El papel potencial de Portulaca oleracea como un agente neuroprotector en la neurotoxicidad y la apoptosis inducida por rotenona en el cerebro de ratas

RESUMEN

Portulaca oleraceae (verdolaga), un miembro de la familia Portulacaceae, está muy extendido como una mala hierba y ha sido clasificada como la octava planta más común en el mundo. Con el fin de evaluar la verdolaga jugo acuoso a base de hierbas como agente neuroprotector, evaluamos los efectos anti-apoptóticos y antioxidantes de la verdolaga (1,5 ml / kg BWT) sobre la rotenona (12 mg / kg bwt) inducida por la lesión cerebral en ratas. Nuestros resultados mostraron que la verdolaga disminuyó significativamente el número de células apoptóticas en el cuerpo estriado. La detección inmunohistoquímica del factor nuclear kappa B (NF-JB) y el linfoma-2 (Bcl-2) de células B mostraron que después del tratamiento verdolaga hubo un aumento en las células teñidas positivamente para Bcl-2 y una disminución en las células teñidas positivamente para NF-JB indica el efecto anti-apoptótica de verdolaga por su actividad antioxidante.

La elevación de las especies reactivas del oxígeno, sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, nitrito / nitrato y lactato deshidrogenasa fueron todos redujo con el tratamiento verdolaga. Por otra parte, la PCR Resultados para iNOS y la caspasa-3 genes mostró baja regulación en grupos verdolaga tratada. En general, nuestro estudio pone de relieve el papel prosupervivencia de verdolaga en el mesencéfalo y el cuerpo estriado y propone su potencial profiláctico contra el desarrollo de daño cerebral y enfermedades neurodegenerativas asociadas con el estrés oxidativo.

INTRODUCCIÓNPortulaca oleracea (la verdolaga) es un alimento vegetal muy nutritivo para el consumo humano que se ha mencionado en los textos egipcios ya en la época de los faraones [1]. Verdolaga ofrece una rica fuente de la planta de beneficios nutricionales [2,3]. Es una de las fuentes vegetales verdes ricas de ácidos grasos omega-3 y ácido a-linolénico [4]. Verdolaga se ha utilizado como un antiséptico, y como un anti-diurético para los trastornos urinarios. Una variedad de la investigación ha demostrado que presenta una amplia gama de efectos biológicos, incluyendo un efecto relajante del músculo esquelético [5], efectos analgésicos y anti-inflamatorios [6], la actividad antifúngica [7] y un efecto antifertilidad [8]. Verdolaga también ha mostrado otros efectos beneficiosos como antidiabético [9] y la cicatrización de heridas propiedades [10].

Aumento de la producción de ROS durante enfermedades neurodegenerativas conduce a un rápido consumo y el agotamiento de antioxidantes endógenos eliminadores. En este contexto y en un esfuerzo para prevenir o disminuir el daño inducido por el estrés oxidativo, los investigadores están evaluando fármacos potenciales para actuar como antioxidantes exógenos así como carroñeros (basureros) para contrarrestar el ataque oxidativo en estas enfermedades. Productos naturales se han utilizado para la terapia dietética para varios milenios y algunos de ellos supuestamente presentan actividad antioxidante significativa [11]. Estudios recientes han demostrado que un número de productos de plantas, incluyendo polifenoles y flavonoides y diversos extractos de plantas, ejerce una acción antioxidante [12].Investigaciones anteriores de nuestro propio grupo ha establecido que los polifenoles y flavonoides tienen efectos neuroprotectores significativos contra el estrés oxidativo inducido por la rotenona, en particular, a través de la inhibición de la peroxidación lipídica inducida por rotenona [13].

Este estudio es importante porque se cree que el estrés oxidativo de estar involucrados en la patogénesis de varias enfermedades, incluyendo la aterosclerosis, la diabetes mellitus, inflamatoria y enfermedades neurodegenerativas y cáncer [14,15]. El aumento de los radicales libres produce la peroxidación lipídica, uno de los principales causas de daño de la membrana celular que finalmente conduce a la degeneración de las células [14].Rotenona es una neurotoxina que se ha propuesto para inducir Parkinson-como la degeneración a través del estrés oxidativo [16]. Se planteó la hipótesis de que la enfermedad de Parkinson (PD) se acompaña de varias alteraciones neuroquímicas, celulares y moleculares. Estos incluyen una mayor generación de radicales libres que incluyen la producción excesiva de óxido nítrico (NO); estos, a su vez, se cree que resultar en daños a dopaminérgicas (DA), las neuronas. Hay un número creciente de estudios recientes sobre el papel del NO, una molécula que se considera

como un mensajero neuronal universal en el sistema nervioso central, en la fisiopatología de las enfermedades neurodegenerativas [16].

En Antkiewicz-Michaluk et al. estudio, el repetido, pero no aguda, la administración de rotenona (durante un período de 7 días), en una dosis de 12 mg / kg sc, fue encontrado para aumentar fuertemente el metabolismo de la dopamina, tal como se mide por el aumento de la concentración de la dopamina intraneuronal metabolitos [17]. Tales cambios neuroquímicos no implican una acción neurotóxica directa, pero el cambio en el catabolismo de la dopamina hacia la vía oxidativa, genera radicales libres, que pueden conducir a la neurodegeneración [18].

El óxido nítrico es un tipo de molécula pleiotrópica libre efímera señalización implicada en diversos procesos biológicos incluyendo funciones neuronales. La producción de NO a partir de L-arginina es catalizada por la dioxigenasa, la óxido nítrico sintasa (NOS), el más tarde tiene tres isoformas: neuronales (nNOS), inducible (iNOS), y endotelial (eNOS). NO ha sido implicado en diversos procesos tales como la vasodilatación o regulación vascular, la modulación de la nocicepción, la función inmune, la neurotransmisión y el acoplamiento excitación-contracción [19].El factor nuclear kappa B (NF-kB) ha ganado cada vez más la atención por su papel como regulador de la muerte celular [20] y actuar como una respuesta citoprotector al daño neuronal. Se expresa ampliamente en el cerebro y existe tanto en inducible y una forma constitutivamente activa. NFkB se activa en las neuronas de la sustancia negra en el cerebro PD [21] y se controla principalmente a través de la interacción con la proteína inhibidora I kappa B, que inhibe la unión de su ADN, impidiendo la absorción nuclear de los complejos de NFkB y terminando así la actividad nuclear NFkB. La fosforilación y degradación de I kappa B inicia el movimiento de NFkB en el núcleo. Actividad NFkB puede, sin embargo, ser pro- o anti-apoptótica, dependiendo de las condiciones experimentales y proteínas diana implicados [22].Otro regulador de la apoptosis es la familia de proteínas lymphoma' de células B - 2 (Bcl-2) ", que tienen un papel crucial en la señalización apoptótica intracelular y que incluyen tanto las proteínas pro-y anti-apoptóticos. Los principales miembros de esta familia son Bcl-2, Bcl-XL y Bax. Bcl-2 y Bcl-xL se localizan en la membrana externa mitocondrial, al retículo endoplásmico y la membrana perinuclear [23].

Para conocimiento de los autores, no hay estudios similares se han realizado para dilucidar los efectos antioxidantes y también los efectos anti-apoptóticos de jugo acuosa verdolaga en la neurotoxicidad inducida por rotenona y la apoptosis en las células neuronales. Por lo tanto, el propósito del estudio fue evaluar cómo verdolaga jugo acuosa protege el cerebro de las ratas de la neurotoxicidad y la apoptosis inducida por rotenona.

2. Materiales y métodos2.1. Preparación del jugo de la plantaHierbas frescas verdolaga, libres de manchas o defectos evidentes, se recogieron desde el Delta del Nilo, Egipto, durante agosto de 2010. Un jugo acuosa de las hierbas verdolaga fue elaborado por maceración en una proporción de 1: 5 (w / v) y esto fue luego conservado por cerca de 24 horas en el refrigerador. Después de la maceración y la infusión, el extracto crudo resultante se filtró y el filtrado se mantuvo a -20 ° C para uso futuro.

2.2. Productos químicos y reactivosRotenona, nitro azul tetrazolio, N- (1-naftil) etilendiamina y Tris-HCl se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Ácido perclórico, ácido tiobarbitúrico (TBA) y ácido tricloroacético (TCA) se adquirieron de Merck. Trizol se adquirió de Life Technologies Corporation (California, EE.UU.). Todos los demás productos químicos y reactivos utilizados en este estudio fueron de grado analítico. Agua bidestilada se utilizó como disolvente. Además, lactato deshidrogenasa (LDH), se utilizaron (DiaSys Diagnostic Systems, GmbH, Alemania) kits comerciales.

2.3. Los animales experimentalesMacho adultas Wistar ratas albinas que pesan 120-150 g se obtuvieron de la Compañía Holding de Productos Biológicos y Vacunas (Vacsera, El Cairo, Egipto). Después de un período de aclimatación de 1 semana, los animales se dividieron en seis grupos (12 ratas por grupo) y se alojaron en jaulas de alambre tocó fondo en una habitación en condiciones estándar de iluminación con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h a 25 ± 1? C. Se les proporcionó agua y una equilibrada dieta ad libitum. Todos los animales recibieron atención en el cumplimiento de las normas egipcias para la protección de los animales.

2.4. Protocolo experimentalAnimales dentro de los diferentes grupos de tratamiento se mantuvieron en sus respectivas dietas durante 12-24 días de la siguiente manera: Grupo A, control sin tratar (Con); grupo B (Pur), se trató por vía oral con jugo de la verdolaga (1,5 ml / kg bwt); grupo C (Rot), se trató por vía oral con rotenona en dosis de 12 mg / kg bwt durante 12 días; grupo D (Rot-Pur), se trató por vía oral con rotenona (12 mg / kg BWT) durante 12 días antes de zumo de verdolaga (1,5 ml / kg BWT) durante otros 12 días; grupo E (Pur-Rot), se trató por vía oral con el jugo de la verdolaga (1,5 ml / kg BWT) durante 12 días antes de la rotenona (12 mg / kg BWT) durante otros 12 días y el grupo H (Rot + PUR) tratados por vía oral con el zumo de verdolaga (1,5 ml / kg BWT) más rotenona (12 mg / kg BWT) durante 12 días.

El nivel de la dosis administrada por vía oral de zumo de verdolaga (1,5 ml / kg bwt) se basó en el trabajo de Dkhil et al. [24] y datos no publicados que demuestra el alto contenido de polifenoles y compuestos flavonoides, en este jugo, así como sus propiedades antioxidantes. La dosis rotenona administrado por vía oral, por su parte (12 mg / kg BWT) sigue la dosis reportada por Antkiewicz- Michaluk et al. [17] como la producción de anomalías en el comportamiento general de ratas, tales como la bradicinesia y la alteración de la marcha.Al final de los experimentos se decapitaron los animales de cada uno de los grupos. Los cerebros de las ratas se retiraron cuidadosamente y disección de los cerebros se realizó en una placa de vidrio enfriada con hielo para la separación de las regiones del cerebro medio y el cuerpo estriado de acuerdo con el método descrito por Glowinski et al. [25]. El cerebro medio y el cuerpo estriado de los primeros seis ratas en cada grupo se pesaron y se homogeneizaron inmediatamente para dar un 50% (w / v) de homogeneizado en un medio enfriado con hielo que contiene 50 mM Tris-HCl y sacarosa 300 mM. El homogeneizado se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min a 4? C. El sobrenadante (10%) se utilizó para las diversas determinaciones bioquímicas.

2.5. La cuantificación de especies de oxígeno reactivasUna versión modificada de un ensayo descrito previamente para la conversión intracelular de nitro azul tetrazolio (NBT) a formazán por el anión superóxido se utilizó para medir la generación de especies reactivas de oxígeno [26]. Brevemente, LL NBT (1,0 mg / ml) se añadió 200 para el mesencéfalo y el cuerpo estriado homogeneizados de cada uno de los grupos, seguido de incubación adicional durante 1 hora a 37 ° C. Las soluciones se trataron entonces con 100 KOH ll (2 M). NBT reducido / g de tejido expresado en lmol se determinó mediante espectrofotometría. Si los compuestos de barrido de radical estaban presentes en el tejido, se formaría menos azul formazán, disminuyendo así la absorción a 570 nm.

2.6. Determinación de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúricoSustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) se ensayaron ensayos colorimétricos mínimas de los homogeneizados de cerebro medio y el cuerpo estriado de acuerdo con el método de Ohkawa et al. [27]. En este método, TBARS determinan usando 1 ml de ácido tricloroacético al 10% y 1 ml de ácido tiobarbitúrico 0,67% que después se calentaron juntos en un baño de agua hirviendo durante 30 min. TBARS A continuación se determinaron por la absorbancia a 535 nm y se expresaron como TBARS formado.

2.7. Determinación de nitrito / nitratoEl ensayo de nitrito / nitrato, como una medida indirecta de la producción de NO, el contenido en homogeneizados de cerebro medio y el cuerpo estriado se realizó de acuerdo con el método de Berkels et al. [28]. En un medio ácido y en presencia de nitrito de la sulfanilamida diazotise ácido nitroso formado se acopló con N- (1-naftil) etilendiamina. El azo-colorante resultante tenía un color púrpura rojizo brillante que podría ser medido a través de espectrofotometría a 540 nm.

2.8. Ensayo de citotoxicidad de lactato deshidrogenasaLa lactato deshidrogenasa se determinó mediante espectrofotometría siguiendo la disminución de NADH a 340 nm de acuerdo, a Bergmeyer [29], y se expresó como U / g de proteína, donde la proteína en los homogeneizados de cerebro medio y el cuerpo estriado se determinaron de acuerdo con Lowry et al. [30].

2.9. Análisis RT-PCREl ARN total se extrajo a partir de muestras congeladas cuerpo estriado siguientes el método reactivo Trizol [31]. El ARN extraído se disolvió en agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC-agua) y se almacenó a -70 ° C. 5 lg de

RNA se utilizó como una plantilla para la producción de cDNA a través de la incubación con RevertAid ™ H Minus transcriptasa inversa (Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc, Canadá) durante 1 hora a 45 ° C, en 10 mM hexámeros aleatorios, 0,375 mM por dNTP, mM MgCl2 3, KCl 75 mM, Tris-HCl 50, pH 8,3, ditiotreitol 10 mM, y 40 unidades de inhibidor de RNasa, seguido por 5 min a 70 ° C para inactivar la enzima. Las muestras se incubaron a continuación durante 30 min a 37 ° C con 0,1 mg / ml de RNasa. La amplificación por PCR se realizó en presencia de 2 mM de MgCl2, 0,05 lM de cada cebador (Metabion International, Martinsried, Deutschland), dNTPs 0,2 mM, 2 U de Taq ADN polimerasa (GoTaq ™ DNA Polimerasa, Promega Corporation) y 4 ll de producto de RT, en un volumen final de 50 ll.

Se llevó a cabo la amplificación simultánea del invariante gen constitutivo GAPDH. Las secuencias de los cebadores fueron como sigue:iNOS (S): 50-GAAAGAACTCGGGCATACCT-30.iNOS (AS): 50-GGCGAAGAACAATCCACAAC-30.Caspasa-3 (S): 50-TTCAGAGGGGATCGTTGTAGAAGTC-30.Caspasa-3 (AS): 50-CAAGCTTGTCGGCATACTGTTTCAG-30.GAPDH (S): 50-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-30.GAPDH (AS): 50-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-30.

Las Condiciones de PCR Para La iNOS were 35 ciclos de desnaturalización a 95 ° C Durante 60 s, hibridación un C Durante 63 ° 60 s, y la extensión A C Durante 72 ° 60 s. La del que de Mientras Condición párr la caspasa-3 FUE de 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C de Durante 60 s, hibridación un C Durante 58 ° 60 s, y la extensión A C Durante 72 ° 60 s. Condiciones de PCR were GAPDH párrafo 25 ciclos de desnaturalización a 95 ° C Durante 45 s, hibridación a 60 ° C Durante 45 s, y la extensión A C Durante 72 ° 45 s. Tras el ciclo Ultimo, extensión Una última se Realizo un 72 ° C Durante 10 min Para Todos los Análisis de PCR. Los Productos de PCR se visualizaron en gel de agarosa de la ONU al 2% con tinción con bromuro de etidio. La Expresión de Todas las Enzimas analizadas se normalizó a la Expresión de GAPDH párr Cada Muestra y sí comparativamente el USO de gel de software Pro Analyser.

2.10. Histopatología y NF-kB y Bcl-2 inmunohistoquímicaPequeños trozos de cerebro medio y el cuerpo estriado se retiraron rápidamente, luego fijó en formalina tamponada neutra. Después de la fijación, las muestras se deshidrataron, incrustado en cera, y luego se seccionaron a 5 l espesor. Para los exámenes histológicos, las secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina. Técnicas de inmunolocalización para NF-kB y Bcl-2 se realizaron en 3-4 secciones de espesor lm según Pedrycz y Czerny [32]. Para los controles negativos, el anticuerpo primario se omitió. En resumen, ratón anti-NF-JB o el ratón anti-Bcl-2 (diluted1: 200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), se incubaron con las secciones durante 60 minutos. Los anticuerpos primarios se diluyeron en TBS (solución salina tamponada con Tris) / 1% de BSA (albúmina de suero bovino). A continuación, un anticuerpo secundario biotinilado dirigido contra inmunoglobulina de ratón (kit biotinilado Enlace Universal-DakoCytomation, suministrado listo para usar) se añadió y se incubó durante 15 min, seguido de peroxidasa de rábano picante conjugada con estreptavidina (kit DakoCytomation, suministra listo para usar) para una mayor 15 min de incubación. En los sitios de inmunolocalización de los anticuerpos primarios, un color rojizo a marrón apareció después de la adición de 3-amino-9-ethylcarbasole (AEC) (DakoCytomationkit, suministra listo para usar) durante 15 min. Los especímenes se contratiñeron con hematoxilina durante 1 min y se montaron usando el fluido Aquatex (Merck KGaA, Alemania). El porcentaje de neuronas positivas se determinó usando un sistema de análisis de imagen. El número de células positivas se obtuvo usando cinco categorías: <5%, negativo (categoría 1); 05.25% (categoría 2); 25-50% (categoría 3); 50-75% (categoría 4); 75-100% (categoría 5). A continuación, la intensidad de la tinción fue de grado muy semana, semana, medio u oscuro. Todas las secciones se incubaron en las mismas condiciones con la misma concentración de anticuerpos y, al mismo tiempo; por lo que la inmunotinción fue comparable entre los diferentes grupos experimentales.

2.11. Los estudios ultraestructurales (microscopía electrónica de transmisión)Pequeños trozos de tejido estriado (aproximadamente 2.1 mm de espesor) se fijaron inmediatamente en helado 0,5% fijador de glutaraldehído. Los tejidos se lavaron a continuación en un tampón fosfato (0,1 M, pH 7,4) y post-fijo durante 2 h en 1% de tetróxido de osmio en el mismo tampón a 4 ° C. Las muestras se lavaron a continuación en tampón fosfato, se deshidrataron con acetona graduada y luego incrustado en Araldite CY 212 para hacer bloques de tejido. Tanto la cortes semifinos y los cortes ultrafinos (80-100 nm) se cortaron utilizando un ultramicrótomo. Las secciones se tiñeron con acetato de uranilo y acetato de plomo

y se examinaron con un microscopio electrónico de transmisión (JEOL, Tokio, Japón) operado a 60 kV. Al menos tres cerebros de cada grupo fueron examinados para cambios ultraestructurales.

2.12. El análisis estadísticoLos resultados se expresaron como la media ± error estándar de la media (SEM). Los datos para comparaciones múltiples variables se analizaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). Para la comparación de importancia entre los grupos, se utilizó la prueba de Duncan como una prueba post hoc de acuerdo con el programa de paquete estadístico (SPSS versión 17.0).

3. ResultadosLa administración de la rotenona durante 12 días indujo una marcada pérdida de la actividad del complejo I. El peso corporal y la apariencia general de los animales se deterioraron hasta la muerte. La administración de la verdolaga, sin embargo, disminuyó significativamente estas manifestaciones (datos suplementarios; Fig. 1).

3.1. Resultados de estrés oxidativoRotenona significativamente (p <0,05) indujo la producción in vivo de radicales libres de oxígeno en los tejidos neuronales de ratas como se indica mediante el ensayo NBT (Fig. 1). Cuando las ratas fueron tratadas con zumo de verdolaga por su cuenta, sin embargo, los tejidos neurales fueron capaces de inhibir la reducción de NBT. Sin embargo, el tratamiento verdolaga después, antes o simultáneamente con rotenona no logró disminuir la reducción de NBT en los tejidos del cerebro medio, en comparación con las ratas control. Además, el tratamiento verdolaga ya sea entregado después o simultáneamente con rotenona, redujo significativamente la reducción de NBT en el tejido estriatal, en comparación con el grupo control. La administración de la verdolaga antes de la rotenona, sin embargo, no logró disminuir la reducción de NBT en el striata de ratas en comparación con el grupo control.

Fig. 1.Reactive oxygen species (ROS) levels in midbrain and striatal brainhomogenates of male rats treated with rotenone and purslane. Con: Untreatedcontrol; Pur: Group B treated with purslane juice; Rot: Group C treated withrotenone;Rot–Pur: Group D treated with rotenone prior to purslane juice; Pur–Rot: Group E treated with purslane juice prior to rotenone and Rot + Pur: Group Htreated with purslane juice plus rotenone. a, significant change at p< 0.05 withrespect to Congroup as a negative control group; b, significant change atp < 0.05with respect to Rot group as a positive control group.

Fig. 2 resume el papel potencial de la verdolaga de TBARS en homogeneizados de tejidos neuronales. Verdolaga fue capaz de reducir el aumento de TBARS que había sido inducida a través de la administración

de la rotenona. Se observaron los efectos protectores máximos de verdolaga verdolaga cuando se co-administra con rotenona. En este caso, el nivel de TBARS inducida por la administración rotenona se redujo significativamente a p <0,05, tanto en el cerebro medio y el cuerpo estriado homogeneizados, en comparación con los de las ratas de control.

Los efectos de la rotenona y la verdolaga en los contenidos de nitrito / nitrato, tanto en el cerebro medio y el cuerpo estriado homogeneizados se presentan en la Fig. 3. Administración verdolaga durante 12 días no parece causar ningún cambio significativo en el nitrito / nitrato contenido en los tejidos del cerebro. Sin embargo, la administración rotenona causó un aumento significativo en el contenido de nitrito / nitrato en los homogeneizados de cerebro medio y el cuerpo estriado (p <0,05). Pre- y post-co-tratamiento de la verdolaga en ratas administradas con rotenona suprimieron la producción de nitrito / nitrato en homogeneizados de cerebro medio, pero los niveles de nitrito / nitrato todavía eran significativamente más altos que los del grupo de control. Por otra parte, se observó el efecto protector máximo de la verdolaga en los homogeneizados de tejido estriado cuando verdolaga se co-administra con rotenona. En este caso, el nivel de nitrito / nitrato se redujo significativamente a p <0,05 en comparación con las ratas de control.

Con base en los resultados mostrados en la Fig. 5, se examinó si la verdolaga podría ejercer un efecto neuroprotector después del tratamiento post, pre-tratamiento para el co-tratamiento. Administración verdolaga causó reducción significativa de la LDH (p <0,05) con la máxima protección que se ofrece en el grupo de tratamiento concurrente, enfatizando así el efecto neuroprotector de la verdolaga.

3.2. Histopatología y NF-kB inmunohistoquímica resultados estudio histopatológico de las muestras mostraron que la rotenona causó la degeneración en el cerebro medio y el cuerpo estriado se caracteriza por la presencia de cuerpos de Lewy (Fig. 6C). Sin embargo, la verdolaga pre-, post- y co-administración mostró un nivel sorprendente de protección, sin signos de los efectos adversos del tratamiento rotenona en las secciones del cerebro medio y el cuerpo estriado de las ratas (Fig. 6d, e y h, respectivamente).

La ultraestructura de las neuronas de las ratas de control y tratadas verdolaga fue normal en apariencia (datos suplementarios; Fig. 3a y b, respectivamente). En el grupo de la rotenona, el análisis ultraestructural demostró que la rotenona indujo una morfología nuclear apoptótica similar caracterizado por una cromatina se condensa parcialmente marginados por la envoltura nuclear. Sin embargo, pre, post-y co-tratamiento de los animales con el jugo de la verdolaga se asoció con protección estructural de las neuronas de estos cambios ultraestructurales inducidas rotenona-(datos suplementario; Fig. 3d, E y H, respectivamente). Se concluye, por tanto, que el jugo de la verdolaga alivió la degeneración inducida por rotenona de las neuronas en el cuerpo estriado de ratas.Investigación inmunohistoquímica para NF-kB y Bcl-2 mostró que había algo de inmunoreactividad en las neuronas del cerebro medio y el cuerpo estriado en el grupo de control tanto para NF-JB y Bcl-2, lo que indica el ciclo de vida normal de las células (. Figs 7a y 8a, respectivamente). En el grupo de verdolaga, el número de NF-JB neuronas inmunotinción positiva se disminuyó, mientras que se aumentó el número de Bcl-2 neuronas positivas que muestra la actividad anti-apoptótica de zumo de verdolaga (Fig. 7b y 8b, respectivamente). La actividad inmunotinción para NF-JB se aumentó en el grupo de rotenona, con menos actividad para Bcl-2 en comparación con el grupo control, lo que indica el efecto apoptótico de la rotenona, tanto en el cerebro medio y el cuerpo estriado (Fig. 7c y 8c, respectivamente). El efecto beneficioso de la verdolaga se demostró cuando las ratas fueron co-tratados con la verdolaga durante la administración rotenona.

En este caso, los números de NF-kB neuronas inmunotinción se redujeron, mientras que hubo un aumento paralelo en el número de Bcl-2 neuronas de tinción positiva (datos suplementarios; Tabla 1). También se muestran Estos efectos de la verdolaga cuando se administró ya sea antes o después del tratamiento rotenona.

Además, el análisis RT-PCR sobre la apoptosis de codificación seleccionado (caspasa-3) genes mostró que el tratamiento verdolaga reduce los efectos de daño celular neuronal mediada por rotenona (Fig 4 y datos suplementarios;. Fig. 2). El efecto protector máximo de verdolaga contra la apoptosis inducida por rotenona se muestra cuando la verdolaga se administró ya sea después o simultáneamente con el tratamiento rotenona, mientras que el gen de la caspasa-3 era todavía hasta reguladas cuando verdolaga se administró antes de la rotenona.

4. DiscusiónActualmente se cree que PD es causada no sólo por la genética, sino también, en gran medida, por factores ambientales, entre los que los pesticidas pueden desempeñar un importante, aunque no exclusiva, papel [17]. Uno de los plaguicidas que pueden estar implicados en el desarrollo de la enfermedad de Parkinson es la rotenona [18]. Dos líneas de razonamiento apoyan el papel de la rotenona. En primer lugar, tanto en la EP hereditaria y espontánea, la actividad del complejo I mitocondrial está disminuida [33] y rotenona es un potente inhibidor, soluble en lípidos de este complejo [34]. En segundo lugar, el daño oxidativo está fuertemente implicado en la neurodegeneración de neuronas DA en la DP [35], y como se muestra por Antkiewicz- Michaluk et al. [17] con anterioridad y en el presente documento, la rotenona produce potentemente el estrés oxidativo.

Rotenona es tóxico para las ratas cuando se aplica en dosis de 12 mg / kg bwt repetidamente durante 12 días, causando la mortalidad considerable. Esas ratas que sobrevivieron mediante tratamiento verdolaga mostraron anomalías claras en el comportamiento general y la pérdida de la ganancia de peso corporal.

En nuestro estudio, el nivel celular de la producción de ROS debido a la rotenona se midió por NBT, con los resultados que confirma que la producción de ROS es inducida por rotenona. La inducción de la producción de ROS mitocondrial por rotenona con frecuencia se ha atribuido a la capacidad de la rotenona para bloquear respiratoria mitocondrial complejo de la cadena I, aumentando de este modo la formación de ubisemiquinona, el donante de electrones primaria en la generación de superóxido mitocondrial [36].

Bloques rotenona flujo de electrones a través del complejo de la cadena respiratoria I, seguido de la mejora de la formación O- 2 [37]. Esto parece ser el principal mecanismo de la formación inducida por rotenona de O- 2, que puede evolucionar rápidamente a H2O2.

La elevación de ROS es una indicación de la tensión oxidativa y por rotenona inducida por citotoxicidad, que también se refleja en el aumento de LDH en los homogeneizados en nuestro estudio. Nuestros resultados muestran, sin embargo, que la producción de ROS se redujo significativamente por la administración de la verdolaga en especial después del tratamiento y co-tratamiento. Una posible explicación es que en el nivel celular, el efecto antioxidante de la verdolaga puede tener un impacto en los niveles de ROS inducida por rotenona al eliminar los radicales libres de oxígeno [24].

La hipótesis de que la generación de radicales de oxígeno y el estrés oxidativo pueden desempeñar un papel importante en la patogénesis de la PD se basa en dos factores. En primer lugar, el potencial para el metabolismo oxidativo de la dopamina para producir especies reactivas de oxígeno y, en segundo lugar, en el hecho de que el deterioro de la función mitocondrial, que ha sido descrito en la EP, también puede dar lugar a aumento de la formación de especies de oxígeno reactivas que conducen a la peroxidación de lípidos excesiva , al daño oxidativo del ADN mitocondrial y de allí a la apoptosis neuronal [38]. Estudios anteriores han demostrado que una dosis baja de rotenona (1,5 mg / kg) administrado durante 30 días aumentan el contenido de ácido tiobarbitúrico en diferentes áreas del cerebro de ratas [12,16].

Nuestros resultados confirman que el tratamiento rotenona (12 mg / kg bwt) aumentó significativamente los niveles de TBARS cerebrales, lo que sugiere que el aumento de la peroxidación lipídica podría estar asociado con el daño celular. En contraste con la administración rotenona, co-administración y post-tratamiento de las ratas con verdolaga revertido la peroxidación de lípidos a aproximadamente los valores de control. De nuevo, esto indica el efecto protector de la verdolaga en purgar los radicales libres.

Este efecto antioxidante de la verdolaga puede ser un resultado de su relativamente rico contenido de vitaminas antioxidantes conocidos. La verdolaga es conocida por ser rica en vitaminas C y E. Las vitaminas C y E son buenos antioxidantes capaces de prevenir la peroxidación de lípidos en plasma y tejidos [39], así como la protección de membranas, orgánulos y proteínas contra el daño oxidativo.

Los resultados del presente estudio indican que la rotenona a la dosis de 12 mg / kg bwt aumenta la generación de NO en el cerebro de las ratas. Esta elevación en la producción de NO puede inhibir enzimas clave del metabolismo de

energía, daño de ADN, agotar glutatión intracelular y reaccionar con el superóxido para formar la mucho más potente oxidante peroxinitrito (ONOO-) [16]. El peroxinitrito es un elemento clave en la resolución de los roles contrastantes de NO en la fisiología y la patología.

La generación de peroxinitrito durante largos períodos de tiempo dará lugar a la oxidación sustancial y potencial destrucción de los componentes celulares del huésped, que conduce a la disfunción de los procesos celulares críticos, la interrupción de vías de señalización celular, y la inducción de la muerte celular a través de tanto la apoptosis y necrosis [40 ].

Tanto nNOS e iNOS se han implicado en DA muerte neuronal inducida por 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) [41]. Estos estudios han demostrado que el bloqueo o deficiencia de nNOS o iNOS protegido neuronas DA en la sustancia negra contra la toxicidad del MPTP. El presente estudio ha demostrado que la rotenona aumenta selectivamente la expresión de iNOS en el cuerpo estriado.

Esto confirmó la participación de óxido nítrico mediada por NOS en la neurotoxicidad inducida por rotenona de la vía nigroestriatal. Nuestros resultados también son consistentes con estudios previos que han demostrado que la expresión de iNOS podría ser inducida por la exposición neurotoxina [42,43]. Curiosamente, el jugo de la verdolaga reduce la expresión de iNOS y nNOS después del tratamiento rotenona. Como muchos extractos de plantas complejas, zumo de verdolaga contiene un número de compuestos biológicamente activos, uno de los cuales es el ácido graso omega-3. Este es un compuesto altamente lipofílico que entra fácilmente en el cerebro desde el plasma [44].

Una de sus principales efectos beneficiosos sobre el sistema nervioso central es su capacidad para regular a la baja de NF-kB, que es en sí mismo un regulador de un número de productos génicos control de la inflamación uno de los cuales es la iNOS. Esto puede explicar la baja regulación de este gen en todos los grupos de verdolaga tratados [45].Dado el papel reportado para NF-kB en el daño neuronal inducida por diversos estímulos, que también investigó la ocurrencia de muerte celular por apoptosis en respuesta a la lesión inducida por el cerebro medio rotenona. Resultados inmunohistoquímicos demostraron que el mesencéfalo de ratas administradas con rotenona aumentó el nivel de proteína NF-kB (Fig. 7).Hemos demostrado aquí, por lo tanto, que la neuroprotección a través de la verdolaga está asociada con la translocación nuclear reducida del factor de transcripción NF-kB. Los efectos neuroprotectores de la verdolaga previamente se han atribuido a alteraciones de la señalización intracelular, incluyendo a través de la ruta de NF-kB. El bloqueo farmacológico de NF-kB podría ofrecer así una estrategia neuroprotectora interesante contra el estrés oxidativo [46].

Otro hallazgo es el aumento en el número de neuronas positivas teñidas con Bcl-2. Esto es consistente con los resultados de Mukherjee et al. [47], quienes encontraron que neuroprotectina D1, que es un metabolito de ácido docosahexaenoico (DHA), ejerce propiedades anti apoptóticas prominentes por hasta la regulación de las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-XL y la disminución de proapoptótica Bax y Bad expresión. Estos resultados están soportados adicionalmente por los resultados de Shina et al. [48] que sugiere que los actos de omega-3 directamente a nivel mitocondrial de la apoptosis mediante la restauración del equilibrio anti-apoptóticos de las proteínas Bcl-2 la familia.

Se cree que la caspasa-3 para ser el ejecutor final del daño en el ADN de apoptosis, como un marcador de apoptosis y los estudios han asociado la muerte neuronal en la EP se ha asociado con la activación de la caspasa-3. Rotenona También se ha demostrado que causa acciones apoptóticos de las neuronas DA través de la activación de las proteasas caspasa-3-como en modelos experimentales. Caspasa-3 escinde ICAD (inhibidor de caspasa activado DNasa), que conduce a la degradación del ADN y la fragmentación. Rotenona toxicidad mediada en el cuerpo estriado exhibe los cambios morfológicos de la apoptosis y aumenta las actividades de la caspasa-3 [49].

Nuestros resultados muestran que no hay regulación por disminución en la expresión del gen de la caspasa-3 en los grupos tratados verdolaga y esto se puede atribuir a una mayor expresión de Bcl-2. Nuestros resultados, por lo tanto, son coherentes con los resultados obtenidos por Andersen [50], que encontraron que la sobre expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 impidió la muerte celular mediada por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Inhibición de la caspasa, por lo tanto, podría proteger a las neuronas DA contra la degeneración inducida por rotenona.

Un hallazgo interesante de nuestro estudio, por lo tanto, es la disminución de la apoptosis después de la administración de la verdolaga (ya sea pre-, poste o co-tratamiento). Este resultado es similar a los resultados obtenidos por Shina et al. [48], quienes encontraron que, en la dieta de omega-3 suplementación de ratas embarazadas impidió la apoptosis inducida por hipotiroidismo en el cerebelo de rata en desarrollo. Esto puede explicarse por el efecto anti-apoptótico de omega-3 mediada a través de la activación de señales pro-supervivencia y la supresión de estrés celular. Omega-3 es muy abundante en las membranas neuronales, evita que los elementos de la apoptosis y la influencia específica de la supervivencia de señalización, tales como fosfoinositol 3-quinasa (PI3K), proteína activada MEK / ERK, p38-quinasa mitógeno (MAPK), JNK y Bcl-2 vías [51] en condiciones neuropatológicos.

En conclusión, se informó de que P. oleracea inhibió significativamente el estrés oxidativo inducido por rotenona y la apoptosis. Los datos actuales apoyan fuertemente la noción de que P. oleracea con su potente mezcla de compuestos antioxidantes podría ser muy útil en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos en los que está implicada la producción de ROS. Nuestros resultados también implican que la ingesta dietética de alimentos de origen vegetal ricos en antioxidantes puede ser útil en la prevención de tales enfermedades inhibiendo la liberación de NF-kB.

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