anova e Tukey (p <0,05).
3.6 Estudo in vivo
Os procedimentos cirúrgicos e o processamento histológico foram realizados no
Centro Multidisciplinar para investigação biológica na área da ciência em animais de
laboratório (CEMIB/UNICAMP) sob responsabilidade do professor Dr. Marcus
Alexandre Finzi Corat
3.6.1 Animais
Camundongos C57BL/6/JUnib, adultos (12 semanas), machos com 22-28 g de
peso corporal, provenientes do CEMIB/UNICAMP, Campinas, Brasil, foram utilizados
73
neste estudo. Todos os procedimentos com animais estavam de acordo com os
Princípios Éticos na Experimentação Animal estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA) e aprovados pelo Comitê de ética para pesquisas
com animais da Universidade Estadual de Campinas-UNICAMP (CEP: 3253-1),
Brasil.
3.6.2 Acondicionamento dos animais
Os animais ficaram alojados em caixa de polietileno no biotério do Centro
Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de
Laboratório (CEMIB), temperatura entre 22ºC à 25ºC, umidade relativa entre 40% a
60%, com foto período com ciclos de 12 horas claro-escuro, acesso irrestrito à ração
peletizada e água ad libitum.
Foram utilizados três grupos: PDLLA como controle, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e
PDLLA/VACNT-O:nHAp2. Todas as amostras foram esterilizadas durante 24 h sob
radiação UV.
1. Grupo B- PDLLA (n=3);
2. Grupo C-PDLLA/VACNT-O:nHAp1 obtida pelo método de
eletrodeposição (n=3);
3. Grupo D-PDLLA/VACNT-O:nHAp2 obtida pelo método de imersão em
SBF (n=3);
3.6.4 Anestesia e Defeito ósseo
Os animais foram anestesiados pela injeção intraperitoneal Avertin (2,2,2-
tribromoetanol) com 2,5% (225-240mg/kg) e realizou-se a tricotomia, seguida de
antissepsia com Povidine® tópico e incisão circular de 1mm de diâmetro com lâmina
de bisturi nº 15, na região da fontanela posterior (região interparietal). O defeito
ósseo foi confeccionado com um equipamento de ultra-som CVDent1000® equipado
com uma ponta de diamante estéril CVDentus® sob irrigação com solução salina
estéril para evitar aquecimento ao osso. O tecido muscular e tegumentar foi suturado
com fio catgut nº 4 e foi realizado o curativo local com Rifamicina tópico (10mg/ml).
Detalhes da região do implante pode ser visto na figura 29.
74
Figura 29 - Ilustração de região de implante de PDLLA/VACNT-O:nHAp em osso interparietal de camundongos.
Fonte: Adaptado de Mouse Genome Informatics, 2015.
Os animais dos grupos A, B, C receberam implante de minirolos poliméricos
estéreis sob ligeira pressão no local exato do defeito ósseo e o tecido muscular foi
suturado.
O analgésico Cloridrato de tramadol, via intraperitoneal foi administrado, na dose
10mg/kg (MCKEON et al., 2011), 2x ao dia, durante duas semanas após a cirurgia.
3.6.5 Eutanásia
Após 4 meses da cirurgia, os animais foram sacrificados. A indução anestésica foi
realizada em uma câmara de vidro transparente (15 cm x 25 cm x 15 cm) dotada de
orifícios para entrada e saída de gases (oxigênio, agente anestésico, gás carbônico).
O agente anestésico halogenado utilizado foi o Halotano (Laboratorio Cristalia) na
concentração de 3% em fração inspirada de oxigênio de 100%, sendo administrado
por vaporizador calibrado automático durante 3 minutos, tempo necessário para que
o animal apresente perda dos reflexos posturais e incapacidade de se deslocar na
câmara.
75
Ao termino do procedimento anestésico os animais foram sacrificados ainda sob
anestesia, por meio de injeção intracardíaca de cloreto de potássio (KCL) a 20%
(LEITE, 2011).
3.6.6 Retirada do tecido ósseo
Após 4 meses, os animais foram sacrificados, os ossos foram retirados, seguido
pela remoção dos tecidos moles dos ossos. Os ossos foram congelados a -89ºC.
3.6.7 Análise espectroscópica
A espectroscopia Raman é uma técnica utilizada para estudo da interação dos
fótons com o material analisado, visando obter as bandas de vibrações moleculares
(SALA, 1996), sendo uma técnica rápida e não destrutiva para diagnóstico e estudo
de tecidos biológicos (SCHRADER; DIPPEL, 1999). Com a microscopia Raman
confocal, é possível analisar pontualmente a amostra e adquirir uma amostragem
controlada nos eixos X, Y e Z, com resolução espacial de 5 µm e espectral de 5 cm1.
Esta análise foi realizada no laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica
na Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) sob responsabilidade do professor
Dr. Airton Abrahao Martin. Secções de bloco da calvária contendo os defeitos foram colhidas a partir dos
locais de cirurgia, a região do defeito ósseo foram seccionadas com uma lâmina de
diamante e os tecidos moles foram removidos anteriormente.
As medidas Raman confocal foram realizadas sobre as secções de blocos da
calvaria onde realizou-se os defeitos utilizando um laser de 785 nm para excitação
focado com uma lente de 40X, por 10 segundos de tempo de integração e 20 mW na
amostra. Os dados foram obtidos pelo Rivers Diagnostics (Model 3510) com detector
CCD. Os dados Raman foram dispersos por um Rivers Diagnóstico (modelo 3510) e
recolhidos por um detector CCD. Analisou-se a região de impressão digital espectral
(400-1800 cm-1) em três locais diferentes de cada amostra.
76
3.6.8 Análise histológica
Para a microscopia óptica, as amostras foram fixadas em solução contendo
formaldeído a 10%, por 48 horas, a seguir as amostras foram lavadas para remoção
do fixador e submetidas à descalcificação com solução de EDTA em tampão fosfato
0,1M por duas a três semanas. As amostras foram lavadas por 2 horas em água
destilada e se procederá à desidratação seriada (álcool 30%- 1h, 50%-1h, 70%-1h,
90%-1h, 100%-1h, 100%-1h e 100 %-1h). Após este processo, as amostras foram
imersas em solução contendo xilol e álcool 100% por 1 hora, posteriormente as
amostras foram imersas em xilol puro por 1 hora e depois três vezes em xilol puro 30
min cada. As amostras foram imersas em Paraplast® a 60ºC por 30 minutos, após o
primeiro banho, as amostras foram trocadas de Paraplast®. Os cortes microscópicos
foram realizados em micrótomo, com 5µm de espessura, foram feitas 3 lâminas para
cada osso. A técnica de coloração foi realizada com três imersões em xilol de 3 min
cada, seguindo a sequência de imersões (3 x de 3min em etanol 100%, 1 x de 3min
em etanol 95%, 1x de 3min em etanol 80%, 1x de 5min em água deionizada, 1x de
3min em hematoxilina, enxague com água deionizada, 1x de 5min em água de
torneira, 8-12x imersões em etanol ácido, enxague com água de torneira, enxague
com água deionizada, 1x de 30seg eosina, 3x de 5min em etanol 95%, 3x de 5min
em etanol 95% e 3x de 5min em etanol 100% e 3x de 15min em xilol) (CAPUTO;
GITIRANA; MANSO, 2010).
3.6.9 Microscopia Eletrônica de Varredura
Os espécimes foram fixados com glutaraldeído a um 2,5% (0,1 M) de tampão de
cacodilato de sódio durante 1h e desidratados numa série graduada de solução de
etanol (30, 50, 70, 95, e 100%) durante 10 minutos cada. Na fase de secagem
utilizou uma solução 1:1 de etanol com hexametildisilazano (HMDS) e as amostras
foram secas com HMDS puro à temperatura ambiente. Após a deposição de uma
fina camada de ouro, as amostras foram examinadas por microscopia eletrônica de
varredura. As micrografias foram obtidas pelo Microscópio Eletrônico de Varredura
de alta resolução, modelo EVO MA10 Carl Zeiss, localizado no Instituto de Pesquisa
e Desenvolvimento na Universidade do Vale do Paraíba.
77
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO A Figura 30 mostra a análise por MEV e MET das nanopartículas antes da
dispersão na matriz polimérica de PDLLA. Figura 30a mostra micrografias coletadas
de nanopartículas de VACNT-O. Figura 30 a.1 mostra detalhes da esfoliação dos
VACNT-O e 30 a.2 mostra uma micrografia MET de estruturas de bambu típicas de
VACNT-O. A Figura 31 mostra nanopartículas nHAp1 obtidas pelo método de
eletrodeposição. Figura 31 b.1 e b.2 mostra detalhes do tipo placa nHAp obtidos por
eletrodeposição usando MEV e MET, respectivamente. A Figura 32 mostra
nanopartículas nHAp2 sobre VACNT-O obtidas depois da imersão em solução de
SBF por 21 dias. Figura 32 c.1 e c.2 mostra nHAp globulares com diâmetros de
tamanho nanométrico, micrografias coletadas de MEV e MET, respectivamente. A
diferença entre ambas nHAp é notável. A porosidade nHAp2 (Figura 32) produzidas
por SBF é maior do que nHAp1, obtidas por eletrodeposição.
78
Figura 30 - Micrografias coletadas, a partir de (a) VACNT-O, detalhes da esfoliação do VACNT-O (a.1) e VACNT-O, verticalmente alinhado (a.2); (a) micrografias coletadas por MEV. (a.1 e a.2) micrografias coletadas por MET.
Fonte: Autora.
79
Figura 31 - Micrografias coletadas a partir de (b) nHAp1 (eletrodepositadas), detalhes da morfologia de placas (b.1 e b.2). (b e b.1) micrografias coletadas por MEV. (b. 2) micrografias coletadas por MET.
Fonte: Autora.
80
Figura 32 - Micrografias coletadas a partir de (c) nHAp2 (imersão em SBF), detalhes da morfologia globular (c.1 e c.2). (c e c.1) micrografias coletadas por MEV. (c. 2) micrografias coletadas por MET.
Fonte: Autora.
81
A Figura 33 mostra micrografias de membranas porosas de PDLLA (Figura 33a),
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (Figura 33b.) e de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 (Figura 33c).
Em geral, observou-se diferenças na morfologia da superfície entre os grupos após
a incorporação das nanopartículas. A Figura 31a mostra os poros menores sobre a
superfície de PDLLA (~ 227 poros por imagem, contados com Image J®). Após a
dispersão de nHAp1 em PDLLA, as membranas apresentaram poros maiores na
superfície com diâmetro entre 12-31μm (~ 87 poros por imagem, contados J®)
(Figura 33b). Após a incorporação de nHAp2, obteve-se valores entre 21-35μm (~
121 poros contados por imagem J®) (Figura 33c). A análise de perfilometria mostra
um aumento da rugosidade na PDLLA/VACNT-O: nHAp1 (Figura 33 b.1) e
PDLLA/VACNT-O:nHAp2 (Figura 33 c.1), em comparação com as membranas de
PDLLA sem nanopartículas incorporadas (Fig. 31 a.1, controle). Portanto, observa-
se a formação de uma quantidade maior de vales nas membranas com
nanopartículas. As membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e
PDLLA/VACNT-O:nHAp2 mostraram valores de porosidade de 84%, 60% e 84%,
respectivamente. As membranas de PDLLA controle, apresentaram poros em menor
diâmetro sobre a superfície (~ 227 poros) e 84% de porosidade. No entanto, o
PDLLA/VACNT-O:nHAp2 apresentou a mesma porosidade de 84% com ~ 121 poros
na superfície, provavelmente devido à grande absorção da nHAp2. Podemos atribuir
isso a maior porosidade da nHAp2 ao comparada com a nHAp1 (Figura 33 c1).
A Tabela 3 mostra a rugosidade da superfície das membranas de PDLLA,
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2. Observou-se uma diferença
significativa entre as membranas de PDLLA (controle) em comparação com
PDLLA/VACNT-O:nHAp2. Em comparação, as membranas de PDLLA/VACNT-
O:nHAp2 apresentou um aumento de rugosidade de 41,84%.
82
Tabela 3 - Análises da rugosidade de superfície das diferentes membranas porosas produzidas. Dados expressos em média de 3 membranas (n = 3)
Membranas porosas Ra (µm) DP
PDLLA 4,11 0,32
PDLLA/VACNT-O:nHAp1
4,88 0,45
PDLLA/VACNT-O:nHAp2
5,83 0,94
Fonte: Autora.
Figura 33 - Micrografias (MEV) e perfilometria das membranas antes e depois das nanopartículas incorporadas. (a) PDLLA, (b) PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e (c) PDLLA/VACNT-O:nHAp2, sendo que (1) perfilometria.
Fonte: Autora.
83
A Figura 34 mostra as análises da energia superficial de membranas de PDLLA,
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após tratamento com plasma
de oxigênio utilizando líquidos polares e dispersivos. Os dados mostram que as
membranas de PDLLA apresentavam um ângulo de contato de 112°. No entanto,
houve uma diferença menor em valores de AC depois da incorporação das
nanopartículas de nHAp (valores entre 89º). Portanto, os tratamentos foram
suficientes para melhorar a hidrofilicidade do biomaterial. Vários autores relataram
que uma superfície polimérica parcialmente hidrofílica com um ângulo de contato de
60-90º aumenta a adesão celular e que a energia de superfície pode estar
relacionada à adesão celular em superfícies poliméricas (VAN WACHEM, 1987;
HASSON; WIEBE; ABBOTT, 1987; TAMADA; IKADA, 1994; IKADA, 1994). As
membranas de PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp1 apresentaram menor diferença
na energia de superfície, com valores entre 21,27±5 mNm-1. No entanto, as
membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 mostraram uma energia de superfície
maior (27,35 ± 7 mNm-1). Esta diferença de energia superficial apresentada nas
membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 pode ser atribuída ao controle da
distribuição de poros, como mostrado na Figura 33c.
Figura 33 mostra os espectros ATR-FTIR coletados de membranas de PDLLA,
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2. Todos os grupos mostraram
uma banda de absorção forte a 1750 cm-1 que corresponde ao grupo carbonila (CO)
da estrutura química de PDLLA. Foram observadas bandas a 1450 cm-1 e 1380 cm-1,
atribuídas a uma absorção saturada a partir da ligação C-H, bem como uma forte
banda de absorção de CO em 1270-1045 cm-1. A banda em 750 cm-1 pode ser
atribuída ao modo rocking da ligação –CH2. A banda a 870 cm-1 corresponde a
deformação C-H e a banda a 960 cm-1 é atribuída a CH=CH (WILSON; DECIUS;
CROOSS, 1980; COLTHUP, DALY, WIBERLY,1990; LIU et al., 2006; ZHENG et al.,
2009).
Analisou-se a área do pico ATR-FTIR para provar as propriedades hidrófilas das
membranas após o tratamento com plasma de oxigênio. Para isso, utilizou-se a
banda mais intensa centrada a 1750 cm-1 atribuída a ligação CO. Observou-se um
aumento de 15% na área (p<0,05) para ambos, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/
VACNT-O:nHAp2 em comparação com PDLLA (controle). Este aumento foi atribuído
à incorporação de grupos de oxigênio, após o tratamento com plasma.
84
Figura 34 - Análise de ângulo de contato de todas as membranas produzidas com e sem nanopartículas incorporadas. O PDLLA sem nanopartículas foi utilizado como controle. Os dados foram coletados a partir de 3 amostras (n=3).
Fonte: Autora.
O aumento da rugosidade e porosidade da superfície dos biomateriais contribui
também para o aumento da molhabilidade e determina a adsorção de proteínas e a
adesão e proliferação celular (DUAN; WANG, 2006; MACHADO, 2008; THELEN;
BARTHELAT; BRINSON, 2004; VANDROVCOVÁ; BAČÁKOVÁ, 2011; BACAKOVA
et al., 2011; BAUER et al., 2013; WU et al., 2014).
Yang, Bei e Wang (2002), descreveram que a hidrofilicidade e a rugosidade de
superfície são características importantes na interação celular e que aumentam a
afinidade das células de fibroblastos pelo PDLLA. No estudo de Yang, Bei e Wang
(2002), a superfície do PDLLA foi modificada por um tratamento a plasma de
oxigênio e amônia, que agregou grupos polares e aumentou a adsorção e
ancoragem do colágeno na superfície do PDLLA (YANG; BEI; WANG, 2002).
Resultados semelhantes foram obtidos por Lin et al (2010), grupos funcionais
tornaram o PDLLA mais hidrofílico e melhorou adesão e proliferação celular na
superfície do PDLLA.
Nithya et al. (2011) estudaram o efeito do plasma e enzima celulase para
modificação de superfície. Os tratamentos de plasma e da enzima celulase foram
eficazes para melhorar a molhabilidade de tecidos de algodão. Esta hidrofilicidade
85
foi comprovada pelo aumento do grupo carbonila (C-O) pela técnica de FTIR
(NITHYA et al., 2011).
Neste contexto, os tratamentos com plasma são frequentemente usados para
modificar a superfície dos materiais e melhorar a resposta celular a uma superfície
(WADE; MAMMODE; BINDER, 1991; LOH, 1999; FAVIA; D´AGOSTINHO, 1998;
YANG; BEI; WANG, 2002). Nesta tese, utilizamos a técnica de ATR-FTIR para
confirmar a hidrofilicidade das membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp obtida pelo
tratamento de plasma de oxigênio (NITHYA et al., 2011).
Resultados semelhantes foram obtidos por Alves et al. (2008), o tratamento de
plasma de oxigênio promoveu o aumento da hidrofilicidade e da energia de
superfície. Estas propriedades favoreceram a adsorção de proteínas e a afinidade
celular após a adsorção das proteínas na superfície do PDLLA (ALVES et al., 2008).
Figura 35 - Espectros FTIR-ATR de membranas PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/ VACNT-O:nHAp2. Todos os espectros foram coletados em três pontos diferentes.
Fonte: Autora.
86
Os componentes da energia de superfície foram obtidos com o método de Owens
(OWENS; WENDT, 1969) e estão listados na tabela 4. Calculou-se a energia de
superfície total da soma das componentes polar (γp) e (γd) dispersiva.
Para estimar as componentes dispersivas e polares foram utilizadas expressões
termodinâmicas, assim como para o cálculo da energia de adesão interfacial das
membranas. Foram utilizados os valores da energia de superfície de células de
fibroblastos de camundongos L929 (SCHAKENRAAD et al., 1998). Os dados
mostram que o PDLLA possui características hidrofóbicas com energia interfacial
positiva (ΔFadh) (tabela 4). No entanto, as membranas com nanopartículas
incorporadas apresentaram resultado termodinamicamente favorável à adesão
celular com valores negativos (ΔFadh).
Tabela 4 - Componentes de energia de superfície e livre interfacial de adesão das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2
Membranas
Energia livre de superfície (mN m-1) Energia interfacial de
adesão
(mJ m-2)
Dispersiva
(γd)
Polar
(γp) Total
PDLLA 10,47 1,38 11,85 20,37
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 30,42 2,7 33,12 -5,27
PDLLA/VACNT-O:nHAp2 38,42 0,78 39,2 -10,20
Fonte: Autora.
A Figura 36 mostra termogramas de membranas PDLLA com e sem nanopartículas incorporadas e a tabela 5 mostra os parâmetros térmicos calculados a partir desses termogramas.
87
Figura 36 - Os termogramas obtidos por calorimetria diferencial exploratória das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2.
Fonte: Autora.
Tabela 5 - Parâmetros Térmicos de membranas de PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp
Material ∆Hv (J g-1) ∆Hcc (J g-1) ∆Hm (J g-1) Tcc (oC) Tm (oC) Xc (%)
PDLLA 6,7 12,4 13,6 112,2 148,7 13,5
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 9,2 18,2 23,4 111,3 150,2 23,2
PDLLA/VACNT-O:nHAp2 6,5 15,3 18,3 111,3 150,1 18,1
Fonte: Autora.
O primeiro pico endotérmico, entre 55°C e 69°C, foi atribuído à evaporação do
solvente residual, sendo que a evaporação do clorofórmio ocorre em torno de 55-
60°C (ALLO et al., 2012), na mesma faixa de transição vítrea (Tg) do PDLLA. Todos
os grupos de membranas apresentaram uma pequena quantidade de solvente
residual. As membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-
88
O:nHAp2 apresentaram uma quantidade de solvente residual de 4%, 3,4% e 2,5%
(m/m), respectivamente. Os solventes orgânicos são prejudiciais para o crescimento
celular, no entanto, esta quantidade residual pode ser evaporada deixando os
materiais em uma estufa a 60°C antes de sua utilização como arcabouços para
regeneração óssea. Observou-se nas membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 dois
picos endotérmicos a 58°C e 62ºC, atribuídos ao restante da evaporação de SBF e
clorofórmio que permaneceu na estrutura das membranas. O pico exotérmico foi
atribuído ao processo de cristalização a frio durante a corrida de aquecimento. A
adição de VACNT-O:nHAp (nHAp1 e nHAp2) diminuiu o tempo de cristalização (tc)
das membranas quando comparado com PDLLA controle, o que indica que nas
membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp provavelmente as partículas atuam como
agentes de nucleação e aumentam a taxa de cristalização do PDLLA. Os aumentos
na entalpia de fusão, em ambas as membranas, confirmam o papel de nucleação
das nanopartículas em processo de cristalização a frio, também observada por
outros pesquisadores (ARMENTANO et al., 2010; DADBIN; NAIMIAN, 2014). Um
tempo de cristalização (tc) com valores mais baixos, podem induzir uma maior
ocorrência de perfeição cristalina, aumentando a entalpia (ΔHm) e a temperatura de
fusão (Tm) e bem como a cristalinidade (Xc) (DI LORENZO, 2006) (Tabela 5).
Portanto, observa-se que as nanopartículas VACNT-O:nHAp1 e VACNT-O:nHAp2
melhoraram a cristalinidade do PDLLA (Xc).
A cristalinidade é uma variável bem conhecida em ciências dos materiais e afeta
não apenas as propriedades físico-mecânicas, mas também biodegradabilidade. No
caso de polímeros, a cristalinidade proporciona uma maior estabilidade térmica, o
que pode ser útil para processos de esterilização térmica (LI; MCCARTHY, 1999).
Além disso, a taxa de biodegradação é mais lenta em polímeros cristalinos do que
nos polímeros semicristalinos ou amorfos, sendo assim a taxa de biodegradação
diminui com o aumento do índice de cristalinidade (TSUJI; MIYAUCHI, 2001;
SARASUA et al., 2005).
Com relação a ensaios biológicos, foi descrito na literatura que um aumento da
cristalinidade influencia a energia superficial, diante destes resultados, BIGGS et al.
(2003), investigaram a resposta celular frente a cristalinidade do PLLA. Os autores
relataram que as micropartículas de PLLA com maior cristalinidade induziu uma
89
menor resposta inflamatória in vitro em comparação com as partículas de
cristalinidade menores (BIGGS et al., 2003).
SARASUA et al. (2011) relataram que células de camundongos (L929) proliferam
melhor em substratos de PLLA do que PDLA, porém queratinócitos proliferam
melhor em PDLA. Células de linhagens diferentes apresentaram respostas
diferentes quando cultivadas em materiais com cristalinidade diferentes, portanto
investigações adicionais devem ser realizadas para determinar o uso clínico
adequado destes biomateriais (SARASUA et al., 2011).
Figura 37 mostra a análise termogravimétrica para caracterizar as perdas de
massa das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-
O:nHAp2. As três amostras apresentaram comportamento térmico muito semelhante
quando expostos às mesmas proporções de aquecimento. Todas as amostras,
quando expostas a uma taxa de aquecimento de 20°C min-1 mostraram perda de
massa a temperaturas equivalentes, o que não indica uma diferença significativa que
possa ser associada à presença das nanopartículas ou seja, a adição de
nanopartículas não alteram a resistência à decomposição térmica.
90
Figura 37 - Análise termogravimétrica das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2.
Fonte: Autora.
Figura 38 (a-c) mostra as micrografias coletadas da superfície das membranas de
PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após a imersão em
SBF por 14 dias. No geral, as membranas apresentaram propriedades de
bioatividade. No entanto, observou-se diferenças entre os grupos de membranas.
Observa-se que os grupos de membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e
PDLLA/VACNT-O: nHAp2 apresentaram mais poros e rugosidade do que o grupo
PDLLA. A propriedade de bioatividade está diretamente relacionada às modificações
na superfície das membranas PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O: nHAp2.
As membranas de PDLLA apresentaram uma camada de apatita globular não
homogênea (Figura 38a). Nitidamente, observa-se uma camada de nHAp globular
compacta nas membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (Figura 38b) e
PDLLA/VACNT-O:nHAp2 (Figura 38c) após 14 dias de imersão em SBF.
91
Figura 38 - Micrografia de varredura eletrônica de estruturas de (a) PDLLA, (b) PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e (c) PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após o processo de biomineralização.
Fonte: Autora
A bioatividade e o processo de biomineralização foi comprovado em todas as
membranas utilizando a técnica de FTIR-ATR (Figura 39). Todos os grupos de
membranas apresentaram uma banda intensa de absorção em 1750 cm-1 que
corresponde ao grupo carbonila (C-O) do PDLLA (REHMAN; BONFIELD, 1997).
Dados mostram um pico em 960 cm-1, relativo ao modo de estiramento do fosfato
identificando a presença de nHAp e a banda de absorção do grupo fosfato são
encontradas entre 1200-1030 cm-1 (RADIN; DUCHEYNE, 1993; REHMAN et al.,
1994; REY et al., 2007; MAHAJAN et al., 2010). Além disso, as bandas da região de
1.650-1.300 cm-1 e o pico em 870 cm-1 são atribuídas ao carbonato na superfície
(RADIN; DUCHEYNE, 1993; REHMAN et al., 1994; REY et al., 2007; MAHAJAN et
al., 2010).
92
Figura 39 - Espectro de FTIR coletados de membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após imersão em solução que simula o fluído corporal (SBF) por 14 dias.
Fonte: Autora.
Além disso, os valores aproximados da razão de CO32-/PO4
3- comprovam a
bioatividade e biomineralização de todas as amostras (Tabela 6).
Tabela 6 - Relação carbonato/fosfato coletadas a partir de espectros FTIR em PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2
Amostra CO32-/PO4
3-
PDLLA 0,061
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 0,063
PDLLA/VACNT-O:nHAp2 0,059
A Figura 40 mostra a caracterização por difração de raio X de membranas de
PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 imersas em SBF por
14 dias. É possível identificar os picos típicos para nHAp carbonatada, na referência
93
cristalográfica JCPDS 019-0272 em: 25,7º (002); 29,3º (210); 32,2º (112); 39,4º
(212); 47,1º (222); 49,5º (213) e 52,7º (004).
Figura 40 - Difratograma de Raios X da superfície de membranas (a) PDLLA e (b) PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e (c) PDLLA/VACNT-O: nHAp2 imersas em SBF durante 14 dias.
Fonte: Autora.
Comparando as membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 imersas em SBF 5x, a
reflexão mais estreita e mais intensa em 32,2° é atribuída à presença de cristais de
HAp. Este resultado comprova a bioatividade muito superior das amostras de
PDLLA/VACNT-O:nHAp2 em relação as membranas PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e
PDLLA, refere-se a maior densificação da camada de HAp em relação aos demais
grupos, após o processo de dissolução precipitação em SBF 5x por 14 dias.
A tabela 7 mostra o aumento do tamanho dos cristalitos de PDLLA/VACNT-O:
nHAp2. O aumento do tamanho médio dos cristalitos formados na superfície de
amostras PDLLA/VACNT-O:nHAp2 indica a incorporação do carbonato formando a
hidroxiapatita carbonatada e a formação de sítios de nucleação ativos durante a
reação de precipitação-dissolução (LEGEROS, 1991; KOKUBO; TAKADAMA, 2006).
94
Tabela 7 - O tamanho de cristalito de nHAp formados na superfície de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após imersão em SBF durante 14 dias
Amostra (2θ) Pico (Å) Cristalito
PDLLA 31,9° 177
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 32,2° 88
PDLLA/VACNT-O:nHAp2 32,0° 617
Fonte: Autora.
A biomineralização sobre a superfície do material é um indicador da bioatividade
do osso, consiste no primeiro método in vitro para testar a aplicabilidade do material
para regeneração óssea (KOKUBO; TAKADAMA, 2006). Por conseguinte, a
capacidade para formar apatita sobre a superfície é um resultado significativo na
determinação do grau de bioatividade do material como um implante ósseo.
O Ca+2 presente na estrutura da hidroxiapatita dispersa no polímero parece atuar
como sítio ativo para a formação de novos cristais. A liberação do cálcio é um dos
fatores responsáveis para a formação da camada bioativa de hidroxiapatita e a
formação do osso (CHEN et al., 2004). Estes cristais são formados como partículas
de diferentes tamanhos e formatos, formando uma camada de hidroxiapatita com
sítios ativos de nucleação durante o processo de dissolução precipitação
(LEGEROS, 1991; ABBONA; BARONNET, 1996). Poros nanométricos e grupos
carboxílicos polares na superfície também podem atuar como sítios iniciantes para
nucleação e crescimento de cristais de apatita (WILSON et al., 2005; MAHJOUBI et
al., 2014). Além disso, a rugosidade da superfície é essencial para o processo de
osseointegração, pois aumenta a ancoragem de fosfato de cálcio e a adesão e
proliferação celular na superfície do biomaterial (CITEAU et al., 2005).
Yang, Dennison e Ong (2005) estudaram a adsorção de proteínas e células em
discos de hidroxiapatitas com diferentes cristalinidades. No estudo de Yang,
Dennison e Ong (2005), a dissolução de hidroxiapatita teve relação com a
cristalinidade, mas a adsorção de proteínas e adesão celular foi menor na superfície
mais cristalina. A dispersão de nanopartículas de VACNTO:nHAp2 na matriz
polimérica promoveu o aumento da rugosidade da superfície e a exposição de
partículas de VACNTO:nHAp2 de maior solubilidade na superfície assim como a
hidrofilicidade adquirida com o tratamento a plasma, favoreceu a precipitação de
95
uma camada mais densa de hidroxiapatita e consequente uma melhor bioatividade
in vitro dessas membranas.
Como observado na Figura 41, todas as membranas produzidas não
apresentaram citotoxicidade, mantendo a viabilidade perto do observado para o
grupo controle (acima de 80%). A análise de variância indicou diferenças entre os
grupos (p = 0,04113) e o teste Tukey apontou diferenças entre o controle positivo
célula e o grupo PDLLA/VACNT-O:nHAp1.
Figura 41 - Análise de viabilidade celular de osteoblastos cultivado por 5 dias sob membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2, sendo que * indica p<0,05.
Fonte: Autora.
No ensaio de fosfatase alcalina, pode-se sugerir que todas as membranas
produzidas foram capazes de induzir efeito de mineralização detectável. No entanto,
diferenças estatisticamente significativas foram encontradas entre os grupos (p =
0,00007).
96
O teste de Tukey apontou diferenças entre PDLLA/VACNT-O:nHAp1 quando
comparado com SBF, e todas as membranas produzidas diferiram do controle
célula. Os dados são ilustrados na figura 42.
Figura 42 - Análise da fosfatase alcalina de osteoblastos cultivado por 5 dias sob membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e PDLLA/VACNT-O: nHAp2, sendo que *•□♦ indicam p< 0,05.
Fonte: Autora.
Em geral, a análise de cultura de células para as membranas produzidas
sugeriram um elevado nível de biocompatibilidade de todos os grupos, uma vez que
os níveis de viabilidade foram acima de 80% quando comparado com o controle
positivo de células. A avaliação da viabilidade com SRB está descrita na literatura
(ZEITLIN et al., 2006; KANEKO et al., 2007), com vantagens porque as células não
precisam metabolizar um sal. Na verdade, esta técnica baseia-se na coloração e
quantificação de proteínas celulares, de modo que fornece uma correlação direta
entre a quantidade de proteínas e o número de células. O grupo PDLLA/VACNT-O:
nHAp1 se mostrou menos biocompatível ou, pelo menos, induziu um menor
crescimento celular quando comparado com o grupo controle. Curiosamente, esses
97
dados poderiam ser diretamente correlacionados com a atividade da fosfatase
alcalina, onde o grupo PDLLA/VACNT-O:nHAp1 teve um aumento significativo na
atividade enzimática. Os testes com o meio de mineralização, o mesmo padrão foi
observado: um aumento significativo na atividade de ALP foi também correlacionado
com uma diminuição na contagem de células com SRB (dados não mostrados). Esta
pode ser uma sugestão direta que o grupo PDLLA/VACNT-O:nHAp1 também induz
um nível mais elevado de diferenciação das células, favorecendo a mineralização e
diminuindo o crescimento das células durante o primeiro contato com o biomaterial.
As membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2
foram implantadas em defeitos na calvária de camundongos. A figura 41 mostra
seções típicas histológicas após 4 meses de implantação. Em geral, os dados
obtidos incentivam a aplicação das membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp para a
regeneração óssea. A biocompatibilidade de PDLLA foi demonstrada, pois não
ocorreu processo inflamatório em nenhum dos grupos estudados. As membranas de
PDLLA mostraram uma baixa taxa de degradação e a presença de fibroblastos em
PDLLA. O tecido adjacente mostrou coloração bastante basofílica, com núcleo
prolongado próximos uns dos outros, como aspecto de fibrose, ainda mostrou um
tecido com recuperação incompleta (Fig.43a e 43a.1). Figura 43b mostra a região de
interface entre as membranas PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e osso com células gigantes
multinucleadas fagocitando as membranas. Observou-se a presença de um tecido
adjacente acidófilo que caracteriza a matriz óssea e o processo de regeneração do
tecido. Além disso, observou-se uma degradação mais rápida das membranas de
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (Figura 43c) em comparação com o grupo controle. Os
melhores resultados foram com o grupo de membranas PDLLA/VACNT-O:nHAp2
(Figura 43c) em que observou-se a regeneração completa do defeito. O osso recém-
formado foi precisamente organizado, incluindo o espaço de medula delimitado, sem
qualquer resíduo de biomaterial ou má formação óssea.
O tecido ósseo nativo compreende uma estrutura altamente especializada no
nível molecular, organizado por macromoléculas orgânicas e inorgânicas com
propriedades químicas importantes e necessárias para a função do tecido. O
biomimetismo faz com que as células reconheçam os materiais e melhorem as
funções alvo, tais como a adesão e proliferação celular (PÉREZ et al., 2013). A
presença de cristais nHAp em PDLLA certamente aumentou o processo de
98
regeneração óssea em ambos os biomateriais, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e
PDLLA/VACNT-O:nHAp2. No entanto, a bioreabsorção completa do polímero e a
formação de osso estrutural foi obtida apenas no grupo de PDLLA/VACNT-O:nHAp2
implantado. Características intrínsecas do biomaterial: como a espessura da parede
de PDLLA, o tamanho dos poros e cristalinidade da nHAp carbonatada podem ser
as responsáveis pelo sucesso de regeneração óssea por este biomaterial. Estes
resultados estão em concordância com os nossos resultados prévios de
biocompatibilidade e osteoindução de nanopartículas globulares (MARSI et al.,
2012).
99
Figura 43 - Fotomicrografia de lâminas histológicas que identificam a regeneração óssea após quatro meses de implante em grupos; (a) A regeneração óssea após o implante das membranas de PDLLA como controle (H&E, 40x); (a.1) detalhes em círculos (H&E, 100x); região de interface entre o primeiro e o osso (*) e seta indica fibroblastos. (b) a regeneração de osso após o implante PDLLA/VACNT-O: nHAp1 (H&E, 40x); (b.1) região de interface entre o polímero e o osso (*), células gigantes fagocitárias em setas (H&E, 100x). (c) regeneração completa de defeito ósseo após a implantação de PDLLA/VANCT-O: nHAp1 (H&E, 40x). (c1) MB indica a formação de medula óssea (H&E, 100x).
Fonte: Autora.
A análise de MEV complementam os resultados histológicos (Figura 44). Pode-se
observar que o PDLLA não foi degradado (Figura 44a). Além disso, o
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 foi parcialmente degradado e uma camada de apatita
biológica foi formada sobre a superfície confirmando os resultados de bioatividade in
vitro (Figura 44b). A Figura 44c mostra a regeneração completa do osso e a
completa degradação do PDLLA/VACNT-O: nHAp2, a formação da camada de
apatita comprova os resultados da figura 42c e pode-se observar os osteoblastos em
detalhes (quadrados), no tecido ósseo.
100
Figura 44 - Micrografias do osso na região de estudo mostram a regeneração óssea após quatro meses de implante em grupos; (a) a regeneração óssea após a implantação das membranas de PDLLA como controle; (a.1) detalhes em círculos da região de interface entre o polímero e oso (*) e a seta indica fibroblastos. (b) a regeneração óssea após a implantação das membranas PDLLA/VACNT-O nHAp1; (b1) detalhes de polímero parcialmente degradado. (*) e camada de hidroxiapatita carbonatada em setas. (c) regeneração óssea completa após a implantação de PDLLA/VACNT-O: nHAp2. (c1) detalhes de osteoblastos nos quadrados e a camada de hidroxiapatita carbonada indicada pelas setas.
Fonte: Autora. Uma técnica óptica foi associada para analisar a interface entre o tecido ósseo e a
região com implantação de biomaterial. A Figura 45 mostra os resultados do Raman
confocal coletados na interface do defeito ósseo e as membranas de PDLLA,
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2. Foram observadas bandas
fosfato ʋ2 a 431 -433 cm-1; fosfato ʋ4 a 584 -589 cm-1; prolina a 855-857 cm-1; ʋ1 fosfato a 960 cm-1; fenilamina na 1005 cm-1; carbonato a 1071-1072 cm-1; amida III,
101
1247-1248 cm-1; CH2-wag a 1451-1452 cm-1 e amida I a 1666-1667 cm-1 (CARDEN;
MORRIS, 2000; HOFMANN et al., 2006; GASIOR-GLOGOWSKA et al., 2010; BI et
al., 2011).
Figura 45 - Um espectro representativo de Raman coletado de seção óssea após quatro meses da implantação das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2.
Fonte: Autora.
Neste estudo, a área do pico Raman correspondente ao carbonato e fosfato foram
calculados para quantificar a diferença de biomineralização na interface de
biomateriais com osso. Assim os valores da razão fosfato/prolina, Fosfato/amida III,
Fosfato/amida I e carbonato/Amida I foram relacionados com o grau de
mineralização, o qual é caracterizado pela relação entre mineral e matriz orgânico de
compósito (MORRIS, 2010; MORRIS; MANDAIR, 2011; NYMAN et al., 2011).
A Tabela 8 mostra um aumento da área dos componentes da matriz mineral com
membranas de PDLLA/VACNT-O: nHAp1, o cálcio e fosfato são responsáveis pela
rigidez e propriedades mecânicas.
102
Tabela 8 - Comparação de valores de picos FWHM de fosfato e carbonato com PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (FWHM; R-quadrado: 0,99) recolhidos de seção osso extraído após quatro meses. Os grupos são significativamente diferentes, p <0,05 (One Way Anova)
Bioimplante Fosfato
(cm-1)
Carbonato
(cm-1)
CO32-/PO4
3-
PDLLA 24,34 19,48 0,80
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 34,03 21,00 0,61
Fonte: Autora.
No processo de formação do osso, a primeira mineralização é intrafibrilar e, em
seguida, a interfibrilar ocorre, minerais ocupam intrafibrilarmente cerca de 30-40%
do volume, um osso humano possui uma média mineral de cerca de 50-60% da fibra
de colágeno (LEES; DAVIDSON, 1998), a composição mineral óssea pode chegar a
60-70% do peso do osso seco (POSNER et al., 1984).
Com base nestes dados, os valores dispostos na Tabela 9 indicam um aumento
do processo de mineralização óssea na regeneração utilizando membranas de
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 em comparação com o grupo de controle.
Resumidamente, a membrana de PDLLA/VACNT-O:nHAp1 promove a
mineralização com uma maior proporção de minerais na matriz. Esta diferença na
composição química do osso formado na interface com o biomaterial pode ser uma
consequência de osteoindução devido a nHAp1 obtida por eletrodeposição. A
substituição de carbonato é um indicativo da qualidade do osso (MORRIS, 2010;
MORRIS; MANDAIR, 2011), observa-se uma proporção menor de precipitação de
carbonato de PDLLA/VACNT-O:nHAp1, bem como um aumento nos índices de
mineralização ao conteúdo orgânico da matriz, indicando uma melhor qualidade do
tecido ósseo.
103
Tabela 9 - Comparação da razão de fosfato/prolina; fosfato/amida III; fosfato/amida I e carbonato/amida I de membranas de PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (FWHM; R-quadrado: 0,99) recolhidos de seção óssea extraída após quatro meses. Os grupos são significativamente
Bioimplante Fosfato/
Prolina
Fosfato/
Amida III
Fosfato/
Amida I
Carbonato/Amida I
PDLLA 1,49 0,65 0,79 0,63
PDLLA/VACNT-O:nHAp1 2,17 2,02 1,60 0,99
Fonte: Autora.
A análise de espectros de membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 não mostra
grupos funcionais relacionados com o componente de matriz mineralizada. O perfil
do espectro de matriz orgânica com bandas atribuídas ao colágeno (FRUSHOUR;
KOENING, 1975), sugere a formação de calo ósseo e da oclusão do defeito ósseo
(MURAO et al., 2013).
Nossos resultados apresentaram que a incorporação de nanopartículas na matriz
polimérica, assim como o tratamento de plasma de oxigênio promoveram uma
estrutura polimérica 3D, com maior porosidade e rugosidade. Estas propriedades de
superfície adquiridas foram responsáveis pelo sucesso nos ensaios preliminares in
vitro e in vivo.
Mikael et al. (2014), relataram a produção de membranas de PLGA porosas
tridimensionais com incorporação de CNT, essas nanopartículas favoreceram a
adesão e proliferação celular, além de melhorar as propriedades mecânicas do
PLGA. As membranas de estrutura 3D são promissores biomateriais para
regeneração óssea (MIKAEL et al., 2014).
Corroborando com estes resultados, a estrutura polimérica 3D das membranas de
PDLLA/VACNT-O:nHAp, assim como a porosidade e rugosidade foram essenciais
para os resultados de biocompatibilidade e mineralização vistos na figura 39 e 40.
Ren et al. (2008) avaliaram scaffolds de PDLLA/HAp produzidos pelo método de
polimerização in situ. As respostas iniciais mostraram a citotoxicidade grau I de
acordo com a norma ISO 109931. Não houve nenhum caso de morte dos animais,
apenas uma pequena resposta inflamatória nas 1-9 semanas (REN et al., 2008).
Nossos resultados in vitro mostraram nenhuma toxicidade e todos os animais
sobreviveram à exposição por 4 meses.
104
Nossos resultados evidenciaram a bioatividade in vitro e in vivo de membranas
PDLLA/VACNT-O:nHAp, a incorporação de nanopartículas e o tratamento de plasma
de O2 promoveram a osseointegração.
Resultados semelhantes foram obtidos por Deplaine et al. (2013), que
descreveram o tratamento com plasma e incorporação de HAp no polímero como
essenciais para melhora da nucleação em SBF, formando uma camada mais
espessa de apatitas biológicas. Este material, quando implantado em lesão
osteocondral de ovelhas, promoveu o aparecimento de osteóides muito semelhantes
ao osso maduro (DEPLAINE et al., 2013).
Além disso, Van der Zande et al. (2011), relataram a produção de scaffolds
poliméricos com a incorporação de CNT e HAp para melhorar as propriedades
mecânicas e osteocondutividade, assim como a retenção de proteína morfogenética
do osso-2 (BMP-2). Os autores avaliaram a liberação de BMP-2 de scaffolds de
PLLA-CNT-μHA durante 5 semanas em ratos, observou-se que a incorporação de
nanopartículas não alterou a bioatividade de BMP-2 (VAN DER ZANDE et al., 2011).
Os resultados de Van der Zande et al. (2011) mostram que é possível a
associação de BMP-2 com nanopartículas, as BMP-2 podem ser facilmente
dispersas em PDLLA amorfo, sendo assim as membranas de PDLLA/VACNT-
O:nHAp podem ser utilizadas para liberação controlada de BMP-2, esta associação
será investigada pelo nosso grupo de pesquisa em trabalhos futuros.
Mahjoubi et al. (2014) mostraram que a modificação da superfície de PDLLA para
hidrofílica pelo método de diazônio, introduz grupos funcionais e proporciona uma
biomineralização com aumento de nucleação de HAp e ainda melhorou o
crescimento e espalhamento celular em superfície do PDLLA modificado.
Nossos resultados são concordantes com os resultados de Mahjoubi et al. 2014, a
incorporação de grupos carboxílicos polares na superfície das membranas
poliméricas favorecem a nucleação de HAp e a interação com o meio biológico.
Hasegawa et al.(2005) implantaram scaffolds de PDLLA/HAp em região
intercondilar femoral, com um tempo de 26 semanas ocorreu um aumento na
formação óssea e os scaffolds de PDLLA/HAp apresentaram degradação mais
rápida do que o controle (HASEGAWA et al., 2005). O tempo de degradação do
PDLLA amorfo, ocorre em 72 semanas (HEIDEMANN et al., 2001). O biomaterial
apresentado nesta tese apresentou melhores resultados, a apatita biomimética
105
cristalina produzida após imersão de VACNT-O em SBF (grupo nHAp2) quando
incorporada no PDLLA contribui para acelerar a degradação do polímero;
PDLLA/VACNT-O: nHAp2 foi completamente degradado após 4 meses e promoveu
a completa e organizada osseointegração.
106
5 CONCLUSÕES Neste trabalho foram produzidas membranas porosas PDLLA/VACNT-O:nHAp de
estruturas honeycombs com incorporação de nanopartículas de VACNT-O:nHAp, o
tratamento de plasma de O2 foi essencial para a aplicabilidade destes
nanocompósitos na regeneração óssea. Desta forma foram comprovados que:
-O método de produção com umidade controlada favorece a formação de poros
na superfície das membranas poliméricas.
- A incorporação de nanopartículas promove o aumento do diâmetro dos poros e
da rugosidade superficial.
- Tratamento superficial utilizando plasma de oxigênio são eficientes para
modificar as características físicas das membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp,
tornando-as parcialmente hidrofílicas.
-A caracterização de materiais mostrou que as membranas porosas
PDLLA/VACNT-O:nHAp apresentaram propriedades de morfologia e porosidade
superiores em comparação com o PDLLA.
- Observaram-se que todas as membranas apresentam propriedade de bioatividade
pelo método de imersão em SBF por 14 dias.
- Os nossos resultados in vitro demonstraram que as membranas produzidas não
apresentam quaisquer efeitos citotóxicos. O ensaio de fosfatase alcalina demostrou
que todas as membranas são capazes de induzir a mineralização.
-Os testes iniciais in vivo, em modelo de defeito na calvária de camundongos, são
promissores, pelo fato dos nanocompósitos de PDLLA/VACNT-O:nHAp não
apresentarem rejeição e promoverem a formação óssea.
-Membranas PDLLA/VACNT-O:nHAp1 apresentaram degradação parcial observada
na histologia e no MEV, os promissores resultados destas membranas foram
apresentados na análise de qualidade óssea por Raman confocal.
- Membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 foram totalmente integradas in vivo após
4 meses de implante e promoveram a completa e organizada osseointegração, com
tempo mais rápido de degradação polimérica, mostrando-se como biomaterial
promissor para regeneração óssea.
107
6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS A partir dos resultados obtidos por esta pesquisa fazem-se necessários as
seguintes investigações futuras:
- Controlar a porosidade das membranas;
-Pesquisar a morfologia, estrutura e propriedades mecânicas de membranas com
diferentes concentrações de nanopartículas;
-Estudo comparativo das diferentes concentrações e tamanhos de poros para a
osseointegração;
-Produção desses biomateriais em diferentes moldes ósseos (exemplo:
artroplastia de quadril);
-Estudo in vivo, para modelos de fratura de fêmur e intercôndilos femorais; com
intervalos de 1- 12 meses em animais saudáveis.
-Estudos fisiopatológicos de osseointegração com estes biomateriais (exemplo:
osteoporose, osteomielites e osteogênese imperfeita);
-Compreender os processos de osseointegração com nanocompósitos
poliméricos;
-Ensaios bactericidas e fungicidas;
- Analisar a interação dos biomateriais com a irradiação laser no infravermelho em
diferentes intervalos de dose para regeneração óssea;
- Analisar o efeito magnético dos biomateriais para promover a hipertermia por
meio de gerador de campo magnético externo ou corrente elétrica para tratamento
de tumores ósseos localizados após remoção cirúrgica;
-Estudo de genotoxicidade dos biomateriais.
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130
ANEXO A –CARTA DE ACEITE DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA COM ANIMAIS
131
ANEXO B- ARTIGOS PUBLICADOS
132
ANEXO C- ARTIGO ACEITO
133
ANEXO D - ARTIGOS E RESUMOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSOS SOBRE O TEMA
1. SIQUEIRA, I. A. W. B. et al. Bactericidal activity of PDLLA/Carbon Nanotubes/nHAp scaffolds for orthopaedic applications. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA BIOMÉDICA, 24., 2014, Uberlândia. Anais...Urbelândia: [S.n], 2014. v. 1. p. 328-330.
2. SIQUEIRA, I. A. W. B. et al. Application of PDLLA/CARBON Nanotubes/nHAP scaffolds for bone regeneration. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA BIOMEDICA, 24., 2014, Uberlândia. Anais..., Urbelândia: [S.n], 2014. v. 1. p. 331-333.
3. SIQUEIRA, I. A. W. B.; MARCIANO, F. R.; LOBO, A. O. Avaliação da bioatividade de nanocompósitos PDLLA/nHAp:VACNT-O pelo método de imersão em fluido corporal simulado. In: ENCONTRO LATINO AMERICANO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E PÓS-GRADUAÇÃO, 18., 2014, São José dos Campos. Anais..., São José dos Campos: Univap, 2014. p. 1-5.
4. LEITE, N. C. et al. Ensaio de Bioatividade in vitro de nanocompósitos de nHAp/MWCNT-UI utilizando Fluido Corporal Simulado. In: ENCONTRO LATINO AMERICANO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 17., 2013, São José dos Campos. Anais...São José dos Campos: Univap, 2013. v. 1. p. 1-1.
5. SIQUEIRA, I. A. W. B.et al. Biomineralização de arcabouços porosos de PDLLA/nanotubo de carbono/grafeno para aplicações biológicas. In: ENCONTRO LATINO AMERICANO DE PÓS-GRADUAÇÃO, 13., 2013, São José dos Campos. Anais...São José dos Campos: Univap, 2013. v. 1. p. 1-6.
6. NEVES, M. F.; et al. Nanocompósitos de nanotubo de carbono com hidroxiapatita para aplicações no tecido ósseo. In: ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E MOSTRA DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA, 16.. 2012, São José dos Campos. Anais..., São José dos Campos: Univap,, 2012. v. 1. p. 1-5.
7. SIQUEIRA, I. A. W. B.; et al. Pesquisas em regeneração óssea: nanotubos de carbono. In: - ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E MOSTRA DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA, 16., 2012, São José dos Campos. Anais... São José dos Campos: Univap, 2012. v. 2. p. 1-5.
8. SIQUEIRA, I. A. W. et al. Raman spectroscopy of bone tissue. In: BRAZILIAN WINTER SCHOOL - BIOPHOTONICS, 1., 2012, São José dos Campos. Proceedings... São José dos Campos: Univap, 2012. v. 1. p. 37-37.
134
9. LEITE, N. C. et al. Produção e ensaios biológicos de um novo nanocompósito a base de nanohidroxiapatita e nanotubos de carbono para regeneração óssea. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CERÂMICA, 58., 2014, Bento Gonçalves. Anais... Bento Gonçalves: Associação Brasileira de Cerâmica , 2014. v. 1. p. 1-1.
10. MARQUES, M. A. et al. Produção e caracterização de membranas porosas de PLA/nHAp para aplicações biomédicas. In: CONGRESSO DE SAÚDE E QUALIDADE DE VIDA DO CONE LESTE PAULISTA, 12., 2014, São José dos Campos. Anais... São José dos Campos: Univap, 2014. v. 1. p. 1-1.
11. LEITE, N. C. et al. Biological studies of nanohydroxyapatite/superhydrophilic carbon nanotubbes composites. In: ENCONTRO DA SBPMAT, 12., 2013, Campos do Jordão. Proceedings..., Campos do Jordão: Sociedade Brasileira de Pesquisa em Materiais, 2013. v. 1. p. 1-1.
12. SIQUEIRA, I. A. W. B. et al. Structure and properties of hydrophilic nHAp/carbon nanotubes/PDLLA scaffolds for osteocondral tissue engineering applications. In: ENCONTRO DA SBPMAT, 12., 2013, Campos do Jordão. Proceedings... Campos do Jordão: Sociedade Brasileira de Pesquisa em Materiais, 2013. v. 1. p. 1-1.
13. SIQUEIRA, I. A. W. et. al. Uso do Laser de Baixa Potência na Regeneração Óssea. In: CONGRESSO SAUDE E QUALIDADE DE VIDA CONELESTE PAULISTA,10., 2012, São José dos Campos. Anais... São José dos Campos: Univap, 2012. v. 1. p. 1-1.
135
ANEXO E - ARTIGO PREMIADO EM CONGRESSO 1. SIQUEIRA, I. A. W. B.; MARCIANO, F. R.; LOBO, A. O. Avaliação da
bioatividade de nanocompósitos PDLLA/nHAp:VACNT-O pelo método de imersão em fluido corporal simulado. In: ENCONTRO LATINO AMERICANO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E PÓS-GRADUAÇÃO, 18., 2014, São José dos Campos. Anais... São José dos Campos: Univap, 2014. p. 1-5.