รายงาน - Burapha Universitydigital_collect.lib.buu.ac.th/dcms/files//2559_069.pdf7.48...

รายงาน

การพฒนาแหนเพอเปนพชนาตนแบบในการวจยพนฐาน และการนาไปประยกตใชทางเทคโนโลยชวภาพ

Development of Duckweed as a Model Aquatic-Plant for Basic Research and Application in Biotechnology

สลล ชนโรจน

รายงานวจยฉบบสมบรณ โครงการวจยทนอดหนน งบประมาณแผนดน สานกงานคณะกรรมการวจยแหงชาต

ประจาปงบประมาณ 2557

สารบญ

หนา

1. บทคดยอ............................................................................................... 1

2. ความสาคญและสรปความเปนมาของโครงการฯ.................................. 2

3. วตถประสงคของการวจย...................................................................... 3

4. ขอบเขตของการวจย............................................................................. 3

5. วธการดาเนนการวจย........................................................................... 3

6. ผลการวจย........................................................................................... 9

7. อภปรายผลการวจย............................................................................. 55

8. สรปผลการวจย.................................................................................... 67

9. ประโยชนและการประยกตใชงาน........................................................ 68

10. เอกสารอางอง.................................................................................... 69

1

1. บทคดยอ

แหน (duckweed) เปนพชดอกทมขนาดเลกทสดและสามารถเจรญเตบโตไดดและเรวในเขตรอน เชน

ประเทศไทย ดงนนแหนจงมความเหมาะสมในการนามาพฒนาเปนพชตนแบบเพอใชในการศกษาทางชววทยา

โครงสรางและสรรวทยาของพช อณชววทยา ชวเคม รวมไปถงการนาองคความรทไดไปประยกตใชทาง

เทคโนโลยชวภาพ จากการศกษาพบวาแหนทพบในแหลงนาภายในมหาวทยาลยบรพาประกอบไปดวย 3 สาย

พนธซงสามารถจาแนกไดดวยเทคนค PCR คอ แหนใหญ (Spirodela polyrhiza) แหนเลก (Lemna minor)

และ ไขนา (Wolffia globosa) ซงสามารถนามาเพาะเลยงในหองปฏบตการในสภาวะปลอดเชอทอณหภม 25

องศาเซลเซยส ความเขมแสง 15 μmol.m-2.s-1 โดยทาการกาจดสงปนเปอนดวยสารฟอกขาวหรอสารโพวโดน

ไอโอดน โดยแหนทง 3 ชนดเจรญเตบโตไดดในอาหารเหลว Hoagland E และมระยะเวลาในการเพมจานวน

ทวคณท 6.6, 2.7 และ 2.4 วน ตามลาดบ เมอศกษาลกษณะทางสณฐานวทยาพบวาแหนใหญ แหนเลก และ

ไขนามลกษณะเปนรปวงร มขนาดฟรอนด (กวาง x ยาว) เฉลย 3.95 x 5.38, 1.37 x 2.41 และ 0.45 x 0.56

มม. ตามลาดบ โดยมจานวนปากใบเฉลย 88, 135 และ 78 ค/มม.2 ตามลาดบ และขนาดของปากใบ (กวาง x

ยาว) เฉลย 12.6 x 20.0, 13.7 x 22.5 และ 23.6 x 30.5 ไมครอน ตามลาดบ จากการศกษาปรมาณ

คารโบไฮเดรตและโปรตนในแหนทง 3 ชนดพบวา แหนใหญ แหนเลก และไขนา มปรมาณคารโปไฮเดรตสงสด

ท 10.9, 28.7 และ 18.8 %ของนาหนกแหง ตามลาดบ ในขณะทมปรมาณโปรตนสงสดท 20.5, 16.0 และ

7.48 %ของนาหนกแหง ตามลาดบ และพบวากรดซาลไซลกและกรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตกทความ

เขมขน 10 uM มผลในการชะลอการเจรญเตบโตของแหนเลกและแหนใหญ ในขณะทกรดแอบไซซกและดาง

ทบทมสงผลใหเกดการยบยงการเจรญเตบโต อยางไรกตามผวจยยงไมพบสารเคมชนดใดทสามารถเหนยวนาให

แหนออกดอกภายใตสภาวะทกาหนด โดยผวจยกาลงศกษาผลของแสงตอการออกดอกของแหน และพฒนา

กระบวนการถายฝากยนเขาสแหนเพอใชพฒนาเทคนคการปรบปรงพนธและการแปลงพนธในแหนตอไป

2

2. ความสาคญและสรปความเปนมาของโครงการฯ

ประเทศไทยเปนประเทศทอยในเขตรอนและมทรพยากรทสามารถนามาใชวจยเพอการพฒนา

นวตกรรมทางชวภาพไดมาก แตเนองดวยประเทศไทยเปนประเทศกาลงพฒนา แหลงเงนทนในการวจยจงมอย

จากด และขดความสามารถในการวจยจงมอาจเปรยบเทยบกบประเทศทพฒนาแลวได ซงประเทศเหลานจะ

เนนการวจยพนฐานเพอเปนแหลงขอมลในการทาวจยประยกตตอไป ดงนนเพอการพฒนาทยงยนและ

เหมาะสมกบประเทศไทย การพฒนาความรพนฐานควบคไปกบการนาความรทไดไปประยกตใช จงมความ

จาเปนอยางยงทจะทาใหประเทศไทยสามารถแขงขนกบประเทศอนได

ปจจบนงานวจยพนฐานทางดานพชจะเนนไปทพชตนแบบคอ Arabidopsis thaliana ซงจดเปน

วชพชบกและขนในสภาพอากาศทเยน ขอไดเปรยบของ Arabidopsis คอ มขนาดเลกและยงมขนาดของของจ

โนม (genome) เลกกวาพชใบเลยงคชนดอน เจรญเตบโตเรวโดยใชเวลาประมาณ 3 เดอนในแตละรน

นอกจากน Arabidopsis ยงมแหลงขอมลทางพนธกรรมและมการพฒนากระบวนการทางพนธวศวกรรมท

สมบรณทสด ทาใหนกวจยสวนใหญเลอก Arabidopsis เปนตนแบบในการศกษากระบวนการทางชววทยาและ

ชวเคมในพช แตขอเสยของ Arabidopsis คอไมสามารถนาไปพฒนาเพอการประยกตใชได และเจรญเตบโตได

ในสภาพอากาศเยนเทานน ดงนนการวจยพนฐานโดยใช Arabidopsis จงไมเหมาะสมกบการพฒนาทาง

วทยาศาสตรของประเทศไทย

ในทางตรงขาม แหน (duckweed) ซงเปนวชพชนาทพบทวไปในประเทศไทย มความเหมาะสมในการ

นามาพฒนาเพอใชเปนพชตนแบบในประเทศไทย กลาวคอแหนซงจดเปนพชใบเลยงเดยวและเปนพชดอกทเลก

ทสด สามารถเจรญเตบโตไดงายและเรวกวา Arabidopsis นอกจากนองคประกอบของเนอเยอไมมความ

สลบซบซอน อกทงยงมขนาดจโนมใกลเคยงกบ Arabidopsis แตสามารถเจรญเตบโตไดดและเรวในเขตรอน

ดงนนพชตระกลแหน (Lemnaoideae) จงมความเหมาะสมในการนามาพฒนาเปนพชตนแบบเพอใชใน

การศกษาทางชววทยาของเซลล โครงสรางและสรรวทยาของพช อณชววทยา ชวเคม รวมไปถงการนาองค

ความรทไดไปประยกตใชทางเทคโนโลยชวภาพในประเทศไทย

ดงนนการพฒนาแหนใหญเพอเปนพชตนแบบจงมความสาคญสาหรบการพฒนาการเรยนการสอน

ทางดานชววทยาและเทคโนโลยชวภาพทางดานพชในประเทศไทย และเพอการรองรบขอมลทางพนธกรรมของ

แหนทสามารถนาไปใชในการทาวจยเชงลกและวจยเชงประยกตตอไปในอนาคต

3

3. วตถประสงคของการวจย

3.1. ศกษาชววทยาของแหนในระดบตางๆ เพอใชประโยชนในการเรยนการสอนทางดานพชในระดบ

เซลลและระดบโมเลกล และใชเปนพชตนแบบในการทาวจยพนฐาน

3.2. พฒนาการเพาะเลยงและคดเลอกสายพนธแหนทเหมาะสมเพอใชในการทาวจยเชงลกหรอการทา

วจยเชงประยกต

3.3. พฒนาเทคนคทางพนธวศกรรมเพอรองรบการประยกตใชกบขอมลรหสพนธกรรมของแหน และ

การปรบปรงพนธ

4. ขอบเขตของการวจย

โครงการวจยนประกอบไปดวยโครงการวจยยอยสามสวนทเกยวเนองกน

4.1. การศกษาวจยในเชงชววทยาของแหน โดยจะมการนาแหนแตละชนดมาศกษาโครงสรางทาง

ชววทยาทงในระดบเนอเยอและในระดบเซลล มการศกษาวงจรชวตและการสบพนธ รวมถงการศกษาทาง

ชวเคมและอณชววทยา

4.2. การพฒนาการนาแหนเขามาเพาะเลยงในหองทดลอง เพอการควบคมตวแปรตางๆ และมการ

ปรบปรงอาหารเลยง อณหภม และแสง ทเปนระบบ โดยจะมการคดเลอกสายพนธแหนทเหมาะสมในการใช

ประโยชนในการทาวจยเชงลกหรอวจยเชงประยกตตอไป

4.3.. การพฒนาเทคนคกระบวนการเปลยนสภาพแหน (transformation) ทเหมาะสมประหยด และ

เปนระบบเพอใชเปนพนฐานในการปรบปรงพนธหรอคดเลอกพนธแหนโดยใชเทคโนโลยทางพนธวศกรรม

(genetic engineering) หรอเทคนคการกลายพนธ (mutation) ตอไป โดยคาดวาจะสามารถพฒนาแหน

ตนแบบทสามารถนาไปประยกตใชในเชงอาหาร พลงงานหรอสงแวดลอมไดภายในระยะเวลาโครงการ 2-3 ป

5. วธการดาเนนการวจย

5.1. การเกบตวอยางแหน

ทาการเกบตวอยางแหนจากแหลงนาธรรมชาต 3 ชนด ไดแก แหนใหญ (Spirodela polyrhiza) แหนเลก

(Lemna minor) และไขนา (Wolffia globosa) จากบรเวณแหลงนาภายในมหาวทยาลยบรพา จากนนนามา

ลางทาความสะอาดดวยนาประปาอยางนอย 3 ครงเพอลางตะกอนดน เศษอนทรย และแมลงนาหลายชนดท

4

ตดอยตามรากและใบของแหนใหญออก จากนนจงนามาลางดวยนากลนแชทงไวเปนเวลา 1 ชวโมงเพอลาง

ไอออนจากนาประปาและตกตะกอนเศษดนทเหลออย

5.2. การกาจดสงมชวตทปนเปอนในแหน

5.2.1. เตรยมอาหารสตร Murashige and Skoog (MS; Murashige and Skoog, 1962) โดยทาการ

ทดลองเลยงแหนในอาหารแขง MS ในขวดแกวมฝาปด และมอาหารเพาะเลยงอยขวดละ 20-25 มลลลตร

5.2.2. หาวธการทเหมาะสมในการกาจดสงมชวตปนเปอนในแหนใหญและแหนเลก โดยเรมจากการ

แชชนสวนแหนใหญทตดรากออกลงในสารฟอกขาวไฮเตอรความเขมขน 3, 5 หรอ 10 เปอรเซนต เปนเวลา 1,

3 และ 5 นาท แลวลางในนากลนฆาเชอทงหมด 3-5 ครงๆละ 5 นาท ตดแตงเอาสวนทถกทาลายออกแลว

นาไปเลยงบนอาหารสตร MS โดยใหแสงสวางดวยหลอดฟลออเรสเซนต ท ความเขมแสง 15 μmol.m-2.s-1

เปนเวลา 16 ชวโมงตอวน ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส

5.2.3. หาวธการทเหมาะสมในการกาจดสงมชวตปนเปอนในไขนา โดยเรมจากการหอไขนาในผาขาว

บาง แลวนาไปแชในสารฟอกขาวไฮเตอรความเขมขน 2 หรอ 5 เปอรเซนต หรอเบตาดนความเขมขน 10 หรอ

20 เปอรเซนต หรอทงเจอรไอโอดนความเขมขน 5 หรอ 10 เปอรเซนต เปนเวลา 30 หรอ 60 วนาท ลางในนา

กลนฆาเชอทงหมด 3-5 ครงๆละ 5 นาท แลวนาไปเลยงบนอาหารสตร MS โดยใหแสงสวางดวย

5.2.4. หลงจากกาจดจลนทรยปนเปอนแลวนาแหนไปเพาะเลยงท หลอดฟลออเรสเซนต ทอณหภม

25 องศาเซลเซยส ความเขมแสง 15 μmol.m-2.s-1 เปนเวลา 16 ชวโมงตอวน เปนเวลา 10-14 วน เพอบนทก

รอยละการรอดชวต และรอยละการปนเปอนตามลาดบ

5.3. การคดเลอกสตรอาหารทเหมาะสมสาหรบการเพาะเลยงแหน

5.3.1. เตรยมอาหารเหลว 4 สตร ไดแก อาหารเหลวสตร MS, Hoagland-E (Cross J,

http://www.mobot.org/jwcross/duckweed/media.htm), Hoagland-E+ (Cowgill and Milazzo,

1989) และ Schenk and Hildebrandt (SH; Schenk and Hildebrandt, 1972) โดยใชความเขมขนปกต

(1x) หรอทครงความเขมขน (0.5x) และใชนากลนปลอดเชอเปนตวควบคม

5.3.2. ถายแหนปลอดเชอมาเพาะเลยงในอาหารเหลว MS เปนเวลา 7 วนเพอปรบสภาพจากนนถาย

แหนลงในอาหารเหลวแตละชนด โดยแตละขวดจะใสแหนจานวน 4-10 ฟรอนด ตามขนาดและชนดของแหน

โดยนาไปเพาะเลยงในหองควบคมสภาวะทมอณหภม 25 องศาเซลเซยส และใหแสงทความเขมแสงประมาณ

15 μ.mol.m-2.s-1 เปนเวลา 16 ชวโมงตอวน นบจานวนฟรอนดทเพมขนทกๆ 2-3 วน เปนเวลา 10-14 วน

5

5.3.3. วเคราะหการเจรญของแหนโดยศกษาระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณ (doubling time)

ของฟรอนด โดยอาหารทใหคาระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณนอยทสดแสดงวาแหนเจรญในอาหาร

ดงกลาวไดดทสด

5.4. การวเคราะหการเตบโตของแหน

เพาะเลยงแหนในอาหารทใหการเจรญเตบโตไดด และถายภาพภายใตกลองจลทรรศนสเตอรโอไมโค

รสโคปทก 12 ชวโมง แลวนาขอมลภาพถายมาวเคราะหผลโดยการวดขนาดของใบโดยใชโปรแกรม ImageJ

(Schneider et al., 2012)

5.5. การเพาะเลยงแหนใหญเพอนามาวเคราะหสารชวโมเลกล

5.5.1. เตรยมอาหารเหลว 4 สตร ไดแก อาหารเหลวสตร MS, E, E+ และ SH ใสกระบะพลาสตก

สเหลยมจานวน 6 ใบๆละ 1 ลตร นาแหนใหญและปหนเลกปลอดเชอมาเพาะเลยงในกระบะพลาสตกสเหลยม

ทเตรยมไว คลมดวยพลาสตกหออาหาร แลวนาไปเพาะเลยงในหองควบคมสภาวะทมอณหภม 25 องศา

เซลเซยส และใหแสงทความเขมแสง 15 μ.mol.m-2.s-1 16 ชวโมงตอวน เปนเวลา 14-21 วน แลวแตชนดของ

แหน

5.5.2. เกบเกยวแหนทเพาะเลยงโดยการกรองผานตะแกรงลวดแลวนามาลางใหสะอาดดวยนากลน

จานวน 3 ครง เพอชะลางสารอาหารทตดอยกบใบและรากของแหนใหญออกจากนนทงใหสะเดดนากอนนามา

บดใหละเอยดในไนโตรเจนเหลว เกบตวอยางไวทอณหภม –20 องศาเซลเซยส

5.6. การวเคราะหปรมาณความชนดวยวธอบลมรอน

5.6.1. นาถวยอะลมเนยมฟอยลไปอบไลความชนในตอบลมรอนทอณหภม 105 องศาเซลเซยส เปน

เวลา 2 ชวโมง หลงจากอบเสรจแลวรบนาถวยอะลมเนยมฟอลยไปทาใหเยนในโถดดความชนทมสารดด

ความชนซลกา 30 นาท นาไปชงหานาหนกดวยเครองชงทศนยม 4 ตาแหนง จากนนนาไปอบซาอกครงเปน

เวลา 30 นาท จนทราบนาหนกทแนนอน

5.6.2. ชงตวอยางแหนนาหนกประมาณ 1-3 กรม ใสลงในถวยอะลมเนยมฟอยลทรนาหนกทแนนอน

นาไปอบไลความชนในตอบลมรอนทอณหภม 80 องศาเซลเซยสเปนเวลา 3 ชวโมง หลงจากอบเสรจรบนาถวย

อะลมเนยมฟอลยทมตวอยางไปทาใหเยนในโถดดความชนทงไว 30 นาท นาไปชงนาหนกดวยเครองชงทศนยม

4 ตาแหนงกอนนามาอบซาอกครงเปนเวลา 30 นาท หรอจนไดนาหนกทแนนอน

5.6.3. นาคาทไดมาคานวณหาปรมาณความชนของแหนใหญจากสตร

6

ปรมาณความชน (รอยละ) =

เมอ w1= นาหนกตวอยางกอนอบ

w2= นาหนกตวอยางหลงอบ

5.7. การวเคราะหปรมาณคารโบไฮเดรตในแหน

5.7.1. สกดคารโบไฮเดรตในตวอยางแหนโดยใชตวอยางบด 1 กรม ใสลงในหลอดทดลองแลวเตมกรด

ไฮโดรคลอลกความเขมขน 2.5 นอรมอล ปรมาตร 10 มลลลตร ผสมใหเขากนดวยเครองผสมสารเปนเวลา 5

นาท ทงไวขามคนทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ผสมใหเขากนอกครงจากนนนาไปตมในนาเดอดเปนเวลา 2

ชวโมง เพอยอยสลายคารโบไฮเดรตในตวอยางใหเปลยนเปนนาตาลโมเลกลเดยว แลวนาไปปนเหวยงท

ความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท เพอแยกตะกอนตวอยางกบสารละลายออกจากกน เกบสวน

สารละลายไปทาการวเคราะหหาปรมาณคารโบไฮเดรตทงหมด

5.7.2. วเคราะหปรมาณคารโบไฮเดรตดวยวธแอนโทรน โดยใชสารละลายตวอยางปรมาตร

500 ไมโครลตร ใสลงในหลอดทดลอง จากนนเตมสารละลายแอนโทรนปรมาตร 2 มลลลตร ผสมใหเขากนแลว

นาไปตมในอางนาเดอดเปนเวลา 8 นาท ทงใหเยนทอณหภมหองนาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน

630 นาโนเมตร

5.7.3. วเคราะหปรมาณคารโบไฮเดรตดวยวธฟนอลซลฟวรกโดยใชสารละลายตวอยางปรมาตร 500

ไมโครลตร ใสลงในหลอดทดลอง จากนนเตมสารละลายฟนอลความเขมขน 5 เปอรเซนตปรมาตร 500

ไมโครลตร และเตมกรดซลฟวรกเขมขน 96 เปอรเซนตปรมาตร 2.5 มลลลตร ผสมใหเขากนนาไปแชในอางนา

ควบคมอณหภมทมอณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน


5.8. การวเคราะหปรมาณโปรตนในแหน

5.8.1. สกดโปรตนในตวอยางแหนใหญโดยใชตวอยางแหนใหญบด 1 กรม ใสลงในหลอดทดลองแลว

เตมกรดไฮโดรคลอลกความเขมขน 0.1 นอรมอล ปรมาตร 10 มลลลตร ผสมใหเขากนดวยเครองผสมสารเปน

เวลา 5 นาท ทงไวขามคนทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ผสมใหเขากนดวยเครองผสมสารซาอกครงเปนเวลา 10

นาท นาไปตมทอณหภม 80 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง แลวนาไปปนเหวยงทความเรว 10,000 รอบตอ

7

นาท เปนเวลา 15 นาท เพอแยกตะกอนตวอยางกบสารละลายออกจากกน เกบสวนสารละลายไปทาการ

วเคราะหหาปรมาณโปรตนทงหมด

5.8.2 วเคราะหหาปรมาณโปรตนดวยวธลอวร (Lowry’s Method) โดยใสสารละลายตวอยาง 200

ไมโครลตรลงในหลอดทดลอง จากนนเตมสารละลาย Lowry’s reagent 1 มลลลตร ผสมใหเขากนแลวทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท เตมสาร Folin–Ciocalteu reagent 100 ไมโครลตร ผสมใหเขากนทนท แลว

ทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 30 นาท นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 750 นาโนเมตร

5.8.2 วเคราะหหาปรมาณโปรตนโดยใช bicinchoninic acid (BCA) โดยใสสารละลายตวอยาง 20

ไมโครลตรลงในหลอดทดลอง แลวเตมสารละลาย BCA reagent 1 มลลลตร ผสมใหเขากน นาไปแชในอางนา

ควบคมอณหภมทมอณหภม 60 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาท นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน


5.8.3. วเคราะหปรมาณโปรตนโดยวธเจลดาลห (Kjeldahl Method) โดยยอยตวอยางแหน 2 กรม

กอนในหลอดยอย ซงใชซลเนยมซงเปนตวเรงปฏกรยา จานวน 1 กรม เตมกรดซลฟวรกเขมขน 30 มลลลตร

และใสเมดกนเดอด 10 เมด ยอยตวอยางในเครองยอยทตงอณหภมไว 150 องศาเซลเซยล เปนเวลา 30 นาท

จากนนเพมอณหภมเปน 250 องศาเซลเซยล ยอยตอไปอก 30 นาท และเพมอณหภมท 350 องศาเซลเซยส

จนไดสารละลายใส หลงจากสารละลายใสยอยตออก 1 ชวโมง แลวนาสารตวอยาง 1 มลลลตร ไปกลนโดยเจอ

จาง 200 เทา ดวยนากลน จากนนปรบ pH เปน 9.5 ดวยสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด ทาการกลนเปนเวลา

8 นาท ไอระเหยทไดจะถกดกไวในขวดรปชมพทมกรดบอรกความเขมขน 4% 100 มลลลตร จากนนนาไป

ไทเทรตกบสารละลายกรดซลฟวรกจนถงจดยต นาปรมาตรทไทเทรตคานวณหาปรมาณโปรตนจากสตร

%P V V M C D Z f

m 100

%P คอ นาหนกโปรตนเปนรอยละ

Vsample คอ ปรมาตรกรดทใชไทเทรตกบสารตวอยาง (ml)

Vblank คอ ปรมาตรกรดทใชไทเทรตกบแบลงค (ml)

MN คอ มวลโมเลกลของไนโตรเจน = 14.0067 (g/mol)

Cacid คอ ความเขมขนของกรดในหนวยโมลตอลตร (M)

Z คอ ปรมาณการแตกตวของกรด

8

D คอ จานวนเทาทเจอจางตวอยาง

Fprotein คอ คาโปรตนแฟคเตอรคดจากในตวอยางสวนใหญนาหนกไนโตรเจนมประมาณ

16% ของนาหนกโปรตนคาโปรตนแฟคเตอรจงมคา = %

% = 6.25

Msample คอ นาหนกตวอยาง (mg)

5.9. การศกษาสารเคมทมผลในการเหนยวนาใหแหนใหญออกดอก

5.9.1. เตรยมอาหารเหลวสตร MS หรอ PS; Pirson-Seidel (Pirson and Seidel, 1950) ทมกรดซา

ลไซลก, กรดแอบไซซก, กรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตก, กรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตก หรอ ดางทบทม

ทมความเขมขน 0.1, 1 และ 10 ไมโครโมลาร ตามลาดบ

5.9.2. นาแหนทไดจากการเพมจานวนเปนเวลา 30 วน มาเพาะเลยงในอาหารเหลวทมสารเคม

ดงกลาว โดยนาไปเพาะเลยงในหองควบคมสภาวะทมอณหภม 25 องศาเซลเซยล และใหแสงทความเขมของ

แสง 20 μ.mol.m-2.s-1 เปนเวลา 16 ชวโมงตอวน นาน 15 วน

5.9.3. บนทกการแตกใบใหม การเจรญเตบโตและการออกดอกของแหน โดยถายรปแหน ทกๆ 3 วน

นาน 15 วน แลวนาขอมลภาพถายของแหนมาวเคราะหผลโดยการวดพนทใบ โดยใชโปรแกรม Imagej เพอ

ศกษาระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของใบและพนทใบ โดยระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของใบ

แสดงถงการเจรญ (development) และระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของพนทใบแสดงถงการเตบโต

(growth)

5.10. การศกษาสณฐานวทยาของแหน

5.10.1. สมตวอยางแหนทตองการวเคราะหมาถายภาพภายใตกลองจลทรรศนสเตอรโอไมโครสโคป

เพอศกษาโครงสรางภายนอก

5.10.2. นาแหนใหญ และแหนเลกตวอยาง ไปตด เพอวดความหนา และใชใขนาทงตนเพอสองด

โครงสรางปากใบภายใตกลองจลทรรศน

5.10.3. วดความกวาง ความยาวของใบ ขนาดของปากใบและจานวนปากใบโดยใชโปรแกรม Image J

5.11. การตรวจสอบชนดของแหนโดยใชเทคนค Polymerase Chain Reaction (PCR)

5.11.1. การออกแบบไพรเมอร ทาไดโดยหาขอมลคลอโรพลาสตจโนมทสนใจของแหนใหญ แหนเลก

และไขนา ในฐานขอมล http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ โดยกาหนดคาขนาดไพรเมอร 20 – 22 bp, Tm

9

50 – 60 , % Gc 50 - 60 , ขนาดชนดเอนเอทไดอยในชวง 1000-1200 bp จากนนนาไพรเมอรทออกแบบมา

ตรวจสอบโดยการ blast กบฐานขอมล NCBI

5.11.2. การสกดคลอโรพลาสตจโนมจากแหน ทาไดโดยนาแหนมา 1-2 กรม ทาความสะอาดและเอา

รากออก บดใหละเอยดใน Edwards Buffer (Edwards et al., 1991) นาไปปนท 10000 rpm เปนเวลา 10

นาท แยกสวนใสมาผสมกบ isopropanol ในปรมาตรทเทากน แลวนาไปปนท 10000 rpm เปนเวลา 10 นาท

เทสารละลายใสสวนบนทง ลางตะกอนดวย 70% Ethanol ทงไวใหแหง ละลายตะกอนดวยนากลน 100

ไมโครลตร

5.11.3. เพมปรมาณสารพนธกรรมโดยใช Taq DNA Polymerase (PL1202, Vivantis) และไพร

เมอรทออกแบบไว และใชรอบ PCR ดงตอไปน Denaturation ท 94 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 วนาท

Annealing ท 60 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 วนาท และ Extension ท 72 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 วนาท

ทงหมด 40 รอบ ผลตภณฑทไดนาไปรนเจลทความเขมขนวน 1% ใน TAE buffer (Tris-Acetate EDTA) pH

8.0

6. ผลการวจย

6.1. ชนดของแหนทพบในแหลงนาภายในมหาวทยาลยบรพา

จากการสารวจทางดานชววทยาในแหลงนาภายในหมาวทยาลยบรพาพบการกระจายตวของ

แหน 3 ชนด ในบรเวณมหาวทยาลยบรพา (รปท 1) ไดแก แหนใหญ (Spirodela polyrhiza) แหนเลก

(Lemna minor) และไขนา (Wolffia globosa)

รปท 1. แหนชนดตางๆทเกบไดจากแหลงนาธรรมชาตภายในมหาวทยาลยบรพา (A) บอนาบรเวณหอพระ

โรงเรยนสาธต พบลบาเพญ (B) บอนาบรเวณหลงตกเคม คณะวทยาศาสตร โดยพบวาแหนใหญ (Spirodela

A B

10

polyrhiza) จะมขนาดใหญทสดประมาณ 1 ซม. ในขณะทแหนเลก (Lemna minor) จะมขนาด 2-3 มม. และ

ไขนา (Wolffia globosa) ทมขนาดเลกกวา 1 มม. (สเกลบาร = 1 มม.)

6.2. การกาจดจลนมรยทปนเปอนในแหน

แหนทเกบจากแหลงนาธรรมชาตจะมการปนเปอนจาก สาหราย และจลนทรย และสงมชวตทตดมา

กบราก เมอนามาเพาะเลยงในหองปฏบตการ สาหรายและจลนทรยเหลานนจะสงผลใหแหนมสภาวะทไม

ปลอดเชอ (รปท 2) ดงนนจงตองมการกาจดสงมชวตทปนเปอนนนดวยดวยสารฟอกขาว (Bleach) ทงเจอร

ไอโอดนหรอเบตาดนทความเขมขนและระยะเวลาแตกตางกน

รปท 2. แหนทผานการกาจดจลนทรยปนเปอน และเพาะเลยงในอาหารสตร MS เปนระยะเวลา 7-14 วน

A) แหนทมการปนเปอน B) แหนทปลอดการปนเปอน

6.2.1. แหนใหญ

6.2.1.1 รอยละการรอดชวต

จากการกาจดจลนทรยทปนเปอนในแหนใหญดวยสารฟอกขาว และทงเจอรไอโอดนทเวลาและความ

เขมขนแตกตางกนพบวา เมอใชสารฟอกขาว ทความเขมขนรอยละ 3 เปนเวลา 5 นาท มอตราการรอดชวต

ของแหนใหญสงทสดรอยละ 73.33 (รปท 3) ในขณะทเมอใชความเขมขนของทงเจอรไอโอดนทรอยละ 50, 75

และ100 เปนเวลา 1, 3 หรอ 5 นาท ไมพบการรอดชวตของแหนใหญ

6.2.1.2 รอยละการปนเปอนของจลนทรย

จากการกาจดจลนทรยทปนเปอนในแหนใหญดวยสารฟอกขาว และทงเจอรไอโอดนทเวลาและความ

เขมขนแตกตางกนพบวาเมอใชสารฟอกขาวความเขมขนรอยละ 10 เปนเวลา 3 นาท พบการปนเปอนนอยสด

A B

11

เทากบรอยละ 6.67 (รปท 4) ในขณะทการกาจดจลนทรยทปนเปอนดวยทงเจอรไอโอดนความเขมขนรอยละ

50, 75 และ 100 ไมพบการปนเปอนและไมพบการรอดชวต

รปท 3. การรอดชวตของแหนใหญทผานการกาจดจลนทรยปนเปอนดวยสารฟอกขาว แลวนามาเพาะเลยงใน

หองปฏบตการดวยอาหารสตร MS เปนเวลา 7 วน (บาร = SD; nd = ไมพบการรอดชวต)

หมายเหต : ตวอกษรทตางกนแสดงความแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (p<0.05)

รปท 4. การปนเปอนจลนทรยในแหนใหญทผานการกาจดจลนทรยปนเปอนดวยสารฟอกขาว แลวนามา

เพาะเลยงในหองปฏบตการดวยอาหารสตร MS เปนเวลา 7 วน (บาร = SD; nd = ไมพบการรอดชวต)


nd

ab

abc abc

bc c c

d

d

bc bc bc bc

c

ab ab

a

nd

12

6.2.2. แหนเลก


จากการกาจดจลนทรยทปนเปอนในแหนเลกดวยสารฟอกขาว และทงเจอรไอโอดนทเวลาและความ

เขมขนแตกตางกนพบวา เมอใชสารฟอกขาวทความเขมขนรอยละ 3 เปนเวลา 1 นาท หรอ 3 นาท มการรอด

ชวตของแหนเลกสงทสดรอยละ 66 (รปท 5) ในขณะทเมอใชความเขมขนทงเจอรไอโอดนรอยละ 50, 75 และ

100 ไมพบการรอดชวตของแหนเลก

6.2.2.2 รอยละการปนเปอนของจลนทรย

จากการกาจดจลนทรยทปนเปอนในแหนเลกดวยสารฟอกขาว และทงเจอรไอโอดนทเวลาและความ

เขมขนแตกตางกนพบวาเมอใชสารฟอกขาวความเขมขนรอยละ 10 เปนเวลา 3 นาท พบการปนเปอนนอย

ทสดเทากบรอยละ 6.67 (รปท 6) ในขณะทการกาจดจลนทรยทปนเปอนดวยทงเจอรไอโอดนความเขมขนรอย

ละ 50, 75 และ 100 ไมพบการปนเปอน และไมพบการรอดชวต

รปท 5. การรอดชวตของแหนเลกทผานการกาจดจลนทรยปนเปอนดวยสารฟอกขาว แลวนามาเพาะเลยงใน

หองปฏบตการดวยอาหารสตร MS เปนเวลา 7 วน (บาร = SD; nd = ไมพบการรอดชวต)


6.2.3. ไขนา


จากการกาจดจลนทรยทปนเปอนในไขนาดวยสารฟอกขาว เบตาดน และทงเจอรไอโอดนทเวลาและ

nd

c c

b

ab

nd nd nd nd nd

13

ความเขมขนแตกตางกน พบวาเมอใชเบตาดนความเขมขนรอยละ 10 เปนเวลา 30 วนาทมการรอด

ชวตของไขนาสงทสดรอยละ 33 (รปท 7) ในขณะทเมอใชความเขมขนของสารฟอกขาวทรอยละ 2 และ 5

หรอทงเจอรไอโอดนทความเขมขนรอยละ 5 และ 10 ทเวลา 30 หรอ 60 วนาท ไมพบการรอดชวตของไขนา

รปท 6. การปนเปอนจลนทรยในแหนเลกทผานการกาจดจลนทรยปนเปอนดวยสารฟอกขาว แลวนามา



รปท 7. การรอดชวตของไขนาทผานการกาจดจลนทรยปนเปอนดวยไอโอดน เบตาดน สารฟอกขาว แลวนามา



ab abc abc

abc abc bc

bc c

b

a a

nd nd nd nd nd nd nd nd nd

nd

14

6.2.3.2 รอยละการปนเปอน

จากการกาจดจลนทรยทปนเปอนในไขนาดวยสารฟอกขาว เบตาดน และทงเจอรไอโอดนทเวลา

และความเขมขนแตกตางกนพบวาเมอใชเบตาดนความเขมขนรอยละ 20 เปนเวลา 60 วนาท พบการปนเปอน

นอยสดเทากบรอยละ 6.67 (รปท 8) ในขณะทเมอใชสารฟอกขาวความเขมขนรอยละ 2 และ5 และทงเจอร

ไอโอดนทความเขมขนรอยละ 5 และ10 เปนเวลา 30 วนาท และ 60 วนาท ไมพบการปนเปอน และไมพบการ

รอดชวต

รปท 8. การปนเปอนจลนทรยในไขนาทผานการกาจดจลนทรยปนเปอนดวยไอโอดน เบตาดนและสารฟอก

ขาว แลวนามาเพาะเลยงในหองปฏบตการดวยอาหารสตร MS เปนเวลา 7 วน (บาร = SD; nd = ไมพบการ

รอดชวต) หมายเหต : ตวอกษรทตางกนแสดงความแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (p<0.05)

6.3. การเจรญของแหนในหองปฏบตการ


เมอนาแหนใหญทปราศจากเชอมาเพาะเลยงในขวดเพาะเลยงทมอาหารเหลว 3 สตร ไดแก

Hoagland-E (E), Hoagland-E+ (E+) หรอ Schenk and Hildebrandt (SH) พบวาแหนใหญทเพาะเลยงใน

อาหารเหลวสตร E มอตราการเจรญเตบโตสงทสด (รปท 9) โดยมอตราการเพมจานวนทวคณ (doubling-

time) ในเวลา 6.6 วน (รปท 10) มพนทฟรอนดเฉลย 28.8 ตารางมลลเมตร และความยาวรากเฉลย 13.8

มลลเมตร (รปท 11) ภายในระยะเวลาการเพาะเลยง 15 วน ในขณะทแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร

E+ มการสรางทวเรยนจานวนมากเมอเพาะเลยงเปนเวลา 45 วน (รปท 12)

nd nd nd nd nd nd nd nd

ab

abc

c

c

15

รปท 9. การเจรญเตบโตของแหนใหญทเพาะเลยงในหองปฏบตการในอาหารสตร E, E+ หรอ SH (บาร = SD)

รปท 10. อตราการเพมจานวนทวคณของแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารสตร E, E+ หรอ SH เปนเวลา 15 วน

(บาร = SD)

หมายเหต : ไมแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (p<0.05)

0

5

10

15

20

25

30

0 5 10 15 20

จานว

นตน

(ฟรอ

นด)

ระยะเวลา (วน)

E

E+

SH

0

2

4

6

8

10

E E+ SH

Doub

ling

time

(day

)

16

รปท 11. เปรยบเทยบพนทฟรอนด (A) และความยาวราก (B) ของแหนใหญทเพาะเลยงเพาะเลยงใน

หองปฏบตการในอาหารสตร E, E+ หรอ SH เปนเวลา 15 วน (บาร = SD)

หมายเหต ตวอกษรทตางกนแสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (p < 0.05)

รปท 12. ลกษณะภายนอกของแหนใหญทเพาะเลยงในหองปฏบตการเปนเวลา 30 วน ใน A) อาหารสตร E B)

อาหารสตร E+ C) อาหารสตร SH และ D) Turions ทพบในอาหารสตร E+ 45 วน (สเกล = 1 มม.)

aa

a

0

10

20

30

40

E E+ SH

พนทฟ

รอนด

(mm2

)

พนทฟรอนด

a

b

c

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

E E+ SH

ความยาวราก

(mm

)

ความยาวราก

A B

A B

C D

17

จากการศกษาการเจรญเตบโตของแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารสตร E โดยการถายภาพภายใตกลอง

จลทรรศนชนดเสตอรโอไมโครสโคป โดยเรมตนเพาะเลยงท 1 ฟรอนดพบวาฟรอนดเรมแรกจะไมมการ

เจรญเตบโตเพมขน ฟรอนดทแตกออกมาใหมจะเจรญเตบโตเตมทในระยะเวลาเฉลย 72 ชวโมง (รปท 13) และ

เกดรากภายในระยะเวลาเฉลย 48 ชวโมง และเรมแตกตนใหมทนทในชวโมงท 72

รปท 13. การเจรญเตบโตของแหนใหญ (A) และการแตกตนใหมของแหนใหญ (B) ทเพาะเลยงใน

หองปฎบตการเปนเวลา 96 ชม. ในอาหารสตร E ซงสอดคลองกบภาพถายการเจรญเตบโตของแหนใหญทกๆ

12 ชม. เปนเวลา 108 ชม. (C) (สเกล = 1 มม.)

0

5

10

15

20

25

30

35

0 20 40 60 80 100

พนทฟ

รอนด

(มลล

เมตร

2 )

เวลา (ชวโมง)

หนวยทดลอง 1



051015202530354045

0 12 23 37 47 61 72 84 96

พนทฟ

รอนด

(mm2 )

เวลา (ชวโมง)

ใบลก

ใบแม

A

B C0 12

24 36

48 60

72 84

96 108

18


จากการเพาะเลยงแหนเลก (Lemna minor) ในอาหารเหลว 4 สตร ไดแก Murashige & Skoog

(MS), Hoagland-E (E), Hoagland-E+ (E+) หรอ Schenk and Hildebrandt (SH) ทสองความเขมขน คอ

ความเขมขนปกต (1x) กบความเขมขนครงหนง (0.5x) พบวาแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวแตละสตรม

ลกษณะสของแผนใบทแตกตางกน (รปท 14) และมการเจรญเตบโตทแตกตางกนซงจาแนกไดดงน

รปท 14. ลกษณะสของแหนเลกทแตกตางกนหลงจากเพาะเลยงเปนเวลา 10 วน ในอาหาร (A) สตร E และ

(B) สตร SH (สเกลบาร = 2 มม.)

6.3.2.1. แหนเลกทถกเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E ความเขมขนปกต มลกษณะแผนใบสเขยวเปน

จานวนมาก ซงพบมากกวาชดควบคม โดยใชเวลาเพมจานวนแบบทวคณท 2.7 วน มจานวนฟรอนดเฉลย

177.78 ฟรอนด (รปท 15)

6.3.2.2 แหนเลกทถกเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร SH ความเขมขนปกต มลกษณะแผนใบสเขยว

มากกวาชดควบคม และแผนใบขาวซดนอยกวาชดควบคม ใชเวลาเพมจานวนแบบทวคณท 2.9 วนและม

จานวนฟรอนดเฉลย 130.67 ฟรอนด (รปท 15)

6.3.2.3 แหนเลกทถกเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS ทความเขมขนปกต มลกษณะแผนใบสเขยว

จานวนมาก และแผนใบขาวซดพบมากกวาชดควบคม ใชเวลาเพมจานวนแบบทวคณท 2.8 วน และมจานวนฟ

รอนดเฉลย 131.78 ฟรอนด

6.3.2.4 แหนเลกทถกเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E+ ความเขมขนปกต มลกษณะแผนใบสเขยว

จานวนมากกวาชดควบคม และมแผนใบขาวซดนอยกวาชดควบคม ใชเวลาเพมจานวนแบบทวคณท 3.0 วน ม

จานวนฟรอนดเฉลย 144.44 ฟรอนด

A B

19

6.3.2.5 แหนเลกทถกเพาะเลยงในนากลน (ชดควบคม) มลกษณะแผนใบสเขยวนอยทสด แตใชเวลา

เพมจานวนแบบทวคณมากทสดและจานวนฟรอนดเฉลยนอยทสด คอ 5.4 วน และ 42.56 ฟรอนด ตามลาดบ

6.3.2.6 แหนเลกทถกเพาะเลยงในอาหารเหลว MS, SH, E และ E+ ความเขมขนครงหนง มลกษณะใบ

สเขยวมากกวาชดควบคม แตแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS และ SH ความเขมขนครงหนง ม

จานวนแผนใบขาวซดทมากกวาชดควบคม และใชเวลาเพมจานวนแบบทวคณท 3.67, 2.67, 2.57 และ 2.78

วน ตามลาดบ มจานวนฟรอนดเฉลย 84.67, 78.33, 158.89 และ 166.44 ฟรอนด ตามลาดบ

6.3.2..7 แหนเลกทถกเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS และ SH ความเขมขนครงหนง มลกษณะแผน

ใบขาวซดมากทสด เมอเทยบกบอาหารเหลวสตรอนๆและชดควบคม (รปท 16) และใชเวลาเพมจานวนแบบ

ทวคณท 3.67 และ 2.67 วน ตามลาดบ โดยมจานวนแผนใบขาวซด คอ 19.56 และ 41.44 ฟรอนด ตามลาดบ

เมอทดสอบดวยวธ Tukey HSD ใหผลทดสอบวา แหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS และ

SH ความเขมขนครงหนงมจานวนแผนใบขาวซดมากทสด (ตารางท 1) และแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลว

สตร MS ความเขมขนครงหนงใชเวลาในการเพมจานวนแบบทวคณมากกวาแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลว

สตรอนๆ และแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวทกสตรใชเวลาเพมจานวนแบบทวคณนอยกวาชดควบคม

อยางมนยสาคญ (รปท 17)

ตารางท 1. ลกษณะไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวเปนเวลา 10 วน (n = 10)

สตรอาหาร ลกษณะแผนใบ (ใบ) สเขยว สขาวซด

H2O 42.33±9.53a 9.11±3.62a

MS 131.78±27.57b 9.67±5.77a

SH 130.67±25.15b 6.67±5.29a

E 177.78±25.51c 3.22±2.82a

E+ 144.44±33.78b, c 5.44±3.00a

0.5x MS 84.67±24.20a 19.56±20.45b

0.5x SH 78.33±41.27a 41.44±42.67b

0.5x E 158.89±31.99b, c 3.33±2.35a

0.5x E+ 166.44±33.31b, c 4.22±2.22a

หมายเหต ตวอกษรทตางกนแสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (p < 0.05)

20

รปท 15. การเพมจานวนฟรอนดของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวเปนเวลา 10 วน (บาร=SEM)

รปท 16. การปรากฏแผนใบขาวซดของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวเปนเวลา 10 วน (บาร=SEM)

เมอนาแหนเลกทปลอดเชอมาเพาะเลยงในอาหารเหลวทง 4 สตร ทความเขมขนปกต โดยมนากลน

เปนชดควบคม ทาการเพาะเลยงเปนเวลา 108 ชวโมง ผลการทดลองพบวาแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลว

สตร SH และ E+ เรมมการแตกฟรอนดทเวลา 24 ชวโมง และแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS, E

และชดควบคมนากลน เรมมการแตกฟรอนดทเวลา 36 ชวโมง (รปท 18)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 2 4 6 8 10

จานว

นตน

(ฟรอ

นด)


MS

SH

E

E+

0.5x MS

0.5x SH

0.5x E

0.5x E+

H2O

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

0 2 4 6 8 10

H2O

MS

SH

E

E+

0.5xMS

0.5xSH

0.5xE

0.5xE+

H2O

จานว

นตน

(ฟรอ

นด)


21

รปท 17. เวลาทใชเพมจานวนทวคณของแหนเลกทเพาะเลยงในหองปฏบตการเปนเวลา 10 วน (บาร = SEM)

หมายเหต ตวอกษรทตางกนแสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญสถต (p<0.05)

รปท 18. ลกษณะการแตกฟรอนดของแหนเลกทเพาะเลยงในหองปฏบตการในระยะเวลา 36 ชวโมง

5.40

2.80 2.90 2.673.01

3.67

2.67 2.57 2.78

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

H20 MS SH E E+ 0.5MS 0.5SH 0.5E 0.5E+

เวลา

ทใชเ

พมจา

นวนท

วคณ

(วน)

c

a aa

a

b

a a a

H2Off

f

0.5x MS 0.5x SH 0.5x E 0.5x E+

MS

SH

36 hr 24 hr

H2

E

E+

0 hr

22

รปท 19. เปรยบเทยบพนทใบของแหนเลกทเพาะเลยงอาหารเหลวทเวลา 108 ชวโมง (บาร=SEM)

หมายเหต ตวอกษรทตางกนแสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (p<0.05)

เมอทาการเปรยบเทยบอตราการเจรญเตบโตของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวทง 4 สตร ความ

เขมขนปกต ทเวลา 108 ชวโมง พบวาแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร Hoagland’s E+ มพนทใบมาก

ทสดคอ 31.39 ตารางมลลเมตร ในขณะทแหนเลกทถกเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS, SH และ E มพนทใบ

เทากบ 17.93, 27.18 และ 22.14 ตารางมลลเมตร ตามลาดบ (รปท 19) เปรยบเทยบกบชดควบคมนากลน ม

พนทใบ 16.69 ตารางมลลเมตร ซงมพนทใบนอยทสด เมอสอบดวยวธ Duncan ใหผลทดสอบวา แหนเลกท

เพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E+ มพนทใบมากวาแหนเลกทถกเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS และนากลน

อยางมนยสาคญ

6.3.3. ไขนา

จากการเพาะเลยงไขนา ในอาหารเหลว 4 สตร ไดแก Murashige & Skoog (MS), Hoagland-E (E),

Hoagland-E+ (E+) หรอ Schenk and Hildebrandt (SH) ทสองความเขมขน คอ ความเขมขนปกต (1x) กบ

ความเขมขนครงหนง (0.5x) เปนเวลา 14 วน พบวาไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวแตละสตรมลกษณะสของ

แผนใบทแตกตางกน (รปท 20) และมการเจรญเตบโตทแตกตางกนซงจาแนกไดดงน

4.2.1 ไขนาทเพาะเลยงในนากลน (ชดควบคม) มลกษณะฟรอนดสเขยวนอยกวาอาหารเหลวสตรอน

และใชเวลาเพมจานวนแบบทวคณมากทสด คอ 4.23 วน

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

H20 MS SH E E+

พนทใ

บ (ต

ร.มม.

)

สตรอาหาร

a

a

ab

ab

b

H2O

23

รปท 20. ลกษณะสของใบทแตกตางกนของไขนาทเพาะเลยงในหองปฏบตการเปนเวลา 14 วน ใน (A) อาหาร

เหลวสตร E (B) อาหารเหลวสตร E+ (C) ฟรอนดสเขยว (D) ฟรอนดสขาวซด (สเกลบาร = 1 มม.)

4.2.2 ไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS, SH, E และ E+ ทความเขมขนปกต (1x) มลกษณะ

ฟรอนดสเขยวมากกวาชดควมคม และมฟรอนดสขาวซดนอยกวาชดควมคม โดยใชเวลาเพมจานวนแบบทวคณ

ท 2.72, 2.70, 2.33 และ 2.82 วน ตามลาดบ (รปท 21)

4.2.3 ไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS, SH, E และ E+ ทความเขมขนครงหนง (0.5x) ม

ลกษณะฟรอนดสเขยวมากกวาชดควมคม โดยใชเวลาเพมจานวนแบบทวคณท 2.63, 2.50, 2.41 และ 2.57

วน ตามลาดบ (รปท 21) และไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS และ E+ ทความเขมขนครงหนง (0.5x)

มลกษณะฟรอนดสขาวซดมากทสด เมอเทยบกบอาหารเหลวสตร MS, SH และ E (รปท 22) โดยมฟรอนดส

ขาวซดเฉลย คอ 3.33 และ 3.67 ฟรอนด ตามลาดบ

เมอทดสอบดวยวธ Duncan ใหผลทดสอบวา ไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E+ และMS ท

ความเขมขนครงหนง มจานวนฟรอนดสขาวซดมากทสด (รปท 22) และไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E

ทความเขมขนปกต ใชเวลาในการเพมจานวนแบบทวคณนอยกวาไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตรอนๆ

และไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวทกสตรใชเวลาเพมจานวนแบบทวคณนอยกวาชดควบคมอยางมนยสาคญ

ทางสถต (รปท 21)

A B

C D

24

รปท 21. การเพมจานวนฟรอนดแบบทวคณของไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวเปนเวลา 14 วน (n = 3) (บาร=SEM) หมายเหต : ตวอกษรทตางกนแสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญสถต (p<0.05)

รปท 22. การปรากฏฟรอนดสขาวซดของไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวเปนเวลา 14 วน (n = 3) (บาร=SEM) หมายเหต : ตวอกษรทตางกนแสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญสถต (p<0.05)

เมอทาการเปรยบเทยบอตราการเจรญเตบโตของไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวเปนระยะเวลา 14

วน พบวาไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร Hoagland E มการเพมจานวนฟรอนดแบบทวคณมากทสดคอ

2.33 วน จงไดนาไขนาทปราศจากการปนเปอนมาเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร Hoagland E (E) ทความ

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

H20 MS SH E E+ 0.5MS 0.5SH 0.5E 0.5E+

การเพ

มจาน

วนแบ

บทวค

ณของ

ไขนา

(วน)

a abababababab ab

c


E+ 0.5E+

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

H20 MS SH E E+ 0.5MS 0.5SH 0.5E 0.5E+

aa a

b

b

a b

a ba b

a b

จานว

นเฉล

ยของ

ฟรอน

ดสขา

วซด


0.5E+E+H2O

25

เขมขนปกต เปนระยะเวลา 14 วน โดยเรมตนจาก 1 ฟรอนด พบวามการเพมจานวนฟรอนดเปน 23 ฟรอนด

โดยเฉลย มการเพมจานวนโดยฟรอนดจะตดกน 2 ฟรอนด แลวหลดออกจากกนทบรเวณระหวางฟรอนด 2

ฟรอนด จะแยกออกเปนฟรอนดเดยว จากนนกจะมฟรอนดขนาดเลก เกดขนมาใหมจากฟรอนดเดม และฟ

รอนดทหลดออกมา (รปท 23)

รปท 23. การเกดฟรอนดใหมของไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E เปนระยะเวลา 48 ชม. (A) ไขนาท

พรอมจะแตกฟรอนดใหม (B) ฟรอนดใหมเรมแตกออกมา ในระยะเวลา 16 ชม. (C) 32 ชม. (D) 48 ชม.

(สเกลบาร = 1 มม.)

6.4 ลกษณะทางสณฐานวทยาของแหนทเพาะเลยงในหองปฏบตการ

แหนใหญ แหนเลก และไขนา ทเพาะเลยงในหองปฏบตการ มลกษณะฟรอนด และขนาดทแตกตาง

กน (รปท 24)

รปท 24. ลกษณะของฟรอนด (A) แหนใหญ (B) แหนเลก (C) ไขนา ทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS (สเกลบาร = 1 มม.)

A B

C D

A B C

26

6.4.1. ความกวางของฟรอนด

แหนใหญ แหนเลก และไขนา มความกวางของฟรอนดเฉลยเทากบ 3.95, 1.37, และ 0.45 มลลเมตร

ตามลาดบ ซงมขนาดทแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (รปท 25)

รปท 25. ความกวางฟรอนดแหนใหญ แหนเลก และไขนาทเพาะเลยงในหองปฏบตการดวยอาหารสตร MS

(บาร=SD) หมายเหต : ตวอกษรทตางกนแสดงความแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (p<0.05)

6.4.2. ความยาวของฟรอนด

แหนใหญ แหนเลก และไขนา มความยาวของฟรอนดเฉลยเทากบ 5.38, 2.41 และ 0.56 มลลเมตร


รปท 26. ความยาวฟรอนดแหนใหญ แหนเลก และไขนาทเพาะเลยงในหองปฏบตการดวยอาหารสตร MS


0

1

2

3

4

5

6

7

แหนใหญ แหนเลก ไขนา

ความกว

างฟร

อนด (

mm.)

0

1

2

3

4

5

6

7


ความยาวฟ

รอนด

(m

m)

a

b

c

c

b

a

27

6.4.3. ความหนาของฟรอนด

จากการเปรยบเทยบลกษณะความหนาฟรอนด (รปท 27) พบวาแหนใหญมความหนาเฉลย

เทากบ 0.21 มลลเมตร และ แหนเลกมความหนาเฉลยเทากบ 0.16 มลลเมตร ซงมขนาดทแตกตางกน สวน

ไขนาไมสามารถวดขนาดความหนาของฟรอนดได (รปท 28)

รปท 27. ภาพถายดานขางเปรยบเทยบความหนาของฟรอนด (A) แหนใหญ (B) แหนเลก (สเกลบาร = 1 มม.)

รปท 28. ความยาวฟรอนดแหนใหญ แหนเลก และไขนาทเพาะเลยงในหองปฏบตการดวยอาหารสตร MS

(บาร=SD; nd=ไมสามารถวเคราะหได)


6.4.4. จานวนปากใบ

จากการเปรยบเทยบจานวนปากใบดานหลงฟรอนด (รปท 29) และดานลางฟรอนด (รปท 30) ของ

แหนใหญ แหนเลก และไขนา ทเพาะเลยงในหองปฏบตการ พบวาจานวนปากใบของแหนเลกมคาเฉลยเทากบ

134.68 คตอตารางมลลเมตร ซงมจานวนแตกตางกบแหนใหญและไขนาทมคาเฉลยเทากบ 88.06 และ 78.08

คตอตารางมลลเมตร ตามลาดบ (รปท 31) ในขณะทดานลางฟรอนดไมพบปากใบ

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ความหน

าของฟร

อนด

(mm)

A B

b

a

nd

28

รปท 29. ปากใบทพบบนดานหลงฟรอนดของ (A) แหนใหญ (B) แหนเลก และใน (C) ไขนา ทเพาะเลยงใน

อาหารเหลวสตร MS (สเกลบาร = 0.1 มม.)

รปท 30. ลกษณะดานผวใตฟรอนดของ (A) แหนใหญ (B) แหนเลก ทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS

(สเกลบาร = 0.1 มม.)

รปท 31. ความหนาแนนของปากใบทพบในแหนใหญ แหนเลก และไขนาทเพาะเลยงในหองปฏบตการดวย

อาหารสตร MS (บาร=SD)


A B C

a

b

a

A B

29

6.4.5. ความกวางปากใบ

ขนาดความกวางปากใบของไขนามคาเฉลยเทากบ 30.49 μm ซงมขนาดแตกตางกบแหนใหญ และ

แหนเลกทมคาเฉลยเทากบ 12.57 μm และ 13.67 μm ตามลาดบ (รปท 32)

รปท 32. ความกวางปากใบของแหนใหญ แหนเลก และไขนาทเพาะเลยงในหองปฏบตการดวยอาหารสตร MS


6.4.6. ความยาวปากใบ

ขนาดความปากใบของแหนใหญ แหนเลก และไขนา มคาเฉลยเทากบ 19.98, 22.51 และ 30.49 μm


รปท 33. ความยาวปากใบของแหนใหญ แหนเลก และไขนาทเพาะเลยงในหองปฏบตการดวยอาหารสตร MS


b

a a

a b

c

30

6.4.7. ความยาวราก จากการวเคราะหความยาวรากของแหนใหญ แหนเลก และไขนา ทเพาะเลยงในหองปฏบตการ ในอาหารเหลวสตร MS (รปท 34) พบวาความยาวรากของแหนใหญมคาเฉลยเทากบ 3.26 มลลเมตร สวนแหนเลกไมสามารถวดความยาวรากไดในอาหารสตร MS ในขณะทไขนาไมพบโครงสรางของราก

รปท 34. รากของแหนใหญทเพาะเลยงในหองปฏบตการในอาหารสตร MS (สเกลบาร = 1 มม.)

6.5. ปรมาณสารชวโมเลกลในแหน


6.5.1.1 ความชน

จากการวเคราะหความชนโดยวธอบลมรอนพบวา แหนใหญทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E, E+ และ

SH มความชนคดเปนรอยละ 96.77, 97.65 และ 96.38 ตามลาดบ (รปท 35) ซงคาความชนดงกลาวสามารถ

นาไปคานวณหานาหนกแหงของแหนใหญทใชทดลองได

รปท 35. ความชนในแหนใหญทเพาะเลยงในหองปฏบตการในอาหารสตร E, E+ หรอ SH เปนเวลา 21 วน


31

6.5.1.2 คารโบไฮเดรตในรปแปงและนาตาล

ปรมาณคารโบไฮเดรตในแหนใหญทไดจากการวเคราะหดวยวธแอนโทรน หรอฟนอลซลฟวรก ใหผลท

แตกตางกน โดยวธฟนอลซลฟวรกจะใหคาทสงกวา และมคาความคลาดเคลอนมากกวา (รปท 36) อยางไรก

ตามแนวโนมของปรมาณคารโบไฮเดรตทวดไดจากทงสองวธเปนไปในทศทางเดยวกน คอ แหนใหญทเพาะเลยง

ในอาหารเหลวสตร E+ จะใหปรมาณคารโบไฮเดรตสงกวาอาหารเหลวสตร E หรอ SH โดยถายดปรมาณ

คารโบไฮเดรตทวเคราะหไดจากวธแอนโทรน แหนใหญทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E, E+ และ SH ม

ปรมาณคารโบไฮเดรต 72.36, 108.90 และ 63.47 มลลกรมตอกรมนาหนกแหง ตามลาดบ แตถายดปรมาณ

คารโบไฮเดรตทวเคราะหไดจากวธหรอฟนอลซลฟวรก แหนใหญทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E, E+ และ SH

มปรมาณคารโบไฮเดรต 110.83, 190.28 และ 112.04 มลลกรมตอกรมนาหนกแหง ตามลาดบ (รปท 36)

รปท 36. ปรมาณคารโบไฮเดรตในแหนใหญทเพาะเลยงในหองปฏบตการในอาหารสตร E, E+ หรอ SH เปน

เวลา 21 วน และวเคราะหหาปรมาณคารโบไฮเดรตดวยวธแอนโทรนหรอวธฟนอลซลฟวรก (บาร=SD)

6.5.1.3 โปรตน

ปรมาณโปรตนในแหนใหญทไดจากการวเคราะหดวยกรดไบซนโคนนค หรอวธของลอวรใหผลไม

แตกตางกน ผลการวเคราะหปรมาณโปรตนดวยกรดไบซนโคนนค พบวาแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารเหลว

สตร E, E+ และ SH มปรมาณโปรตน 200.49, 237.41 และ 186.95 มลลกรมตอกรมนาหนกแหง ตามลาดบ

ในขณะทผลการวเคราะหปรมาณโปรตนดวยวธของลอวร พบวาแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E, E+

และ SH มปรมาณโปรตน 197.74, 205.16 และ 174.19 มลลกรมตอกรมนาหนกแหง ตามลาดบ แสดงใหเหน

0

50

100

150

200

250

300

E E+ SH

ปรมาณคารโบ

ไฮเดรต

(mg/

g dw)

Anthrone Method

Phenol Sulfuric Method

32

วาแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E+ จะใหปรมาณโปรตนสงกวาอาหารเหลวสตร E หรอ SH

ถงแมวาทงอาหารทงสามสตรจะใหผลการวเคราะหปรมาณโปรตนไมแตกตางกนอยางมนยสาคญ (รปท 37)

รปท 37. ปรมาณโปรตนในแหนใหญทเพาะเลยงในหองปฏบตการในอาหารสตร E, E+ หรอ SH เปนเวลา 21

วน และวเคราะหหาปรมาณโปรตนดวยกรดไบซนโคนนคหรอวธของลอวร (บาร=SD)


รปท 38. ปรมาณโปรตนในแหนใหญทเพาะเลยงในหองปฏบตการในอาหารสตร E เปนเวลา 21 วน และ

วเคราะหหาปรมาณโปรตนดวยกรดไบซนโคนนค, วธของลอวร หรอวธเจลดาลห (บาร=SD)


0

50

100

150

200

250

300

350

E E+ SH

ปรมาณโปรตน

(mg/g dw

)

BCA assay

Lowry's method

a

aa

0

5

10

15

20

25

30

Kjeldalh BCA Lowry

ปรมาณโปรตน (%

)

33

อยางไรกตามการวเคราะหปรมาณโปรตนดวยสองวธขางตนไมไดเปนการวเคราะหปรมาณโปรตน

ทงหมด เนองจากตองมการสกดโปรตนออกมาจากตวอยางกอนทจะนาไปวเคราะห ดงนนผวจยจงทาการ

เปรยบเทยบปรมาณโปรตนทวดไดจากการสกดแลวนาไปวเคราะหดวยกรดไบซนโคนนค หรอวธของลอวร กบ

ปรมาณโปรตนทวดไดจากตวอยางทงหมดโดยใชวธเจลดาลห โดยใชแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารสตร E เปน

ตวอยางในการวเคราะห ผลการวเคราะหแสดงใหเหนวาวธทงสามวธ ไมมความแตกตางกนอยางมนยสาคญ

โดยวธเจลดาลหจะใหผลการวเคราะหปรมาณโปรตนสงทสดและมความคลาดเคลอนนอยทสด (รปท 38)



จากการทดลอง พบวาแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวทง 4 สตร MS, SH, E และ E+ มปรมาณ

ความชนรอยละ 93.60, 92.80, 94.98 และ 94.87 ตามลาดบ (รปท 39) เมอทดสอบคาเฉลยดวยวธ Duncan

และ Tukey HSD ใหผลทดสอบวา แหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E และ E+ มปรมาณความชนสง

กวาแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS และ SH อยางมนยสาคญ

รปท 39. ความชนในแหนเลกทเพาะเลยงในหองปฏบตการในอาหารสตร MS, E, E+ หรอ SH เปนเวลา 14

วน (บาร=SEM) หมายเหต ตวอกษรทตางกนแสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (p<0.05)

93.60

92.80

94.98 94.87

90.0090.5091.0091.5092.0092.5093.0093.5094.0094.5095.0095.5096.00

MS SH E E+

ความ

ชน (%

)

b

a

c c


34


จากการวเคราะหปรมาณคารโบไฮเดรตในแหนเลกทเพาะเลยงในหองปฏบตการ พบวาแหนเลกท

เพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS, SH, E และ E+ มปรมาณคารโบไฮเดรตเทากบ 211.26, 208.71, 213.69

และ 286.99 มลลกรมตอกรมนาหนกแหง ตามลาดบ (รปท 40) เมอทดสอบดวยวธ Duncan และ Tukey

HSD ใหผลทดสอบวา ปรมาณคารโบไฮเดรตของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E+ มากกวาแหนเลกท

เพาะเลยงในอาหารเหลวทงสามสตรอยางมนยสาคญ

รปท 40. ปรมาณคารโบไฮเดรตในแหนเลกทเพาะเลยงในหองปฏบตการในอาหารสตร MS, E, E+ หรอ SH

เปนเวลา 14 วน (บาร=SEM)

หมายเหต ตวอกษรทแตกตางกนแสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (p<0.05)

6.5.2.3 โปรตน

จากการวเคราะหปรมาณโปรตนในแหนเลกทเพาะเลยงในหองปฏบตการ พบวาแหนเลกทเพาะเลยง

ในอาหารเหลวสตร MS, SH, E และ E+ มปรมาณโปรตนเทากบ 157.86, 160.01, 117.0 และ 152.52

มลลกรมตอกรมนาหนกแหง ตามลาดบ (รปท 41) เมอทดสอบดวยวธ Duncan และ Tukey HSD ใหผล

ทดสอบวา แหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร E มปรมาณโปรตนนอยกวาแหนเลกทเพาะเลยงในอาหาร

เหลวสตรอนอยางมนยสาคญ

0.00

50.00

100.00

150.00

200.00

250.00

300.00

350.00

400.00

MS SH E E+

ปรมา

ณคา

รโบไ

ฮเดร

ต (m

g/g

DW)


a a a

b

35

รปท 41. ปรมาณโปรตนในแหนเลกทเพาะเลยงในหองปฏบตการในอาหารสตร MS, E, E+ หรอ SH เปนเวลา

14 วน (บาร=SEM) หมายเหต ตวอกษรทแตกตางกนแสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต

(p<0.05)

6.5.3. ไขนา


จากการทดลองพบวาไขนาทเพาะเลยงในหองปฏบตการในอาหารเหลวสตร MS, SH, E และ E+ มปร

ความชนรอยละ 93.69, 96.07, 96.28 และ 96.79 ตามลาดบ (รปท 42) เมอทดสอบทางสถตดวยวธ Duncan

ใหผลทดสอบวา ไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS มปรมาณความชนนอยกวาไขนาทเพาะเลยงใน

อาหารเหลวสตร SH, E+ และ E อยางมนยสาคญ


เมอทาการวเคราะหปรมาณคารโบไฮเดรตในไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลว 4 สตร พบวาไขนาท

เพาะเลยงในอาหารเหลวสตร MS, SH, E และ E+ มคารโบไฮเดรตรอยละ 9.17, 13.44, 18.67 และ 18.84

ของนาหนกแหง ตามลาดบ (รปท 43) เมอทดสอบทางสถตดวยวธ Duncan และ Tukey HSD ใหผลทดสอบ

วา ปรมาณคารโบไฮเดรตในไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวทกสตรไมตางกนอยางมนยสาคญ

6.5.3.3 โปรตน

เมอทาการวเคราะหปรมาณโปรตนในไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลว 4 สตร พบวาไขนาทเพาะเลยง

ในอาหารเหลวสตร MS, SH, E และ E+ มโปรตนรอยละ 2.34, 5.05, 7.48 และ 2.99 ของนาหนกแหง

0.0020.0040.0060.0080.00

100.00120.00140.00160.00180.00200.00

MS SH E E+

ปรมา

ณโป

รตน(

mg/

g DW

)

bb

b

a


36

ตามลาดบ (รปท 44) เมอทดสอบทางสถตดวยวธ Duncan ใหผลทดสอบวา ไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลว

สตร E มปรมาณโปรตนมากกวาไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตรอน อยางมนยสาคญ

รปท 42. ความชนในไขนาทเพาะเลยงในหองปฏบตการในอาหารสตร MS, E, E+ หรอ SH เปนเวลา 14 วน

(บาร=SEM) หมายเหต : ตวอกษรทตางกนแสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญสถต (p<0.05)

รปท 43. ปรมาณคารโบไฮเดรตในไขนาทเพาะเลยงในหองปฏบตการในอาหารสตร MS, E, E+ หรอ SH เปน

เวลา14 วน โดยเทยบเปนรอยละของนาหนกแหง (บาร=SEM)

หมายเหต : ไมแตกตางกนอยางมนยสาคญสถต (p<0.05)

91

92

93

94

95

96

97

98

MS SH E E+

b b

b


ความ

ชน (

%) a

0

5

10

15

20

25

MS SH E E+

ปรมา

ณคาร

โบไฮ

เดรต

(%)


37

รปท 44. ปรมาณโปรตนในไขนาทเพาะเลยงในหองปฏบตการในอาหารสตร MS, E, E+ หรอ SH เปนเวลา 14

วน โดยเทยบเปนรอยละของนาหนกแหง (บาร=SEM)

หมายเหต : ตวอกษรทตางกนแสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญสถต (p<0.05)

6.6. ผลของสารเคมตอการเจรญเตบโตและการออกดอกของแหน


6.6.1.1. เพาะเลยงในอาหารสตร MS

รปท 45. ระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารสตร MS ทมสารเคมเหนยวนา

ทความเขมขน 0.1 ไมโครโมลาร โดยคานวณจาก A) จานวนใบ, B) พนทใบ (บาร=SD)

หมายเหต : ตวอกษรทตางกนแสดงความแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต (p < 0.05)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

MS SH E E+

a

b

c

ab

ปรมา

ณโปร

ตน (%

)


0.00

5.00

10.00

15.00

Control SA 0.1 μM

ABA 0.1 μM

EDTA 0.1 μM

2,4-D 0.1 μM

KMnO4 0.1 μM

Fron

d do

ublin

g tim

e (d

ay)

สารเคมเหนยวนาทความเขมขน 0.1 μM

a a

b

aa

a

0.00

5.00

10.00

15.00

Control SA 0.1 μM

ABA 0.1 μM

EDTA 0.1 μM

2,4-D 0.1 μM

KMnO4 0.1 μMLe

af a

rea

doub

ling

time

(day

)


a a

b

a

b

a

A B

38

การทดสอบผลของสารเคมเหนยวนา ในอาหารเหลวสตร MS ทไมมสารเคมเหนยวนา (ชดควบคม)

และทมสารเคมเหนยวนา ไดแก กรดซาลไซลก กรดแอบไซซก กรดเอทลนไดอะมนเต-ตราอะซตก กรด 2,4-ได

คลอโรฟนอกซอะซตกและดางทบทม ทระดบความเขมขน 0.1 ไมโครโมลาร พบวา ระยะเวลาในการเพม

จานวนทวคณของใบ (รปท 45, A) ของแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซซก (10.97 วน) มากกวา

ชดควบคมและอาหารทมสารเคมเหนยวนาอนๆ ในขณะทระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของพนทใบ (รปท

45, B) ของแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซซก (6.53 วน) และอาหารทมกรด 2,4-ไดคลอโรฟ

นอกซอะซตก (5.52 วน) มากกวาชดควบคมและอาหารทมสารเคมเหนยวนาอนๆ

รปท 46. ระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารสตร MS ทมสารเคมเหนยวนา

ทความเขมขน 1 ไมโครโมลาร โดยคานวณจาก A) จานวนใบ, B) พนทใบ (บาร=SD)


การทดสอบผลของสารเคมเหนยวนาในอาหารเหลวสตร MS ทไมมสารเคมเหนยวนา(ชดควบคม) และ

ทมสารเหนยวนา ไดแก กรดซาลไซลก กรดแอบไซซก กรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซ-ตก กรด 2,4-ไดคลอโรฟ

นอกซอะซตกและดางทบทม ทระดบความเขมขน 1 ไมโครโมลาร พบวา ระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณ

ของใบ (รปท 46, A) ของแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซซก (11.05 วน) มากกวาชดควบคมและ

อาหารทมสารเคมเหนยวนาอนๆ ในขณะทระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของพนทใบ (รปท 46, B) ของ

แหนใหญทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซซก (11.17 วน) และอาหารทมกรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตก

(8.82 วน) มากกวาชดควบคม อาหารทมกรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตกและดางทบทม

การทดสอบผลสารเคมเหนยวนาในอาหารเหลวสตร MS ทไมมสารเคมเหนยวนา (ชดควบคม) และทม

สารเหนยวนา ไดแก กรดซาลไซลก กรดแอบไซซก กรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตก กรด 2,4-ไดคลอโรฟนอก

ซอะซตกและดางทบทม ทระดบความเขมขน 10 ไมโครโมลาร พบวา ระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของ

-3.00

4.00

11.00

18.00

25.00

Control SA 1 μM

ABA 1μM

EDTA 1 μM

2,4-D 1 μM

KMnO4 1 μMFr

ond

doub

ling

time

(day

)

สารเคมเหนยวนาทความเขมขน 1 μM

-3.00

4.00

11.00

18.00

25.00

Control SA 1 μM

ABA 1 μM

EDTA 1 μM

2,4-D 1 μM

KMnO4 1 μM

Leaf

are

a do

ublin

g tim

e (d

ay)


a

ab

b

a

b

aa a a

b

a a

A B

39

ใบ (รปท 47, A) ของแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารทมกรดซาลไซลก (13.72 วน) กรดแอบไซซก (15.31 วน)

และกรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตก (17.94 วน) มากกวาชดควบคม อาหารทมกรดเอทลนไดอะมนเต

ตราอะซตกและดางทบทม ในขณะทระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของพนทใบ (รปท 47, B) ของแหน

ใหญทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซซก (26.94 วน) มากกวาอาหารทมกรดซาลไซลก มากกวาอาหารทม

กรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตก และมากกวาชดควบคม อาหารทมกรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตกและ

ดางทบทม

รปท 47. ระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของแหนใหญทยงเพาะเลยงในอาหารสตร MS ทมสารเคม

เหนยวนาทความเขมขน 10 ไมโครโมลาร โดยคานวณจาก A) จานวนใบ, B) พนทใบ (บาร=SD)


6.6.1.2. เพาะเลยงในอาหารสตร PS

รปท 48. ระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารสตร PS ทมสารเคมเหนยวนา



0.00

10.00

20.00

30.00

Control SA 10 μM

ABA 10 μM

EDTA 10 μM

2,4-D 10 μM

KMnO4 10 μMFr

ond

doub

ling

time

(day

)


0.00

10.00

20.00

30.00

Control SA 10 μM

ABA 10 μM

EDTA 10 μM

2,4-D 10 μM

KMnO4 10 μM

Leaf

are

a do

ublin

g tim

e (d

ay)


a

c d

ab

a

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

Control SA 0.1 μM

ABA 0.1 μM

EDTA 0.1 μM

2,4-D 0.1 μM

KMnO4 0.1 μMFr

ound

dou

blin

g tim

e (d

ay)


a

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

Control SA 0.1 μM

ABA 0.1 μM

EDTA 0.1 μM

2,4-D 0.1 μM

KMnO4 0.1 μM

Leaf

are

a do

ublin

g tim

e (d

ay)


aa

a

aa

a

b b b

a a a

A B

ab ab ab

a

SA

b A B

40

การทดสอบผลของสารเหนยวนาในอาหารเหลวสตร PS ทไมมสารเคมเหนยวนา (ชดควบคม) และทม

สารเหนยวนา ไดแก กรดซาลไซลก กรดแอบไซซก กรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตก กรด 2,4-ไดคลอโรฟนอก

ซอะซตก และดางทบทม ทระดบความเขมขน 0.1 ไมโครโมลาร พบวา ระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของ

ใบ (รปท 48, A) ของแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารทมกรดซาลไซลก (11.60 วน) มากกวาชดควบคมและดาง

ทบทม ในขณะทระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของพนทใบ (รปท 48, B) ของแหนใหญทเพาะเลยงในชด

ควบคมและอาหารทมดางทบทมทงสามความเขมขนไมแตกตางกน

การทดสอบผลของสารเคมเหนยวนาในอาหารเหลวสตร PS ทไมมสารเคมเหนยวนา (ชดควบคม) และ

ทมสารเคมเหนยวนา ไดแก กรดซาลไซลก กรดแอบไซซก กรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตก กรด 2,4-ไดคลอ

โรฟนอกซอะซตกและดางทบทม ทระดบความเขมขน 1 ไมโครโมลาร พบวา ระยะเวลาในการเพมจานวน

ทวคณของใบ (รปท 49, A) ของแหนใหญทเพาะลยงในชดควบคมและอาหารทมสารเคมเหนยวนาไมแตกตาง

กน ในขณะทระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของพนทใบ (รปท 49, B) ของแหนใหญทเพาะลยงในอาหารท

มกรดแอบไซซก (24.50 วน) มากกวาชดควบคม กรดซาลไซลก กรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตก และดาง

ทบทม







ทวคณของใบ (รปท 50, A) ของแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารทมกรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตก (19.10

-10.00

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

Control SA 1 μM ABA 1μM

EDTA 1 μM

2,4-D 1 μM

KMnO4 1 μM

Frou

nd d

oubl

ing

time

(day

)


a

a aa

aa

-10.00

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

Control SA 1 μM

ABA 1 μM

EDTA 1 μM

2,4-D 1 μM

KMnO4 1 μM

Frou

nd d

oubl

ing ti

me

(day

)


a a

b

a

ab

a

SA SA

A B

41

วน) มากกวาอาหารทมกรดแอบไซซก ชดควบคม กรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตก และดางทบทม ในขณะท

ระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของพนทใบ (รปท 50, B) ของแหนใหญทเพาะเลยงในชดควบคมและ

สารเคมเหนยวนาอนๆ ไมแตกตางกน





6.6.2.1. เพาะเลยงในอาหารสตร MS

รปท 51. ระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารสตร MS ทมสารเคมเหนยวนา



การทดสอบผลของสารเคมเหนยวนาในอาหารเหลวสตร MS ทไมมสารเคมเหนยวนา (ชดควบคม)

และทมสารเคมเหนยวนา ไดแก กรดซาลไซลก กรดแอบไซซก กรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตก กรด 2,4-ได

คลอโรฟนอกซอะซตกและดางทบทม ทระดบความเขมขน 0.1 ไมโครโมลาร พบวา ระยะเวลาในการเพม

-10.00

0.00

10.00

20.00

30.00

Control SA 10 μM

ABA 10 μM

EDTA 10 μM

2,4-D 10 μM

KMnO4 10 μM

Fron

d do

ublin

g tim

e (d

ay)


a

bc ab

a

c

a

-10.00

0.00

10.00

20.00

30.00

Control SA 10 μM

ABA 10 μM

EDTA 10 μM

2,4-D 10 μM

KMnO4 10 μMLe

af a

rea

doub

ling

time

(day

)


aa

a

a

a

a

0.000.501.001.502.002.503.003.50

Control SA 0.1 μM

ABA 0.1 μM

EDTA 0.1 μM

2,4-D 0.1 μM

KMnO4 0.1 μMFr

ond

doub

ling

time

(day

)


ab abc

ac b

SA0.000.501.001.502.002.503.003.504.00

Control SA 0.1 μM

ABA 0.1 μM

EDTA 0.1 μM

2,4-D 0.1 μM

KMnO4 0.1 μMLe

af a

rea

doub

ling

time

(day

)


ab ab

b

a

b

ab

A B

SA

A B

42

จานวนทวคณของใบ (รปท 51, A) ของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซซก (2.66 วน) และอาหาร

ทมกรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตก (2.73 วน) มากกวาอาหารทมดางทบทม (2.51 วน) และมากกวาอาหาร

ทมกรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตก (2.33 วน) ในขณะทระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของพนทใบ (รป

ท 51, B) ของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซซก (2.84 วน) และอาหารทมกรด 2,4-ไดคลอโรฟ

นอกซอะซตก (2.89 วน) มากกวาอาหารทมกรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตก (2.09 วน)



คลอโรฟนอกซอะซตกและดางทบทม ทระดบความเขมขน 1 ไมโครโมลาร พบวา ระยะเวลาในการเพมจานวน

ทวคณของใบ (รปท 52, A) ของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซซก (5.63 วน) มากกวาอาหารทม

กรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตก (4.81 วน) และมากกวาชดควบคม อาหารทมกรดซาลไซลก (2.26 วน) กรด

เอทลนไดอะมนเตตราอะซตก (2.35 วน) และดางทบทม (2.47 วน) ในขณะทระยะเวลาในการเพมจานวน

ทวคณของพนทใบ (รปท 52, B) ของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซซก (9.20 วน) มากกวา

อาหารชดควบคมและอาหารทมกรดซาลไซลก (2.40 วน) กรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตก (2.06 วน) และ

ดางทบทม (2.19 วน)




0.00

5.00

10.00

15.00

Control SA 1 μM

ABA 1μM

EDTA 1 μM

2,4-D 1 μM

KMnO4 1 μMFr

ond

doub

ling

time

(day

)


a ac

a b a

0.00

5.00

10.00

15.00

Control SA 1 μM

ABA 1 μM

EDTA 1 μM

2,4-D 1 μM

KMnO4 1 μMLe

af a

rea

doub

ling

time

(day

)


a a a

ab

a

SA

A B

43



คลอโรฟนอกซอะซตกและดางทบทม ทระดบความเขมขน 10 ไมโครโมลาร พบวา ระยะเวลาในการเพม

จานวนทวคณของใบ (รปท 53, A) ของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซซก (9.84 วน) มากกวา

อาหารทมกรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตก (6.53 วน) และอาหารทมกรดซาลไซลก (5.15 วน) และมากกวา

ชดควบคมและอาหารทมกรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตก (2.33 วน) และดางทบทม (2.33 วน) ในขณะท

ระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของพนทใบ (รปท 53, B) ของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซ

ซกความเขมขน 10 ไมโครโมลาร (23.06 วน) มากกวาชดควบคมและอาหารทมสารเคมเหนยวนาอนๆ




6.6.2.2 เพาะเลยงในอาหารสตร PS



โรฟนอกซอะซตกและดางทบทม ทระดบความเขมขน 0.1 ไมโครโมลาร พบวา ระยะเวลาในการเพมจานวน

ทวคณของใบ (รปท 54, A) ของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซซก (2.82 วน) และอาหารทมดาง

ทบทม (2.62 วน) มากกวาชดควบคมและอาหารทมกรดซาลไซลก (2.44 วน) และกรด 2,4-ไดคลอโรฟนอก

ซอะซตก (2.38 วน) ในขณะทระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของพนทใบ (รปท 54, B) ของแหนเลกท

เพาะเลยงในชดควบคมและอาหารทมสารเคมเหนยวนาไมแตกตางกน

-5.00

5.00

15.00

25.00

35.00

Control SA 10 μM

ABA 10 μM

EDTA 10 μM

2,4-D 10 μM

KMnO4 10 μM

Fron

d do

ublin

g tim

e (d

ay)


ba

ba

c

a

-5.00

5.00

15.00

25.00

35.00

Control SA 10 μM

ABA 10 μM

EDTA 10 μM

2,4-D 10 μM

KMnO4 10 μMLe

af a

rea

doub

ling

time

(day

)


a a

b

aa

a

A B

44

รปท 54. ระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารสตร PS ทมสารเคมเหนยวนาท

ระดบความเขมขน 0.1 ไมโครโมลาร โดยคานวณจาก A) จานวนใบ, B) พนทใบ (บาร=SD)


การทดสอบผลของสารเคมเหนยวนาในอาหารเหลวสตร PS ไมมสารเคมเหนยวนา (ชดควบคม) และท

มสารเคมเหนยวนา ไดแก กรดซาลไซลก กรดแอบไซซก กรดเอทลนไดอะมนเต-ตราอะซตก กรด 2,4-ไดคลอ


ทวคณของใบ (รปท 55, A) ของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซซก (3.80 วน) มากกวาอาหารทม

กรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตก (2.88 วน) และอาหารทมกรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตก (2.32 วน)

ในขณะทระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของพนทใบ (รปท 55, B) ในอาหารทมกรดแอบไซซกมากกวาชด

ควบคมและอาหารทมสารเคมเหนยวนาอนๆ

รปท 55. ระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารสตร PS ทมสารเคมเหนยวนาท

ระดบความเขมขน 1 ไมโครโมลาร โดยคานวณจาก A) จานวนใบ, B) พนทใบ (บาร=SD)


0.000.501.001.502.002.503.003.50

Control SA 0.1 μM

ABA 0.1 μM

EDTA 0.1 μM

2,4-D 0.1 μM

KMnO4 0.1 μMFr

ond

doub

ling

time

(day

)


a ab ab

ab

0.000.501.001.502.002.503.003.50

Control SA 0.1 μM

ABA 0.1 μM

EDTA 0.1 μM

2,4-D 0.1 μM

KMnO4 0.1 μMLe

af a

rea

doub

ling

time

(day

)


aa

a a a a

0.001.002.003.004.005.00

Control SA 1 μM

ABA 1μM

EDTA 1 μM

2,4-D 1 μM

KMnO4 1 μMFr

ond

doub

ling

time

(day

)


ab a ab

cb

0.001.002.003.004.005.00

Control SA 1 μM

ABA 1 μM

EDTA 1 μM

2,4-D 1 μM

KMnO4 1 μM

Leaf

are

a do

ublin

g tim

e (d

ay)


a a

b

aa

aab

A B

A B

45

การทดสอบผลของสารเคมเหนยวนาในอาหารเหลวสตร PS ในชดควบคม (ไมมสารเคมเหนยวนา)

และทมสารเคมเหนยวนา ไดแก กรดซาลไซลก กรดแอบไซซก กรดเอทลนไดอะมนเต-ตราอะซตก กรด 2,4-ได

คลอโรฟนอกซอะซตก และดางทบทม ทระดบความเขมขน 10 ไมโครโมลาร พบวา ระยะเวลาในการเพม

จานวนทวคณของใบ (รปท 56, A) ของแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารทมกรดแอบไซซก (9.70 วน) มากกวา

อาหารทมกรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตก (5.59 วน) และมากกวาชดควบคมและสารเคมเหนยวนาอนๆ

ในขณะทระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของพนทใบ (รปท 56, B) ในอาหารทมกรด 2,4-ไดคลอโรฟนอก

ซอะซตกความเขมขน 10 ไมโครโมลาร (4.11 วน) มากกวาชดควบคมและสารเคมเหนยวนาอนๆ

รปท 56. ระยะเวลาในการเพมจานวนทวคณของแหนเลกเพาะเลยงในอาหารสตร PS ทมสารเคมทระดบความ

เขมขน 10 ไมโครโมลาร โดยคานวณจาก A) จานวนใบ, B) พนทใบ (บาร=SD, ไมพบการโต=ng)


6.6.3. การออกดอก

ในการพฒนาเทคนคการทาพนธวศวกรรมในแหนใหญ ขนแรกคอการทาใหแหนใหญออกดอก จาก

การศกษาการเหนยวนาใหแหนใหญและแหนเลกออกดอกโดยใชกรดซาลไซลกเปนสารเคมในการเหนยวนาโดย

เพาะเลยงแหนในอาหารสตร MS และในอาหารสตร PS (Pirson-seidel; Krajncic and Nemec, 1995)

พบวากรดซาลไซลก 10 ไมโครโมลตอลตร สงผลใหแหนใหญทเจรญในสองสตรอาหารมลกษณะใบใหญ หนา

ใตใบมสแดงเขม (รปท 57) ในขณะทกรดซาลไซลกความเขมขน 100 ไมโครโมลตอลตร มผลยบยงการ

เจรญเตบโตของแหนใหญทาใหแหนใหญแคระแกรน ใบเหลอง และตาย ในสวนของแหนเลกพบวากรดซาลไซ

ลก 10 ไมโครโมลตอลตร ไมสงผลตอแหนเลกทเจรญในอาหาร PS แตทาใหแหนเลกเจรญชาลงในอาหาร MS

และไมพบการเปลยนแปลงทางสณฐานวทยาอยางมนยสาคญ (รปท 58) อยางไรกตามในการทดลองนยงไมพบ

การออกดอกของแหนเลกและแหนใหญ

0.00

4.00

8.00

12.00

Control SA 10 μM

ABA 10 μM

EDTA 10 μM

2,4-D 10 μM

KMnO4 10 μMFr

ond

doub

ling

time

(day

)


a a a

ba

c

0.00

4.00

8.00

12.00

Control SA 10 μM

ABA 10 μM

EDTA 10 μM

2,4-D 10 μM

KMnO4 10 μM

Leaf

are

a do

ublin

g tim

e (d

ay)


a a ab a

ng

A B

46

วนท Control สารเคมเหนยวนา

Salicylic acid (SA) 0.1 μM

Salicylic acid (SA) 1 μM


0

3

6

9

12

15

รปท 57. ลกษณะแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารสตร PS ทมกรดซาลไซลกเปรยบเทยบกบชดควบคม (ไมม

กรดซาลไซลก) เปนระยะเวลา 15 วน (สเกล = 1 มม.)

47

วนท Control สารเคมเหนยวนา

Salicylic acid (SA) 0.1 μM



0

3

6

9

12

15

รปท 58. ลกษณะแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารสตร PS ทมกรดซาลไซลกเปรยบเทยบกบชดควบคม (ไมมกรด

ซาลไซลก) เปนระยะเวลา 15 วน (สเกล = 1 มม.)

48

6.7. การตรวจสอบชนดของแหนโดยใชเทคนค PCR

6.7.1. การออกแบบไพรเมอร

ไพรเมอรถกออกแบบดวยโปรแกรม Vector NTI® Advance (Life Technologies, USA) โดยอาศย

ขอมลคลอโรพลาสตจโนมของแหนแตละชนดในการออกแบบ ไพรเมอรทออกแบบสาเรจจะมลาดบเบส 20 –

22 bp, มคา Tm ในชวง 50 – 60 องศาเซลเซยส และสดสวน GC 50 – 60 % ซงจะใหผลตภณฑ DNA

ในชวง 1000–1200 bp จากการวเคราะหพบวาไพรเมอรบางชนทออกแบบมาสามารถเขาคกบคลอโรพลาสต

จโนมของแหนคนละชนดได (ตารางท 2) ซงคไพรเมอรทจาเพาะตอแหนชนดเดยวจะถกเลอกไปทดสอบ

ความจาเพาะเจาะจงในการเขาคกบจโนมสงมชวตอนตอไป

ตารางท 2. ขอมลของไพรเมอรทออกแบบดวยโปรแกรม Vector NTI® Advance

No.

Name

ลาดบเบสของไพรเมอร

Tm

%GC

ขนาดไพรเมอร

(bp) สกลแหนทไพรเมอรสามารถเขาคได

1 Lmchlf1 TAATTAAGGGCGAACGACGG 54.4 50 20 แหนเลก 2 Lmchlf2 AATTAAGGGCGAACGACGGG 55 50 20 แหนเลก 3 Lmchlf3 CATCCGCCCCCTTACTTAAGC 53.7 56.3 21 แหนเลกและไขนา 4 Lmchlr1 CTTCTGCAGCGATTGGTTTG 53.4 50 20 แหนเลก 5 Lmchlr2 CATGGCGGCTTGCTTGAGAT 54.2 50 20 แหนเลกและไขนา 6 Lmchlr3 TCGCCTTCATTGCTGCTCCT 54 50 20 แหนเลก 7 Wachlf1 CGTCAACAGATGCTGCTTCCC 57 57.1 21 ไขนา 8 Wachlf2 GCGCGTGGTGGATTCACAAT 56.8 55 20 ไขนาและแหนใหญ 9 Wachlf3 GCGCGTGGTGGATTCACAATC 56.8 57.1 21 ไขนาและแหนใหญ

10 Wachlr1 GCAAGCCAGTTTGGACCGAT 56.3 55 20 ไขนา 11 Wachlr2 ATCGCCTTCATTGCTGCTCC 57 55 20 ไขนา 12 Wachlr3 CGCCTTCATTGCTGCTCCTC 57.1 55 20 ไขนา 13 Spchlf1 TCCTCTCCCAAGTCGCTACA 52.2 55 20 แหนใหญ 14 Spchlf2 ATATAGGGCGAACGACGGGA 52.2 55 20 แหนใหญและแหนเลก 15 Spchlf3 TATAGGGCGAACGACGGGAA 52.5 55 20 แหนใหญและแหนเลก 16 Spchlr1 CACTGGAAGAGCGTACGGAA 52.8 55 20 แหนใหญ 17 Spchlr2 CGTCCTTGGATTGCTGTTGC 52.2 55 20 แหนใหญ 18 Spchlr3 GCGTCCTTGGATTGCTGTTG 52.8 55 20 แหนใหญ

49

6.7.2. การทดสอบความจาเพาะเจาะจงของไพรเมอร

เมอพจารณาคไพรเมอรทเหมาะสมในการเขาคกบคลอโรพลาสตจโนมของแหนแตละชนดแลวพบวา

ทกคมความจาเพาะเจาะจงตอแหนชนดนนๆมากทสด โดยอาจจะมบางคทมไพรเมอรหนงสามารถเขาคไดกบ

จโนมของสงมชวตอน เชน Lmchlr หรอ Wachlf แตเมอพจารณาเปนคแลวจะพบความจาเพาะเจาะจง ซง

กระบวนการดงกลาวทาไดโดยการนาไพรเมอรแตละอนไปบลาสต (Blast) กบฐานขอมลจโนมของสงมชวตใน

NCBI (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) แลวนามา

วเคราะหคาตะแนนทได (Total score) และความเหมอนของลาดบ (Query cover) (ตารางท 3)

ตารางท 3. ผลการบลาสตไพรเมอรทออกแบบในฐานขอมล NCBI (แสดงผล 5 อนดบแรก)

ชอ

ลาดบ

No.

สงมชวต

ชนด

Total score

Query cover

Lmchlf

TAA-TTA-AGG-GCG-AAC-GAC-

GG

1 แหนเลก L. minor 40.1 100%

2 พช S. sp. nov. 'nanocephala' 36.2 90%

3 แบคทเรย A. cylindrica 34.2 85% 4 พช S. actinophylla 34.2 85% 5 เหด T. Versicolor 32.2 80%

Lmchlr

CTT-CTG-CAG-CGA-TTG-GTT-

TG

1 หญานา R. rostratum 40.1 100% 2 แหนเลก L. minor 40.1 100% 3 แบคทเรย R. hominis 64.4 95% 4 หนอน พยาธ B. Malayi 36.2 90% 5 เพลย A. pisum 34.2 85%

Wachlf

CGT-CAA-CAG-ATG-CTG-CTT-

CCC

1 Chromalveolata B. pacifica 42.1 100% 2 ไขนา W. australiana 42.1 100% 3 ไขนา W. lingulata 42.1 100% 4 โลมาแมนาจน L. vexillifer 40.1 95% 5 แรดขาว C. simum 40.1 95%

Wachlr

GCA-AGC-CAG-TTT-GGA-CCG-

AT

1 ไขนา W. columbiana 40.1 100% 2 ไขนา W. australiana 40.1 100% 3 ไขนา W. lingulata 40.1 100% 4 ไขนา W. australiana 40.1 100% 5 ไขนา W. australiana 40.1 100%

50

ตารางท 3. ผลการบลาสตไพรเมอรทออกแบบในฐานขอมล NCBI (ตอ)

ชอ

ลาดบ

No.

สงมชวต

Species

Total score

Query cover

Spchlf

TCC-TCT-CCC-AAG-TCG-CTA-CA

1 แหนใหญ S. polyrhiza 40.1 100% 2 พช C. rubella 34.2 85% 3 สาหราย Calothrix sp 90.7 95% 4 เหด T. melanosporum 34.2 85% 5 เชอรา P. brasiliensis 34.2 85%

Spchlr

CAC-TGG-AAG-AGC-GTA-CGG-AA

1 แหนใหญ S. polyrhiza strain 7498 40.1 100%

2 แหนใหญ S. polyrhiza strain SJ PsbK 40.1 100%

3 แหนใหญ S. polyrhiza strain 8790 PsbK 40.1 100%



ตารางท 4. ขนาดผลตภณฑ DNA ทไดจากการทา PCR เมอใชคไพรเมอรทจาเพาะตอแหนแตละชนด คานวณ

โดยใชโปรแกรม Vector NTI® Advance

No. ชอไพรเมอร ลาดบ ใชตรวจสอบ ขนาด DNA ทได

1 ไพรเมอรแหนเลก

Lmchlf TAA-TTA-AGG-GCG-AAC-GAC-GG จโนมของ

แหนเลก

1,077 bp

Lmchlr CTT-CTG-CAG-

CGA-TTG-GTT-TG

2 ไพรเมอรไขนา

Wachlf CGT-CAA-CAG-ATG-CTG-CTT-CCC จโนมของ

ไขนา

1,175 bp

Wachlr GCA-AGC-CAG-

TTT-GGA-CCG-AT

3 ไพรเมอรแหนใหญ

Spchlf TCC-TCT-CCC-AAG-TCG-CTA-CA จโนมของ

แหนใหญ

1,190 bp

Spchlr CAC-TGG-AAG-

AGC-GTA-CGG-AA

51

6.7.3. การประมาณขนาดผลตภณฑ DNA ทได

จาการทานายขนาดของผลตภณฑ DNA เมอใชคไพรเมอรทออกแบบมาจาเพาะตอแหนแตละชนดโดย

ใชโปรแกรม Vector NTI® Advance พบวาผลตภณฑ DNA ทคานวณไดมขนาดอยในชวง 1000 – 1200 bp

โดยเมอใชคไพรเมอรแหนเลกจะใหขนาดชน DNA 1,077 bp, คไพรเมอรไขนาจะใหขนาดชน DNA 1,175 bp

และ คไพรเมอรแหนใหญจะใหขนาดชน DNA 1,190 bp ตามลาดบ (ตารางท 4)

6.7.4. การวเคราะหชนดของแหนดวยเทคนค PCR

6.7.4.1 คไพรเมอรไขนา

จากการเพมปรมาณสารพนธกรรมดวยเทคนค PCR โดยใชคไพรเมอรไขนา และ DNA แมพมพจาก

แหนใหญ แหนเลก และไขนาทเพาะเลยงในหองปฏบตการ พบแถบ DNA ในชองทใช DNA แมพมพจากแหน

ใหญ และไขนาตามลาดบ แตไมพบแถบ DNA ในชองทใช DNA แมพมพจากแหนเลก (รปท 59)

รปท 59. Agarose Gel แสดงแถบ DNA ทไดจากการเพมปรมาณสารพนธกรรมดวยเทคนค PCR โดยใชคไพร

เมอรไขนาและ DNA แมพมพทสกดจาก แหนใหญ (2) แหนเลก (3) และ ไขนา (4) ทเพาะเลยงใน

หองปฏบตการ โดยเทยบขนาดแถบ DNA ทไดกบ 1 kb DNA ladder (1)

52

เมอวเคราะหผลโดยการหาขนาดแถบ DNA โดยใชโปรแกรม ImageJ (Schneider et al., 2012)

พบวาแถบ DNA ทปรากฏในชองทใช DNA แมพมพจากแหนใหญและไขนา มขนาด DNA เฉลยเทากบ 1097

และ 1050 bp ตามลาดบ (ตารางท 5)

ตารางท 5. ขนาดผลตภณฑ DNA ทไดจากการเพมปรมาณสารพนธกรรมดวยเทคนค PCR โดยใชคไพรเมอร

ไขนาและ DNA แมพมพทสกดจากแหนทเพาะเลยงในหองปฏบตการ คานวณโดยใชโปรแกรม ImageJ (n=4)

DNA แมพมพ ขนาด DNA คาคลาดเคลอน

แหนใหญ 1097 ±135

แหนเลก - -

ไขนา 1050 ±173

6.7.4.2 คไพรเมอรแหนใหญ

จากการเพมปรมาณสารพนธกรรมดวยเทคนค PCR โดยใชคไพรเมอรแหนใหญและ DNA แมพมพจาก


ใหญ แตไมพบแถบ DNA ในชองทใช DNA แมพมพจากแหนเลก และไขนาตามลาดบ (รปท 60) เมอวเคราะห

ผลโดยการหาขนาดแถบ DNA โดยใชโปรแกรม ImageJ พบวาแถบ DNA ทปรากฏในชองทใช DNA แมพมพ

จากแหนใหญมขนาด DNA เฉลยเทากบ 1,140 bp (ตารางท 6)


แหนใหญและ DNA แมพมพทสกดจากแหนทเพาะเลยงในหองปฏบตการ คานวณโดยใชโปรแกรม ImageJ

(n=4)


แหนใหญ 1140 ±131

แหนเลก - -

ไขนา - -

53


เมอรแหนใหญและ DNA แมพมพทสกดจาก แหนใหญ (2) แหนเลก (3) และ ไขนา (4) ทเพาะเลยงใน


6.7.4.3 คไพรเมอรแหนเลก

จากการเพมปรมาณสารพนธกรรมดวยเทคนค PCR โดยใชคไพรเมอรแหนเลกและ DNA แมพมพจาก


ทงสามชนด (รปท 61) และเมอวเคราะหผลโดยการหาขนาดแถบ DNA โดยใชโปรแกรม ImageJ พบวาแถบ

DNA ทปรากฏในชองทใช DNA แมพมพจากแหนใหญ แหนเลก และไขนา มขนาด DNA เฉลยเทากบ 1,127

bp, 996 bp และ 943 bp ตามลาดบ (ตารางท 7)

54


เมอรแหนเลกและ DNA แมพมพทสกดจาก แหนใหญ (2) แหนเลก (3) และ ไขนา (4) ทเพาะเลยงใน



แหนเลกและ DNA แมพมพทสกดจากแหนทเพาะเลยงในหองปฏบตการ คานวณโดยใชโปรแกรม ImageJ

(n=4)


แหนใหญ 1127 ±154

แหนเลก 996 ±212

ไขนา 943 ±247

55

7. อภปรายผลการวจย

7.1. การกาจดจลนทรยปนเปอนในแหน

ตวอยางแหนใหญ แหนเลก และไขนาจากแหลงนาภายในมหาวทยาลยบรพามสงมชวตหลากหลาย

อาศยอยรวมกน เชน หนอนนา แมลงหลายชนด สาหราย และจลนทรย เมอนาแหนดงกลาวมาเพาะเลยงใน

อาหารสตร MS ในหองปฏบตการทมการควบคมอณหภม ความชนสมพทธ และความเขมแสง พบวามการ

ปนเปอนของสาหราย และจลนทรย การปนเปอนดงกลาวอาจสงผลตอการวเคราะหตอไป ดงนนจงตองมการ

กาจดจลนทรยปนเปอนดวยสารเคมกอนนามาศกษา

7.1.1. สารฟอกขาวเหมาะสมสาหรบใชในการกาจดจลนทรยทปนเปอนในแหนใหญและแหนเลก

จากการศกษาพบวาการใชสารฟอกขาวในการกาจดจลนทรยทปนเปอนในแหนใหญและแหนเลก

สงผลใหแหนใหญและแหนเลก มรอยละของการรอดชวตสงทสด ในขณะทมการปนเปอนของจลนทรยนอย

ทสด ในขณะทเมอใชทงเจอรไอโอดนกาจดจลนทรยทปนเปอนกลบไมพบการรอดชวตของแหนใหญและแหน

เลก แสดงใหเหนวาสารฟอกขาว เชน ไฮเตอร มประสทธภาพเพยงพอในการกาจดจลนทรยทปนเปอนภายนอก

ซงสารฟอกขาวดงกลาวมราคาถกจงสามารถนามาใชไดสะดวก โดยผวจยพบวาสาหรบแหนใหญ การใชไฮเตอร

ความเขมขน 3% เปนเวลา 5 นาท ใหประสทธภาพในการกาจดจลนทรยปนเปอนและอตราการรอดชวตทด

ทสด ในขณะทแหนเลกจะไวตอสารฟอกขาวมากกวาแหนใหญทาใหเวลาทใชในการกาจดจลนทรยทเหมาะสม

สนกวาอยในชวง 1 – 3 นาท ทความเขมขนไฮเตอรรอยละ 3 เชนเดยวกน อยางไรกตามทเวลาและความ

เขมขนดงกลาว แหนเลกมความแตกตางระหวางรอยละการรอดชวตกบรอยละการปนเปออยประมาณ 30%

ดงนนผวจยจงสรปไดวาสารฟอกขาวมความเหมาะสมทสดในการใชกาจดจลนทรยทปนเปอนในแหนใหญและ

แหนเลก เพอทจะนามาเพาะเลยงในหองปฏบตการ

7.1.2. โพวโดนไอโอดนเหมาะสมสาหรบใชในการกาจดจลนทรยทปนเปอนในไขนา

เนองจากไขนาเปนพชดอกทมขนาดเลกทสดทาใหไขนามความบอบบางทสดเมอเทยบกบแหนชนดอน

การใชสารฟอกขาวหรอทงเจอรไอโอดนในการกาจดจลนทรยปนเปอนทาใหไขนาตายทงหมด ดงนนผวจยจง

สนใจทจะใชโพวโดนไอโอดน เชน เบตาดน® ซงมฤทธในการกาจดจลนทรยเชนเดยวกบทงเจอรไอโอดนแต

ฤทธจะออนกวา จากการศกษาพบวาความเขมขนของเบตาดนทเหมาะสมในการกาจดจลนทรยปนเปอนใน

ไขนาคอท 10% เปนระยะเวลา 30 วนาท ซงเปนสภาวะเดยวทใหอตราการรอดชวตสงกวาการปนเปอนท 5 -

10% อยางไรกตามขอเสยของการใชโพวโดนไอโอดนคอราคาทแพงกวาสารฟอกขาว แตกสามารถหาซอไดงาย

56

ดงนนผวจยจงสรปไดวาโพวโดนไอโอดนมความเหมาะสมทสดในการใชกาจดจลนทรยทปนเปอนในไขนา

เพอทจะนามาเพาะเลยงในหองปฏบตการ

7.2. อาหารทเหมาะสมในการเพาะเลยงแหน

7.2.1. แหนเจรญเตบโตไดดในอาหาร Hoagland E

การเพาะเลยงแหนภายนอกตวอาคารในสภาวะปลอดเชอทาไดยาก และควบคมสภาวะแวดลอมท

สามารถรบกวนผลการทดลองไดยาก เชน ความเขมแสงและอณหภมทแตกตางกนในแตละวน ผวจยจงเลอกทา

การเพาะเลยงแหนใหญในในหองปฏบตการควบคมสภาวะทอณหภม 25 องศาเซลเซยส และใหแสงความเขม

แสง 15 μmol.m2.s-1 เปนเวลา 12 ชวโมงตอวน ในอาหารเหลว 4 สตร เพอคนหาสตรอาหารทเหมาะสมใน

การเพาะเลยงแหนในหองปฏบตการ โดยผลการศกษาพบวาแหนเจรญเตบโตไดดในอาหาร Hoagland E

เนองจากแหนทเพาะเลยงในอาหาร Hoagland E มอตราการเจรญเตบโตสงทสด โดยมระยะเวลาในการเพม

จานวนทวคณของแหนใหญ แหนเลก และไขนา ในอาหาร Hoagland E อยท 6.6, 2.7 และ 2.4 วน

ตามลาดบ

ในขณะทแหนทเพาะเลยงในอาหารอาหาร Hoagland E+ จะมอาการใบเหลองหรอขาวซดในชวง

สปดาหท 2 ของการเพาะเลยง นอกจากนยงพบการสรางทวเรยนจานวนมากในแหนใหญเมอเพาะเลยงใน

ระยะยาว ซงเปนสงทแสดงใหเหนถงการตอบสนองตอสภาวะทไมเหมาะสม ซงสาเหตอาจมาจากอาหาร

Hoagland E+ มธาตอาหารบางชนดมากเกนไปโดยสงเกตไดจากแหนกลบเจรญเตบโตไดดกวาในอาหาร

Hoagland E+ ครงสตร ทงนอาหารเหลวสตร E+ มธาตอาหารหลกมากกวาสตร E ถง 2-10 เทา ซงธาตอาหาร

ทมมากเกนไปอาจสงผลยงยงการเจรญเตบโตได และเมอพจารณาอาหาร MS และ SH จะพบวา อาหารทงสอง

ชนดสงผลใหแหนเจรญเตบโตไดไมตางกน แตไมเหมาะสมในการเพาะเลยงในระยะเวลานาน เพราะวาอาหาร

ทงสองชนดนมปรมาณธาตอาหารบางชนดทจาเปนสาหรบการเจรญเตบโตของแหนนอยกวาอาหาร Hoagland

E โดยสงเกตไดจากการใชความเขมขนครงหนงของอาหารทงสองสตรสงผลใหการเจรญเตบโตของแหนลดลง

อยางชดเจน เมอเทยบกบอาหาร Hoagland E ครงความเขมขนซงไมสงผลตอการเจรญเตบโตมากนก ดงนน

จากผลการศกษาขางตนแสดงใหเหนวา อาหาร Hoagland E เหมาะสมทสดทจะนามาใชเพาะเลยงแหนใน

หองปฏบตการ

57

7.2.2. อาหาร Hoagland E+ กระตนการสะสมคารโบไฮเดรตในแหน

จากการเปรยบเทยบปรมาณคารโบไฮเดรตในแหนพบวาแหนทเจรญในอาหารเหลวสตร Hoagland

E+ มปรมาณคารโบไฮเดรตสงทสด ในขณะทการเจรญเตบโตโดยรวมจะชาทสด แสดงใหเหนวาการเจรญเตบโต

ทชานนสงผลใหแหนสามารถสะสมคารโบไฮเดรตไดมากขน โดยเมอแหนอยในสภาวะทไมเหมาะสมจะชะลอ

กระบวนการจรญเตบโตสงผลใหคารโบไฮเดรตทสรางขนจากการสงเคราะหดวยแสงไมถกนาไปใชในการสราง

โครงสรางและเกดการสะสมเพมขนตามลาดบ

7.3. แหนเจรญเตบโตและขยายพนธไดอยางรวดเรวในหองปฏบตการ

7.3.1. แหนใหญใชเวลาเจรญเตบโตเตมท 72 ชวโมง

จากการศกษาแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารเหลว Hoagland E ภายใตกลองจลทรรศนสเตอรโอไมโค

รสโคปโดยเรมตนท 1 ฟรอนด พบวาฟรอนดแรกจะไมมการเจรญเตบโตเพมขนอาจมสาเหตมาจากฟรอนด

นนๆเจรญเตบโตเตมทอยกอนแลว หรอการฝนแยกฟรอนดแหนใหญออกจากกนเพอทาใหไดฟรอนดเดยวอาจ

ทาใหแหนใหญหยดการเจรญเตบโต และเปนผลใหเวลาทใชในการเตรยมตวสบพนธตางกน แตระยะเวลาทใช

ในการเจรญเตบโตของฟรอนดทแตกออกมาใหมใกลเคยงกน ทกหนวยทดลองฟรอนดจะเจรญเตบโตเตมทใน

เวลา 72 ชวโมงโดยกาหนดเวลาทเจรญเตบโตเตมทเมอฟรอนดหยดการเปลยนแปลง และจะแตกฟรอนดใหม

ทนทเมอเจรญเตบโตเตมทในชวโมงท 72 จากการทดลองแสดงใหเหนวาแหนใหญเปนพชทเจรญเตบโตท

รวดเรว และพรอมขยายพนธไดทนทเมอเจรญเตบโตเตมทแลว

7.3.2. แหนเลกใชเวลาในการเจรญเตบโตเตมท 24 ชวโมง

จากการทดลองพบวาแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวความเขมขนปกตสตร MS, SH, E และ E+

โดยมนากลนเปนชดควบคม เรมมการเจรญของฟรอนดทเวลา 24 ชวโมง โดยในอาหารเหลวความเขมขนครง

สตรใชเวลานานกวาอาหารเหลวความเขมขนปกตและในอาหารเหลว SH แหนเลกมการเจรญมากขนเรอยๆ

จนแตกฟรอนดใหมทเวลา 96 ชวโมง ในขณะทแหนเลกทถกเพาะเลยงในอาหารเหลว Hoagland E และ E+ ม

การแตกฟรอนดใหมทเวลา 108 ชวโมง แตแหนเลกทเพาะเลยงในนากลนและอาหารเหลว MS ยงไมมการ

แตกฟรอนดใหมในระยะเวลาททดลอง ทงนแหนเลกทเจรญในอาหารเหลว Hoagland E มอตราการแตก

ฟรอนดเรวกวาอาหารเหลว MS ซงสองคลองกบรายงานวจยของ Kittiwongwattana และ Vuttipongchaikij

(2013)

58

7.4. การใชแหนเปนพชตนแบบในการศกษาทางชววทยา

เนองจากแหนใหญมขนาดเลกและเจรญเตบโตไดเรว และมองคประกอบตางๆของพชดอกสมบรณ เรา

จงสามารถพฒนาแหนมาใชในการเรยนการสอนทางชววทยาได โดยเฉพาะการศกษาโครงสรางของเนอเยอและ

เซลลตางๆภายใตกลองจลทรรศน เชน การศกษาโครงสรางของทอลาเลยง, แอเรนไคมา (เซลลททาหนาทเกบ

อากาศ), หรอเซลลชนผวหนง เปนตน นอกจากนแหนยงมเซลลพเศษทเรยกวา Idioblast ซงเปนเซลลทสะสม

ผลกแคลเซยมออกซาเลทไวภายใน และสามารถมองเหนไดโดยใชเทคนค Differential Interference

Contrast (DIC) นอกจากนเนองจากแหนตอบสนองตอสภาวะภายนอกไดเรว จงเหมาะสมทจะใชทดสอบการ

ปดเปดของปากใบ โดยไมตองมการลอกเซลลชนผวหนงออกมาทาการศกษาเหมอนการใชพชตนแบบชนดอน

7.4.1. โครงสรางทางสณฐานวทยา

จากการศกษาลกษณะทางสณฐานวทยาของแหนใหญ แหนเลก และไขนา ทเพาะเลยงใน

หองปฏบตการทมการควบคมอณหภม ความเขมแสง และความชนสมพทธโดยนามาศกษาภายใตกลอง

จลทรรศนเพอดลกษณะภายนอกของแหนพบวา แหนใหญมขนาดของฟรอนดใหญทสด รองลงมาคอแหนเลก

และไขนา สวนความหนาฟรอนดของแหนใหญจะหนามากกวาแหนเลก แตมจานวนปากใบและขนาดปากใบท

เลกกวาแหนเลก และไขนา ดงตารางท 8 จากผลการวเคราะหขางตนทาใหสามารถจาแนกชนดของแหน

เบองตนไดตามองคประกอบทางสณฐานวทยาดงกลาว

ตารางท 8. ลกษณะทางสณฐานวทยาของแหน

ลกษณะทศกษา แหนใหญ แหนเลก ไขนา

ความกวางฟรอนดแม (mm.) 3.95 1.37 0.45

ความยาวฟรอนแม (mm.) 5.38 2.41 0.56

ความหนาของฟรอนด (mm.) 0.21 0.16 -

จานวนปากใบ (ค/mm2) 88.06 134.68 78.08

ความกวางปากใบ (μm.) 12.57 13.67 23.55

ความยาวปากใบ (μm.) 19.98 22.51 30.49

59

7.4.2. ไขนาเหมาะสมในการใชศกษาการทางานของปากใบ

เนองจากไขนามขนาดปากใบทใหญทสดเมอเทยบกบแหนเลกและแหนใหญ ซงจะทาใหการสกเกตการ

ปดเปดของปากใบทาไดงาย นอกจากนเนองจากไขนามขนาดเลกทสดทาใหในแตละครงททาการสงเกตจะได

ขอมลมาจากจานวนตวอยางของไขนาจานวนมากเมอเทยบกบแหนเลกและแหนใหญ

7.5. ปรมาณคารโบไฮเดรตและโปรตนในแหน

7.5.1. การวเคราะหปรมาณคารโบไฮเดรตดวยวธแอนโทรนมความนาเชอถอมากกวาวธฟนอล

ซลฟวรก

ปรมาณคารโบไฮเดรตทวเคราะหดวยวธแอนโทรนและวธฟนอลซลฟวรกแตกตางกนทระดบนยสาคญ

0.05 อาทเชนแหนใหญทเพาะเลยงในอาหารเหลว Hoagland E มปรมาณคารโบไฮเดรตเฉลย 72.36 เมอวด

โดยวธแอนโทรน และ 110.83 มลลกรมตอกรมนาหนกแหง เมอวดโดยวธฟนอลซลฟวรก ดงนนจะเหนไดวา

ปรมาณคารโบไฮเดรตทวเคราะหไดจากวธฟนอลซลฟวรกมปรมาณมากกวาและมคาเบยงเบนมาตรฐานสง ซง

อาจเกดจากฟนอลสามารถทาปฏกรยากบสารประกอบชนดอนทสกดไดจากแหนและมผลรบกวนการวเคราะห

วธแอนโทรนมความจาเพาะตอนาตาลสงกวาวธฟนอลซลฟวรก โดยสงเกตไดจากการทดลองวเคราะห

ปรมาณคารโบไฮเดรตในสารละลายแปง 1 เปอรเซนต และสารละลายนาตาล 1 เปอรเซนต ดวยวธแอนโทรน

และวธฟนอลซลฟวรก ซงวธแอนโทรนสามารถตรวจพบคารโบไฮเดรตไดดกวาทงในตวอยางแปงมาตรฐาน

(85.9 และ 68.7 เปอรเซนต ในวธแอนโทรน และวธฟนอลซลฟวรก ตามลาดบ; ขอมลทไมไดตพมพ) หรอนา

ตาลมาตรฐาน (104.1 และ 72.5 เปอรเซนต ในวธแอนโทรน และวธฟนอลซลฟวรก ตามลาดบ; ขอมลทไมได

ตพมพ) แสดงใหเหนวาวธแอนโทรนนาเชอถอกวาวธฟนอลซลฟวรกในการวดนาตาลหรอคารโบไฮเดรตท

สามารถถกเปลยนเปนนาตาลไดในสภาวะทรอนและเปนกรด

7.5.2. การวเคราะหปรมาณโปรตนดวยกรดไบซนโคนนค วธลอวร และวธเจลดาลห ม

ประสทธภาพไมแตกตางกน

ปรมาณโปรตนทวเคราะหดวยกรดไบซนโคนนค วธลอวร และวธเจลดาลห ไมแตกตางกนอยางม

นยสาคญ แตสงเกตไดวาปรมาณโปรตนทวเคราะหไดดวยวธเจลดาลหจะมากกวาอก 2 วธ ซงความแตกตาง

เลกนอยนอาจมาจากปรมาณโปรตนทสกดไดจากตวอยางแหนใหญทนามาวเคราะหดวยกรดไบซนโครนนค

และวธลอวร ยงไมใชโปรตนทงหมดในตวอยาง เพราะการสกดนนไมสามารถทาได 100% แตจากการทดลอง

พบวา เมอเทยบรอยละของปรมาณโปรตนทวเคราะหได โดยใหปรมาณโปรตนทวเคราะหไดจากวธเจลดาลห

60

เปน 100% ประสทธภาพในการสกดโปรตนในแหนใหญดวย 0.1 นอรมอล กรดไฮโดรคลอรก อยทประมาณ

86% ซงอยในเกณฑทยอมรบได โดยสามารถปรบปรงใหมประสทธภาพมากขนโดยการสกดซา (Casal et al.,

1999) อยางไรกตามขอไดเปรยบของการวเคราะหโปรตนดวยกรดไบซนโคนนค หรอวธลอวร คอการใช

ตวอยางในปรมาณนอย ทาใหวเคราะหหลายตวอยางไดในเวลาเดยวกน เมอเทยบกบวธเจลดาลห ซงตองใช

ตวอยางในปรมาณมากกวา นอกจากนเมอเปรยบเทยบการวเคราะหโปรตนทสกดจากแหนใหญดวยกรดไบ

ซนโคนนค หรอวธลอวร กไมมความแตกตางกนอยางมนยสาคญ แสดงใหเหนวาวธลอวรเหมาะสมในการ

วเคราะหปรมาณโปรตนทสกดจากแหนใหญทสด เพราะมราคาถกกวาการวเคราะหดวยกรดไบซนโคนนค

7.5.3. แหนใหญทเพาะเลยงในหองปฏบตการมปรมาณโปรตนสงแตมปรมาณคารโบไฮเดรตตา

แหนใหญทเพาะเลยงในอาหารทงสามสตรมปรมาณคารโบไฮเดรตในรปแปงและนาตาลไมแตกตางกน

โดยมปรมาณคารโบไฮเดรตสงทสดเมอเพาะเลยงในอาหารเหลว Hoagland E+ ท 10.9 เปอรเซนตของ

นาหนกแหง ซงถอวานอยเมอเทยบกบพชพลงงาน โดยมประมาณ 1 ใน 3 ของหวมนสาปะหลง (30.15%,

Karim et al., 2009) และมประมาณ 1 ใน 6 ของกากมนสาปะหลง (64.6%, Oboh, 2006) และคดเปน

ครงนงของถวเหลอง (20.3%, Stevenson et al., 2006) นอกจากนเมอเปรยบเทยบกบแหนเลกและไขนา

แลวพบวาแหนใหญมปรมาณคารโบไฮเดรตตาทสด (แหนเลก 28.7% และไขนา 18.84%, งานวจยน) อยางไร

กตามปรมาณคารโบไฮเดรตทวเคราะหไดสวนใหญมาจากฟรอนดซงเกดขนระหวางการสงเคราะหดวยแสง

ดงนนชวงระยะเวลาในการเกบตวอยางจงมความสาคญเพราะพชจะสะสมแปงมากทสดในตอนเยน และจะพบ

แปงนอยทสดในเวลาเชา ทาใหตวอยางทเกบในเวลาเชาจะมการสะสมของแปงนอยกวาตวอยางพชทเกบใน

ตอนเยน ดงนนอาจเปนไปไดวาแหนใหญใชแปงทสรางขนอยางรวดเรวในการสรางชวมวล เชน เซลลโลส และ

เพคตน ซงไมสามารถวเคราะหไดดวยวธแอนโทรน ทาใหเมอวเคราะหแลวมปรมาณแปงสะสมอยนอยเมอเทยบ

กบนาหนกทงหมด และสามารถอธบายไดวาในอาหารเหลว Hoagland E+ ซงแหนใหญเจรญเตบโตไดชาทสด

กลบมปรมาณคารโบไฮเดรตสงทสด เพราะแปงทสงเคราะหขนถกสะสมไว และไมไดนาไปใชในการสรางชวมวล

แหนใหญทเพาะเลยงในอาหารทงสามสตรมปรมาณโปรตนไมแตกตางกน ผลการทดลองแสดงใหเหน

วาสตรอาหารทแตกตางกนไมมผลตอการสงเคราะหโปรตนของแหนใหญ และปรมาณโปรตนทสามารถ

วเคราะหได คอ 200.65 กรมตอกรมนาหนกแหง หรอ 20.06 เปอรเซนตในนาหนกแหง ซงใกลเคยงกบโปรตน

ทวเคราะหไดจากแหนเลก (16%, งานวจยน; 20%, Casal et al., 1999) และมประมาณครงหนงของถว

เหลอง (39.6%, Stevenson et al., 2006) แตมมากกวากากมนสาปะหลงประมาณ 2.5 เทา (8.2%, Oboh,

61

2006) และมากกวาไขนา (7.5%, งานวจยน) ดงนนแหนใหญจงเหมาะสมทจะนามาใชเปนพชเพอการผลต

โปรตนมากกวาคารโบไฮเดรต ยกเวนกรณทตองการชวมวลในปรมาณมาก

7.5.4. แหนเลกทเพาะเลยงในหองปฏบตการมปรมาณคารโบไฮเดรตและโปรตนสง

แหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลว Hoagland E+ มปรมาณคารโบไฮเดรตทวเคราะหไดสงสดเทากบ 28.7%

ของนาหนกแหง ซงมปรมาณมากกวาแหนใหญ (10.9%, งานวจยน) และยงมปรมาณคารโบไฮเดรตใกลเคยง

กบหวมนสาปะหลง (30.15%, Karim et al., 2009) ซงเปนพชพลงงาน อกทงยงมปรมาณมากกวาถวเหลองซง

เปนพชอาหารประมาณ 1.5 เทา (20.3%, Stevenson et al., 2006) ในขณะทปรมาณโปรตนทวเคราะหได

จากแหนเลกทเพาะเลยงในอาหารเหลวสตร SH เทากบ 16.0% ของนาหนกแหง ซงคอนขางใกลเคยงกบ

โปรตนทวเคราะหไดจากแหนเลก (20%) ดงในรายงานวจยของ Casal และคณะ (1999) และแหนใหญ

(20.06%, งานวจยน) และยงมปรมาณโปรตนมากกวาสองเทาของกากมนสาปะหลง (8.2%, Oboh; 2006) ซง

เปนพชพลงงาน แตมปรมาณโปรตนเกอบครงหนงเมอเทยบกบถวเหลองซงเปนพชอาหาร (39.6%,

Stevenson et al., 2006)

7.5.5. ไขนาทเพาะเลยงในหองปฏบตการมปรมาณคารโบไฮเดรตสงแตมปรมาณโปรตา

ไขนาทเพาะเลยงในอาหารเหลว Hoagland E+และ E มปรมาณคารโบไฮเดรตทวเคราะหไดสงสดเทากบ

18.84% และ 18.67% ของนาหนกแหง ตามลาดบ ซงมปรมาณมากกวาแหนใหญ (10.9%; งานวจยน) และม

ปรมาณมากกวาถวเหลอง (11.4%, Steven และคณะ, 2006) ซงเปนพชอาหารแตมปรมาณคารโบไฮเดรต

นอยกวาแหนเลก (28.7%, งานวจยน) และยงมปรมาณคารโบไฮเดรตนอยกวากบมนสาปะหลง (25.00%,

Sriroth และคณะ, 1998) ซงเปนพชพลงงาน ในขณะทปรมาณโปรตนทวเคราะหไดจากไขนาทเพาะเลยงใน

อาหารเหลว Hoagland E เทากบ 7.48% ของนาหนกแหง ซงมปรมาณนอยกวาแหนใหญและแหนเลก

(20.06%, 11.7%, งานวจยน) ทงนพบวาไขนาสามารถใชทดแทนโปรตนจากถวเหลองไดถงรอยละ 75 ในการ

เลยงไกไข ซงจะทาใหสสนของใขแดงเพมมากขนดวย (Chantiratikul et al., 2010) แสดงใหเหนวาถงแมวา

ไขนาเปนพชนาทมการสะสมโปรตนนอยเมอเทยบกบแหนใหญและแหนเลก แตไขนาสามารถนาไปประกอบ

อาหารและใชทดแทนอาหารสตวได ดงนนการพฒนาปรบปรงพนธใหไขนามปรมาณโปรตนสงขนอาจชวยให

ไขนากลายเปนพชอาหารทางเลอกตอไป

62

7.6. สารเคมเหนยวนาทสงผลตอการเจรญเตบโตของแหนในหองปฏบตการ

7.6.1. กรดซาลไซลกชะลอการเจรญเตบโตของแหนเลกและแหนใหญ

กรดซาลไซลกทระดบความเขมขน 10 ไมโครโมลาร สงผลใหแหนเลกมการเจรญชาลง แตไมสงผลตอ

การเตบโต ในขณะทกรดซาลไซลกทความเขมขนดงกลาวสงผลใหแหนใหญมการเจรญเตบโตชาลง ทงนอาจ

เนองมาจากแหนเลกและแหนใหญเกดความเครยด เนองจากสภาวะทไมเหมาะสม จงสงผลใหการเจรญเตบโต

ชาซงสอดคลองกบงานวจยของ Cleland และ Ben-Tal (1982) ทศกษาผลของการใหกรดซาลไซลกความ

เขมขน 10 ไมโครโมลาร ตอการเจรญเตบโตของแหน (Lemna gibba สายพนธ G3) ในอาหารสตร Hutner

พบวากรดซาลไซลกความเขมขน 10 ไมโครโมลาร สงผลใหการเจรญเตบโตลดลง

7.6.2. กรดแอบไซซกยบยงการเจรญเตบโตของแหนเลกและแหนใหญ

กรดแอบไซซกทระดบความเขมขน 10 ไมโครโมลาร สงผลใหแหนเลกมการเจรญชาลงและยบยงการ

เตบโต และกรดแอบไซซกความเขมขน 1 ไมโครโมลาร สงผลใหแหนเลกมการเจรญเตบโตชาลง ในขณะทกรด

แอบไซซกความเขมขน 10 ไมโครโมลาร สงผลใหแหนใหญมการเตบโตชาลง แตไมสงผลตอการเจรญ เนองจาก

กรดแอบไซซกสามารถทาใหเกดการเปลยนแปลงของแรธาตในใบ จงสงผลยบยงการเจรญเตบโตในแหน

(Dekock et al., 1978)

7.6.3. กรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตกทระดบความเขมขน 0.1 ถง 10 ไมโครโมลาร ไมสงผลตอ

การเจรญเตบโตของแหนเลกและแหนใหญ

กรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตกทระดบความเขมขน 0.1, 1 และ 10 ไมโครโมลาร ไมสงผลตอการ

เจรญเตบโตของแหนเลกและแหนใหญ เนองจากกรดเอทลนไดอะมนเตตราอะซตกเปนสารคเลตทสามารถชวย

รกษาเสถยรภาพของวตามนในอาหาร ทาใหวตามนในอาหารไมสญเสยไปไดงายและชวยใหอาหารเสอม

คณภาพนอยลง ปองกนการตกตะกอนของเหลก จงไมสงผลตอการเจรญเตบโต

7.6.4. กรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตกชะลอการเจรญเตบโตของแหนเลกและแหนใหญ

กรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตกทระดบความเขมขน 10 ไมโครโมลาร สงผลใหแหนเลกมการ

เจรญเตบโตชาลง ในขณะทกรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตกทความเขมขนดงกลาวสงผลใหแหนใหญมการ

เจรญเตบโตชาลง สวนกรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตกความเขมขน 1 ไมโครโมลาร สงผลใหแหนใหญมการ

เตบโตชาลง เนองจากกรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตกเปนสารในกลมออกซนทมคณสมบตเปนสารกาจด

63

วชพช ถาใชความเขมขนสงสามารถทาใหพชตาย หากใชความเขมขนตาจะสามารถควบคมการเจรญเตบโตของ

พชไดจงสงผลใหการเจรญเตบโตชา

7.6.5. ดางทบทมยบยงการเจรญของแหนใหญ

ดางทบทมทความเขมขน 0.1, 1 และ 10 ไมโครโมลาร ไมสงผลตอการเจรญเตบโตของแหนเลก

ในขณะทดางทบทมทระดบความเขมขน 1 ไมโครโมลาร สงผลใหแหนใหญมการเจรญชาลง แตไมสงผลตอการ

เตบโต เนองจากดางทบทมเปนเปนตวออกซไดซอยางแรง ซงอาจจะเกดปฏกรยากบธาตอาหารตวอนทอยใน

อาหารเพาะเลยงทาใหสงผลตอการเจรญชา

7.6.6. สารเคมเหนยวนาทระดบความเขมขนในชวง 0.1 ไมโครโมลาร ถง 10 ไมโครโมลาร ไม

สามารถเหนยวนาใหแหนเลกและแหนใหญออกดอกได

การเหนยวนาแหนเลกและแหนใหญดวยสารเคม โดยนาแหนทมลกษณะเปนกระจก 2 ใบ ทปราศจาก

การปนเปอนอายประมาณ 1 เดอน ทไดจากการเพาะเลยงบนอาหารแขงสตร MS มาเลยงในอาหารเหลวสตร

MS และ PS ทเตมสารเคมเหนยวนาเรงการออกดอก ไดแก กรดซาลไซลก กรดแอบไซซก กรดเอทลนไดอะมน

เตตราอะซตก กรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตกและดางทบทม ทระดบความเขมขน 0.1, 1 และ 10 ไมโครโม

ลาร มาเพาะเลยงภายในหองปฏบตการ ทอณหภม 24-25 องศาเซลเซยส ความเขมแสง 20 umol m-2 s-1

ใหแสง 16 ชวโมงตอวน เปนระยะเวลา 15 วน พบวา แหนเลกและแหนใหญมการเกดความเครยด เนองจาก

การตอบสนองตอสภาวะทไมเหมาะสมจากการเหนยวนาดวยสารเคม จงทาใหมการลดลงหรอยบยงการ

เจรญเตบโตและการเพมขนาดของใบ แตสารเคมเหนยวนาใหเกดการออกดอกทระดบความเขมขนดงกลาวไม

สามารถเหนยวนาใหแหนเลกและแหนใหญออกดอกได ซงอาจมสาเหตมาจากสตรอาหาร อณหภม ความเขม

แสงและชวงเวลาการใหแสงยงไมเหมาะสม หรอมาจากแหนเลกและแหนใหญทนามาเพาะเลยงมกระจกของใบ

ไมถง 4 ใบ เมอเทยบกบแหนเลกและแหนใหญทเจรญเตบโตตามธรรมชาตทมกระจกของใบ 4 ใบ จงทาใหยง

ไมพบการออกดอกของแหนเลกและแหนใหญ ซงผลการทดลองแตกตางจากงานวจยของ Tanaka และ

Cleland (1980) ทใชแหน Lemna gibba สายพนธ G3 ทมลกษณะกระจกของใบ 4 ใบ มาเพาะเลยงใน

อาหารสตร Hoagland ทมกรดซาลไซลกความเขมขน 10 ไมโครโมลาร โดยเพาะเลยงในหองควบคมสภาวะท

อณหภม 27-28 องศาเซลเซยส ความเขมแสง 6000-7000 ลกซ และใหแสง 8 ชวโมงตอวน พบวา กรดซาลไซ

ลกทความเขมขน 10 ไมโครโมลาร สามารถเหนยวนาใหเกดการออกดอกในแหนได นอกจากนยงแตกตางจาก

งานวจยของ Cleland และ Ben-Tal (1982) ทใชแหน Lemna gibba สายพนธ G3 ทมกระจกของใบ 4 ใบ

64

มาเพาะเลยงในอาหารสตร Hutner ทมกรดซาลไซลกความเขมขน 10 ไมโครโมลาร โดยเพาะเลยงใน

หองควบคมสภาวะทอณหภม 28 องศาเซลเซยส ความเขมแสง 6000-7000 ลกซ และใหแสง 9 ชวโมงตอวน

เปนระยะเวลา 11 วน พบวา กรดซาลไซลกทความเขมขน 10 ไมโครโมลาร สามารถเหนยวนาใหเกดการออก

ดอกในแหนได และแตกตางจากงานวจยของ Krajnčič และ Nemec (1995) ทเพาะเลยงแหนใหญในอาหาร

สตร Pirson-seidel ทมกรดจสโมนก (Jasmonic acid) ทความเขมขน 0.475-47.5 nmol·L-1 โดยเพาะเลยง

ในหองควบคมสภาวะทอณหภม 27-28 องศาเซลเซยส ความเขมแสง 3000±100 ลกซ โดยใหแสง 16 ชวโมง

ตอวน หรอใหแสง 8 ชวโมงตอวน พบวา กรดจสโมนกทความเขมขน 0.475-47.5 nmol·L-1 สามารถเหนยวนา

ใหเกดการออกดอกในแหนใหญได ซงแสดงใหเหนวา สตรอาหารทใช อณหภม ความเขมแสงและชวงเวลาการ

ใหแสงมผลตอการออกดอกของแหน ดงนนผวจยคาดวานอกเหนอจากการกระตนดวยสารเคมแลวการควบคม

ชนดและปรมาณของแสงทเหมาะสมจะชวยใหแหนออกดอกได

7.7. การวเคราะหความแตกตางทางพนธกรรมของแหนดวยเทคนค PCR

7.7.1. การออกแบบไพรเมอรเพอนาไปตรวจสอบแหนแตละชนด

การจาแนกชนดของแหนโดยวธทางสณฐานวทยาอาจชวยใหแยกแยะแหนแตละชนดได แตตองใช

เวลานานถงจะสามารถจาแนกชนดได ดงนนจงไดทาการวเคราะหความแตกตางทางพนธกรรมเพอชวยในการ

ตรวจสอบยนยนชนดของแหนไดรวดเรวยงขน จากการออกแบบไพรเมอรดวยโปรแกรม Vector NTI โดยใช

ขอมลลาดบคลอโรพลาสตจโนม ของแหนใหญ แหนเลก และไขนา จากฐานขอมล NCBI ในการออกแบบจะ

กาหนดคา Tm=50-60 oC %GC=50-60 และขนาดของไพรเมอร 1000-1200 bp ไพรเมอรทออกแบบจะม

ความจาเพาะเจาะจง ตอแหนชนดนนๆ เมอออกแบบไพรเมอรสาเรจจะได forward primers และ reverse

primers ของแหนแตละชนด และเมอนาไพรเมอรทไดไปทดสอบความจาเพาะเจาะจงกบฐานขอมล NCBI

พบวาไพรเมอรมความจาเพาะเจาะจง เนองจากไพรเมอรทใชในการศกษาตรวจพบขอมลของพชตระกลแหนท

ตองการศกษา นอกจากนยงพบสงมชวตอน ซงเปนสงมชวตทไมตองการศกษา ซงมคาความคลายคลงกนอยใน

ระดบทใกลเคยงกน และมเปอรเซนตทมคเบสเหมอนกนอยในระดบสง

7.7.2. ความจาเพาะเจาะจงของไพรเมอรตอแหนทเพาะเลยงในหองปฏบตการ

เมอสกดดเอนเอจากแหนทเพาะเลยงในหองปฏบตการ และนามาเพมปรมาณสารพนธกรรมดวย

เทคนค PCR โดยใชไพรเมอรทงสามชนด พบวาไพรเมอรทออกแบบมาตรวจสอบแหนใหญมความจาเพาะ

เจาะจงตอแหนใหญ ในขณะทไพรเมอรแหนเลกและไขนาทออกแบบมาตรวจสอบแหนเลกและไขนา ไมม

65

ความจาเพาะเจาะจงเนองจากไพรเมอรไขนาสามารถจบกบลาดบจโนมของแหนใหญ ทาใหปรากฏแถบชนด

เอนเอขนมา สวนไพรเมอรแหนเลกสามารถจบกบลาดบจโนมของแหนใหญ และไขนาทาใหปรากฏแถบชนด

เอนเอขนมาเชนกน แสดงใหเหนวาไพรเมอรทออกแบบมานนสามารถใชบงบอกชนดของแหนใหญไดชดเจน

และสามารถใชจานแกชนดของแหนทงสามชนดไดจากผลการเพมปรมาณสารพนธกรรม

7.7.3. ความจาเพาะเจาจงของไพรเมอรตอพชสกลแหน (ขอมลทไมไดตพมพ)

จากการสกดดเอนเอจากจอกซงเปนตวแทนของพชนากบพรกซงเปนตวแทนของพชบก เมอทดสอบ

ดวยไพรเมอรไขนาและไพรเมอรแหนใหญพบวาไมปรากฏแถบดเอนเอ ในขณะทเมอใชไพรเมอรแหนเลก

ปรากฏแถบชนดเอนเอ แสดงใหเหนวาไพรเมอรไขนาและไพรเมอรแหนใหญมความจาเพาะเจาะจงตอพชสกล

แหนเทานน สวนไพรเมอรแหนเลกไมมความจาเพาะเจาะจงตอพชสกลแหน เนองจากไพรเมอรแหนเลก

สามารถจบกบลาดบจโนมของจอกทาใหปรากฏแถบชนดเอนเอขนมา แสดงวาไพรเมอรแหนเลกมความจาเพาะ

เจาะจงตอพชตระกล Araceae ซงประกอบไปดวยจอกและแหน เปนตน ซงอาจมลาดบจโนมทใกลเคยงกน

7.7.4. การวเคราะหหาสาเหตความไมจาเพาะเจาะจงของไพรเมอร

ในขนตอนการออกแบบไพรเมอร ไดมการทาการทดสอบความจาเพาะเจาะจงของไพรเมอรดวยการบ

ลาสตจากฐานขอมล NCBI ผลจากการทาอเลกโตรโพรรซสปรากกฎวามเพยงไพรเมอรของแหนใหญเทานนทม

ความจาเพาะเจาะจงตอแหนใหญ จงมการตรวจสอบไพรเมอรไขนาและไพรเมอรแหนเลกวาเพราะสาเหตใดจง

ไมมความจาเพาะเจาะจงโดยนาขอมลลาดบของไพรเมอรไขนาและแหนเลกมาทดสอบดวยโปรแกรม Vector

NTI ผลจากการตรวจสอบแสดงใหเหนวาไพรเมอรของแหนเลกและไขนาทออกแบบมาไมมความจาเพาะ

เจาะจงเนองจากลาดบขอมลทใชในการออกแบบไพรเมอรของแหนใหญ แหนเลก และไขนาใชลาดบจโนมทอย

ในคลอโรพลาสตของแหนทงสามชนด ซงมลาดบทคลายคลงกนมาก เมอนามาตรวจสอบหาลาดบทไมเขาค

พบวาไพรเมอรของไขนาสามารถจบกบลาดบจโนมของแหนใหญ และไพรเมอรแหนเลกสามารถจบกบลาดบ

จโนมของแหนใหญและไขนา โดยมลาดบทไมเขาคประมาณ 1-3 คเบสในแตละไพรเมอร แสดงใหเหนวาลาดบ

ทแตกตางกนเพยงเลกนอยไมสงผลตอการเขาคของไพรเมอรกบลาดบจโนมของแหนทาใหไพรเมอรสามารถจบ

กบลาดบจโนมของแหนและปรากฏแถบชนดเอนเอขนมาหลงจากการเพมปรมาณสารพนธกรรมและการทา

ทาอเลกโตรโพรรซส

66

7.8. การพฒนาแหนเพอนาไปใชประโยชนทางชวภาพ

ถงแมวาผวจยยงไมสามารถเหนยวนาใหแหนออกดอกไดในหองปฏบตการ ซงอาจมสาเหตมาจากอาย

ของแหนใหญทนามาเพาะเลยงนอยและยงไมสามารถออกดอกได หรอมาจากสภาวะทใชในการเพาะเลยง

เนองจากในงานวจยทรายงานผลการเหนยวนาใหแหนใหญออกดอกเพาะเลยงในสภาวะทมอณหภมและใหแสง

ทความเขมแสงสงกวาทผวจยใชในการเพาะเลยง ซงยงตองมการศกษาวจยสภาวะทเหมาะสมเพมขนในอนาคต

เพอเปนจดเรมตนในการศกษาทางพนธศาสตร และปรบปรงพนธแหนใหญใหสามารถตอบสนองตอโจทยวจย

ได นอกจากนยงสามารถพฒนาเทคนคทางพนธวศวกรรมไปพรอมๆกนได โดยการถายยนทสนใจเขาไปในแหน

ใหญ เนองจากขอมลทางพนธกรรมของแหนใหญไดมการเปดเผยแลว แตยงไมมการตงชอยนและทาฐานขอมล

ทสามารถเขาถงไดโดยงาย (http://spirodelagenome.org/)

67

8. สรปผลการวจย

แหน (duckweed) ทพบในแหลงนาภายในมหาวทยาลยบรพาประกอบไปดวย 3 สายพนธคอ แหน

ใหญ (Spirodela polyrhiza) แหนเลก (Lemna minor) และ ไขนา (Wolffia globosa) ซงสามารถนามา

เพาะเลยงในหองปฏบตการในสภาวะปลอดเชอทอณหภม 25 องศาเซลเซยส ความเขมแสง 15 μmol.m-2.s-1

โดยทาการกาจดสงปนเปอนดวยสารฟอกขาวหรอสารโพวโดนไอโอดน จากการศกษาพบวาแหนใหญ แหนเลก

และไขนาสามารถจาแนกไดดวยเทคนค PCR โดยออกแบบไพรเมอรใหสอดคลองกบคลอโรพลาสตจโนมของ

แหนแตละชนด และไดขนาดชน DNA หลงจากการทาการเพมปรมาณสารพนธกรรมทประมาณ 1140, 996,

และ 1050 คเบส ตามลาดบซงใกลเคยงกบทประมาณการไว จากการเปรยบเทยบการเจรญของแหนทง 3 ชนด

ในอาหารเหลว 4 สตรพบวาแหนทง 3 ชนดเจรญเตบโตไดดในอาหารเหลว Hoagland E และมระยะเวลาใน

การเพมจานวนทวคณของแหนใหญ แหนเลก และไขนา อยท 6.6, 2.7 และ 2.4 วน ตามลาดบ โดยแหนใหญ

และแหนเลกจะใชระยะเวลาในการเจรญเตบโตเพอแตกฟรอนดใหม 72 และ 24 ชวโมง ตามลาดบ เมอศกษา

ลกษณะทางสณฐานวทยาพบวาแหนใหญ แหนเลก และไขนามลกษณะเปนรปวงร มขนาดฟรอนด (กวาง x

ยาว) เฉลย 3.95 x 5.38, 1.37 x 2.41 และ 0.45 x 0.56 มม. ตามลาดบ โดยมจานวนปากใบเฉลย 88, 135

และ 78 ค/มม.2 ตามลาดบ และขนาดของปากใบ (กวาง x ยาว) เฉลย 12.6 x 20.0, 13.7 x 22.5 และ 23.6 x

30.5 ไมครอน ตามลาดบ จากการศกษาปรมาณคารโบไฮเดรตและโปรตนในแหนทง 3 ชนดพบวา แหนใหญ

แหนเลก และไขนา มปรมาณคารโปไฮเดรตสงสดเมอเพาะเลยงในอาหารเหลว Hoagland E+ โดยวดคาได

10.9, 28.7 และ 18.8 %ของนาหนกแหง ตามลาดบ ในขณะทมปรมาณโปรตนสงสดท 20.5, 16.0 และ 7.48

%ของนาหนกแหง ตามลาดบ นอกจากนยงพบสารเคมและฮอรโมนบางชนดทความเขมขน 10 uM มผลในการ

ชะลอหรอยบยงการเจรญเตบโตของแหนดงน กรดซาลไซลกและกรด 2,4-ไดคลอโรฟนอกซอะซตกมผลในการ

ชะลอการเจรญเตบโตของแหนเลกและแหนใหญ และกรดแอบไซซกยบยงการเจรญเตบโตของแหนเลกและ

แหนใหญ ในขณะทดางทบทมยบยงการเจรญของแหนใหญเทานน อยางไรกตามผวจยยงไมพบสารเคมชนดใด

ทสามารถเหนยวนาใหแหนออกดอกภายใตสภาวะทกาหนด โดยผวจยกาลงศกษาผลของแสงตอการออกดอก

ของแหน และพฒนากระบวนการถายฝากยนเขาสแหนเพอใชพฒนาเทคนคการปรบปรงพนธและการแปลง

พนธในแหนตอไป

68

9. ประโยชนและการประยกตใชงาน

9.1. สามารถเพาะเลยงแหนใหญ แหนเลก และไขนาทปราศจากจลนทรยปนเปอนไดภายในหองปฏบตการ

9.2. นาแหนทเพาะเลยงไดมาเปนพชตนแบบในการศกษาทางดานชววทยา ชวเคม และเทคโนโลยชวภาพ

9.3. งานวจยชนนนาไปใชในการเรยนการสอน 5 รายวชา ไดแก

307312 เทคนคระดบโมเลกลในเทคโนโลยชวภาพ (มคอ.3)

307313 ขอมลทางชวภาพ

307332 การเพาะเลยงเซลลและเนอเยอ (มคอ.3)

307483 หวขอเลอกสรรทางเทคโนโลยชวภาพ

307493 ปญหาพเศษทางเทคโนโลยชวภาพ

9.4. ผลงานวจยไดนาไปเผยแพรในการประชมวชาการระดบประเทศในงานวทยาศาสตรวจยครงท 5

9.5. ผลงานวจยไดนาไปใชในการบรการวชาการในงานสปดาหวนวทยาศาสตรแหงชาตภาคตะวนออกครง

ท 29 และครงท 30 ณ มหาวทยาลยบรพา

9.6. ผลงานวจยบางสวนไดถกตพมพในรายงานสบเนองการประชมวชาการระดบประเทศในงาน

วทยาศาสตรวจยครงท 6 (อรไพลน และคณะ, 2557) โดยงานวจยสวนใหญจะเกบไวตพมพในวารสารวชาการ

ระดบนานาชาตตอไป

9.7. สามารถพฒนาการใชแหนเพอผลตโปรตนตางๆโดยอาศยเทคนคทางพนธวศวกรรม หรอใชเปนตว

บงชทางชวภาพ หรอใชชวมวลในการทาชวพลงงานตอไปในอนาคต

69

10. เอกสารอางอง

1. Casal JA, Vermaat JE and Wiegman F. 1999. A test of two methods for plant protein

determination using duckweed. Aquatic Botany. 67: 61–67.

2. Chantiratikul A, Chinrasri O, Chantiratikul P, Sangdee A, Maneechote U and Bunchasak C.

2010. Effect of replacement of protein from soybean meal with protein from Woffia meal

(Wolffoa globasa (L.) Wimm.) on performance and egg production in laying hens. Int. J. Poult.

Sci. 9: 283-287.

3. Cleland CF and Ben-Tal Y. 1982. Influence of giving salicylic acid for different time periods

on flowering and growth in the long-day plant Lemna gibba G3. Plant physiology. 70(1): 287-

290.

4. Cowgill UM and Williams LR. 1989. Eds. American Society for Testing and materials. Phila.

pp. 379-391.

5. Cross J. Synthetic Media for Growing Duckweeds. The Charms of Duckweeds. Retrieved

August 13, 2013 from http://www.mobot.org/jwcross/duckweed/media.htm

6. DeKock PC, Vaughan D and Hall A. 1978. Effect of abscisic acid and benzyl adenine on the

inorganic and organic composition of the duckweed, Lemna gibba L. New Phytologist. 81(3):

505-511.

7. Edwards K, Johnstone C and Thompson C. 1991. A simple and rapid method for the

preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic acids research. 19(6): 1349.

8. Karim OR, Fasasi OS and Oyeyinka SA (2009). Gari Yield and Chemical Composition of

Cassava Roots Stored Using Traditional Methods. Pakistan Journal of Nutrition. 8(12): 1830-

1833.

9. Kittiwongwattana C and Vuttipongchaikij S. 2013. Effects of nutrient media on vegetative

growth of Lemna minor and Landoltia punctata during in vitro and ex vitro cultivation.

Maejo International Journal of Science and Technology. 7(1): 60-69.

70

10. Krajncic B and Nemec J. 1995. The Effect of Jasmonic Acid on Flowering in Spirodela

polyrrhiza (L.) Schleiden. J. Plant Physiol. 146: 754-756.

11. Murashige T and Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with

tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.

12. Pirson A and Seidel F. 1950. Cellular and physiological investigations of Lemna minor root

with special consideration to potassium and calcium lack. Planta 38: 431–473.

13. Oboh G. 2006. Nutrient enrichment of cassava peels using a mixed culture of

Saccharomyces cerevisae and Lactobacillus spp solid media fermentation techniques.

Electronic Journal of Biotechnology. 9(1).

14. Schenk RU and Hildebrandt AC. 1972. Medium and Techniques for Induction and Growth

of Monocotyledonous and Dicotyledonous Plant Cell Cultures. Can. J. Bot. 50: 199-204.

15. Schneider CA, Rasband WS and Eliceiri KW. 2012. NIH Image to ImageJ: 25 years of image

analysis. Nat Methods. 9(7): 671-5.

16. Stevenson DG, Doorenbos RK, Jane J and Inglett GE. 2006. Structures and Functional

Properties of Starch From Seeds of Three Soybean (Glycine max (L.) Merr.) Varieties.

Starch/Stärke 58: 509–519.

17. Tanaka O and Cleland CF. 1980. Comparison of the ability of salicylic acid and

ferricyanide to induce flowering in the long-day plant, Lemna gibba G3. Plant physiology.

65(6): 1058-1061.

18. อรไพลน ใจประเสรฐ, พทธานนท ทาระ และ สลล ชนโรจน. 2557. ผลของสภาวะการเพาะเลยงตอการ

เตบโตและการผลตสารชวโมเลกลของจอก. รายงานสบเนองจากการประชมวชาการระดบชาต “วทยาศาสตร

วจย”ครง ท 6 วนท 20-21 มนาคม 2557 มหาวทยาลยบรพา. 101-106.

รายงาน - Burapha Universitydigital_collect.lib.buu.ac.th/dcms/files//2559_069.pdf7.48...

Documents

Transcript of รายงาน - Burapha Universitydigital_collect.lib.buu.ac.th/dcms/files//2559_069.pdf7.48...