การประเมินดีเอ็นเอ 6 ตําแหน ง...
Transcript of การประเมินดีเอ็นเอ 6 ตําแหน ง...
DIPTEROCARPACEAE
การประเมนดเอนเอ 6 ตาแหนง เพอการระบชนดของพรรณไมวงศยาง
ในประเทศไทยในประเทศไทยAssessment of Six Candidate DNA Barcode Loci in
Dipterocarpaceae of Thailandp p
จดทาโดย
ส ส นางสาวสลลลา บญเทยม
สาขาวทยาศาสตรชวภาพปาไม
อาจารยทปรกษา อ.ดร.สธร ดวงใจ
DIPTEROCARPACEAE
บทนา
สวนมากเปนไมตนขนาดใหญลาตนมกมชน หรอนายาง มกลนเฉพาะตว ใบ เดยวออกสลบเสนแขนงใบมกขนานกนเปน
ระเบยบ
ดอก สมบรณเพศ กลบรองดอก 5 กลบ กลบดอก 5 กลบ โคนกลบมกดอก 5 กลบ กลบดอก 5 กลบ โคนกลบมก
เชอมตดกน เกสรเพศผมาก อาจเรยงกน 1-2-
3 ชน รงไขจมอยในฐานของดอกเพยงเลกนอย ม 3 ชอง แตละชองมไขออน 2 หนวย กานชเกสรเพศเมย 1-3 กาน ผล ชนดแหง แขง และไมแตก โดยมากมกมปก
DIPTEROCARPACEAE
ความหลากชนดและการกระจายพนธ
Dipterocarpoideaeอนวงศ Dipterocarpoideaeอนวงศ Dipterocarpoideaeพบ 13 สกล ประมาณ 470 ชนด
ขอบเขตการกระจายอยในเขตรอนของทวปขอบเขตการกร จายอยในเขตรอนของทวป
เอเชย
กระจายพนธในเขตรอนทวโลก มประมาณ 470-580 ชนด แบงเปน 3 อนวงศ คอ
1.Pakaraimoideae2.Monotoideae3.Dipterocarpoideae
DIPTEROCARPACEAE
การกระจาย : พรรณไมวงศยางในประเทศไทย
DIPTEROCARPACEAE
การกระจาย : พรรณไมวงศยางในประเทศไทย
Dipterocarpus 16 ชนด Neobalanocarpus 1 ชนด Dipterocarpus 16 ชนด Neobalanocarpus 1 ชนด
Hopea 17 ชนด Parashorea 2 ชนด
Anisoptera 4 ชนด Shorea 24 ชนด
Cotylelobium 1 ชนด Vatica 13 ชนด y
( มานพ, 2550 และ Pooma, 2003)
DIPTEROCARPACEAE
นเวศวทยาของพรรณไมวงศยาง ในประเทศไทย
DIPTEROCARPACEAE
ความสาคญและการใชประโยชน
DIPTEROCARPACEAE
ขอจากดบางประการในการจาแนกชนด
ของพรรณไมวงศยาง
การจาแนกชนดสวนใหญใชดอก และ ผล กรณทมขอจากด ไดแก
การตรวจสอบกลาไม
การตรวจสอบไมทอน
การวจยเกยวกบรากพรรณไมวงศยางกบรา
ไมคอรไรซา (mycorrhiza)
DIPTEROCARPACEAE
ดเอนเอบารโคด (DNA Barcode)
การบงชชนดของสงมชวต โดยใชขอมลลาดบ
นวคลโอไทดของสายดเอนเอในตาแหนงดเอนเอ
มาตรฐาน (standardized DNA) ฐ (sta da d ed )
การวเคราะหลาดบนวคลโอไทด คอ การวเคราะห=การจดเรยงตวของเบส 4 ตว คอ A,T,C, และ G
=
DIPTEROCARPACEAE
DNA barcode และ DNA marker แตกตางกนอยางไร
DNA barcode DNA marker
DIPTEROCARPACEAE
ดเอนเอบารโคด
ตาแหนงดเอนเอมาตรฐาน คอ ตาแหนงกรณพชมการเสนอตาแหนงดเอนเอมาตรฐาน
ใ โ โ hl l tตาแหนงดเอนเอมาตรฐาน คอ ตาแหนง
ของดเอนเอทมการประเมนแลววาม
ในคลอโรพลาสตจโนม (chloroplast genome) ไดแก
1 t F t Hศกยภาพเพยงพอทจะจาแนกชนด 1.atpF-atpH spacer 2.ยน matK3 b L3.ยน rbcL
4.ยน rpoB5 C15.ยน rpoC16. psbK-psbl spacer 7 t H bA7. trnH-psbA spacer
DIPTEROCARPACEAE
การประเมนดเอนเอทเหมาะสม
โครงสรางแผนภาพ (topology) intra- specific divergences
การคานวณคา genetic distance
divergences<
inter specificgดวย Kimura 2-parameter
(K2P) distances
inter-specificdivergences
( )
DIPTEROCARPACEAE
ตวอยางการวเคราะหขอมล
DIPTEROCARPACEAE
ขนตอนการทาด
เอนเอบารโคด
DIPTEROCARPACEAE
ประโยชนดเอนเอบารโคด
ช การระบชนด
ตรวจสอบและวเคราะหชนดพชอาหาร
และเหยอ
ป ประเมนความหลากหลายทางชวภาพ
DIPTEROCARPACEAE
วตถประสงค
1 สรางดเอนเอบารโคด (DNA barcode) เพอร บชนด1. สรางดเอนเอบารโคด (DNA barcode) เพอระบชนด
พรรณไมวงศยางในประเทศไทย
2 ศกษาความสมพนธทางวงศวานววฒนาการของพรรณไม2. ศกษาความสมพนธทางวงศวานววฒนาการของพรรณไม
วงศยางในประเทศไทย
DIPTEROCARPACEAE
วสดอปกรณ
อปกรณใน วสดอปกรณสาหรบสกดดเอนเอ อปกรณใน
ภาคสนาม วสดอปกรณสาหรบตรวจสอบ
คณภาพดเอนเอ
อปกรณใน
คณภาพดเอนเอ
วสดอปกรณสาหรบทาปฏกรยา
ลกโซพอลเมอเรส หองปฏบตการ
วสดอปกรณสาหรบทาผลตผล
ลกโซพอลเมอเรส
ปฏกรยาลกโซพอลเมอเรสใหบรสทธ
วสดอปกรณสาหรบวเคราะห
ขอมล
DIPTEROCARPACEAE
หลอดทดลอง โกรง เครองเขยา ชอนชา
ป ไ โ ป ป ปเครองปนเหวยง เครองควบคมอณหภม ตเยน ไมโครปเปต และทป
สารเคมสาหรบสกดดเอนเอ ไดแก liquid nitrogen, Sorbital buffer, 2% CTAB
buffer, Chloroform :isoamylalkohal 24:1, Isopropanal ,70 % Ethanol, TE buffer และ
RNAse (10 mg/ml)
DIPTEROCARPACEAE
อปกรณและสารเคมสาหรบตรวจสอบคณภาพดเอนเอ
ไดแก ชด electrophoresis กลองพลาสตกสาหรบยอมเจล ไมโครปเปต และ tip ไดแก ชด electrophoresis กลองพลาสตกสาหรบยอมเจล ไมโครปเปต และ tip
สารเคมสาหรบตรวจสอบคณภาพดเอนเอ ไดแก agarose gel,
สารละลาย 0.5 X TAE buffer, สารละลาย 6x loading buffer, สารละลายg
ethidium bromide (10 mg/ml)
DIPTEROCARPACEAE
หลอดทดลองขนาด เครองพซอาร เครองปนเหวยงขนาดเลก ไมโครปเปตตและ tip,
Dream Taq TM Green
PCR Master Mix, BSA/DMSO, ไพรเมอร, นากลน
DIPTEROCARPACEAE
ใชอปกรณชดเดยวกนกบอปกรณการทาปฏกรยาลกโซพอลใชอปกรณชดเดยวกนกบอปกรณการทาปฏกรยาลกโซพอล
เมอเรส สารเคมทใชคอ เอนไซม Exonuclease และ
Alk li Ph h tAlkaline Phosphatase
DIPTEROCARPACEAE
คอมพวเตอร โปรแกรม ChromasPro โปรแกรม Clustal X
โปรแกรม MEXGA 5 โปรแกรม PAUP โปรแกรม Mrbayes
DIPTEROCARPACEAE
วธการ
ใ ใ ตาแหนงของดเอนเอทใชในการศกษา
1.rbcL2 dhF2.ndhF3.trnK-matK4 t L t F4.trnL-trnF 5trnS-trnG6 bA t H6.psbA-trnH
DIPTEROCARPACEAE
วธการ
สกดดเอนเอเกบตวอยาง
สกดดเอนเอ
และตรวสอบ
ใ หาลาดบนว ทาดเอนเอให
บรสทธ เพมปรมาณดเอนเอ
หาลาดบนว
คลโอไทด
วเคราะหขอมลในการหาตาแหนง ดเอนเอทเหมาะสม บนทกเขาสฐานขอมล
DIPTEROCARPACEAE
การวเคราะหขอมล
การแกไขขอมล (Editing) : Assembling ดวยโปรแกรม Chromas ( g) gPro + multiple alignment ดวยโปรแกรม Clustal X
วเคราะหลกษณะความผนแปรของลาดบนวคลโอไทด ดวยและคานวนณคา
genetic distanceโปรแกรม MEXGA 5 0genetic distanceโปรแกรม MEXGA 5.0
สรางแผนภาพวงศวานววฒนาการ แบบ parsimony ในโปรแกรม PAUP*
Version 4 0b10 และแบบ likelyhood ในโปรแกรม MrbayesVersion 4.0b10 และแบบ likelyhood ในโปรแกรม Mrbayes
DIPTEROCARPACEAE
วธการ
Editing DNA sequence : chromas Pro or Bioedit
DIPTEROCARPACEAE
วธการ
การทา Multiple Alignment: clustral X
Species A: ATCCAAGTTTTAGGCGGATAGSpecies B: ATCCAAGGTTTATCCGTAGTATAG
DNA data
Species B: ATCCAAGGTTTATCCGTAGTATAGSpecies C: ATCCAGGTATAACCGTATAG
Species D: ??CCATGGTATAACCGTATAG
DNA dataSpecies A: ATCCAAGTTTTAGGC GGATAGSpecies A: ATCCAAGTTTTAGGC---GGATAGSpecies B: ATCCAAGGTTTATCCGTAGTATAGSpecies C: ATCCA-GGTATAACC---GTATAG
D ?? CC TGGT T CC GT T GSpecies D: ?? CCATGGTATAACC---GTATAG
DIPTEROCARPACEAE
วธการ
เปด nexus matrix ใน MEGA5 วเคราะห K2P distance
DIPTEROCARPACEAE
วธการ
คา K2P distance ทง interspecific and intraspecific ทไดจากการวเคราะห
DIPTEROCARPACEAE
วธการ
เปด nexus matrix ใน PAUP or MrBayes ทา tree เพอใชในการประเมนความเหมาะสม
DIPTEROCARPACEAE
Tree from gene A Tree from gene B
Dipterocarpus baudiiDipterocarpus kerriiDipterocarpus kerrii Dip04Dipterocarpus kerrii Dip14
Dipterocarpus turbinatus Dip37
Dipterocarpus baudii Dip21
Dipterocarpus alatus Dip16Dipterocarpus alatus Dip20
Dipterocarpus baudiiDipterocarpus kerriiDipterocarpus kerrii Dip04Dipterocarpus kerrii Dip14Dipterocarpus turbinatus Dip37
Dipterocarpus baudii Dip21
Dipterocarpus alatus Dip16Dipterocarpus alatus Dip20
p p pDipterocarpus turbinatus Dip46Dipterocarpus turbinatus Dip48
Dipterocarpus intricatus Dip01Dipterocarpus intricatus Dip02Dipterocarpus intricatus Dip05Dipterocarpus intricatus Dip07Dipterocarpus intricatus Dip08
Dipterocarpus intricatus Dip09
Dipterocarpus turbinatus Dip37Dipterocarpus turbinatus Dip46Dipterocarpus turbinatus Dip48
Dipterocarpus intricatus Dip01Dipterocarpus intricatus Dip02Dipterocarpus intricatus Dip05Dipterocarpus intricatus Dip07Dipterocarpus intricatus Dip08
Dipterocarpus intricatus Dip09p p pDipterocarpus intricatus Dip33
Dipterocarpus tuberculatus Dip03Dipterocarpus tuberculatus Dip06
Dipterocarpus gracilis Dip30Dipterocarpus obtusifolius Dip36Dipterocarpus obtusifolius Dip38
Dipterocarpus tuberculatus Dip03Dipterocarpus tuberculatus Dip06
Dipterocarpus intricatus Dip09Dipterocarpus intricatus Dip33
Dipterocarpus tuberculatus Dip03Dipterocarpus tuberculatus Dip06
Dipterocarpus gracilis Dip30Dipterocarpus obtusifolius Dip36Dipterocarpus obtusifolius Dip38
Dipterocarpus tuberculatus Dip03Di t t b l t Di 06
Dipterocarpus tuberculatus Dip50Dipterocarpus tuberculatus Dip52
Dipterocarpus dyeri Dip28Dipterocarpus grandiflorus Dip15Dipterocarpus grandiflorus Dip32
Dipterocarpus costatus Dip47Di t h t Di 23
Dipterocarpus tuberculatus Dip06
Dipterocarpus dyeri Dip68
Dipterocarpus tuberculatus Dip50Dipterocarpus tuberculatus Dip52
Dipterocarpus dyeri Dip28Dipterocarpus grandiflorus Dip15Dipterocarpus grandiflorus Dip32
Dipterocarpus costatus Dip47
Dipterocarpus tuberculatus Dip06
Dipterocarpus dyeri Dip68
Dipterocarpus crinitus Dip26Dipterocarpus cornutus
Dipterocarpus chartaceus Dip23Dipterocarpus chartaceus Dip24
Dipterocarpus glandulosusDipterocarpus hispidusDipterocarpus insignisDipterocarpus zeylanicus
Dipterocarpus crinitus Dip26Dipterocarpus cornutus
Dipterocarpus chartaceus Dip23Dipterocarpus chartaceus Dip24
Dipterocarpus glandulosusDipterocarpus hispidusDipterocarpus insignisDipterocarpus zeylanicusDipterocarpus zeylanicus Dipterocarpus zeylanicus
Therefore: for DNA barcoding, gene A better than gene B
DIPTEROCARPACEAE
สถานทและระยะเวลาทาการวจย
สถานท
1. การปฏบตงานภาคสนาม เกบตวอยางพรรณไมวงศยางทกระจายใน
ประเทศไทย
2. การปฏบตงานในหองปฏบตการ ศกษาและปฏบตงานใน
หองปฏบตการ ภาควชาชววทยาปาไม คณะวนศาสตร
มหาวทยาลยเกษตรศาสตร
ระยะเวลาทาการวจย
เรมตงแตเดอนพฤศจกายน พ.ศ. 2554 สนสดเดอน กรกฎาคม พ.ศ. 2556
DIPTEROCARPACEAE
ผลประโยชนทคาดวาจะไดรบ
ใ ไ ใ ป ไ ไ 1. สามารถใชดเอนเอระบชนดพรรณไมวงศยางในประเทศไทยได
2. สามารถจดทาฐานขอมลลาดบนวคลโอไทดของพรรณไมวงศยาง
ในประเทศไทย ในประเทศไทย
3. ทราบความสมพนธทางวงศวานววฒนาการของพรรณไมวงศยางใน
ประเทศไทยเพอเปนขอมลพนฐานในการนาไปจดการดานการอนรกษอยาง ฐ
ถกตอง และเปนขอมลสนบสนนงานทางดานอนกรมวธาน (taxonomy)
DIPTEROCARPACEAE
ขอขอบคณ
อ.ดร.สธร ดวงใจ อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก
อ.ดร.อไรวรรณ อรญวาสน อาจารยทปรกษา วทยานพนธรวม
และ นองๆปรญญาตร ทมสวนรวมในงานวจย
DIPTEROCARPACEAEDIPTEROCARPACEAE
ขอบคณคะขอบคณคะ